本發(fā)明涉及抗idhir132h抗體和它們在診斷和治療中的用途。
背景技術(shù)：
：異檸檬酸脫氫酶(isocitratedehydrogenase，idh)是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸，同時利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸作為輔助因子生成nadh/nadph(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸)，在能量代謝、維生素、氨基酸合成的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。idh主要分為idh1、idh2和idh3亞型。人類idh1和idh2的相似性達到70％，分別由不同基因編碼(idh1基因位于染色體2q33；idh2基因位于染色體5q26)。idh1表達于細胞質(zhì)和過氧化物酶體，而idh2主要存在于線粒體。2009年，美國yanhai實驗室和復(fù)旦大學(xué)趙世民團隊等發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤新的生物標(biāo)記物—異檸檬酸脫氫酶1(isocitratedehydrogenase1，idh1)r132的點突變。研究發(fā)現(xiàn)idh1第132位的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸會顯著抑制細胞內(nèi)idh1的活力，導(dǎo)致胞內(nèi)α-酮戊二酸(α-kg)水平明顯下降，而α-kg的下降則進一步導(dǎo)致脯氨酸羥基化酶(prolylhdroxylase)活力的降低。仿佛推倒了多米諾骨牌一樣，一系列反應(yīng)導(dǎo)致了細胞缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducingfactor，hif1α)的穩(wěn)定性增加，從而激活了hif1α信號通路，最終促進腫瘤生長。大量臨床膠質(zhì)瘤樣品篩查發(fā)現(xiàn)，idh1基因r132突變在繼發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的突變頻率高達75％以上，使得idh1基因成為潛在的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷指針和靶向治療目標(biāo)。idh1在世界衛(wèi)生組織(who)分級ii及iii級彌散性膠質(zhì)瘤中發(fā)生突變的頻率高。93％的idh1突變特點是氨基酸發(fā)生置換r132h。在急性髓系白血病中，idh1基因也發(fā)生突變，idh1r132h是其中一種主要突變。雖然在腫瘤及白血病中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)idh1r132h的突變，但是目前并沒有關(guān)于針對這一位點的抗體尤其是單克隆抗體問世。另一方面，目前對于疾病的診斷以及針對腫瘤的免疫治療都需要有特異性的抗體。因此，研發(fā)新型的抗idh1r132h單克隆抗體以用于疾病的診斷及癌癥的免疫治療或者給患者提供更多的藥物選擇，將成為研究熱點和迫切需求。技術(shù)實現(xiàn)要素：鑒于以上所述的現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于獲得高親和力的抗idh1r132h的抗體，并驗證其相關(guān)功能，以用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題并滿足迫切的實際需要。為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：1、一種分離的抗idh1r132h抗體或其功能性衍生物，所述抗idh1r132h抗體或其功能性衍生物特異性地識別idh1r132h的表位，所述抗idh1r132h抗體具有：(1)seqidno：2、6、10中的一個表示的抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列或其保守型變異序列；和(2)seqidno：4、8、12中的一個表示的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列或其保守型變異序列。2、如技術(shù)方案1所述的抗idh1r132h抗體或其功能性衍生物，所述衍生物為所述抗idh1r132h抗體的片段、抗體/抗體片段一因子融合蛋白、或抗體/抗體片段一化學(xué)偶聯(lián)物。3、如技術(shù)方案2所述的抗idh1r132h抗體或其功能性衍生物，所述抗idh1r132h抗體的片段為fab、fab'、f(ab)'2、或scfv。4、一種人源化抗體或其功能性衍生物，所述人源化抗體包含人源化的重鏈和人源化的輕鏈，其中所述重鏈包含：(1)技術(shù)方案1中所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列或其保守型變異序列，和(2)來自人受體抗體重鏈的骨架；其中所述輕鏈包含：(1)技術(shù)方案1中所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列或其保守型變異序列，和(2)來自人受體抗體輕鏈的骨架。5、一種分離的核酸分子，所述核酸分子編碼技術(shù)方案1至4中任一項所述的抗idh1r132h抗體的重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)或所述抗idh1r132h抗體的全長的氨基酸。6、一種構(gòu)建載體，所述構(gòu)建體含有如技術(shù)方案1至4中任一項所述的核酸分子；優(yōu)選的是，所述構(gòu)建體由所述核酸分子插入到表達載體的多克隆位點構(gòu)建而成。7、一種表達系統(tǒng)，所述表達系統(tǒng)由技術(shù)方案5所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到宿主細胞構(gòu)建而成。8、一種制備技術(shù)方案1至4中任一項所述的抗idh1r132h抗體的方法，所述方法包括如下步驟：(1)在適合表達所述抗idh1r132h抗體的條件下，培養(yǎng)技術(shù)方案6所述的表達系統(tǒng)，從而表達出所述抗idh1r132h抗體；(2)純化分離出所述抗idh1r132h抗體。9、如技術(shù)方案1至4中任一項所述的抗idh1r132h抗體或其功能性衍生物在制備分子阻滯藥物上的用途；優(yōu)選為在制備用于腫瘤治療或腫瘤診斷的分子阻滯藥物中的用途；更優(yōu)選為在制備用于診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤尤其是ii及iii級彌散性神經(jīng)膠質(zhì)瘤或者急性髓系白血病的診斷試劑中的用途。10、一種藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的如技術(shù)方案1至4中任一項所述的抗idh1r132h抗體或其功能性衍生物。本發(fā)明的所述抗體能夠特異性地識別與惡性疾病相關(guān)的idhir132h的突變位點并與之特異性地結(jié)合，可用于診斷和治療idhir132h突變后發(fā)揮致病作用的那些疾病，例如膠質(zhì)瘤及白血病等疾病。附圖說明圖1為斑點免疫印跡法(dotblot)檢測抗idh1r132h抗體特異性的檢測結(jié)果。圖2為在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系u87中驗證idh1r132h抗體特異性的驗證結(jié)果。圖3為在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系u251中驗證idh1r132h抗體特異性的驗證結(jié)果。圖4為a2e8細胞株分泌單抗功能驗證的結(jié)果。圖5為a11b3細胞株分泌單抗功能驗證的結(jié)果。圖6為d4c7細胞株分泌單抗功能驗證的結(jié)果。圖7為a2e8細胞株分泌單抗在人膠質(zhì)瘤標(biāo)本中染色的結(jié)果。具體實施方式本發(fā)明在第一方面提供了一種抗idh1r132h抗體尤其是抗idh1r132h抗體或其功能性衍生物，所述抗idh1r132h抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno：2、6、10或其保守型變異序列，所述抗idh1r132h抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno：4、8、12或其保守型變異序列。在一些實施方式中，重鏈和輕鏈的保守保守型變異序列相應(yīng)地包括下表中所示的序列：a2e8重鏈cdr1gyvfskfwseqidno:13a2e8重鏈cdr2stlemvtlseqidno:14a2e8重鏈cdr3kidggrlvcilppgtlvtvsaseqidno:15a2e8輕鏈cdr1ksvstsgysyseqidno:16a2e8輕鏈cdr2lvs-a2e8輕鏈cdr3qhireltrseggpswkseqidno:17a11b3重鏈cdr1gyafssswseqidno:18a11b3重鏈cdr2iypgdgdtseqidno:19a11b3重鏈cdr3aregsyytydvrayvvygmdyseqidno:20a11b3輕鏈cdr1qsllygsnqknyseqidno:21a11b3輕鏈cdr2was-a11b3輕鏈cdr3qqcyrypltseqidno:22d4c7重鏈cdr1gytftsfwseqidno:23d4c7重鏈cdr2inphdgytseqidno:24d4c7重鏈cdr3sipypgmdyseqidno:25d4c7輕鏈cdr1ksvstsgysyseqidno:26d4c7輕鏈cdr2las-d4c7輕鏈cdr3qhireltrseggpswkynseqidno:27本發(fā)明進一步提供了所述抗idh1r132h抗體的功能性衍生物，所述衍生物為抗idh1r132h抗體的片段、抗體/抗體片段-因子融合蛋白、抗體/抗體片段-化學(xué)偶聯(lián)物。所述抗idh1r132h抗體的片段可以為fab、fab'、f(ab)'2、或scfv等。所述抗體/抗體片段-因子融合蛋白具體可以為抗體-因子融合蛋白、或抗體片段-因子融合蛋白。所述抗體/抗體片段-化學(xué)偶聯(lián)物具體可以為抗體-化學(xué)偶聯(lián)物、或抗體片段-化學(xué)偶聯(lián)物。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述抗idh1r132h抗體由細胞系a2e8、a11b3或d4c7所生成。在另外一些優(yōu)選的實施方式中，所述idh1r132h的表位被細胞系a2e8、a11b3或d4c7所生成的抗idh1r132h抗體所結(jié)合。本發(fā)明在第二方面提供了一種分離的核酸分子(例如dna分子)，該核酸分子編碼所述抗idh1r132h抗體的重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)或編碼所述抗idh1r132h抗體的全長氨基酸序列。本發(fā)明在第三方面提供了一種構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含所述分離的核酸分子。優(yōu)選的是，所述構(gòu)建體通過將所述分離的核酸分子插入到表達載體的多克隆位點來構(gòu)建制得。本發(fā)明中的表達載體指本領(lǐng)域熟知的噬菌體、細菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體或其他表達載體。更優(yōu)選的是，所述表達載體選自由pcdna3.1+、pee14.4和phlx101組成的組。本發(fā)明在第四方面提供了一種抗idh1r132h抗體的表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)通過將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到宿主細胞來構(gòu)建制得。本發(fā)明中的宿主細胞可以是原核細胞(如細菌細胞)、低等真核細胞(如酵母細胞)、或高等真核細胞(如哺乳動物細胞)。優(yōu)選的是，所述宿主細胞選自由中國倉鼠卵巢細胞系(cho)，多種cos細胞系、hela細胞系、骨髓細胞系(如sp2/0細胞系、nso細胞系、yb2/0細胞系等)、和轉(zhuǎn)化的細胞或雜交瘤細胞組成的組。本發(fā)明在第五方面提供了一種制備所述抗idh1r132h抗體的方法，所述方法包括如下步驟：(1)在適合于表達所述抗體的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的表達系統(tǒng)，從而表達出所述抗idh1r132h抗體；和(2)純化分離出所述的抗idh1r132h抗體。本發(fā)明中所用的宿主細胞均為現(xiàn)有技術(shù)，可通過商業(yè)途徑購買獲取，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基亦為各種常規(guī)培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗選擇適用的培養(yǎng)基，在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群?，用例如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)法誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理鹽析方法、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析凝膠過濾、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。本發(fā)明從單克隆培養(yǎng)的細胞株中篩選獲取目的抗體的基因序列，用以構(gòu)建真核表達載體，表達后即可重建抗體的活性，獲得抗idh1r132h抗idh1r132h抗體。本發(fā)明在第六方面提供了一種人源化抗體，其包含人源化重鏈和人源化輕鏈，其中：(1)所述人源化重鏈的可變區(qū)可以包含來自小鼠a2e8、a11b3或d4c7重鏈的互補決定區(qū)和來自人受體抗體重鏈的骨架，所述來自人受體抗體重鏈的骨架可任選地具有一個或多個人骨架殘基取代；以及(2)人源化輕鏈的可變區(qū)可以包含三個來自小鼠a2e8、a11b3或d4c7輕鏈的互補決定區(qū)和來自人受體抗體輕鏈的骨架，所述來自人受體抗體輕鏈的骨架可任選地具有一個或多個人骨架殘基取代；并且(3)人源化抗體特異性結(jié)合到人idh1r132h的表位。本發(fā)明在第七方面提供了所述抗idh1r132h抗體在制備分子阻滯藥物中的用途。優(yōu)選的是，所述用途可以為制備用于腫瘤治療或腫瘤診斷的分子阻滯藥物中的用途。本發(fā)明第八方面提供了所述抗idh1r132h抗體在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑優(yōu)選為用于診斷腫瘤及白血病的診斷試劑，更優(yōu)選為用于診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤尤其是ii及iii級彌散性神經(jīng)膠質(zhì)瘤或者急性髓系白血病的診斷試劑。以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解的是，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案。還應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，否則諸如“一個”、“一”和“這個”或“一種”等包括復(fù)數(shù)形式。當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明。實施例11.抗idh1r132h抗體的生產(chǎn)抗原的制備人工合成含有idh1r132h的短肽(由上海強耀生物技術(shù)公司合成)，與載體偶聯(lián)后免疫小鼠。雜交瘤的制備我們使用標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)免疫方式和融合方法來制備抗idh1r132h抗體。該方法的簡要過程如下：小鼠免疫在上述得到idh1r132h抗原，任選一個型別的與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，進行四肢肌肉多點注射，每只每次注射200微升。首次免疫后，分別用同樣劑量的另外任一型別的加弗氏不完全佐劑進行加強免疫。在第四次加強免疫后，采血，檢測其與的反應(yīng)滴度。當(dāng)?shù)味冗_到106以上時，取小鼠脾臟細胞用于融合。融合前72hr再次進行加強免疫經(jīng)尾靜脈注射1次，50ul/只。制備60塊融合板。融合：取血清滴度最高的3只小鼠的脾臟細胞，與小鼠骨髓瘤細胞相融合。先將脾臟研磨，得到脾細胞懸液，然后將其與細胞數(shù)目低十倍的處于對數(shù)生長期的sp2/0小鼠骨髓瘤細胞混合，并經(jīng)peg1500作用1min，將兩種細胞融合一起；然后把融合細胞液分裝到60塊96孔板中培養(yǎng)。融合培養(yǎng)基為含hat和20％fbs的rpmi1640完全篩選培養(yǎng)基?？乖瓘V譜性克隆通過elisa及中和實驗篩選得到，并且經(jīng)3次克隆化后，得到穩(wěn)定的抗idh1r132h抗體細胞株。雜交瘤的篩選：融合細胞在96孔板中培養(yǎng)10天后，吸取細胞上清，進行elisa及中和檢測。將陽性孔繼續(xù)克隆化，直至細胞株所分泌的抗體能夠穩(wěn)定結(jié)合抗原為止。篩選結(jié)果獲得三株分泌抗idh1r132h抗體的細胞株：a2e8、a11b3和d4c7。雜交瘤的培養(yǎng)：將穩(wěn)定的雜交瘤細胞株在二氧化碳培養(yǎng)箱中擴增培養(yǎng)：從96孔板轉(zhuǎn)移至24孔板，再轉(zhuǎn)移至50ml細胞培養(yǎng)瓶。然后，收集細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞，將其注射到小鼠腹腔內(nèi)，并在一天后從小鼠腹腔中吸取腹水。單克隆抗體的純化腹水先用50％的硫酸鉸沉淀處理，然后用ph7.2的pbs進行透析，然后用deae柱進行純化，最終得到經(jīng)純化的單克隆抗體。實施例2抗idh1r132h抗體特異性的檢測。斑點雜交驗證：利用帶flag標(biāo)簽表達idh1全長的過表達載體和表達idh1r132h的過表達載體轉(zhuǎn)染hek293ft細胞，72hr后裂解細胞，取裂解液30ul點在nc膜上，室溫自然風(fēng)干，用含5％脫脂奶粉的pbs室溫封閉1hr，加入tbst1：5000稀釋的單克隆抗體，室溫作用1hr，tbst漂洗膜10min×3；加入稀釋后的二抗(均為1：4000稀釋)，水平搖床室溫孵育1h。吸凈二抗，tbst漂洗膜，10min×4，混合ecl(a：b＝100：1液)，充分覆蓋濕潤nc膜表面，靜置1min；于暗室中用保鮮膜將nc膜封好，將x光片平放于nc膜上顯影并記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果可見，篩選到的3株單克隆抗體可以特異性識別idh1r132h表位(見圖1)。flag標(biāo)簽的idh1野生型(wt)和idh1r132h突變的表達產(chǎn)物可以用flag抗體(sigma，m2，1：5000)識別反應(yīng)(最右邊兩個點)。westernblot法檢測：利用表達idh1全長的過表達載體和表達idh1r132h的過表達載體轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系u87mg和u251mg，感染72hr后收集細胞蛋白樣品進行電泳。電泳時，按每孔50μg蛋白上樣量等量上樣。以400ma恒壓轉(zhuǎn)膜100min。將膜放入放入1％酪蛋白/tbs中于室溫下振蕩封閉1h。加入tbst稀釋后的idhi抗體(1：5000稀釋)，4℃振蕩孵育過夜。吸凈一抗，tbst漂洗膜10min×3；加入稀釋后的二抗(均為1：4000稀釋)，水平搖床室溫孵育1h。吸凈二抗，tbst漂洗膜，10min×4，混合ecl(a：b＝100：1液)，充分覆蓋濕潤nc膜表面，靜置1min；于暗室中用保鮮膜將nc膜封好，將x光片平放于nc膜上顯影并記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果可見，idh1r132h抗體可以特異性識別膠質(zhì)瘤細胞中的idh1r132h表位(見圖2-3)。實施例3單克隆抗體的輕鏈基因和重鏈基因可變區(qū)的分離采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法分離抗體基因可變區(qū)，其中vlf與vlr為用于輕鏈可變區(qū)基因擴增的下游引物，vlf和vlr用于重鏈可變區(qū)基因擴增的下游引物。所使用的模板為利用trizol法提取的雜交瘤細胞株總rna，消化dna后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cdna。條件為pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；然后95℃15s，55℃30s，72℃50s，反應(yīng)40個循環(huán)?；厥漳康钠危⒖寺〉絫-載體中，然后進行測序(英駿公司)。對測序序列進行比對，以確定抗體可變區(qū)的核普酸序列，并進而確定相應(yīng)的氨基酸序列。按照上述方法，從雜交瘤細胞株a2e8、a11b3和d4c7中克隆出各細胞株所分泌的單抗的可變區(qū)基因，并確定了相應(yīng)的氨基酸序列。表1顯示了所使用的引物的序列。表2顯示了株單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核甘酸序列和氨基酸序列的序列編號。表1：用于擴增單抗可變區(qū)基因的引物的序列表2：3株單克隆抗體的可變區(qū)的序列編號用上述鑒定的序列，通過已知的抗體工程技術(shù)，可以制備各種基因工程抗體，例如嵌合抗體，人源化抗體，單鏈抗體，雙抗體等，并保留其所源自的單克隆抗體的生物學(xué)特性。因此，凡所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。實施例4抗idh1r132h抗體功能鑒定免疫熒光細胞化學(xué)染色觀察dh1r132h抗體與表達idh1r132h抗原細胞的結(jié)合能力。利用表達idh1全長的過表達載體和表達idh1r132h的過表達載體轉(zhuǎn)染hek293ft細胞，接種細胞爬片，轉(zhuǎn)染72hr后，用4％多聚甲醛室溫固定15min，15％驢血清封閉1h，一抗4℃過夜，pbs洗滌后加入熒光二抗，室溫孵育1h，pbs洗滌后封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。結(jié)果顯示獲得的單克隆抗體可以特異性識別表達在細胞中的idh1r132h表位。(見圖4-6)實施例5為了驗證idh1r132h在腫瘤標(biāo)本中的特異性，我們利用a2e8細胞株分泌單抗對人膠質(zhì)瘤組織進行染色驗證其特異性。腦膠質(zhì)瘤石蠟切片置于60℃烤片10分鐘，二甲苯脫蠟：二甲苯1(10min)，二甲苯2(10min)；梯度水化：無水乙醇1(10min)，無水乙醇2(10min)，95％乙醇(5min)，80％乙醇(5min)，70％乙醇(5min)，50％乙醇(5min)，雙蒸水(5min)；1×pbs洗(3min×3次)；抗原修復(fù)：預(yù)熱edta抗原修復(fù)液，將切片完全浸入修復(fù)液，注意微波過程中避免修復(fù)液蒸發(fā)過多，暴露組織，注意補液，微波過程中應(yīng)將微波調(diào)整至中火或小火，保持溫度(92℃-98℃，20min)；自然冷卻至室溫，組畫筆距離組織0.5cm圈出組織輪廓，15％驢血清稀釋液室溫封閉30min；1×pbs洗(3min×3次)；一抗4℃過夜；1×pbs洗(3min×3次)洗滌后加入熒光二抗，置于37℃孵育2小時。使用含dapi的甘油封片，并于熒光顯微鏡下觀察拍照。結(jié)果顯示獲得的單克隆抗體可以特異性識別表達在膠質(zhì)瘤細胞中的idh1r132h表位。(見圖7)盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解：根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對細節(jié)進行各種修改和變動，并且這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。序列表<110>北京愛仁醫(yī)療科技有限公司<120>抗idhir132h抗體及其制備方法和用途<130>gy17100152<160>31<170>patentinversion3.5<210>1<211>351<212>dna<213>小鼠<400>1gaggtcaaactgcagcagtctggggctgagctggtgaagcctggggcctcagtgaagatt60tcctgcaaagcttctggctacgtcttcagcaagttctggtcaactgggtacagcagaggc120ctggaaagggtcttgagtggattggacagatctaccctggagatggtgacattattacaa180cggaaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacat240gcagctcagcagcctgacctctgcggacactgcggtctatctctgtgcaagatcgacggg300ggacgtctggtatgcatactgccgccagggactctggtcactgtctctgca351<210>2<211>117<212>prt<213>小鼠<400>2gluvallysleuglnglnserglyalagluleuvallysproglyala151015servallysilesercyslysalaserglytyrvalpheserlysphe202530trpserthrglytyrserargglyleugluargvalleuserglyleu354045aspargserthrleuglumetvalthrleuleuglnarglysvalgln505560glyglnglyhisthraspcysargglnileleuglnhisserleuhis65707580alaalaglnglnproaspleucysglyhiscysglyleuserleucys859095lysileaspglyglyargleuvalcysileleuproproglythrleu100105110valthrvalserala115<210>3<211>324<212>dna<213>小鼠<400>3gatattgtgctgacccagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccacc60atctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaac120caacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatct180ggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccat240cctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgt300tcggaggggggaccaagctggaaa324<210>4<211>108<212>prt<213>小鼠<400>4aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesertyrargalaserlysservalserthrser202530glytyrsertyrmethistrpasnglnglnlysproglyglnpropro354045argleuleuiletyrleuvalserasnleugluserglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleuasnilehis65707580provalgluglugluaspalaalathrtyrtyrcysglnhisilearg859095gluleuthrargsergluglyglyprosertrplys100105<210>5<211>372<212>dna<213>小鼠<400>5gtcaagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcctcagtgaagatttcc60tgcaaggcttctggctatgcattcagtagctcctggatgaactgggtgaagcagaggcct120ggaaagggtcttgagtggattggacggatttatcctggagatggagatactaactacaat180gggaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagccaacatg240cagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctacttctgtgcaagagaggggagt300tactatacttacgacgtgagggcgtacgtggtctatggtatggactactggggccaaggg360accacggtcacc372<210>6<211>124<212>prt<213>小鼠<400>6vallysleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyalaser151015vallysilesercyslysalaserglytyralaphesersersertrp202530metasntrpvallysglnargproglylysglyleuglutrpilegly354045argiletyrproglyaspglyaspthrasntyrasnglylysphelys505560glylysalathrleuthralaasplysserserserthralaasnmet65707580glnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrphecysala859095arggluglysertyrtyrthrtyraspvalargalatyrvalvaltyr100105110glymetasptyrtrpglyglnglythrthrvalthr115120<210>7<211>340<212>dna<213>小鼠<400>7gatattgtgataacccagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggttact60atgaggtgcaagtccagtcagagccttttatatggtagcaatcaaaagaactacttggcc120tggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagg180gaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcacc240atcagcagtgtgaaggctgaagacctggcagtttattactgtcagcaatgttataggtat300ccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaac340<210>8<211>124<212>prt<213>小鼠<400>8vallysleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyalaser151015vallysilesercyslysalaserglytyralaphesersersertrp202530metasntrpvallysglnargproglylysglyleuglutrpilegly354045argiletyrproglyaspglyaspthrasntyrasnglylysphelys505560glylysalathrleuthralaasplysserserserthralaasnmet65707580glnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrphecysala859095arggluglysertyrtyrthrtyraspvalargalatyrvalvaltyr100105110glymetasptyrtrpglyglnglythrthrvalthr115120<210>9<211>348<212>dna<213>小鼠<400>9ccggtgcagctgcaggagtcaggggctgagcttgtgaagcctggggcttcagtgaagttg60tcctgcagggcttctggctacaccttcaccagcttctggatgcactgggtgaagcagagg120cctggacaaggccttgaatggattggacagattaatcctcacgatggttatactaattac180aatgagaggttcaggagcaaggccacactgactgtagacagatcctccagtacagcctac240atgcaactcagcagcctgacatctgaggactcttcggtctattactgttcaataccttac300cccggtatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca348<210>10<211>116<212>prt<213>小鼠<400>10provalglnleuglngluserglyalagluleuvallyspro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