本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更特別地，涉及一種cux1蛋白可結(jié)合的dna片段及其在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cux1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

cux1(ccaatdisplacementprotein)，又名為cdp/cux/cut(ccaat-displacementprotein/cuthomeobox)，是一類在多細(xì)胞物種中分布極其廣泛的轉(zhuǎn)錄家族蛋白，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，此外，該分子也參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，具有多種生物學(xué)功能。多項(xiàng)研究表明：cux1作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，可與多種原癌基因啟動(dòng)子區(qū)域(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-2000bp左右)結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)。

研究認(rèn)為：cux1蛋白可通過(guò)其特有的dna結(jié)合域與多種蛋白質(zhì)和dna結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)功能。并且cux1的功能具有雙面性，即可以激活也可以抑制基因啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等過(guò)程。研究還發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)過(guò)程中，cux1蛋白有不同的剪切變體，它們對(duì)靶基因的調(diào)控作用并不一致。cux1蛋白全長(zhǎng)分子，即p200，與dna的結(jié)合具有不穩(wěn)定性，多表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄抑制；而經(jīng)過(guò)溶酶體組織蛋白酶l水解之后的截短產(chǎn)物，即p110等，其與靶基因的結(jié)合更穩(wěn)定，多參與轉(zhuǎn)錄激活的過(guò)程，更多被當(dāng)作一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究。

cux1蛋白結(jié)合位點(diǎn)的改變可能造成其活性的改變，引起細(xì)胞功能紊亂，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至誘發(fā)惡性腫瘤。因此，檢測(cè)cux1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性對(duì)于探知細(xì)胞內(nèi)部的病理發(fā)生機(jī)制十分重要。然而，目前檢測(cè)cux1內(nèi)源性活性仍然依靠westernblot或qrcr等方法，雖然靈敏度高，但檢測(cè)到的只是cux1蛋白和mrna含量的差異，并不能直接體現(xiàn)其作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合至靶序列以調(diào)控轉(zhuǎn)錄的活性改變。我們需要檢測(cè)的不僅是ctcf的轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)含量，而是需要檢測(cè)ctcf結(jié)合至有效位點(diǎn)以影響轉(zhuǎn)錄的活性。

因此，需要設(shè)計(jì)一種新的用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cux1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，cux1蛋白結(jié)合的dna序列存在高度的保守性，其結(jié)合的dna核心序列為atcrat(r表示a、g)。

基于以上研究，本發(fā)明提供了一種cux1蛋白可結(jié)合的dna片段，其包含一個(gè)或多個(gè)cux1蛋白結(jié)合框，每個(gè)所述cux1蛋白結(jié)合框的序列獨(dú)立地為5’-atcgat-3’和/或5’-atcaat-3’。

優(yōu)選地，當(dāng)包含多個(gè)cux1蛋白結(jié)合框時(shí)，每?jī)蓚€(gè)相鄰的cux1蛋白結(jié)合框之間具有間隔序列，并且每?jī)蓚€(gè)相鄰的cux1蛋白結(jié)合框之間的間隔序列各自獨(dú)立地為3-10bp長(zhǎng)。

優(yōu)選地，序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明還提供了上述dna片段在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cux1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cux1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法，其包括以下步驟：

s1：將包括上述dna片段以及連接于所述dna片段下游的報(bào)告基因表達(dá)框的報(bào)告基因系統(tǒng)導(dǎo)入所述細(xì)胞；

s2：通過(guò)檢測(cè)所述報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)計(jì)算所述細(xì)胞內(nèi)cux1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

優(yōu)選地，所述報(bào)告基因系統(tǒng)為雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，包括重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒，并且所述重組質(zhì)粒帶有所述dna片段以及連接在所述dna片段下游的熒光素酶i的表達(dá)框，所述對(duì)照質(zhì)粒帶有熒光素酶ii的表達(dá)框，所示熒光素酶i與所述熒光素酶ii不同。

優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒通過(guò)將所述dna片段插入至質(zhì)粒pgl3-basic的kpni與hindiii位點(diǎn)之間得到。

優(yōu)選地，所述對(duì)照質(zhì)粒為phrl-tk。

優(yōu)選地，s1具體包括：

s11：將所述細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁，并恢復(fù)形態(tài)；

s12：將所述重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。

優(yōu)選地，s2具體包括：

s21：轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時(shí)，洗滌細(xì)胞；

s22：分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的熒光素酶i和熒光素酶ii的活性；

s23：將熒光素酶ii活性歸一化熒光素酶i活性得到值作為衡量cux1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的指標(biāo)。

通過(guò)使用本發(fā)明的dna片段和方法，可直接針對(duì)性地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cux1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，而非僅僅檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)的含量，從而使得能夠更準(zhǔn)確地分析cux1作為轉(zhuǎn)錄因子在一些病理學(xué)發(fā)展中所起的作用。

附圖說(shuō)明

圖1為kpni與hindiii對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳照片；

圖2為轉(zhuǎn)染有pgl3-basic-cux1和phrl-tk的人宮頸癌細(xì)胞系hela、人前列腺癌細(xì)胞系pc-3、人腎上皮細(xì)胞293t、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系sh-sy5y細(xì)胞中的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性統(tǒng)計(jì)圖，該相對(duì)活性通過(guò)將海腎熒光素酶活性歸一化來(lái)得到。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.構(gòu)建cux1蛋白可結(jié)合的dna片段

發(fā)明人對(duì)cux1進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)cux1蛋白結(jié)合的dna序列為atcrat(r表示a、g)，合成該dna核心序列時(shí)，將這段dna核心序列重復(fù)四次，以核心堿基鄰近堿基進(jìn)行間隔，并連接至攜帶螢火蟲熒光素酶的表達(dá)載體(pgl3.0-basic)中，構(gòu)建成功后，該熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體即包含四個(gè)重復(fù)的cux1蛋白結(jié)合的dna核心序列，以核心堿基臨近的堿基進(jìn)行間隔，其序列如seqidno:1所示。

為保證載體構(gòu)建的成功，在末端加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的粘性末端，本例在5’端加入kpni酶切位點(diǎn)的粘性末端(catgg)，在3’端加入hindiii酶切位點(diǎn)的粘性末端(ttcga)，序列兩邊的粘性末端的設(shè)計(jì)有助于片段與載體的連接。

通過(guò)從頭合成的方法，分別合成該片段的兩條寡核苷酸鏈，其序列分別如seqidno:2和3所示，這兩條寡核苷酸鏈皆由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。兩條寡核苷酸鏈互補(bǔ)配對(duì)后形成包含kpni酶切位點(diǎn)粘性末端和hindiii酶切位點(diǎn)粘性末端的雙鏈dna片段。100μl退火體系如下：annealingbufferfordnaoligos(5x)20μl、寡核苷酸鏈(50μm)各20μl，余下為ddh2o。

充分混勻后，設(shè)置pcr儀程序進(jìn)行退火反應(yīng)，具體程序?yàn)椋?5℃退火2分鐘(目的是讓dnaoligo充分變性)；每90秒下降1℃，降至25℃后結(jié)束反應(yīng)。dna退火產(chǎn)物用1.5％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后置冰上備用。

2.將cux1蛋白可結(jié)合的dna片段插入熒光素酶表達(dá)載體

用內(nèi)切酶kpni和hindiii(購(gòu)自takara公司，kpni貨號(hào)為1618，hindiii貨號(hào)為1615)對(duì)上述pgl3-basic空載體進(jìn)行雙酶切，20μl酶切體系如下：10xquickcutgreenbuffer2μl，kpni1μl，hindiii1μl，pgl3-basic空載體1μg，余下為ddh2o。

充分混勻后，37℃酶切反應(yīng)90分鐘，用1.5％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒雙酶切后的情況，然后切膠回收(dna膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，貨號(hào)為dp209)，回收結(jié)束后測(cè)樣品濃度，置冰上備用。

將退火得到的雙鏈dna連接至pgl3-basic熒光素酶表達(dá)載體上。10μl連接體系如下：dna連接酶(購(gòu)自takara公司，貨號(hào)為6022)5μl，雙鏈dna片段與經(jīng)雙酶切的pgl3-basic載體共5μl。為促進(jìn)酶連成功率，將dna片段與載體的摩爾比控制在10:1左右。充分混勻后，將酶連體系置于pcr儀中，16℃反應(yīng)1小時(shí)，連接反應(yīng)結(jié)束后得到重組質(zhì)粒，置于冰上備用。

將重組質(zhì)粒(含有cux1蛋白結(jié)合的dna片段的pgl3-basic表達(dá)載體)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。按照經(jīng)典的熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體方法如下：從-80℃冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α置于冰上解凍2-3分鐘，在感受態(tài)處于將融未融的狀態(tài)時(shí)，立即加入上述連接好的重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰上孵育10-30分鐘，然后42℃熱激60秒，在立即放至冰上靜置3-5分鐘，最后加入500μl不含抗生素的lb液體培養(yǎng)基(經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理)，放置于恒溫?fù)u床中擴(kuò)增1小時(shí)，擴(kuò)增條件為37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘。取擴(kuò)增后的菌液100μl均勻涂布于直徑為3.5厘米含氨芐青霉素的lb固體選擇培養(yǎng)基中，室溫靜置10分鐘后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜。次日挑取單菌落至5ml含氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃200轉(zhuǎn)/分鐘，搖菌繁殖12小時(shí)后提取質(zhì)粒，1.5％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

用內(nèi)切酶kpni和hindiii對(duì)上述提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，本發(fā)明實(shí)施例雙酶切鑒定如圖1所示(泳道1為marker，泳道2-4均顯示為陽(yáng)性克隆)。陽(yáng)性組送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，確認(rèn)dna片段已整合至pgl3-basic載體上.至此，含有cux1蛋白結(jié)合的dna片段的pgl3-basic表達(dá)載體(以下均表示為pgl3-basic-cux1)構(gòu)建成功。

3.pgl3-basic-cux1轉(zhuǎn)染細(xì)胞

本發(fā)明實(shí)施例采用人宮頸癌細(xì)胞系hela、人前列腺癌細(xì)胞系pc3、人腎上皮細(xì)胞293t、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系sh-sy5y細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。分別將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞hela、pc3、293t和sh-sy5y均勻種植在24孔板內(nèi)，每孔約10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，用10％胎牛血清，高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁并恢復(fù)形態(tài)后，將報(bào)告基因系統(tǒng)相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中(轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約為60-80％為宜，轉(zhuǎn)染前2小時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)基)。使用的轉(zhuǎn)染試劑為neofect(購(gòu)自零客創(chuàng)智生物科技有限公司，貨號(hào)為tf20121201)。50μl轉(zhuǎn)染體系如下：質(zhì)粒0.5μg，neofect轉(zhuǎn)染試劑0.5μl，余下為無(wú)血清培養(yǎng)基。

本實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)粒分別為：pgl3-basic空載體、pgl3-basic-cux1(含有cux1蛋白結(jié)合的dna核心序列的pgl3-basic表達(dá)載體)、phrl-tk(帶有海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參素酶基因的質(zhì)粒)、pcdna3.1(+)-cux1(cux1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)。

4.計(jì)算cux1的活性

以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算cux1活性。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時(shí)，再棄培養(yǎng)基上清，用1xpbs清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，清洗細(xì)胞時(shí)注意操作輕柔，避免正面吹打細(xì)胞。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自蓋寧生物科技有新公司，貨號(hào)為gn201-01)進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果如圖2所示，在人宮頸癌細(xì)胞系hela、人前列腺癌細(xì)胞系pc-3、人腎上皮細(xì)胞293t、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系sh-sy5y細(xì)胞中，cux1均具有較高的活性。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

<120>一種cux1蛋白可結(jié)合dna片段及在cux1活性檢測(cè)中的應(yīng)用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tatatcgattatctcatcgatcatcttatcaattatctcatcgatta47

<210>2

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctatatcgattatctcatcgatcatcttatcaattatctcatcgattata50

<210>3

<211>58

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agcttataatcgatgagataattgataagatgatcgatgagataatcgatataggtac58