本發(fā)明屬于核酸標(biāo)記領(lǐng)域，特別涉及一種細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，具有熒光響應(yīng)的核酸標(biāo)記技術(shù)在研究核酸分子結(jié)構(gòu)以及其在細(xì)胞內(nèi)的合成過(guò)程具有非常重要的價(jià)值和意義。尤其是利用生物正交反應(yīng)觸發(fā)的熒光響應(yīng)標(biāo)記方法經(jīng)成為一種生物分子標(biāo)記的重要工具，這種標(biāo)記方法可以在溫和的條件下選擇性標(biāo)記和追蹤生物分子，并進(jìn)行靈敏的可視化熒光成像。最初的標(biāo)記方法有熒光響應(yīng)的合成后標(biāo)記，模板介導(dǎo)的連接和dna或rna的代謝標(biāo)記，這些方法是基于一價(jià)銅離子催化的疊氮和炔烴的環(huán)化加成反應(yīng)[gierlich,j.；burley,g.a.；gramlich,p.m.；hammond,d.m.；carell,t.org.lett.2006,8,3639–3642]。為了打破銅離子催化的高毒性[kennedy,d.c.；mckay,c.s.；legault,m.c.b.；danielson,d.c.；blake,j.a.；pegoraro,a.f.；stolow,a.；mester,z.；pezacki,j.p.j.am.chem.soc.2011,133,17993-18001]熒光響應(yīng)標(biāo)記核酸進(jìn)一步發(fā)展為基于非銅催化的生物正交反應(yīng)，非銅催化的生物正交反應(yīng)包括張力促進(jìn)的1，3-兩極環(huán)化加成反應(yīng)，狄爾斯-阿爾德反應(yīng)和親核加成反應(yīng)[domnick,c.；eggert,f.；kath-schorr,s.chem.commun.2015,51,8253–8256]。但是即便如此，由于非銅催化的反應(yīng)基團(tuán)的尺寸的限制，到目前為止還沒(méi)有報(bào)道過(guò)在細(xì)胞內(nèi)有熒光響應(yīng)的dna快速標(biāo)記和成像的方法。在細(xì)胞環(huán)境內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記核酸對(duì)于探究核酸的復(fù)制及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程是非常重要的。

光誘導(dǎo)的疊氮-炔烴環(huán)化加成反應(yīng)即光點(diǎn)擊反應(yīng)是一種非金屬催化的具有熒光響應(yīng)的生物正交反應(yīng)。光點(diǎn)擊反應(yīng)已經(jīng)作為一種有效的蛋白定點(diǎn)修飾方法，近年來(lái)這種反應(yīng)引起了很多人的關(guān)注。光點(diǎn)擊反應(yīng)已經(jīng)成功地被證明可以用可見(jiàn)光405nm[an,p.；yu,z.；lin,q.chem.commun.2013,49,9920-9922.]和近紅外光700nm激發(fā)[yu,z.；ohulchanskyy,t.y.；an,p.；prasad,p.n.；lin,q.j.am.chem.soc.2013,135,16766–16769]。通過(guò)改變四唑化合物的結(jié)構(gòu)來(lái)減少紫外光的限制。鑒于這一優(yōu)勢(shì)，近期光點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)已經(jīng)開(kāi)始被應(yīng)用于在體外對(duì)核酸的修飾[(a)holstein,j.m.；stummer,d.；rentmeister,a.chem.sci.2015,6,1362–1369.(b)arndt,s.；wagenknecht,h.-a.angew.chem.int.ed.2014,53,14580–14582]。但是，有的文獻(xiàn)報(bào)道的四唑化合物通過(guò)光點(diǎn)擊反應(yīng)標(biāo)記核酸后的產(chǎn)物熒光較弱或者無(wú)光，有的文獻(xiàn)則用四唑化合物可以熒光響應(yīng)標(biāo)記rna[li,j.；huang,l.；xiao,x.；chen,y.；wang,x.；zhou,z.；zhang,y.j.am.chem.soc.2016,138,15943-15949]。在光點(diǎn)擊反應(yīng)標(biāo)記核酸的過(guò)程中，這種不明確的熒光響應(yīng)行為成為其首要問(wèn)題。因此，解決光點(diǎn)擊反應(yīng)標(biāo)記核酸中的熒光響應(yīng)問(wèn)題及探究可以用于活體內(nèi)代謝標(biāo)記核酸的具有熒光響應(yīng)能力的探針具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針。該探針具有光點(diǎn)擊反應(yīng)的特征性?xún)?yōu)點(diǎn)如：反應(yīng)速度快，反應(yīng)基團(tuán)分子為小且易修飾具有烯烴基團(tuán)的化合物，并且該探針具有細(xì)胞核靶向性，適合應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)核酸的快速代謝標(biāo)記。

本發(fā)明的另一目的在于提供了所述細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針，為香豆素四唑化合物w1和w2中的至少一種；所述的w1和w2的結(jié)構(gòu)式如式i和式ii所示：

其中，r為c1-c2烷基、烷基衍生物取代基，含酯基衍生物取代基或芳香烴衍生物取代基。

所述的c1-c2烷基、烷基衍生物取代基優(yōu)選為甲基、乙基或三氟甲基；

所述的含酯基衍生物取代基優(yōu)選為乙酸乙酯取代基

所述的芳香烴衍生物取代基優(yōu)選為苯甲基對(duì)三氟甲基苯甲基對(duì)甲氧基苯甲基或2,5-二甲氧基苯甲基

所述的細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針的制備方法，包括如下步驟：

(1)將香豆素衍生物加入乙醇水溶液中，接著加入濃鹽酸，然后在5℃條件下加入nano2(亞硝酸鈉)水溶液，再在-15℃的條件下滴加到4-甲基((2-(苯磺酰)亞肼基)甲基)苯甲酸鹽的吡啶中，恢復(fù)室溫進(jìn)行反應(yīng)，萃取、減壓蒸餾、得到香豆素四唑化合物(w1)；

(2)將步驟(1)中得到的香豆素四唑化合物(w1)和氫氧化鋰在四氫呋喃、甲醇和水的混溶液中加熱攪拌反應(yīng)，反應(yīng)終止后再調(diào)節(jié)溶液的ph值至出現(xiàn)紫色沉淀，得到中間體a；

(3)將步驟(2)中得到的中間體a、nhs(n-羥基丁二酰亞胺)和edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)在dmf(n,n-二甲基甲酰胺)中攪拌反應(yīng)(用于活化香豆素四唑化合物)，反應(yīng)終止后再加入飽和食鹽水析出沉淀，得到四唑化合物b；

(4)將步驟(3)中得到的四唑化合物b加入到含有三乙胺的dcm(二氯甲烷)和dmso(二甲基亞砜)溶液中，然后加入?；撬崴芤簲嚢璺磻?yīng)，減壓蒸餾，加甲醇稀釋沉淀過(guò)濾后，調(diào)ph值至中性，再加入乙醚、過(guò)濾、取沉淀，得到w2，即為細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針。

步驟(1)中所述的香豆素衍生物和4-甲基((2-(苯磺酰)亞肼基)甲基)苯甲酸鹽優(yōu)選為按摩爾比10:9配比計(jì)算。

步驟(1)中所述的乙醇水溶液為乙醇和水按體積比1:1配比得到。

步驟(1)中所述的反應(yīng)的條件為攪拌過(guò)夜進(jìn)行反應(yīng)。

步驟(1)中所述的乙醇水溶液的用量為按乙醇水溶液和濃鹽酸的體積比6:1配比計(jì)算。

步驟(1)中所述的濃鹽酸的濃度優(yōu)選為體積百分比37％。

步驟(1)中所述的萃取為采用dcm(二氯甲烷)進(jìn)行萃取。

所述的具有熒光響應(yīng)的dna光點(diǎn)擊探針的制備方法，還包括將步驟(1)中得到的香豆素四唑化合物經(jīng)硅膠柱進(jìn)一步純化。

步驟(2)中所述的香豆素四唑化合物和氫氧化鋰優(yōu)選為按摩爾比1:20配比計(jì)算。

步驟(2)中所述的四氫呋喃的用量為按四氫呋喃、甲醇和水體積比2:1:1配比計(jì)算。

步驟(3)中所述的中間體a、nhs和edc優(yōu)選為按摩爾比1:2:2配比計(jì)算。

步驟(3)中所述的反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為12h。

步驟(4)所述的四唑化合物b、三乙胺和?；撬醿?yōu)選為按摩爾比1：2：2配比計(jì)算。

步驟(4)中所述的dcm的用量為按dcm和dmso體積比4～6:1配比計(jì)算；優(yōu)選為按體積比5：1配比計(jì)算。

步驟(4)中所述的調(diào)ph值優(yōu)選為用氫氧化鈉的甲醇溶液進(jìn)行調(diào)ph值。

所述的氫氧化鈉的濃度優(yōu)選為0.5mol/l。

步驟(4)中所述的反應(yīng)優(yōu)選為在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行反應(yīng)。

所述的細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針在核酸標(biāo)記領(lǐng)域中的應(yīng)用。

所述的細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針在核酸標(biāo)記領(lǐng)域中的應(yīng)用，通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)：

(i)將細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針與具有氨基的核酸序列在硼酸鈉緩沖液中避光孵育進(jìn)行縮合反應(yīng)，用預(yù)冷的無(wú)水乙醇將核酸沉降出來(lái)，得到香豆素四唑修飾的核酸；

(ii)將步驟(i)得到的香豆素四唑修飾的核酸分別與異丙基丙烯酰胺和n-(2-羥乙基)馬來(lái)酰亞胺在磷酸鹽緩沖液中、紫外光照射下發(fā)生光點(diǎn)擊反應(yīng)，得到具有熒光響應(yīng)的核酸。

步驟(i)中所述的細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針和核酸序列優(yōu)選為按摩爾比(8～12)：1配比計(jì)算；更優(yōu)選為按10:1配比計(jì)算。

步驟(i)中所述的核酸序列優(yōu)選為5’端氨基標(biāo)記。

步驟(i)中所述的硼酸鈉緩沖液的ph優(yōu)選為8.0。

步驟(i)中所述的縮合反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為14小時(shí)。

步驟(ii)中所述的紫外光的波長(zhǎng)優(yōu)選為350nm。

步驟(ii)中所述的紫外光的照射時(shí)間優(yōu)選為10分鐘。

步驟(ii)中所述的磷酸鹽緩沖液的ph值為5.5～7.5，優(yōu)選為7.5。

所述的細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針在核酸標(biāo)記領(lǐng)域中的應(yīng)用，還可以通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)：

①將細(xì)胞傳代到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁后，加入5-乙烯基-2’-脫氧尿苷(vdu)進(jìn)行培養(yǎng)；

②換成新的dmem培養(yǎng)液孵育后，再加入細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針繼續(xù)培養(yǎng)；

③加入新的dmem培養(yǎng)液孵育后，再用紫外光照射進(jìn)行反應(yīng)。

步驟①中所述的細(xì)胞優(yōu)選為腫瘤細(xì)胞。

步驟①中所述的細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針優(yōu)選為ctz-so3。

步驟①中所述的加入vdu為加入終濃度為30～50μm的vdu；優(yōu)選為加入終濃度為30μm的vdu。

步驟①中所述的培養(yǎng)的時(shí)間為12～20小時(shí)；優(yōu)選為16小時(shí)。

步驟②中所述的加入細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針為加入終濃度為10～20μm的細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針，優(yōu)選為加入終濃度為10μm的細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針。

步驟②中所述的孵育的時(shí)間為3～6小時(shí)；優(yōu)選為4小時(shí)。

步驟②中所述的繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為3～6小時(shí)；優(yōu)選為4小時(shí)。

步驟③中所述的孵育的時(shí)間優(yōu)選為2小時(shí)。

步驟③中所述的紫外光波長(zhǎng)優(yōu)選為350nm。

步驟③中所述的紫外光的照射時(shí)間為8～14分鐘；優(yōu)選為10分鐘。

本發(fā)明中細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針標(biāo)記核酸的發(fā)光原理是：標(biāo)記核酸后產(chǎn)物發(fā)光部分由兩部分組成，熒光探針香豆素衍生物部分和吡唑啉部分，吡唑啉部分發(fā)光可以被核酸引起的光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)淬滅，但是香豆素部分的熒光不受影響，因此，香豆素四唑在紫外光的照射下可以熒光響應(yīng)的標(biāo)記核酸。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本文中光點(diǎn)擊探針具有細(xì)胞核靶向性適用于活體內(nèi)的核酸代謝標(biāo)記。

(2)反應(yīng)基團(tuán)分子小，不干擾細(xì)胞內(nèi)核酸正常的代謝過(guò)程。

(3)反應(yīng)速度快，可以快速標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的核酸。

(4)反應(yīng)中用350nm的紫外光照射減少對(duì)細(xì)胞及核酸的損傷。

(5)反應(yīng)過(guò)程中有熒光響應(yīng)，反應(yīng)完后不需要清洗步驟即可，核酸標(biāo)記成像不需要將細(xì)胞固定或核酸變性。

(6)反應(yīng)原料容易獲得，反應(yīng)產(chǎn)物合成簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單，易于普及。

(7)本發(fā)明中具有熒光響應(yīng)的dna光點(diǎn)擊探針，香豆素的ehomo值在-0.324hartree以下時(shí)香豆素的熒光可以被四氮唑淬滅，隨著香豆素的ehomo值逐漸降低，標(biāo)記核酸產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率會(huì)逐漸升高，同時(shí)香豆素四唑化合物的熒光量子產(chǎn)率也會(huì)有所增加。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明中細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針的合成路線(xiàn)圖與實(shí)施1中產(chǎn)物1～7的結(jié)構(gòu)圖，其中，圖a為合成路線(xiàn)圖；圖b為產(chǎn)物1～7的結(jié)構(gòu)圖。

圖2是實(shí)施例2中計(jì)算的香豆素衍生物的最高占據(jù)分子軌道能量值(ehomo)和熒光量子產(chǎn)率關(guān)系圖(圖中uv表示350nm紫外光)。

圖3是實(shí)施例3中香豆素四唑修飾的核酸和不同帶烯烴的化合物光點(diǎn)擊反應(yīng)后的熒光圖；其中，圖a為香豆素四唑修飾的核酸分別與異丙基丙烯酰胺和n-(2-羥乙基)馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜圖；圖b為在不同ph值的緩沖液中香豆素四唑修飾的核酸與n，n-二甲基乙基丙烯酰胺反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜圖。

圖4是實(shí)施例4中細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針ctz-so3和vdu光點(diǎn)擊反應(yīng)后的熒光圖和吸收?qǐng)D；其中，圖a為ctz-so3和vdu反應(yīng)前后的熒光光譜圖；圖b為ctz-so3和vdu反應(yīng)前后的吸收譜圖。

圖5是實(shí)施例4中光點(diǎn)擊速率數(shù)據(jù)分析圖。

圖6是實(shí)施例5中細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針ctz-so3標(biāo)記細(xì)胞核酸圖(圖中uv表示350nm紫外光)；其中圖a為ctz-so3標(biāo)記細(xì)胞dna的原理示意圖；圖b為ctz-so3標(biāo)記細(xì)胞dna的共聚焦顯微成像圖。

圖7是實(shí)施例6中驗(yàn)證活細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)熒光響應(yīng)標(biāo)記dna的光點(diǎn)擊探針ctz-so3具有細(xì)胞核靶向性的共聚焦顯微成像圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

1、實(shí)施例中所涉及的化學(xué)試劑均由阿拉丁購(gòu)買(mǎi)；所涉及的dna產(chǎn)品和dmem細(xì)胞培養(yǎng)液均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；細(xì)胞來(lái)源于atcc細(xì)胞庫(kù)；3k超濾管購(gòu)自頗爾公司；熒光光譜儀(ls55)，紫外吸收光譜儀(lambada35；perkinelmer，beaconsweld，bucks，uk)；激光共聚焦掃描顯微鏡(lsm510/con-focor2，carl-zeiss，jena，germany)。

2、實(shí)施例中4-甲基((2-(苯磺酰)亞肼基)甲基)苯甲酸鹽的合成參考：li,z.,qian,l.,li,l.,bernhammer,j.c.,huynh,h.v.,lee,j.s.,&yao,s.q.(2016).angewandtechemieinternationaledition,55(6),2002-2006。

實(shí)施例1一系列種基于光點(diǎn)擊反應(yīng)且具有熒光響應(yīng)的dna探針的制備

(1)將香豆素衍生物1′(1mmol)加入6ml的乙醇/水(etoh/h2o，體積比1:1)中然后加入1ml濃度為37％(v/v)的濃鹽酸攪拌，并在5℃的條件下慢慢加入到1.5mlnano2(1mmol)的水溶液中并攪拌；然后在-15℃的條件下將這些混合物逐滴的滴加到4-甲基((2-(苯磺酰)亞肼基)甲基)苯甲酸鹽((e)-methyl4-((2-(phenylsulfonyl)hydrazono)methyl)benzoate，0.9mmol)的干燥吡啶(8ml)中恢復(fù)室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，反應(yīng)完全后，反應(yīng)混合物用dcm(二氯甲烷)萃取，減壓蒸餾，然后用硅膠柱進(jìn)一步提純(洗脫劑為甲醇：二氯甲烷、體積比1:5；硅膠柱規(guī)格為300目)，得到純品產(chǎn)物(香豆素四唑化合物1)，如圖1所示；

(2)參考上述制備方法，分別用香豆素衍生物2′～7′替換上述香豆素衍生物1′，得到香豆素四唑化合物2～7(如圖1所示)；

上述香豆素衍生物1′～7′的結(jié)構(gòu)式如下所示：

產(chǎn)率及表征數(shù)據(jù)：

1:yield:52％.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.35(m,2h),8.23(m,4h),7.81(m,1h),6.39(d,j＝1.0hz,1h),3.96(s,3h),2.50(d,j＝1.5hz,3h)；

2:yield:50％.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.37(d,j＝4.0hz,2h),8.30(d,j＝8.0hz,2h),8.24(d,j＝8.0hz,2h),7.98(d,j＝8.0hz,1h),6.92(s,1h),3.98(s,3h)；ms(esi)calcdforc19h11f3n4o4,416.32[m⁺],found417.04.

3:yield:48％.¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ＝8.34(d,j＝8.0hz,2h),8.22(d,j＝8.0hz,2h),8.17(s,1h),8.01(d,j＝4.0hz,1h),7.94(d,j＝4.0hz,1h),6.64(s,1h),4.16(m,j＝4.0hz,2h),4.06(s,2h),3.92(s,3h),1.22(t,j＝6.0hz,3h)；ms(esi)calcdforc22h18n4o6,434.40[m⁺],found434.60.

4:yield:45％.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.36(d,j＝8.0hz,2h),8.22(d,j＝4.0hz,3h),8.16(d,j＝4.0hz,1h),7.87(d,j＝8.0hz,1h),7.39(d,j＝8.0hz,2h),7.34(d,j＝8.0hz,1h),7.27(d,j＝8.0hz,2h),6.24(s,1h),4.18(s,2h),3.97(s,3h)；ms(esi)calcdforc25h18n4o4,438.44[m⁺],found439.10.

5:yield:41％.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.36(d,j＝8.0hz,2h),8.24(d,j＝4.0hz,1h),8.22(d,j＝4.0hz,2h),8.19(d,j＝8.0hz,1h),7.83(d,j＝8.0hz,1h),7.62(d,j＝8.0hz,1h),7.55(t,j＝8.0hz,2h),7.46(d,j＝4.0hz,1h),6.18(s,1h),4.24(s,2h),3.97(s,3h)；ms(esi)calcdforc26h17f3n4o4,506.44[m^-],found505.16.

6:yield:42.％¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.36(d,j＝8.0hz,2h),8.23(d,j＝8.0hz,3h),8.16(d,j＝4.0hz,2h),7.87(d,j＝4.0hz,2h),7.18(d,j＝4.0hz,2h),6.92(d,j＝8.0hz,2h),4.12(s,2h),3.98(s,3h),3.82(s,3h)；ms(esi)calcdforc26h20n4o5,468.47[m⁺],found468.70.

7:yield:40％.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.36(d,j＝8.0hz,2h),8.22(d,j＝4.0hz,2h),8.20(d,j＝4.0hz,2h),7.95(d,j＝8.0hz,1h),6.89(d,j＝8.0hz,1h),6.84(d,j＝8.0hz,1h),6.72(d,j＝4.0hz,1h),6.14(s,1h),4.12(s,2h),3.97(s,3h)，3.81(s,3h)，3.75(s,3h)；ms(esi)calcdforc27h22n4o6,498.50[m^-],found497.10.

(2)ctz-so3的制備

將上述得到的香豆素四唑化合物1(362mg，1.0mmol)與氫氧化鋰(840mg，20.0mmol)在四氫呋喃、甲醇和水的混合液(體積比2:1:1)中加熱攪拌反應(yīng)，反應(yīng)終止后調(diào)節(jié)溶液的ph值至出現(xiàn)紫色沉淀；得到中間體8；稱(chēng)取中間體8(240mg，0.69mmol)放入25ml單頸燒瓶中，加入4ml的dmf(二甲基甲酰胺)使攪拌其溶解，得到中間體8溶液；稱(chēng)取nhs(208mg，1.38mmol)和edc(264mg，1.38mmol)放入25ml單頸燒瓶中，加入3mldmf攪拌使其溶解，得到nhs(n-羥基丁二酰亞胺)/edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)溶液；將中間體8溶液緩慢地滴入到nhs/edc溶液中，攪拌過(guò)夜(12h)，tlc(薄層色譜)跟蹤檢測(cè)反應(yīng)；反應(yīng)完全后，向反應(yīng)液中加入飽和食鹽水，沉淀析出；過(guò)濾收集沉淀，用水沖洗沉淀；將沉淀烘干，得到四唑化合物9。

將四唑化合物9(200mg，0.45mmol)和三乙胺(125μl，0.9mmol)加入到含有三乙胺的dcm(二氯甲烷)/dmso(二甲基亞砜)體積比為5:1的溶液中，然后再加牛磺酸(112.5mg，0.9mmol)的水溶液2ml，氮?dú)獗Ｗo(hù)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完全后減壓蒸餾，加甲醇稀釋沉淀過(guò)濾后，濾液用0.5m氫氧化鈉的甲醇溶液調(diào)至中性，然后加乙醚，過(guò)濾沉淀得到183mgctz-so3(結(jié)構(gòu)式如式iii所示)，產(chǎn)率78％，即為具有細(xì)胞核靶向性熒光響應(yīng)的dna探針。

其中，r為甲基。

數(shù)據(jù)表征：¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ＝8.70(t,j＝4.0hz,1h),8.28(d,j＝8.0hz,2h),8.17(t,j＝4.0hz,2h),8.09(d,j＝8.0hz,1h),8.02(d,j＝8.0hz,2h),6.56(s,1h),3.55(t,j＝4.0hz,2h),2.71(t,j＝4.0hz,2h),2.48(s,3h)；ms(esi)calcdforc20h16n5o6s,454.08[m^-],found453.94.

(3)ctz-el的制備

將三乙胺(138μl，1.0mmol)加入10ml的二氯甲烷中，然后加入上述制得的四唑化合物9(45mg，0.1mmol)，然后加入乙胺(65μl，1.0mmol)，混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌1小時(shí)，反應(yīng)完后減壓蒸餾，然后經(jīng)過(guò)硅膠柱提純得最終產(chǎn)物ctz-el，其結(jié)構(gòu)式如式iv所示：

其中，r為甲基。

數(shù)據(jù)表征：¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.33(d,j＝4.0hz,2h),8.19(d,j＝4.0hz,2h),7.93(t,j＝4.0hz,2h),7.81(d,j＝8.0hz,1h),6.40(s,1h),6.23(s,1h),3.53(m,2h),2.52(s,3h),1.29(t,j＝4.0hz,3h)；ms(esi)calcdforc20h17n5o3,375.13,[m⁺h⁺],found376.15.

實(shí)施例2：香豆素四唑1-7和標(biāo)記dna產(chǎn)物的光動(dòng)力學(xué)特性

將實(shí)施例1中得到的香豆素四唑化合物1-7分別與修飾烯烴的dna結(jié)構(gòu)如式iii反應(yīng)，香豆素四唑化合物1-7的濃度是100μm，修飾烯烴的dna的濃度是10μm，在350nm紫外燈下照射10分鐘，反應(yīng)完后用超濾管提純產(chǎn)物。測(cè)7種反應(yīng)產(chǎn)物的熒光并計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率，結(jié)果見(jiàn)表1。圖2是實(shí)施例1中計(jì)算的香豆素衍生物的ehomo(最高占據(jù)分子軌道能量值，根據(jù)wb97xd/6-311+g(d,p)方法計(jì)算，)和熒光量子產(chǎn)率關(guān)系圖。從表1和圖2中反應(yīng)前除香豆素四唑2外其它香豆素四唑幾乎沒(méi)有熒光，光點(diǎn)擊反應(yīng)后可以產(chǎn)生明顯熒光響應(yīng)。從表2中可以看出在計(jì)算的香豆素的ehomo值在-0.324hartree以下時(shí)香豆素的熒光可以被四氮唑淬滅，隨著香豆素的ehomo值逐漸降低，標(biāo)記核酸產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率會(huì)逐漸升高從0.129升至0.389，同時(shí)香豆素四唑化合物的熒光量子產(chǎn)率也會(huì)有所增加。

表1四唑化合物1-7和標(biāo)記dna產(chǎn)物的光學(xué)特性

實(shí)施例3：香豆素四唑標(biāo)記核酸后發(fā)光原理的探究

取香豆素四唑1作為實(shí)施案例中的樣品，將其活化后的四唑化合物9(方法同實(shí)施例1)，取一管5’端氨基標(biāo)記的核酸序列離心(12000rpm，20min)；將離心管蓋打開(kāi)，快速加入55μl0.1m硼酸鈉緩沖液(ph8.0)迅速蓋上管蓋；在漩渦儀上充分振蕩10min；加入30μl50mm的四唑化合物9(提前用二甲基亞砜配置成50mm的溶液)；將離心管纏上錫箔紙，放在離心管加上振蕩孵育14小時(shí)；往離心管中加入1ml預(yù)冷訂的無(wú)水乙醇，上下振蕩1min；然后放入超低溫冰箱靜置2小時(shí)；4℃、12000rpm離心20min；吸去上層澄清溶液，加入1ml預(yù)冷1ml預(yù)冷訂的無(wú)水乙醇，上下振蕩1min；然后放入超低溫冰箱靜置2小時(shí)；4℃、12000rpm離心20min；吸去上層澄清溶液，靜置30min，加55μl無(wú)菌水，充分振蕩5min；12000rpm離心10min；吸去上層澄清溶液放入離心管中-20℃保存，得到香豆素四唑修飾的核酸，結(jié)構(gòu)式如式vi所示；然后將香豆素四唑修飾的核酸分別與異丙基丙烯酰胺和n-(2-羥乙基)馬來(lái)酰亞胺在ph7.5的磷酸鹽緩沖液中在350nm紫外光下照射10分鐘，反應(yīng)后用超濾管提純，然后用熒光光譜儀測(cè)熒光，實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3a所示，從圖中可以看出，香豆素四唑修飾的核酸與異丙基丙烯酰胺反應(yīng)后產(chǎn)生熒光在490nm，n-(2-羥乙基)馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)產(chǎn)物熒光在450nm，這些發(fā)現(xiàn)表明反應(yīng)產(chǎn)物的淬滅效應(yīng)可能是由于烯烴化合物的光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移。為了驗(yàn)證這個(gè)觀(guān)點(diǎn)將香豆素四唑修飾的核酸與n，n-二甲基乙基丙烯酰胺在350nm的紫外光下分別在ph5.5～7.5的磷酸鹽緩沖液中反應(yīng)，反應(yīng)后用超濾管提純，然后用熒光光譜儀測(cè)測(cè)熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3b所示，從圖中可已看出隨著ph從5.5增加到7.5，在490nm處的熒光逐漸減弱并在450nm處出現(xiàn)一個(gè)新的發(fā)射峰。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果近一步證明帶有香豆素的四唑化合物的環(huán)化加成反應(yīng)產(chǎn)物的發(fā)射峰在450nm和490nm分別來(lái)自于香豆素和吡唑啉部分。更重要的是基于這些發(fā)現(xiàn)我們可以預(yù)測(cè)以及監(jiān)測(cè)一些烯烴化合物和帶香豆素四唑化合物反應(yīng)產(chǎn)物的發(fā)射峰。

實(shí)施例4：光點(diǎn)擊反應(yīng)速率的測(cè)定

5μm的vdu(5-乙烯基-2’-脫氧尿苷)分別和25μm、50μm的四唑化合物ctz-so3(實(shí)施例1制得)在350nm紫外燈下分別照射1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘后，用高效液相色譜(hplc)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，并計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)率，再通過(guò)公式計(jì)算反應(yīng)速度，其中，

公式是；ln(vdu/(vdu-[product]t))＝kobserved*t；kobserved＝kcycloaddition*[ctz-so3]

式中：product表示產(chǎn)物濃度；kobserved表示實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到的反應(yīng)速率；kcycloaddition表示實(shí)際點(diǎn)擊反應(yīng)速率；t表示時(shí)間；vdu表示vdu的濃度；ctz-so3表示ctz-so3的濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，圖4是具有細(xì)胞核靶向的四唑香豆素和vdu光點(diǎn)擊反應(yīng)后的熒光和吸收?qǐng)D；從圖4a中可以看出光照后450nm處熒光明顯增強(qiáng)，圖4b中光照后330nm處吸收降低395nm處吸收增強(qiáng)，表明產(chǎn)物生成。

光點(diǎn)擊反應(yīng)符合準(zhǔn)一階反應(yīng)，在vdu相同濃度，四唑化合物不同濃度的條件下用350nm紫外燈照射不同的時(shí)間，然后用高效液相色譜(hplc)分析生成產(chǎn)物的濃度及產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，表2表示反應(yīng)產(chǎn)物和時(shí)間的關(guān)系，從表2中可以看出隨著光照時(shí)間的增加生成的產(chǎn)物不斷增加，并且香豆素四唑濃度大的組產(chǎn)物生成的速度比濃度小的組要快。數(shù)據(jù)分析如圖5所示，圖5是表中的數(shù)據(jù)分析后線(xiàn)性擬合的結(jié)果，通過(guò)公式計(jì)算光點(diǎn)擊反應(yīng)速率為k(5.0equiv.)＝14.8m^-1s^-1；k(10equiv.)＝19.8m^-1s^-1，相比反電子需求的diels-alde的vdu和四唑化合物連接反應(yīng)的速率(0.02m^-1s^-1)明顯增加。

擬合的線(xiàn)性部分的結(jié)果：kobserved，5.0eq＝3.71205e-4；kobserved,10eq＝9.89344e-4.

根據(jù)公式計(jì)算的反應(yīng)速度是:k(5.0equiv.)＝14.8m^-1s^-1；k(10equiv.)＝19.8m^-1s^-1.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本文中光點(diǎn)擊速率最快可達(dá)到20m^-1s^-1，表明可以通過(guò)光點(diǎn)擊反應(yīng)可以快速的代謝標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的dna，這種光誘導(dǎo)的生物正交反應(yīng)區(qū)別于其他正交反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)是可以快速追蹤細(xì)胞內(nèi)dna或rna的合成和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

表2光點(diǎn)擊反應(yīng)速率條件

實(shí)施例5細(xì)胞內(nèi)代謝標(biāo)記dna

(一)活細(xì)胞內(nèi)的核酸代謝標(biāo)記

將a549細(xì)胞傳代到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入30μm的vdu，對(duì)照組加入同樣體積的pbs(ph7.4)培養(yǎng)16小時(shí)，然后換成新的dmem培養(yǎng)液孵育4小時(shí)后都加入10μm的香豆素四唑ctz-so3(實(shí)施例1制得)孵育4小時(shí)，然后加入新的dmem細(xì)胞培養(yǎng)液孵育2小時(shí)后，分別用350nm紫外光(uv)照射10分鐘后，激光共聚焦顯微鏡成像。

(二)固定細(xì)胞內(nèi)的核酸代謝標(biāo)記

將a549細(xì)胞傳代到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入30μm的vdu，對(duì)照組加入同樣體積的pbs(ph7.4)培養(yǎng)16小時(shí)，然后換成新的dmem培養(yǎng)液孵育4小時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，用3.7％(v/v)多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10分鐘后用0.2％(v/v)tritonx-100通透細(xì)胞，然后分別加入10μm的香豆素四唑ctz-so3避光孵育2小時(shí)，用350nm紫外燈照射10分鐘，用激光共聚焦顯微鏡成像。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如實(shí)驗(yàn)圖6所示，從圖中可以看出活細(xì)胞中加vdu孵育的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生明顯的熒光信號(hào)，沒(méi)有加vdu孵育的對(duì)照組中的熒光非常微弱。固定細(xì)胞中加vdu孵育的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生明顯的熒光信號(hào)，活細(xì)胞標(biāo)記和固定細(xì)胞標(biāo)記結(jié)果無(wú)明顯差別，并且重要的是在活細(xì)胞標(biāo)記dna實(shí)驗(yàn)過(guò)程是在免洗的條件下，不需要使dna變性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們成功的在活細(xì)胞中基于光點(diǎn)擊反應(yīng)熒光響應(yīng)的標(biāo)記細(xì)胞dna。

實(shí)施例6探針具有細(xì)胞核靶向性

香豆素四唑ctz-so3具有細(xì)胞核靶向性的驗(yàn)證：

將a549細(xì)胞傳代到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入100μm的香豆素四唑ctz-so3，對(duì)照組加入100μm的香豆素四唑ctz-el(實(shí)施例1制得)，孵育過(guò)夜，再加入新的培養(yǎng)液孵育2h后，分別用350nm紫外光照射10分鐘后，激光共聚焦顯微鏡成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，從圖中可以看出實(shí)驗(yàn)組熒光部位主要集中在細(xì)胞核，而加入ctz-el的對(duì)照組的熒光部位主要集中在細(xì)胞質(zhì)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明帶陰離子的香豆素四唑ctz-so3具有良好的細(xì)胞核靶向性。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。