本發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞的定位與檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種pH和乏氧雙響應(yīng)定位腫瘤細(xì)胞的萘亞胺類比率熒光探針，簡單來說，就是一種用于檢測氫離子和硝基還原酶的萘亞胺類比率熒光探針。

背景技術(shù)：

據(jù)相關(guān)組織報(bào)道，2004年全球有約800萬人死于癌癥，2013年有約900萬人死于癌癥，預(yù)計(jì)到2030年死于癌癥的人數(shù)將超過1300萬，顯然癌癥已經(jīng)成為威脅人類健康重大疾病。研究人員早在1955年提出了腫瘤中存在乏氧區(qū)域的假說，后續(xù)大量實(shí)驗(yàn)表明了腫瘤細(xì)胞的氧濃度比正常細(xì)胞低。由于腫瘤乏氧與腫瘤細(xì)胞的惡性表型，癌癥治療的抗性，以及癌癥病人的死亡率緊密相關(guān)，所以對于癌癥治療和診斷并發(fā)展有效的乏氧檢測方法是刻不容緩的。乏氧是腫瘤微環(huán)境的一個(gè)重要特征，檢測乏氧可以預(yù)測并治療反應(yīng)。目前對于腫瘤乏氧的檢測主要有以下方法：有組織形態(tài)分析法、氧電極分析法、DNA斷裂分析法、核磁共振分析法、核醫(yī)學(xué)檢測方法和乏氧探針成像法。由于乏氧探針成像分析法與前面四中方法相比具有靈敏度度高、方法簡單的特點(diǎn)，所以其在乏氧檢測方法中是一種具有很大優(yōu)勢。在乏氧細(xì)胞內(nèi)乏氧探針可以被反應(yīng)還原，生成或者釋放熒光物質(zhì)，達(dá)到檢測乏氧的目的。

細(xì)胞內(nèi)的pH是細(xì)胞很重要的參數(shù)，與細(xì)胞內(nèi)受體介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)、酶活性、細(xì)胞增殖和凋亡、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生命過程息息相關(guān)。在正常的生理?xiàng)l件下，人體細(xì)胞內(nèi)的H⁺的濃度為40nmol/L(pH7.4)，僅在很小的范圍內(nèi)有輕微的變化(7.35-7.45)。研究表明，不正常的pH值變動(dòng)，通常與細(xì)胞功能紊亂和一些疾病相關(guān)，如腎性中毒、阿爾茲海默癥、肺氣腫、炎癥和癌癥等。腫瘤細(xì)胞的pH范圍約在5.8～7.7，比正常細(xì)胞中低0.5單位左右。研究表明腫瘤中酸性環(huán)境與離子轉(zhuǎn)運(yùn)體Na⁺/H⁺交換體(NHE)和H⁺乳酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)等過程有關(guān)。因此，腫瘤細(xì)胞與正常組織的酸性不同，可作為切入點(diǎn)，用于藥物的靶向設(shè)計(jì)和腫瘤診斷。目前可用于檢測pH的方法主要有：微電極法、核磁共振法、吸收光譜法以及熒光光譜法等。其中，熒光技術(shù)具有高靈敏性、非損傷性、能原位直接檢測等優(yōu)點(diǎn)，使得該技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境的pH檢測有著更廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，研究人員為了定位機(jī)體中的腫瘤細(xì)胞基本上是通過其細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)的乏氧和pH呈現(xiàn)弱酸性進(jìn)行的。然而，已報(bào)道的熒光探針中大部分的熒光探針只能單獨(dú)對乏氧環(huán)境進(jìn)行檢測或者對單獨(dú)pH進(jìn)行檢測，通過探針的熒光變化定位腫瘤細(xì)胞。這樣檢測出來的結(jié)果對于定位腫瘤細(xì)胞的準(zhǔn)確性有一定的局限性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對上述問題，設(shè)計(jì)一種同時(shí)響應(yīng)腫瘤細(xì)胞中乏氧環(huán)境和弱酸性的小分子探針，是以萘酰亞胺為發(fā)光基團(tuán)，引入嗎啉和含硝基的基團(tuán)，能同時(shí)響應(yīng)腫瘤細(xì)胞中乏氧環(huán)境和弱酸性。由于靈敏度較高，因此可以用于定位體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：本發(fā)明采用萘酰亞胺為母體，引入嗎啉和含有硝基的基團(tuán)分別作為氫離子和硝基還原酶的活性中心，以便該探針更好地在生物體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞成像。

本發(fā)明的第一方面，提供一種pH和乏氧雙響應(yīng)定位腫瘤細(xì)胞的萘酰亞胺類比率熒光探針，其結(jié)構(gòu)通式I如下所示：

其中，R₁，R₂，R₃為C₁～C₂₀的烷基或者氫；

R₄為嗎啉類、乙二胺、N-甲基乙二胺、N,N-二甲基乙二胺、哌嗪，吡啶等可以檢測氫離子的基團(tuán)且所連的碳鏈長度n≥1；

R₅為對硝基苯甲醇、5-硝基呋喃、5-硝基噻吩、硝基咪唑及這些化合物的衍生物。

所述的烷基包括直鏈或帶有支鏈的鏈狀烷基。

優(yōu)選的，所述的R₁為C₁～C₄的烷基。最優(yōu)選的，所述的R₁為C₄的烷基。

優(yōu)選的，所述的R₂和R₃為氫。

優(yōu)選的，所述的R₄所接的碳鏈長度為2(即n＝1時(shí))，R₄為嗎啉。

優(yōu)選的，所述的R₅為對硝基苯甲氧基。

優(yōu)選的，所述的R₁為C₄的烷基，R₂和R₃為氫，R₄所接的碳鏈長度為2(即n＝1時(shí))，R₄為嗎啉，R5為對硝基苯甲醇，此時(shí)所述的熒光探針為化合物3，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

將通式Ⅰ的熒光探針置于一定的pH和乏氧條件下，通式Ⅰ與硝基還原酶和氫離子反應(yīng)生成通式Ⅱ，結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致紫外吸收以及熒光信號(hào)的變化，因此所述的熒光探針可以檢測硝基還原酶和pH。

通式Ⅰ的熒光探針在一定pH的0.01M PBS緩沖溶液中加入硝基還原酶和NADH，37℃下，反應(yīng)一定時(shí)間，會(huì)生成通式Ⅱ所代表的化合物，其顏色會(huì)變黃。

通式Ⅱ結(jié)構(gòu)如下所示：

反應(yīng)過程如下所示：

本發(fā)明的第二方面，提供上述通式Ⅰ的pH和乏氧雙響應(yīng)定位腫瘤細(xì)胞的萘酰亞胺類比率熒光探針在檢測氫離子和硝基還原酶中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三方面，提供上述通式Ⅰ的pH和乏氧雙響應(yīng)定位腫瘤細(xì)胞的萘酰亞胺類比率熒光探針在制備用于腫瘤細(xì)胞的定位與檢測的試劑盒中的應(yīng)用。所述的熒光探針能很好地響應(yīng)pH和硝基還原酶，因此可以定位生物體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，其在癌癥的治療和檢測方面，有著非常廣闊地前景。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明所述的小分子熒光探針以萘酰亞胺為母體引入硝基芐基和嗎啉活性基團(tuán)分別用于檢測乏氧和pH。通過實(shí)驗(yàn)證明所述的探針在酸性下檢測硝基還原酶的效果要遠(yuǎn)好于在中性條件下(即正常的生理?xiàng)l件下)。因此該探針消除了常規(guī)的乏氧探針只能檢測硝基還原酶的局限性，大大地提高了腫瘤細(xì)胞成像的準(zhǔn)確性。所述的小分子探針能很好地響應(yīng)pH和硝基還原酶，因此可以定位生物體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，其在癌癥的治療和檢測方面提供了一種新的思路，有著非常廣闊地前景。

附圖說明

圖1.化合物2和化合物3紫外-可見吸收光譜。

圖2.化合物2的pH滴定的熒光強(qiáng)度變化，其中左圖為熒光光譜，右圖為滴定曲線。

圖3.pH 7.0下化合物3與硝基還原酶反應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化，其中左圖為熒光光譜，右圖為熒光變化時(shí)間曲線。

圖4.pH 6.0下化合物3與硝基還原酶反應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化，其中左圖為熒光光譜，右圖為熒光變化時(shí)間曲線。

圖5.pH 5.0下化合物3與硝基還原酶反應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化，其中左圖為熒光光譜，右圖為熒光變化時(shí)間曲線。

圖6.化合物3在pH 5.0、6.0和7.0下與硝基還原酶反應(yīng)的熒光變化時(shí)間曲線對比圖。

圖7.化合物2的核磁共振氫譜圖。

圖8.化合物3的核磁共振氫譜圖。

圖9.化合物3的核磁共振碳譜圖。

圖10.化合物3的質(zhì)譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

實(shí)施例1(探針的合成)

反應(yīng)路線如下所示：

1.1合成化合物1：

將5.54g的A和40mL的正丁胺放入250mL的燒瓶中加入100mL無水乙醇，120℃，冷凝回流3h。冷卻至室溫，抽濾得8.0g白色固體。

1.2合成化合物2：

將2.0g化合物1和3.2mL的N-(2-氨基乙基)嗎啉加入到100mL的燒瓶中并加入0.01mg的五水硫酸銅和40mL乙氧基乙醇。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，120℃回流8h，旋干，用柱層析方法提純(DCM：甲醇＝10:1)得化1.3g黃色固體。

化合物2的核磁共振氫譜見圖7。

1.3合成化合物3：

將130mgNaH溶于2mLTHF中，氬氣保護(hù)冷卻至0℃，將50mg化合物2溶于3mLTHF中并逐滴加入到反應(yīng)液中反應(yīng)3h。將氯甲酸對硝基芐酯溶于2mLTHF中并逐滴加入到反應(yīng)液中反應(yīng)2h。40℃下反應(yīng)12h。加入10mL去離子水，萃取，用柱層析方法提純(EA：DCM＝13:1)。得到10mg淡黃色固體?；衔?的核磁共振氫譜見圖8。化合物3的核磁共振碳譜見圖9?；衔?的質(zhì)譜見圖10。

實(shí)施例2(化合物2與化合物3的紫外-可見吸收光譜)

配置濃度為1mM化合物2和化合物3的DMSO溶液。取3mL0.01M PBS緩沖溶液加入30μLDMSO溶液做空白對照。同樣取相同的PBS溶液3mL分別加入配置好的化合物2和化合物3溶液，分別測試得到圖1化合物2和化合物3的紫外吸收曲線。由圖1可知，化合物2和化合物3的等吸收點(diǎn)為389nm。

實(shí)施例3(化合物2的pH滴定)

從圖1中獲取化合物2的激發(fā)波長分別為449nm。取3mL 0.01M PBS(pH7.4)緩沖溶液加入分別加入30μL1mM化合物2和化合物3的溶液用0.1M HCl和NaOH溶液滴定。分別收集化合物2在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0下的熒光強(qiáng)度?；衔?測得結(jié)果見圖2。由圖2可知，化合物2的滴定躍遷為4.0～7.0。

實(shí)施例4(化合物3在pH 7.0下與硝基還原酶反應(yīng)的熒光變化)

設(shè)置儀器的激發(fā)波長為389nm，取3mL 0.01M PBS(pH 7.0)緩沖溶液加入30μL化合物3的溶液，30μL的NTR溶液，20μL NADH溶液。使溶液中含有化合物3 10μM、NTR 10μg/mL、NADH 500μM和1％DMSO。將反應(yīng)液置于37℃條件下0-6min每30s測其熒光強(qiáng)度。測得結(jié)果見圖3。由圖3可知，化合物3可以和硝基還原酶反應(yīng)故能用于檢測細(xì)胞中的乏氧條件。

實(shí)施例5(化合物3在pH 6.0下與硝基還原酶反應(yīng)的熒光變化)

設(shè)置儀器的激發(fā)波長為389nm，取3mL 0.01M PBS(pH 6.0)緩沖溶液加入30μL化合物3的溶液，30μL的NTR溶液，20μL NADH溶液。使溶液中含有化合物3 10μM、NTR 10μg/mL、NADH 500μM和1％DMSO。將反應(yīng)液置于37℃條件下0-6min每30s測其熒光強(qiáng)度。測得結(jié)果見圖4。由圖4可知，化合物3可以在pH 6.0的條件下和硝基還原酶反應(yīng)。

實(shí)施例6(化合物3在pH 5.0下與硝基還原酶反應(yīng)的熒光變化)

設(shè)置儀器的激發(fā)波長為389nm，取3mL 0.01M PBS(pH 6.0)緩沖溶液加入30μL化合物3的溶液，30μL的NTR溶液，20μL NADH溶液。使溶液中化合物3的濃度為10μM、NTR 10μg/mL、NADH 500μM和1％DMSO。將反應(yīng)液置于37℃條件下0-6min每30s測其熒光強(qiáng)度。測得結(jié)果見圖5。由圖5可知，化合物3可以在pH 6.0的條件下和硝基還原酶反應(yīng)。

實(shí)施例7(化合物3在pH 5.0、6.0和7.0下與硝基還原酶反應(yīng)的熒光變化對比)

將化合物3在pH 5.0、6.0和7.0下與硝基還原酶反應(yīng)的熒光變化時(shí)間曲線對比圖。見圖6。由圖6可知，化合物3在不同的pH條件下比率熒光強(qiáng)度變化的不同且隨著酸性的增強(qiáng)，該化合物的比率熒光強(qiáng)度變化在增大。故該化合物可以用于定位腫瘤細(xì)胞。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。