本發(fā)明涉及植物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種植物葉片離體培養(yǎng)保存方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物葉片離體保存可為領(lǐng)域科學(xué)研究提供鮮活的研究樣品，常用于植物葉片的生理測(cè)定、遺傳測(cè)定以及病理學(xué)研究。
楊樹種類繁多，適應(yīng)性強(qiáng)，生長快，是世界各國優(yōu)選的用材樹種和能源、木本飼料樹種。楊樹的引種、雜交和推廣栽培是我國林業(yè)建設(shè)的重要內(nèi)容之一。野外樣本的采集，是豐富楊樹品種、科學(xué)研究的必要環(huán)節(jié)；傳統(tǒng)的野外采集因時(shí)間、氣溫等限制，需要將樣本置冰壺等低溫設(shè)備中帶回，具有攜帶不方便、成本高、設(shè)備空間大、樣本存活時(shí)間短等缺點(diǎn)。
在楊樹的生理測(cè)定、遺傳測(cè)定、以及病理學(xué)研究中，采集楊樹葉片和進(jìn)行室內(nèi)研究也面臨同樣的問題；為此g.p.clinton等(1924)發(fā)明了葉盤法，用打孔器打取葉餅，50％的酒精表面消毒后漂洗2-3次，再置于1-1.5％的固體瓊脂培養(yǎng)基上面，密封培養(yǎng)皿后光照保存，該方法在進(jìn)行生理、病理研究時(shí)具有接種菌種純度高、接種密度定量化、溫度及光照等實(shí)驗(yàn)條件易控制、統(tǒng)計(jì)方便、易重復(fù)、與田間調(diào)查一致性好等優(yōu)點(diǎn)，但葉片損失大、自然壞死率高、容易被污染、葉盤壽命短、操作不方便等缺點(diǎn)。
隨后，littlefieldl.j.(1981)、hitoshinakamura(1998)等先后對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，國內(nèi)學(xué)者胡景江(2000)、田呈明(2002)、杜林(2005)等也先后對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，但壞死和污染依然是研究中面臨的嚴(yán)重問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種植物葉片離體培養(yǎng)保存方法及其應(yīng)用，主要目的是解決離體葉片培養(yǎng)時(shí)葉片損失大、自然壞死率高以及生命維持時(shí)間短的技術(shù)問題。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明主要提供了如下技術(shù)方案：
一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種植物葉片離體培養(yǎng)保存方法，所述方法包括如下步驟：選取整葉并留取葉柄作為預(yù)培養(yǎng)葉；
在玻璃皿底部的內(nèi)表面上鋪設(shè)培養(yǎng)紙，在所述培養(yǎng)紙上倒入培養(yǎng)液；
將所述預(yù)培養(yǎng)葉的正面與含有所述培養(yǎng)液的培養(yǎng)紙表面相對(duì)緊密放置，使所述預(yù)培養(yǎng)葉的葉柄部分緊貼于所述培養(yǎng)紙以吸收所述培養(yǎng)紙中的所述培養(yǎng)液；
用保鮮膜密封所述玻璃皿形成密封玻璃皿，將所述密封玻璃皿置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)；其中，所述培養(yǎng)室的恒溫溫度為25℃-28℃，每10h-14h交替選用黑暗或光照環(huán)境培養(yǎng)，所述密封玻璃皿內(nèi)的所述預(yù)培養(yǎng)葉的生命存活時(shí)間為25天-100天。
作為優(yōu)選，所述植物葉片為楊樹葉片；留取的葉柄長度為2cm-3cm，留取葉柄的目的是幫助葉片進(jìn)行水份代謝以維持葉片生命力；所述楊樹優(yōu)選為青楊、黑楊及其雜交楊樹葉片。
作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)紙的面積為所述玻璃皿底部的內(nèi)表面面積的三分之一至二分之一，目的是使玻璃皿中的葉片正面能見到光；所述培養(yǎng)紙可以延伸至所述玻璃皿的側(cè)壁。
作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)紙為中性濾紙、普通家用衛(wèi)生紙或普通報(bào)紙；培養(yǎng)皿為普通的玻璃培養(yǎng)皿或一次性培養(yǎng)皿，保鮮膜或封口膜均可用作培養(yǎng)皿側(cè)壁的密封材料。
作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)液為赤霉素水溶液、普通自來水或無菌水；向所述培養(yǎng)紙上倒入所述培養(yǎng)液是指所述培養(yǎng)紙被所述培養(yǎng)液全部浸濕而無多余液體流出，即所述培養(yǎng)紙吸收所述培養(yǎng)液后基本達(dá)到飽和狀態(tài)以維持所述玻璃皿內(nèi)rh為100％。
作為優(yōu)選，所述赤霉素水溶液的體積濃度為1-10‰克/升。
作為優(yōu)選，所述光照環(huán)境是采用燈光照明，所述燈光照明是采用5-8根功率為15瓦的led燈管；所述燈管品牌為歐普燈管。
作為優(yōu)選，所述密封玻璃皿內(nèi)的相對(duì)濕度為100％以使葉片維持生命力，氣孔張開，有效進(jìn)行光合作用；所述密封玻璃皿內(nèi)的所述預(yù)培養(yǎng)葉的生命存活時(shí)間為40天-60天。
作為優(yōu)選，所述相對(duì)放置指將所述預(yù)培養(yǎng)葉倒扣在所述培養(yǎng)紙上，所述預(yù)培養(yǎng)葉的正面是指本領(lǐng)域技術(shù)人員一致認(rèn)同的葉片的一面，即顏色光亮鮮艷的一面，與葉片背面相對(duì)；將所述葉片倒扣于所述培養(yǎng)紙上后，最好用鑷子小心調(diào)整葉柄高度以使所述葉柄和濾紙充分接觸。
另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了上述培養(yǎng)保存方法在植物種質(zhì)保存、植物遺傳測(cè)定、植物生理活性測(cè)定以及致病性測(cè)定中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明針對(duì)葉盤法培養(yǎng)保存植物葉片出現(xiàn)的自然壞死率高、葉片損失大以及葉片生命維持時(shí)間短的技術(shù)問題，采用了將留有葉柄的整片葉子放于封閉的玻璃皿中，該玻璃皿底部鋪設(shè)有培養(yǎng)紙，該培養(yǎng)紙中含有培養(yǎng)液，該葉柄可緊密接觸培養(yǎng)紙，以及將上述封閉的玻璃皿放入25℃-28℃恒溫環(huán)境和每10h-14h交替選用黑暗或光照環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)手段，達(dá)到了經(jīng)過培養(yǎng)保存的葉片完整、葉片無污染、生命可維持25天-100天并且操作簡單快速的技術(shù)目的，為植物種質(zhì)保存、植物遺傳測(cè)定、植物生理活性測(cè)定以及致病性測(cè)定提供了較好保存方法。
具體實(shí)施方式
為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效,以下以較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的具體實(shí)施方式、技術(shù)方案、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。下述說明中的多個(gè)實(shí)施例中的特定特征、結(jié)構(gòu)、或特點(diǎn)可由任何合適形式組合。
實(shí)施例1
選取69楊任意葉齡健康的整片幼葉，留存2-3cm長的葉柄，準(zhǔn)備干凈的玻璃培養(yǎng)皿(φ＝90)、干凈的中性濾紙，剪取玻璃培養(yǎng)皿面積1/2的中性濾紙作為培養(yǎng)紙，將其鋪設(shè)于培養(yǎng)皿底部，上述中性濾紙可以沿皿壁突出，配置特定質(zhì)量比的赤霉素水溶液(ga3水溶液)，量取3ml上述赤霉素水溶液并將其倒入上述中性濾紙，并使上述中性濾紙完全濕潤而無多余液體流出；
將上述預(yù)培養(yǎng)葉倒扣于上述中性濾紙表面，使預(yù)培養(yǎng)葉片基部(即有葉柄的部分)緊密貼于濾紙上，預(yù)培養(yǎng)葉的其余部分可以在中性濾紙上，用鑷子小心調(diào)整葉柄高度使葉柄和中性濾紙充分接觸；用保鮮膜將上述玻璃培養(yǎng)皿密封，帶回實(shí)驗(yàn)室備用；
將上述玻璃培養(yǎng)皿置恒溫26℃，每12小時(shí)交替使用黑暗或光照環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，60天后，上述69楊葉片仍然鮮綠并可在葉柄處萌發(fā)出完整的根系，90天后葉片仍具有較強(qiáng)的生命力。
實(shí)施例2
選取太白楊6-10天的整葉，留存2-3cm長的葉柄，準(zhǔn)備干凈的玻璃培養(yǎng)皿(φ＝90)、干凈的中性濾紙，剪取玻璃培養(yǎng)皿面積1/2的中性濾紙作為培養(yǎng)紙，將其鋪設(shè)于培養(yǎng)皿底部，上述中性濾紙可以沿皿壁突出，配置濃度為10‰克/升的赤霉素水溶液(ga3水溶液)，量取3ml上述赤霉素水溶液并將其倒入上述中性濾紙，并使上述中性濾紙完全濕潤而無多余液體流出；設(shè)置兩個(gè)處理組，分別命名處理組1，處理組2；每個(gè)處理組處理4片葉子，共8個(gè)葉片。
采用液氮對(duì)上述太白楊離體葉片迅速研磨后，于-20℃保存?zhèn)溆?，采?5％乙醇提取法(王元軍2010)測(cè)定上述液氮研磨保存的太白楊離體葉片的葉綠素含量，制備粗酶液并將其置于4℃保存；
對(duì)上述粗酶液進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定(hodgesetal.1999；郝再彬2006)：采用考馬斯亮藍(lán)g-250法測(cè)定上述粗酶液的可溶性蛋白質(zhì)含量，采用氮藍(lán)四唑(nbt)光還原法測(cè)定上述粗酶液的超氧化物歧化酶(sod)活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定上述過氧化物酶(pod)活性，測(cè)定結(jié)果如表1所示，由測(cè)定結(jié)果可知，上述太白楊的離體葉片可維持各生理指標(biāo)基本一致。
表1.太白楊離體葉片培養(yǎng)生理指標(biāo)差異
實(shí)施例3
選取太白楊5-10天的健康的5組整片葉，留存2-3cm長的葉柄，準(zhǔn)備干凈的玻璃培養(yǎng)皿(φ＝90)、干凈的中性濾紙，剪取玻璃培養(yǎng)皿面積1/2的中性濾紙作為培養(yǎng)紙，將其鋪設(shè)于培養(yǎng)皿底部，上述中性濾紙可以沿皿壁突出，配置濃度為10‰克/升的赤霉素水溶液(ga3水溶液)，量取3ml上述赤霉素水溶液并將其倒入上述中性濾紙，并使上述中性濾紙完全濕潤而無多余液體流出；
將上述預(yù)培養(yǎng)葉倒扣于上述中性濾紙表面，使預(yù)培養(yǎng)葉片基部(即有葉柄的部分)緊密貼于濾紙上，用鑷子小心調(diào)整葉柄高度使葉柄和中性濾紙充分接觸；用保鮮膜將上述玻璃培養(yǎng)皿密封，帶回實(shí)驗(yàn)室備用；
將松楊柵銹菌(melampsoralarici-populinakleb.)夏孢子制成1×105的無菌水懸液，用噴壺小心的將懸液噴于太白楊葉背使液體不流動(dòng)；
用保鮮膜密封培養(yǎng)皿，于26℃恒溫、12小時(shí)黑暗/光照交替培養(yǎng)；觀察和記錄潛育期、夏孢子繁殖情況；結(jié)果表明，該方法中的5組培養(yǎng)葉片，均獲得一致實(shí)驗(yàn)結(jié)果，潛育期6天，夏孢子堆產(chǎn)量多而大，無雜菌污染，20天內(nèi)可連續(xù)收獲夏孢子，葉片無明顯死亡現(xiàn)象。
實(shí)施例4
本實(shí)施例4與實(shí)施例3的不同之處在于，培養(yǎng)紙采用普通報(bào)紙，40天后太白楊離體葉片仍能產(chǎn)生夏孢子堆，但葉肉組織已開始?jí)乃馈?/p>
由以上實(shí)施例1實(shí)施例4的測(cè)試結(jié)果可知，采用本發(fā)明離體培養(yǎng)葉片的方法可維持葉片生命力25天-100天；采用本發(fā)明方法培養(yǎng)的葉片完整、無污染，葉片的各項(xiàng)生理指標(biāo)基本穩(wěn)定；本發(fā)明方法操作簡單快速；本發(fā)明方法為植物種質(zhì)保存、植物遺傳測(cè)定、植物生理活性測(cè)定以及致病性測(cè)定提供了較好保存方法。
本發(fā)明實(shí)施例中未盡之處，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可從現(xiàn)有技術(shù)中選用。
以上公開的僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以上述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。