本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及用于治療腫瘤的多肽。

背景技術(shù)：

p53蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子。在細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，可被誘導(dǎo)表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的停滯階段，繼而凋亡或者衰老。現(xiàn)在的研究認(rèn)為，p53蛋白具有強(qiáng)有力腫瘤抑制功能。p53蛋白被p53基因編碼。p53基因是一種抑癌基因，p53基因是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)功能有關(guān)。p53基因分為野生型和突變型兩種，其產(chǎn)物也有野生型和突變型。野生型p53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期僅數(shù)分鐘，并具有反式激活功能和廣譜的腫瘤抑制作用。p53基因的突變(缺失)是人類腫瘤的常見事件，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。一般認(rèn)為p53突變與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及不良預(yù)后相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的研究認(rèn)為p53蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要因子，通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抑癌作用的。p53蛋白也可以誘導(dǎo)細(xì)胞老化，這已經(jīng)成為它發(fā)揮抑癌作用的一大主要機(jī)制。

從p53蛋白作用的分子機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，p53蛋白具有上百個(gè)的靶基因。p53蛋白通過與這些基因內(nèi)部或上游的p53反應(yīng)元件相結(jié)合的方式反式激活這些基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因中有很多都與細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期調(diào)控過程有關(guān)，比如編碼細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制蛋白的p21基因和凋亡前體蛋白BAX的編碼基因等，促進(jìn)細(xì)胞死亡或生長停滯。最近，人們又發(fā)現(xiàn)microRNA也是受到p53調(diào)控的底物之一，其中最重要的就是miR-34家族成員。與此同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)p53蛋白也能起到抑制轉(zhuǎn)錄的作用。p53蛋白不僅對轉(zhuǎn)錄因子起作用，還對非轉(zhuǎn)錄因子起作用；不僅有胞內(nèi)的作用，也有胞質(zhì)中的作用。這些非轉(zhuǎn)錄因子作用中最值得一提的就是p53蛋白能夠與胞質(zhì)中的Bcl2家族蛋白發(fā)生相互作用，從而介導(dǎo)凋亡途徑，使得線粒體外膜通透性增高，釋放出細(xì)胞色素C，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。由此可見，p53蛋白可以通過多種不同的作用方式來達(dá)到抑制基因轉(zhuǎn)錄的目的。由于p53蛋白在人體腫瘤當(dāng)中所具有的重要作用，它成為了癌癥治療的新靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有腫瘤患者治療的藥物特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種p53蛋白激動(dòng)多肽，能有效治療腫瘤。

技術(shù)方案

一種p53蛋白激動(dòng)多肽，其序列為SEQ ID NO1。所述多肽的治療腫瘤的應(yīng)用。其用途可通過多種給藥方式治療腫瘤，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注等實(shí)現(xiàn)。所述P53蛋白激動(dòng)多肽用于促進(jìn)p53蛋白活性。

有益結(jié)果：

本發(fā)明中的p53蛋白激動(dòng)多肽序列SEQ ID NO1，可以靶向促進(jìn)p53蛋白活性，促進(jìn)p53蛋白產(chǎn)生的效應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長，達(dá)到治療腫瘤的效果。試驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明能夠抑制體外的多種腫瘤細(xì)胞活性，以及腫瘤模型裸鼠的腫瘤的生長。同時(shí)，本發(fā)明能夠抑制微管蛋白聚合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)。達(dá)到治療腫瘤的效果。

具體實(shí)施方式

p53蛋白激動(dòng)多肽由上海生工吉爾合成。

實(shí)施例1

p53蛋白激動(dòng)多肽的體外細(xì)胞增殖活性測定

采用MTT比色法。將對數(shù)生長的U937細(xì)胞，以1.0×10⁵加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物p53蛋白激動(dòng)多肽；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶標(biāo)儀570nm處測定吸光度A值，按公式細(xì)胞生長增殖抑制率＝(實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光值-1)×100％。計(jì)算出實(shí)驗(yàn)藥物的IC50為54.20nmol/L。

實(shí)施例2

P53蛋白激動(dòng)多肽對肝瘤細(xì)胞HePG2細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)的影響：將HEPG2細(xì)胞用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90％以上的匯合度時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，3000rpm離心5min收集細(xì)胞；加入10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(5ml)懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5*10⁶個(gè)/ml，于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、P53蛋白激動(dòng)多肽各劑量(5、10、20mg/ml)組。各組分別加入HEPG2細(xì)胞懸液600μl/孔后，空白對照組加入1640培養(yǎng)液600μl，P53蛋白激動(dòng)多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽。按20μl/1×10⁵個(gè)細(xì)胞加入蛋白質(zhì)提取液，吹吸打散細(xì)胞，4℃放置30min使細(xì)胞裂解，用于檢測細(xì)胞裂解液中P53蛋白表達(dá)量。

結(jié)果顯示，P53蛋白激動(dòng)多肽處理的HEPG2細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)明顯升高。HEPG2細(xì)胞細(xì)胞裂解液中中P53蛋白表達(dá)(29.71±16.87pg/(mg總蛋白)(p<0.05)，175.29±25.41pg/(mg總蛋白)(p<0.05)，45.62±20.32pg/(mg總蛋白)(p<0.05))，與HEPG2細(xì)胞對照組相比有顯著性差異。由此可見，P53蛋白激動(dòng)多肽能促進(jìn)HEPG2細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)。

實(shí)施例3

用腫瘤模型檢測P53蛋白激動(dòng)多肽的體內(nèi)效應(yīng)。

建立乳腺癌瘤腫瘤模型，將處于對數(shù)生長期的OVCAR-3T細(xì)胞用胰蛋白酶于37℃消化后，收集培養(yǎng)液，生理鹽水清洗2～3次。用生理鹽水將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×10⁷個(gè)/mL，接種于C57BL/6裸鼠右前肢腋部皮下，每只0.1mL。1w～2w后裸鼠腫瘤體積長到100～200mm³，剖取其瘤組織在無菌條件下碾磨，制備成1×10⁷個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種于C57BL/6裸鼠右前肢腋部皮下，每只0.1mL。1w～2w后裸鼠腫瘤體積長到70～100mm³后，裸鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。(1)空白組；(2)P53蛋白激動(dòng)多肽低劑量組；(3)P53蛋白激動(dòng)多肽中劑量組；(4)P53蛋白激動(dòng)多肽高劑量組。建立卵巢癌腫瘤模型，方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組P53蛋白激動(dòng)多肽(上海生工吉爾合成)設(shè)3個(gè)劑量：20、40、80mg/Kg，在腫瘤周圍多點(diǎn)注射。連續(xù)給藥21天后，觀察裸鼠存活數(shù)量，計(jì)算存活率。結(jié)果顯示，P53蛋白激動(dòng)多肽可有效地保護(hù)小白鼠，提高荷瘤裸鼠的生存率，生存率達(dá)到69.3％。建立乳腺癌瘤腫瘤模型，陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組多肽(上海生工合成)設(shè)3個(gè)劑量：2、4、8mg/Kg。21天后，觀察裸鼠存活數(shù)量，計(jì)算存活率。結(jié)果顯示，P53蛋白激動(dòng)多肽可有效地保護(hù)裸鼠，提高荷瘤裸鼠的生存率，80mg/Kg時(shí)的生存率達(dá)到49.3％。

實(shí)施例4

p53蛋白激動(dòng)多肽對體外微管蛋白聚合與解聚的作用。

取新鮮牛腦組織，剝?nèi)ツX膜和大的血管，剪碎，用冷MES緩沖液洗滌1-2次，以每克腦組織0.5-1ml的比例加入MES緩沖液，在4℃下，用電動(dòng)勻漿器勻漿；4℃，105000g離心1h，取上清，加入等體積的微管聚合緩沖液，37℃水浴保溫30min。26℃，105000g離心1h，取沉淀，加入約1/10勻漿體積的冷MES緩沖液，輕輕攪拌或用勻漿器將沉淀碾碎；將懸液放冰浴30min，使沉淀完全溶解。用Lowry’s法測定蛋白含量(SDS聚酰胺凝膠電泳法)。微管蛋白用MES緩沖液稀釋至4-5mg/ml，置液氮中保存。取冷凍的微管蛋白溶液，快速用常溫水沖其壁，使之融化，放入冰浴，用MES緩沖液稀釋至所需濃度(2-3mg/ml)，加入ATP至1mmol/l。以從冰浴中馬上取出的微管蛋白溶液在分光光度計(jì)350nm處調(diào)定為“0”點(diǎn)。然后將比色杯在37℃溫度下測定微管蛋白溶液的OD值，連續(xù)20-30min，記錄溫度-吸光值曲線(T-OD曲線)，重復(fù)三次。抑制率計(jì)算：抑制率(％)＝(對照管OD值－加藥管OD值)/對照管OD值。

實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)劑量：0.75μM、3μM、24μM，陽性對照組長春新堿劑量3μM，空白組加入等體積的溶劑DMSO；按上述操作測定吸光值。結(jié)果，隨p53蛋白激動(dòng)多肽濃度增加，聚合抑制率逐漸下降，說明有聚合能力的微管蛋白隨藥物濃度的增加而不斷減少。

SEQUENCE LISTING

<110> 羅瑞雪

<120> p53蛋白激動(dòng)多肽及其應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg

1 5 10 15

Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val

20 25 30

Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu

35 40 45

Ala