本發(fā)明涉及兩株厚垣孢普克尼亞菌真菌及其應(yīng)用，屬于微生物菌種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物病原線蟲是一種危害嚴(yán)重的植物病害，據(jù)報(bào)道的植物病原線蟲達(dá)200多屬5000余種。植物病原線蟲病害給全世界農(nóng)業(yè)每年帶來近1250億美元的經(jīng)濟(jì)損失，僅次于真菌病害。線蟲生物防治引起了人們的關(guān)注，各國(guó)政府也給予了極大支持，第一代線蟲生物防治劑的活菌劑如捕食線蟲真菌、內(nèi)寄生真菌和寄生性細(xì)菌應(yīng)運(yùn)而生，但它受環(huán)境因素影響大、穩(wěn)定性較差、貨架期短等問題，使其應(yīng)用受到限制。為克服這一弊病，國(guó)內(nèi)外研究者更加關(guān)注第二代線蟲生防因子即菌株代謝產(chǎn)物研究開發(fā)。真菌的次生代謝產(chǎn)物作為第二代線蟲生防因子，以直接作用于農(nóng)作物線蟲的方式發(fā)揮作用，有著作用快、藥效高、環(huán)境相容性好、不容易造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)。前期研究我們發(fā)現(xiàn)真菌菌株能夠通過產(chǎn)生金輪霉素(aurovertins)類次生代謝產(chǎn)物來作為毒力因子殺死線蟲，因此尋找和篩選能夠高效產(chǎn)生金輪霉素類化合物的真菌菌株，為制備高效的殺線蟲毒力真菌制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供兩株厚垣孢普克尼亞菌真菌及其應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明分離篩選的厚垣孢普克尼亞菌pochoniachlamydosporiaymf1.00615和厚垣孢普克尼亞菌pochoniachlamydosporiaymf1.00111，已于2014年09月04日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏號(hào)分別為cgmccno.9586和cgmccno.9585。
本發(fā)明分離篩選的厚垣孢普克尼亞菌pochoniachlamydosporiaymf1.00615和厚垣孢普克尼亞菌pochoniachlamydosporiaymf1.00111在制備抗線蟲活性物質(zhì)aurovertins及抗植物病原線蟲制劑中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下的有益效果在于：
厚垣孢普克尼亞菌pochoniachlamydosporiaymf1.00615和厚垣孢普克尼亞菌pochoniachlamydosporiaymf1.00111中的pdb發(fā)酵液中含有達(dá)到800-1500μg/ml含量的抗線蟲活性物質(zhì)金輪霉素，具有很強(qiáng)的毒殺線蟲活性，能夠在制備毒殺植物病原線蟲制劑中應(yīng)用。
附圖說明
圖1顯示tlc檢測(cè)pochoniachlamydosporia發(fā)酵液乙酸乙酯部(c)及菌絲體甲醇粗提物(m)的結(jié)果。其中：化合物1：金霉素i(aurovertini)、化合物2：金霉素e(aurovertine)、化合物3：金霉素f(aurovertinf)、化合物4：金霉素d(aurovertind)。
圖2為化合物1–4結(jié)構(gòu)。
圖3為hplc檢測(cè)兩株真菌pochoniachlamydosporiaymf1.00615和ymf1.00111與已報(bào)道的ymf1.00613發(fā)酵液金輪霉素類含量的對(duì)比結(jié)果。橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為吸收峰豐度，菌株ymf1.00615和ymf1.00111的金霉素d的吸收峰豐度均達(dá)到400mau,已報(bào)道的ymf1.00613的吸收峰豐度則為250mau。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
(1)菌株pochoniachlamydosporiaymf1.00615和ymf1.00111的培養(yǎng)：
將在pda固體培養(yǎng)基中的ymf1.00615和ymf1.00111分別常規(guī)活化3天，在無菌條件下，將2x2cm2大小的菌塊接種于裝有250mlpdb培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃，160r·min-1搖床培養(yǎng)7天。
pda固體培養(yǎng)基為：去皮馬鈴薯200g，切成小塊后煮沸30min，4層紗布過濾，在濾液中加入20g葡萄糖，加水定容至1l，加入1.5％(m/v)的瓊脂，121℃滅菌20分鐘后待用；
pdb液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，切成1x1x1cm小塊后煮沸30min，4層紗布過濾，在濾液中加入20g葡萄糖，加水定容至1l，121℃滅菌20分鐘后待用。
實(shí)施例2菌株pochoniachlamydosporiaymf1.00615和ymf1.00111的發(fā)酵液的提取和tlc檢測(cè)
將上述實(shí)施1的菌種發(fā)酵液過濾，濾液即發(fā)酵原液減壓濃縮后，用等體積乙酸乙酯萃取三次，然后合并乙酸乙酯減壓蒸干。菌絲體用乙醇或丙酮浸泡12小時(shí)后，將甲醇提取液真空蒸干。用100ml的丙酮分別浸泡發(fā)酵液乙酸乙酯部和菌絲體甲醇粗提物，超聲波20min，進(jìn)行薄層層析tlc板檢測(cè)，以氯仿：甲醇＝15:1為展板體系時(shí)，uv檢測(cè)時(shí)在365nm下顯示黃綠色熒光，在254nm下顯示暗斑，10％h2so4酒精溶液噴灑并加熱顯色時(shí)為紫色，檢測(cè)到幾個(gè)相似的條帶(見下圖1)，其中在菌絲體甲醇提取物中(圖1中的m)化合物4含量最高，在發(fā)酵液乙酸乙酯部(圖1中的c)化合物3含量最高。四種金輪霉素類代謝產(chǎn)物化合物1-4的結(jié)構(gòu)如圖2所示。
實(shí)施例3菌株pochoniachlamydosporiaymf1.00615和ymf1.00111的發(fā)酵液的金輪霉素aurovertins含量分析
hplc檢測(cè)樣品制備方法為：將實(shí)施1的pdb發(fā)酵液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾并裝入hplc樣品瓶，放于4℃?zhèn)溆?。?yīng)用高效液相色譜儀hp1200unit(agilent,waldbronn,germany)，配以capcellpakc18，5μm，4.6×250mm(shiseido)反相柱。流動(dòng)相為色譜純乙腈和去離子水(10％乙腈-95％乙腈。洗脫流速為1ml/min。柱溫40℃，上樣量25μl。以金輪霉素(aurovertins)d，e，i，f為對(duì)照，檢測(cè)發(fā)酵液中金輪霉素含量，洗脫體系如表1所示，uv檢測(cè)波段為220-400nm。
表1.hplc檢測(cè)厚垣孢普克尼亞菌pdb發(fā)酵液中金輪霉素的洗脫體系
如圖3所示，發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的生產(chǎn)金輪霉素的菌株pochoniachlamydosporiaymf1.00613相比，本發(fā)明中的兩株菌株ymf1.00615和1.00111的pdb發(fā)酵液中含有更高含量的抗線蟲活性物質(zhì)金輪霉素，含量超出將近一倍，總含量達(dá)到800-1500μg/ml。其中ymf1.00615中的金輪霉素d的比例含量最高。
實(shí)施例4菌株pochoniachlamydosporiaymf1.00615和ymf1.00111的發(fā)酵液的殺線蟲能力的測(cè)試
將實(shí)施例1的菌絲體過濾：使用0.22μm濾膜將菌液與菌絲體分離，將菌液在120℃滅菌20min。用液體浸入法測(cè)試菌株發(fā)酵液的殺線蟲活性：根結(jié)線蟲meloidogyneincognita(race3)培養(yǎng)在溫室中(25℃)番茄根部。采集帶有根結(jié)線蟲卵塊的番茄病株，將病根剪切成約2cm小段，用滅菌的解剖針挑取成熟卵塊并將其置于40μm細(xì)胞篩網(wǎng)。將篩網(wǎng)和卵塊置于2％次氯酸鈉溶液中1min，期間輕微晃動(dòng)篩網(wǎng)。無菌水沖洗卵塊5–7次后將篩網(wǎng)放置于裝有15ml無菌水的6cm培養(yǎng)皿中28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化24小時(shí)即獲得二齡幼蟲(j2)用于毒性測(cè)試。
使用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在每孔中加入1ml發(fā)酵濾液和10μl線蟲懸液(平均500頭線蟲/10μl)，20℃(c.elegans)或28℃(m.incognita)靜置24小時(shí)后，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)線蟲死亡率。鑒定線蟲死亡的方法為，死亡線蟲僵直或呈“j”型，活線蟲則卷曲扭動(dòng)。用針尖撥動(dòng)靜止線蟲身體各部，線蟲仍未做出任何反應(yīng)則鑒定為死亡。
死亡率＝(死亡線蟲數(shù)/(死亡線蟲數(shù)+活線蟲數(shù)))×100％
校正死亡率＝供試樣品死亡率-對(duì)照組死亡率
以未接種真菌的pdb液體培養(yǎng)基為對(duì)照，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取三次平均值，計(jì)算出平均死亡率和校正死亡率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
表2供試菌株發(fā)酵液處理線蟲24小時(shí)毒性測(cè)試結(jié)果
如表2所示，菌株pochoniachlamydosporiaymf1.00615和ymf1.00111的發(fā)酵液菌株的pdb發(fā)酵液處理植物寄生線蟲m.incognita24小時(shí)后，線蟲的死亡率均高于95％，說明株菌的發(fā)酵液表現(xiàn)出很強(qiáng)毒殺線蟲活性。