本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及波羅蜜中的一種異戊烯基黃酮類化合物在制備治療炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中性粒細胞（pmns）是人體抵御外來病原菌入侵的第一道防線。當(dāng)pmns識別出受體分泌的小肽或細菌與血清中抗體形成的復(fù)合體后，經(jīng)膜上受體介導(dǎo)引起細胞的激活，迅速產(chǎn)生大量的超氧陰離子(o2^?-)。o2^?-在超氧化物歧化酶和髓過氧化物酶的催化下發(fā)生了一系列自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生了各種活性氧（ros），包括羥自由基（ho·）、過氧化氫（h2o2）以及次氯酸（hocl）。這些ros可以高效的消滅入侵的病原微生物，這種現(xiàn)象稱為呼吸爆發(fā)。在正常生理條件下，pmns的呼吸爆發(fā)被精確調(diào)控，形成了機體最為有效的病原菌抵御機制。然而，ros在殺死入侵細菌的同時，也可對周圍正常組織造成損傷，造成阻塞微循環(huán)、損傷血管內(nèi)皮細胞和血管外組織細胞、釋放和促進釋放炎癥介質(zhì)，成為“破壞者”。如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人中，中性粒細胞被不正當(dāng)?shù)募せ?，產(chǎn)生的大量ros造成關(guān)節(jié)軟骨組織的腐蝕。又如膿毒血癥或外科手術(shù)損傷、創(chuàng)傷、燒傷、缺血再灌注損傷中，過度激活的pmns會引起組織損傷，嚴重時導(dǎo)致失控性炎性反應(yīng)，包括代償性抗炎反應(yīng)綜合征(cars)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(sirs)等。因此，發(fā)現(xiàn)抑制pmns呼吸爆發(fā)的物質(zhì)對于治療pmns呼吸爆發(fā)所致的各種氧化性損傷具有重要意義。

波羅蜜artocarpusheterophyllus又名“樹波羅”、“木波羅”、“牛肚子果”等，為?？撇_蜜屬植物，在我國華南各省及臺灣地區(qū)有廣泛栽培。波羅蜜在民間有多種藥用用途，如治療貧血、哮喘和皮膚病、緩解抽搐和潰瘍、鎮(zhèn)靜、抗梅毒、驅(qū)蟲等?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明，波羅蜜的根富含大量的異戊烯基酚性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、酪氨酸酶抑制、磷脂酶抑制、組織蛋白酶k抑制等活性。在本課題組的的前期活性篩選中，波羅蜜根的95%乙醇提取物對大鼠pmns呼吸爆發(fā)表現(xiàn)了較強的抑制活性。因此，本發(fā)明對該活性提取物進行深入的研究，從中獲得了一個活性異戊烯基黃酮，為一個新化合物，命名為artoheteroidc。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供具有抑制pmns呼吸爆發(fā)活性的物質(zhì)，為臨床上與pmns呼吸爆發(fā)相關(guān)炎癥的治療提供藥物。發(fā)明具體涉及波羅蜜根中提取的一種異戊烯基黃酮，具有如下所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)：

。

該化合物是未見文獻報道的新化合物，命名為artoheteroidc。

本發(fā)明的進一步目的是提供上述化合物在制備抗炎（與pmns呼吸爆發(fā)相關(guān)炎癥）藥物中的新用途。

本發(fā)明所述化合物通過下述方法制備：

波羅蜜根藥材（17kg），用95%乙醇滲漏提取，提取液減壓濃縮得浸膏1.5kg。浸膏以水混懸，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并分別濃縮至干。取氯仿萃取部位浸膏532g，進行大孔樹脂柱色譜（柱規(guī)格：15*55cm，5.3kg），用乙醇-水梯度洗脫，得10個流分frs.h1-h10。流份h5(10.0g)上凝膠sephadexlh-20柱，甲醇洗脫得10個流份：frs.h5l1-h5l10。流份h5l5(1.5g)上反向ods柱，甲醇-水(2:8→10:0,v/v)洗脫，得4個流分h5l5o1-h5l5o4。流分h5l5o4(483.0mg)繼續(xù)上sephadexlh-20凝膠柱，氯仿-甲醇(1:1,v/v)洗脫，得7個流分frs.h5l5o4l1-h5l5o4l7。其中的h5l5o4l1(36.0mg)經(jīng)過制備型hplc(ch3cn-h2o,11:9,v/v)分離獲得了本發(fā)明所述的化合物artoheteroidc(4.6mg,tr35min)。

經(jīng)過活性測試表明，本發(fā)明所述的化合物artoheteroidc對佛波豆蔻酸乙酯(pma)刺激的大鼠中性粒細胞爆發(fā)具有顯著的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度(ic50)為7.5m。

本發(fā)明所述的化合物可進一步制備成治療pmns呼吸爆發(fā)失控所致炎癥的藥物。

附圖說明

圖1artoheteroidc的的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖2為本發(fā)明所述化合物artoheteroidc的核磁共振氫譜(¹hnmr)。

圖3為本發(fā)明所述化合物artoheteroidc的核磁共振碳譜(¹³hnmr)。

圖4為本發(fā)明所述化合物artoheteroidc的主要hmbc(h→c)相關(guān)。

圖5為本發(fā)明所述化合物artoheteroidc的實測ecd及其計算機模擬ecd譜。

具體實施方式

通過以下給出的具體實施例，可以進一步清楚地了解本發(fā)明。

實施例1波羅蜜中異戊烯基黃酮artoheteroidc的制備

波羅蜜根藥材（17kg），用95%乙醇滲漏提取，提取液減壓濃縮得浸膏1.5kg。浸膏以水混懸，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并分別濃縮至干。取氯仿萃取部位浸膏532g，進行大孔樹脂柱色譜（柱規(guī)格：15*55cm，5.3kg），用乙醇-水梯度洗脫，得10個流分frs.h1-h10。流份h5(10.0g)上凝膠sephadexlh-20柱，甲醇洗脫得10個流份：frs.h5l1-h5l10。流份h5l5(1.5g)上反向ods柱，甲醇-水(2:8→10:0,v/v)洗脫，得4個流分h5l5o1-h5l5o4。流分h5l5o4(483.0mg)繼續(xù)上sephadexlh-20凝膠柱，氯仿-甲醇(1:1,v/v)洗脫，得7個流分frs.h5l5o4l1-h5l5o4l7。其中的h5l5o4l1(36.0mg)經(jīng)過制備型hplc(ch3cn-h2o,11:9,v/v)分離獲得了本發(fā)明所述的化合物artoheteroidc(4.6mg,tr35min)。

實施例2波羅蜜中異戊烯基黃酮artoheteroidc的結(jié)構(gòu)鑒定

artoheteroidc,一種黃色無定型粉末，hr-esi-ms給出準(zhǔn)分子離子峰m/z381.0979（[m-h]^-，c21h17o7，計算值:381.0980），確定其分子式為c21h18o7。紅外光譜(νmax3430,2974,1651,1612,1504,1467,1356cm^-1)和紫外光譜(λmax263,316,378nm)顯示該化合物具有異戊烯基黃酮類化合物的典型的吸收特性。artoheteroidc的¹hnmr譜（600mhz,dimethylsulfoxide-d6）顯示了以下質(zhì)子信號：一個氫鍵締合的羥基δh12.33(1h,s,oh-5)；一對間位耦合的芳香質(zhì)子δh6.33(1h,d,j=1.8hz,h-8)and6.13(1h,d,j=1.8hz,h-6)；一個孤立的芳香質(zhì)子δh6.38(h-3′)；一個甲氧基δh3.77(3h,s,meo-4′)；兩個甲基δh1.57(3h,s,h3-14)and1.23(3h,s,h3-15)和一個abx型自旋耦合體系δh2.60(lh,t,j=15.1hz,ha-11),3.10(lh,dd,j=15.1,7.0,hz,hb-11),and3.34(lh,dd,j=15.1,7.0hz,h-12)。artoheteroidc的氫譜與已知化合物artoninl很相似，主要的不同是artoninl有兩個甲氧基而artoheteroidc只有一個甲氧基。artoheteroidc的¹³cnmr和dept譜出現(xiàn)了21個碳信號，來自一個黃酮骨架（15碳）、一個異戊烯基（5碳）和一個甲氧基。通過hsqcandhmbc二位核磁共振實驗，我們對artoheteroidc的所有h和c信號進行了全歸屬(表1).質(zhì)子信號δh3.77(meo-4′)和碳信號δc147.7的hmbc說明甲氧基取代發(fā)生在c-4′位。異戊烯基取代發(fā)生在c-3位，并與b環(huán)的c-5′氧化環(huán)合形成二氫呋喃環(huán)。這可以通過以下hmbc相關(guān)(圖4)所證實：ha-11/hb-11與c-2(δc159.9),c-3(δc111.7),c-4(δc179.6),c-6′(δc131.8),c-12(δc45.9),c-13(δc92.6)；h-12與c-1′(δc104.3),c-5′(δc136.7),c-6′,c-11(δc19.4),c-13,c-14(δc27.8),andc-15(δc22.4)。通過比較artoheteroidc的實測ecd和計算機模擬的12r和12s兩種構(gòu)型的ecd，發(fā)現(xiàn)artoheteroidc與12r的構(gòu)型擬合很好（圖5），故確定c-12的絕對構(gòu)型為r。于是，artoheteroidc的結(jié)構(gòu)被確定為圖1所示。

表1本發(fā)明所述化合物artoheteroidc的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)^a

^abrukeravance600核磁共振儀;化學(xué)位移值(ppm)通過(cd3)2so校正(h2.50;c39.52).

實施例3artoheteroidc對大鼠pmns的細胞毒性評價實驗

參照標(biāo)準(zhǔn)臺盼藍排除法的相關(guān)文獻測定artoheteroidc對pmns的細胞毒性。37°c下，1ml的pmns細胞懸液（1×10⁶）（2%fcs-hbss）與10μldmso或artoheteroidc（終濃度范圍從1到1000μm）一起孵育30分鐘。每份樣本中加入112μl0.4%的臺盼藍染液，高倍顯微鏡下，通過計數(shù)100個細胞吸收臺盼藍的情況來計算樣品對pmns的細胞毒性作用。結(jié)果表明，artoheteroidc在180m以上才開始表現(xiàn)對pmns的毒性。

實施例4artoheteroidc對大鼠pmns呼吸爆發(fā)抑制率的測定

取sd大鼠，雌雄不限，眼眶取血，1%肝素鈉抗凝，葡聚糖t-500沉降紅細胞，淋巴細胞分離液分離，低滲除去殘留紅細胞，用臺盼藍排斥法檢測大鼠pmn純度和活度(均>95%)，再用細胞稀釋液調(diào)整細胞濃度為2×10⁶個·ml^-1。4℃保存，在12h內(nèi)使用，pmns活力恒定。pmns在受到外源性刺激劑-佛波豆蔻酸乙酯(佛波醇)（pma）激活后發(fā)生呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量的活性氧自由基，自由基被發(fā)光劑魯米諾捕獲產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光(chemiluminesence，cl)，pmn-cl強度與pmns的細胞數(shù)量及pmns的呼吸爆發(fā)和吞噬功能正相關(guān)。取1mlpmns細胞稀釋液于發(fā)光杯中，向其中加入200μl魯米諾工作液，置于超微弱發(fā)光測量儀中孵育10min(參數(shù)設(shè)定：發(fā)光池溫度37℃，電壓1000v，最長檢測時間1800s)，記錄自發(fā)光過程(計數(shù)時間間隔5s)。然后加入10μl樣品溶液（以10μldmso為空白對照）繼續(xù)測定5min，加入8g·ml^-1pma刺激劑10μl，繼續(xù)測定15min,記錄測定結(jié)果。pmn-cl強度以發(fā)光記數(shù)峰高表示。按公式(1)計算pmn-cl抑制率。

pmn-cl抑制率(%)=×100%

以pmn-cl抑制率為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，建立量效關(guān)系曲線，通過量效曲線可求算出發(fā)光抑制率為50%時樣品的濃度(即ic50值)。以維生素c(vc)作為陽性對照。結(jié)果表明，artoheteroidc對pma刺激的大鼠pmns爆發(fā)具有強烈抑制作用，ic50為7.5m，其活性優(yōu)于陽性對照vc（ic50=24.3m）。