本發(fā)明屬于天然藥物及化學(xué)藥物領(lǐng)域，特別涉及一種間苯三酚三聚體myrtucommuloner的抗菌活性及其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)菌感染可引發(fā)人體多種疾病。目前，臨床上耐藥菌感染日益嚴(yán)重，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)、耐青霉素肺炎鏈球菌(prsp)，耐多藥結(jié)核分枝桿菌(mdr-tb)等不斷蔓延，且細(xì)菌耐藥性逐漸呈多藥耐藥發(fā)展趨勢(shì)。近些年來(lái)，臨床上因耐藥菌感染所致的病死率逐年升高，反映出傳統(tǒng)抗菌藥物已難滿(mǎn)足現(xiàn)代臨床治療的需求。因此，研究開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

香桃木(myrtuscommunislinn.)為桃金娘科(myrtaceae)香桃木屬植物，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，常被用作防腐劑和消毒劑等。香桃木精油或其提取物具有較強(qiáng)的抗菌活性。1974年，rotsteina等首次從香桃木中發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的?；g苯三酚類(lèi)化合物myrtucommulonesa-b(antimicrobialagentsandchemotherapy,1974,6:539-542)。近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道了香桃木中的間苯三酚類(lèi)成分myrtucommulonesd-e具有良好的抗菌及降血糖活性(europeanjournaloforganicchemistry,2006,10:2371-2377)?？梢?jiàn)，間苯三酚類(lèi)化合物可能是香桃木的主要活性成分。然而，目前香桃木間苯三酚類(lèi)化學(xué)成分的研究尚不深入，僅報(bào)道了不足20個(gè)化合物。因此，其抗菌活性成分有待深入研究和發(fā)掘?；衔飉yrtucommuloner僅作為合成產(chǎn)物被報(bào)道(angewandtechemie,internationaledition,2010,49:2045-2049)，其抗菌作用尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，myrtucommuloner的結(jié)構(gòu)中具有四環(huán)體系，不同于myrtucommulonea的三環(huán)體系和myrtucommulonesd-e的五環(huán)體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有抗菌活性的間苯三酚三聚體myrtucommuloner。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述化合物在抗菌藥物制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種間苯三酚三聚體myrtucommuloner，結(jié)構(gòu)如式i所示，為首次從自然界分離得到的新天然產(chǎn)物；

上述間苯三酚三聚體的提取分離方法包括以下步驟：將香桃木(myrtuscommunis)干燥枝葉粉碎，用95％(w/w)乙醇滲漉提取，提取物濃縮后用石油醚萃取，石油醚萃取部位通過(guò)硅膠柱層析、sephadexlh-20、十八烷基鍵合硅膠(ods)柱層析及制備型hplc分離純化，得到化合物myrtucommuloner。

myrtucommuloner在制備抗菌藥物制劑中的應(yīng)用，所述藥物制劑中含有治療有效量的myrtucommuloner，余量為藥用輔料或其它可配伍的藥物；

所述的菌包括金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、糞腸球菌、耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌中的至少一種；

所述藥用輔料是指常規(guī)的藥用賦形劑，如溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑和粘合劑等；

所述其它可配伍的藥物，指的是以有效劑量的myrtucommuloner為藥物原料，再配伍其它天然藥物或化學(xué)藥品；

所述的抗菌藥物制劑包括多種臨床藥物劑型，如片劑、注射液、脂質(zhì)體納米粒、控釋劑、消毒劑等。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明首次從香桃木中分離鑒定了間苯三酚三聚體myrtucommuloner，是新的天然產(chǎn)物。

(2)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)myrtucommuloner在較低濃度(0.25～1.00μg/ml)下即對(duì)金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬(wàn)古霉素中介耐藥金葡菌、糞腸球菌和耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌均具有顯著的抗菌活性。

(3)本發(fā)明的myrtucommuloner對(duì)真核細(xì)胞毒性較低。

附圖說(shuō)明

圖1為間苯三酚三聚體myrtucommuloner的¹hnmr譜圖

圖2為間苯三酚三聚體myrtucommuloner的¹³cnmr譜圖

圖3為間苯三酚三聚體myrtucommuloner的x射線(xiàn)衍射結(jié)構(gòu)圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

化合物的提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定：

(1)香桃木(myrtuscommunis)干燥枝葉18kg，粉碎成粗粉，用25l95％(w/w)乙醇滲漉提取4次，合并滲漉液并減壓濃縮至無(wú)醇味，得到總浸膏約1.9kg?？偨嗉?l水混懸后，用5l石油醚萃取，重復(fù)4次，合并萃取液，減壓濃縮得到石油醚萃取部位489g。

(2)石油醚萃取部位進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑，按照石油醚和乙酸乙酯體積比為100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:100和0:100的洗脫梯度進(jìn)行洗脫，通過(guò)薄層色譜(tlc)分析后合并相似流份，得到10個(gè)主流份fr.a～fr.j。其中流份fr.d(石油醚-乙酸乙酯100:5洗脫部分，75g)繼續(xù)經(jīng)硅膠柱層析，按照石油醚和乙酸乙酯體積比為100:0、100:3、100:5、100:7、100:10、100:20、100:50的洗脫梯度進(jìn)行洗脫，得到7個(gè)亞流份fr.d1～fr.d7。

(3)①對(duì)亞流份fr.d4(石油醚-乙酸乙酯100:7洗脫部分，21.3g)進(jìn)行反相ods柱層析，以甲醇-水(meoh-h2o)為洗脫劑，按照甲醇和水體積比為50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的洗脫梯度進(jìn)行洗脫，收集洗脫液(洗脫體積100-3000ml)，通過(guò)tlc分析后合并相似流份，得到6個(gè)流份fr.d4a～fr.d4f。

②取流份fr.d4d溶解后上樣于sephadexlh-20色譜柱，以體積比為1:1的氯仿-甲醇(chcl3-meoh)混合溶劑為洗脫劑，流速為0.5ml/min進(jìn)行洗脫，收集洗脫液(洗脫體積100-2500ml)，通過(guò)tlc分析后合并相似流份，得到3個(gè)流份fr.d4d1～fr.d4d3。

③取流份fr.d4d2減壓濃縮后用甲醇溶解，然后用反相制備型hplc分離純化，以體積比為85:15的甲醇-水為洗脫劑，流速為3ml/min進(jìn)行洗脫，得到myrtucommuloner(2.6g)。

(4)myrtucommuloner的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色塊狀晶體；香草醛-濃硫酸反應(yīng)(tlc)顯紅色；m.p.215～216℃；uv(meoh)λmax(logε)242(3.14),267(3.72),304(4.41)nm；ir(kbr)νmax3421,2966,1717,1661,1602,1468,1388,1302,1182,1148,1120,1015,955,788,634,454cm^-1；hr-esi-msm/z651.3527[m+h]⁺(計(jì)算值c38h51o9:651.3528)。¹hnmr、¹³cnmr圖譜見(jiàn)圖1～2。x射線(xiàn)衍射結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

根據(jù)以上理化和光譜數(shù)據(jù)，鑒定了myrtucommuloner的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例2

myrtucommuloner對(duì)多種細(xì)菌的抑制作用

金黃色葡萄球菌s.aureusatcc29213、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌s.aureusatcc33591(mrsa)、萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌s.aureusmu50(visa)、凝固酶陰性葡萄球菌s.epidermidisatcc12228、糞腸球菌e.faecalisatcc29212、耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌e.faeciumatcc700221、大腸埃希菌e.coliatcc25922、銅綠假單胞菌ps.aeruginosaatcc27853，以上菌株均來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。

采用肉湯微量二倍稀釋法，測(cè)定化合物體外抑菌作用的最小抑菌濃度(mic)，具體操作方法如下：

(1)細(xì)菌培養(yǎng)：以胰酪胨大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)菌，35℃隔夜培養(yǎng)(12-16h)至約0.5個(gè)mcfarland濃度(1×10⁸cfu)時(shí)備用。

(2)先將測(cè)試樣品在乙醇中溶解成較高濃度，繼而用cation-adjustedmuellerhinton(camh)肉湯進(jìn)行系列倍比稀釋使樣品濃度范圍從256μg/ml到0.25μg/ml。另外，采用相同培養(yǎng)液配制好一定濃度的苯唑西林和萬(wàn)古霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。

(3)在96孔板上每孔加入100μl不同濃度的含藥培養(yǎng)液和100μl經(jīng)camh適當(dāng)稀釋的含菌培養(yǎng)液，使最終菌濃度達(dá)5×10⁵cfu/ml。以不含藥的camh肉湯加菌液作陰性對(duì)照(camh培養(yǎng)基、菌液各100μl)，以不加菌液的camh肉湯培養(yǎng)基作空白對(duì)照(camh培養(yǎng)基200μl)。將96孔板密封后置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育24h。

(4)以陰性對(duì)照孔內(nèi)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為前提條件，通過(guò)肉眼觀察，以加藥后孔內(nèi)細(xì)菌無(wú)明顯生長(zhǎng)的藥物最低濃度為該藥物的mic(μg/ml)，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1.myrtucommuloner對(duì)多種細(xì)菌的抑制作用

結(jié)果顯示，化合物myrtucommuloner對(duì)金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬(wàn)古霉素中介耐藥金葡菌、凝固酶陰性葡萄球菌、糞腸球菌、耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌均具有顯著的抗菌活性，mic值為0.25–8μg/ml。

尤其是上述化合物對(duì)耐甲氧西林金葡菌，萬(wàn)古霉素中介耐藥金葡菌和耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌的抗菌活性顯著優(yōu)于苯唑西林、萬(wàn)古霉素等現(xiàn)有臨床藥物，這對(duì)于將該類(lèi)化合物作為新型抗耐藥菌藥物研發(fā)具有重要意義。

本發(fā)明的myrtucommuloner作為新天然產(chǎn)物，對(duì)于耐藥菌具有良好的活性，有可能發(fā)展為新型抗菌藥物。

實(shí)施例3

myrtucommuloner對(duì)正常細(xì)胞的影響

試驗(yàn)方法：人胚腎細(xì)胞hek293(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))于含有10％(v/v)胎牛血清及雙抗(青霉素和鏈霉素各100u/ml)的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用pbs洗滌，0.25％(w/v)的胰蛋白酶消化，然后用新鮮dmem培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶個(gè)/ml，鋪96孔板，每孔200μl，待細(xì)胞貼壁后，加不同濃度的樣品，在37℃、5％co2條件下共培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μl5mg/mlmtt溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用移液槍吸出孔中液體，每孔加入100μldmso，室溫下輕搖10分鐘，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每個(gè)孔的吸光度od值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少3次以上。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式：抑制率(％)＝(1-加藥組od值)/對(duì)照組od值×100％。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2.myrtucommuloner對(duì)hek293的細(xì)胞毒性

試驗(yàn)結(jié)果顯示：即使在200μg/ml的高濃度下，本發(fā)明的化合物myrtucommuloner對(duì)人正常細(xì)胞胚胎腎細(xì)胞hek293僅表現(xiàn)出很低的細(xì)胞毒作用，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為15.19％。

實(shí)施例4片劑的制備

myrtucommuloner0.5g，乳糖20g，淀粉漿適量，硬脂酸鎂0.1g，混合，過(guò)篩，干燥后壓片。每片含myrtucommuloner0.05g。

實(shí)施例5注射液的制備

myrtucommuloner0.5g，丙二醇5g，研磨，再加少量注射用水稀釋?zhuān)靹?，然后加入氯化鈉適量，溶解后再加入注射用水至100ml，調(diào)ph值5.5-6.5，濾過(guò)，灌封，滅菌，即得100支注射用針劑。

實(shí)施例6脂質(zhì)體納米粒的制備

myrtucommuloner0.5g，大豆卵磷脂50mg，溶于2.5ml乙醇中，另取硬脂酸20mg和大豆卵靈脂50mg溶于2.5ml環(huán)己烷中，混合攪拌均勻。于37℃恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，使藥物及輔料在燒瓶壁形成均勻脂質(zhì)薄膜，于真空干燥器中放置過(guò)夜，除盡有機(jī)溶劑；另取聚乙二醇單硬脂酸酯375mg，攪拌溶解在17.5ml水中，加入上述薄膜中，超聲10min，定容至25ml，得淡黃色透明溶液。將此溶液冷凍干燥可得凍干粉。用球磨機(jī)研磨24小時(shí)，制得粒徑均勻的納米粒，混勻并分裝。每袋含myrtucommuloner0.05g。

實(shí)施例7控釋劑的制備

myrtucommuloner0.5g，乳糖4g和淀粉漿適量直接裝到旋轉(zhuǎn)制粒機(jī)/包衣器制備顆粒，將稀釋到15％固體的塑化乙基纖維素包衣劑懸浮液噴霧到myrtucommuloner顆粒的旋轉(zhuǎn)床上。在噴霧期間，用泊洛沙姆188制成的分散體載體膜包衣顆粒，形成平均顆粒度大約為450μm的持續(xù)釋放的顆粒。混勻裝入膠囊，每個(gè)膠囊含myrtucommuloner0.05g。

實(shí)施例8消毒劑的制備

myrtucommuloner0.5g，溶解于10ml乙醇中，依次加入聚乙二醇0.15g，聚山梨醇酯2.0g，最后加純水至1000g，制成消毒制劑。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。