本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種A40926的發(fā)酵工藝，特別是涉及一種基于代謝參數(shù)OUR和CER補(bǔ)水、補(bǔ)糖發(fā)酵生產(chǎn)A40926的方法。
背景技術(shù)：
隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，尤其是耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)的感染已成為臨床抗感染治療失敗的主要原因之一。隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)菌株的增加、替考拉寧與萬(wàn)古霉素存在部分交叉耐藥以及一些腸球菌具有中度或高度傳遞性耐藥性等情況的發(fā)現(xiàn)，尋找新的糖肽類抗生素已成為臨床治療迫切的需要(Jovetic,S.,et al.,β-Lactam and glycopeptide antibiotics:first and last line of defense？Trends in Biotechnology,2010.28(12):p.596-603.)。
達(dá)巴萬(wàn)星(Dalbavancin)是一種具有抗多重耐藥菌的新型半合成糖肽類抗生素，與萬(wàn)古霉素及替考拉寧相比，具有更廣譜、更強(qiáng)的抗菌活性和更優(yōu)良的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)(Billeter,M.,et al.,Dalbavancin:A novel once-weekly lipoglycopeptide antibiotic.Clinical Infectious Diseases,2008.46(4):p.577-583；Colabella,J.andL.Chagan,Dalbavancin(zeven),a novel glycopeptide for resistant gram-positive organisms.P&T:a peer-reviewed journal for formulary management,2008.33(1):p.42-57；王靖雯,吳寅,and文愛(ài)東,新型糖肽類抗生素——達(dá)巴萬(wàn)星.中國(guó)感染控制雜志,2011.10(2):p.156-157.)。
2014年5月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)達(dá)巴萬(wàn)星(DalvanceTM，Durata Therapeutics公司)用于治療成人皮膚及軟組織感染，成為第一個(gè)FDA批準(zhǔn)的一周一次、給藥兩周的靜脈注射抗生素，為臨床治療革蘭氏陽(yáng)性菌感染提供了新的選擇。湯森路透預(yù)計(jì)未來(lái)幾年內(nèi)該藥物市場(chǎng)銷售額將呈直線上升趨勢(shì)，2019年銷售額將達(dá)到4.5億美元。
達(dá)巴萬(wàn)星合成的關(guān)鍵中間體A40926是由野野村放線菌(Nonomuraea sp.)ATCC39727發(fā)酵產(chǎn)生的天然糖肽類抗生素，其主要由結(jié)構(gòu)相近的PA、PB、A、B0和B1五種成分組成，其中B0是其主要成分，這五種成分具有相同的母核結(jié)構(gòu)(沈曉放，陳少欣,半合成糖肽類抗生素達(dá)巴萬(wàn)星前體A40926的生物合成.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2010.41(2):p.141-147.)。
目前，關(guān)于A40926發(fā)酵工藝研究和報(bào)道較少。產(chǎn)品主要由意大利的Vicuron Pharmaceuticals制藥公司通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)，其報(bào)道的最高發(fā)酵單位為128mg/L。Beltrametti F.等人(Valine influences production and complex composition of glycopeptide antibiotic A40926 in fermentations of Nonomuraea sp.ATCC 39727，The Journal of Antibiotics，2004，57(1)：33～44)研究發(fā)現(xiàn)L-纈氨酸是A40926B0組份的分支酰基鏈的潛在前體，在T/2培養(yǎng)基中添加0.3％L-纈氨酸，在搖瓶實(shí)驗(yàn)中獲得了最高220U/mL總產(chǎn)量，但報(bào)道僅限于搖瓶產(chǎn)量。較優(yōu)的發(fā)酵工藝是獲得高產(chǎn)量達(dá)巴萬(wàn)星前體的關(guān)鍵因素之一，中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN103060405A公開(kāi)了一種A40926的發(fā)酵工藝，該技術(shù)方案報(bào)道通過(guò)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基可達(dá)到720mg/L的總產(chǎn)量。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服了現(xiàn)有技術(shù)中A40926的發(fā)酵工藝的發(fā)酵產(chǎn)率低，無(wú)法達(dá)到生產(chǎn)化要求的缺陷，提供了一種操作簡(jiǎn)單、成本低、能夠大規(guī)模生產(chǎn)A40926的方法，具體涉及一種發(fā)酵法生產(chǎn)A40926的方法。
本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
一種發(fā)酵法生產(chǎn)A40926的方法，將經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)所得種子液接種至裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，發(fā)酵過(guò)程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)OUR(攝氧率)、CER(二氧化碳生成率)和Kla(體積氧傳遞系數(shù))，發(fā)酵中后期60～80h，當(dāng)CER、OUR、Kla同步下降時(shí)，開(kāi)始流加補(bǔ)水和糖溶液；發(fā)酵進(jìn)行96-144h放罐。
發(fā)酵中后期60～80h，CER、OUR、Kla同步下降，一是由于菌絲量大并結(jié)團(tuán)，中間的菌絲利用的溶氧受限，致使大量的中間菌絲生長(zhǎng)受限；二是由于碳源和氮源供應(yīng)不足，導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)受限。此時(shí)，提高碳源和氮源的補(bǔ)給速率并往發(fā)酵罐中補(bǔ)水，補(bǔ)水的作用有兩個(gè)，一是稀釋菌濃，維持菌濃在合理范圍內(nèi)；二是增加氧傳遞能力，從而使OUR、CER上升。
所述的發(fā)酵法生產(chǎn)A40926的方法，種子培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)，包含以下組分：葡萄糖2％，燕麥粉2％，胰蛋白胨0.3％，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001％，MnCl·4H2O 0.001％，ZnSO4·7H2O0.001％，pH7.2。所述的發(fā)酵法生產(chǎn)A40926的方法，發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)，包含以下組分：玉米淀粉4％，糊精1.5％，葡萄糖2％，豆油1％，黃豆餅粉4％，胰蛋白胨1.5％，L-纈氨酸0.2％，碳酸鈣0.5％，pH6.5。
所述的發(fā)酵法生產(chǎn)A40926的方法，所述流加糖為單糖，優(yōu)選葡萄糖。
所述的發(fā)酵法生產(chǎn)A40926的方法，水為無(wú)菌水。
所述的發(fā)酵法生產(chǎn)A40926的方法，其特征在于補(bǔ)料流加糖溶液的濃度為5～15％(w/v)，流速為1～3g/L·h。
所述的發(fā)酵法生產(chǎn)A40926的方法，包含以下步驟：
a)搖瓶培養(yǎng)：將斜面平板保存生產(chǎn)菌株接種入搖瓶種子培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速200rpm；
b)種子培養(yǎng)：將搖瓶種子液接種于種子罐，種子罐培養(yǎng)基同搖瓶種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)速180rpm，罐壓0.05Mpa，通氣比1:1V/V/min；
c)發(fā)酵培養(yǎng)：種子培養(yǎng)72h后，將種子液移種至發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)時(shí)監(jiān)控各發(fā)酵參數(shù)的變化；發(fā)酵培養(yǎng)60～80h，當(dāng)CER、OUR、Kla同步下降時(shí)，開(kāi)始流加補(bǔ)水和糖溶液；發(fā)酵培養(yǎng)4～6天后放罐，檢測(cè)。
所述的發(fā)酵法生產(chǎn)A40926的方法，步驟c)發(fā)酵罐接種量為8～12％，以25～32℃培養(yǎng)，罐壓0.05Mpa，通氣比1:1V/V/min，DO(溶解氧濃度)控制在30～100％，轉(zhuǎn)速200-480rpm。
本發(fā)明中，所述的產(chǎn)A40926的菌種為本領(lǐng)域常規(guī)所說(shuō)的能夠發(fā)酵生產(chǎn)A40926的菌種，優(yōu)選為野野村氏菌屬放線菌(Nonomuraea sp.)ATCC39727。
本發(fā)明上述野野村放線菌的種子液是按常規(guī)的方法將野野村放線菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)而得到的。所述的種子培養(yǎng)基可以是現(xiàn)有的野野村放線菌的種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)的溫度較佳的是28℃。
本發(fā)明所用的和補(bǔ)料發(fā)酵罐培養(yǎng)基均采用常規(guī)的實(shí)消滅菌。
本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說(shuō)明之外，均市售可得。
相比于現(xiàn)有的補(bǔ)料培養(yǎng)基和補(bǔ)料調(diào)控工藝，本發(fā)明的有益效果如下：
本發(fā)明提供了一種基于代謝參數(shù)OUR和CER補(bǔ)水、補(bǔ)糖發(fā)酵生產(chǎn)A40926的方法，在發(fā)酵過(guò)程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)OUR、CER和Kla變化，發(fā)酵中后期60～80h，當(dāng)CER、OUR、Kla同步下降時(shí)，開(kāi)始流加補(bǔ)水和糖溶液，從而解除發(fā)酵培養(yǎng)中后期由于發(fā)酵液粘度增加、氧傳遞受限及營(yíng)養(yǎng)匱乏的不利影響，從而大幅度提高了A40926的產(chǎn)量。
本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明A40926的發(fā)酵工藝發(fā)酵水平高、操作簡(jiǎn)單、成本低、能夠大規(guī)模生產(chǎn)，A40926效價(jià)960mg/L以上，最高效價(jià)可達(dá)1120mg/L。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明的制備過(guò)程和有益效果，實(shí)施例僅用于例證的目的，不限制本發(fā)明的范圍，同時(shí)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所做的顯而易見(jiàn)的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1
將斜面平板保存的種子野野村氏菌屬放線菌ATCC39727接種入搖瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基：燕麥粉2％，葡萄糖2％，胰蛋白胨0.3％，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.006％，MnCl·4H2O 0.003％，ZnSO4·7H2O0.004％，碳酸鈣0.3％，余量為純化水，pH值為7.0，在28℃培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速240rpm；按5％接種量接入搖瓶二級(jí)種子培養(yǎng)基(同一級(jí)種子培養(yǎng)基)，在28℃下，旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速240rpm。
將100mL搖瓶種子液接種于種子罐(30L罐，裝液量60％，培養(yǎng)基同搖瓶種子培養(yǎng)基)，培養(yǎng)溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)速180rpm，罐壓0.05Mpa，通氣比1:1V/V/min。培養(yǎng)72h后，以8％接種量移種至50L發(fā)酵罐，實(shí)際裝液量30L，以25℃培養(yǎng)144h，其中，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，罐壓0.05Mpa，通氣比1:1V/V/min。
發(fā)酵培養(yǎng)基配制，玉米淀粉4％，糊精1.5％，葡萄糖2％，豆油1％，黃豆餅粉4％，胰蛋白胨1.5％，L-纈氨酸0.2％，碳酸鈣0.5％，pH6.5。
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到72h，在CER、OUR、Kla開(kāi)始下降之前，開(kāi)始流加含有5％葡萄糖和無(wú)菌水。葡萄糖體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加初始速率1.3g/L·h。之后，根據(jù)CER、OUR的變化調(diào)節(jié)補(bǔ)速，維持CER、OUR平穩(wěn)。無(wú)菌水體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率5g/L·h，當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵144h，通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度(該檢測(cè)方法記載于，Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)，其中，A40926發(fā)酵單位為960mg/L。
與本實(shí)施例同時(shí)準(zhǔn)備一對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其余條件同上述，區(qū)別僅在于發(fā)酵過(guò)程不流加葡萄糖和無(wú)菌水。發(fā)酵144h，通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，A40926發(fā)酵單位為788mg/L。
實(shí)施例2
其他條件同實(shí)施實(shí)例1。
按照8％接種量移種至50L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，以30℃培養(yǎng)96h。
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到65h，即CER、OUR、KLA開(kāi)始下降前，開(kāi)始流加含有10％葡萄糖和無(wú)菌水。葡萄糖體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率2g/L·h。之后，根據(jù)CER、OUR的變化調(diào)節(jié)補(bǔ)速，維持CER、OUR平穩(wěn)。無(wú)菌水體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率5g/L·h，當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵96h通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，其中，A40926發(fā)酵單位為1000mg/L。
與本實(shí)施例同時(shí)準(zhǔn)備一對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其余條件同上述，區(qū)別僅在于發(fā)酵過(guò)程不流加葡萄糖和無(wú)菌水。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，A40926發(fā)酵單位為828mg/L。
實(shí)施例3
其他條件同實(shí)施實(shí)例1。
按照8％接種量移種至50L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，以32℃培養(yǎng)96h。
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到70h，即CER、OUR、Kla開(kāi)始下降3h之后，開(kāi)始流加含有15％葡萄糖和無(wú)菌水。葡萄糖體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率2.7g/L·h。之后，根據(jù)CER、OUR的變化調(diào)節(jié)補(bǔ)速，維持CER、OUR平穩(wěn)。無(wú)菌水體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率5g/L·h，當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵96h通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度。A40926發(fā)酵單位為978mg/L。
與本實(shí)施例同時(shí)準(zhǔn)備一對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其余條件同上述，區(qū)別僅在于發(fā)酵過(guò)程不流加葡萄糖和無(wú)菌水。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，A40926發(fā)酵單位為812mg/L。
實(shí)施例4
其他條件同實(shí)施例1。
按照10％接種量接種于50L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，以28℃培養(yǎng)120h。
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到80h，即CER、OUR、Kla開(kāi)始下降時(shí)，開(kāi)始流加含有10％葡萄糖和無(wú)菌水。葡萄糖體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率2.7g/L·h。之后，根據(jù)CER、OUR的變化調(diào)節(jié)補(bǔ)速，維持CER、OUR平穩(wěn)。無(wú)菌水體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率5g/L·h，當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵78h通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，其中，A40926發(fā)酵單位為1002mg/L。
與本實(shí)施例同時(shí)準(zhǔn)備一對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其余條件同上述，區(qū)別僅在于發(fā)酵過(guò)程不流加葡萄糖和無(wú)菌水。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，A40926發(fā)酵單位為818mg/L。
實(shí)施例5
其他條件同實(shí)施例1。
按照10％接種量接種于50L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，以30℃培養(yǎng)96h。
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到75h時(shí)，即CER、OUR、Kla開(kāi)始下降8h之后，開(kāi)始流加含有15％葡萄糖和無(wú)菌水。葡萄糖體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率1.3g/L·h。之后，根據(jù)CER、OUR的變化調(diào)節(jié)補(bǔ)速維持CER、OUR平穩(wěn)。無(wú)菌水體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率5g/L·h，當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵96h，通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，其中，A40926發(fā)酵單位為1016mg/L。
與本實(shí)施例同時(shí)準(zhǔn)備一對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其余條件同上述，區(qū)別僅在于發(fā)酵過(guò)程不流加葡萄糖和無(wú)菌水。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，A40926發(fā)酵單位為827mg/L。
實(shí)施例6
其他條件同實(shí)施例1。
按照10％接種量接種于50L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，以32℃培養(yǎng)96h。
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到65h時(shí)，即CER、OUR、Kla開(kāi)始下降時(shí)，開(kāi)始流加含有10％葡萄糖和無(wú)菌水。葡萄糖體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率2g/L·h。之后，根據(jù)CER、OUR的變化調(diào)節(jié)補(bǔ)速，維持CER、OUR平穩(wěn)。無(wú)菌水體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率5g/L·h，當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵96h。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，其中，A40926發(fā)酵單位為1080mg/L。
與本實(shí)施例同時(shí)準(zhǔn)備一對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其余條件同上述，區(qū)別僅在于發(fā)酵過(guò)程不流加葡萄糖和無(wú)菌水。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，A40926發(fā)酵單位為812mg/L。
實(shí)施例7
其他條件同實(shí)施例1。
按照12％接種量接種于50L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，以28℃培養(yǎng)120h。
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到80h時(shí)，即CER、OUR、Kla開(kāi)始下降時(shí)，開(kāi)始流加含有15％葡萄糖和無(wú)菌水。葡萄糖體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率2g/L·h，之后，根據(jù)CER、OUR的變化調(diào)節(jié)補(bǔ)速維持CER、OUR平穩(wěn)。無(wú)菌水體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率5g/L·h，當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵120h。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，其中，A40926發(fā)酵單位為1032mg/L。
與本實(shí)施例同時(shí)準(zhǔn)備一對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其余條件同上述，區(qū)別僅在于發(fā)酵過(guò)程不流加葡萄糖和無(wú)菌水。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，A40926發(fā)酵單位為826mg/L。
實(shí)施例8
其他條件同實(shí)施例1。
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到70h時(shí)，即CER、OUR、Kla開(kāi)始下降時(shí)，開(kāi)始流加含有15％葡萄糖和無(wú)菌水。葡萄糖體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率1.3g/L·h，之后，根據(jù)CER、OUR的變化調(diào)節(jié)補(bǔ)速維持CER、OUR平穩(wěn)。無(wú)菌水體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率5g/L·h，當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵96h，通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，其中，A40926發(fā)酵單位為1120mg/L。
與本實(shí)施例同時(shí)準(zhǔn)備一對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其余條件同上述，區(qū)別僅在于發(fā)酵過(guò)程不流加葡萄糖和無(wú)菌水。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度，A40926發(fā)酵單位為833mg/L。
實(shí)施例9
其他條件同實(shí)施實(shí)例1。
按照8％接種量移種至50L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，以32℃培養(yǎng)96h。
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到65h，即CER、OUR、Kla開(kāi)始下降3h之后，開(kāi)始流加含有15％葡萄糖和無(wú)菌水。葡萄糖體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率1.0g/L·h。之后，根據(jù)CER、OUR的變化調(diào)節(jié)補(bǔ)速，維持CER、OUR平穩(wěn)。無(wú)菌水體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率5g/L·h，當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵96h通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度。A40926發(fā)酵單位為967mg/L。
實(shí)施例10
其他條件同實(shí)施實(shí)例1。
按照10％接種量移種至50L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，以32℃培養(yǎng)96h。
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到80h，即CER、OUR、Kla開(kāi)始下降3h之后，開(kāi)始流加含有15％葡萄糖和無(wú)菌水。葡萄糖體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率3.0g/L·h。之后，根據(jù)CER、OUR的變化調(diào)節(jié)補(bǔ)速，維持CER、OUR平穩(wěn)。無(wú)菌水體積為發(fā)酵罐實(shí)際裝液質(zhì)量12％，流加速率5g/L·h，當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵96h通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中A40926濃度。A40926發(fā)酵單位為988mg/L。
將上述各實(shí)施例1-10和相應(yīng)對(duì)比例的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)至下表1中，進(jìn)一步進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如下所示。
表1本發(fā)明實(shí)施例及對(duì)比例在50L發(fā)酵罐上的試驗(yàn)結(jié)果
從上表可以看出，在50L發(fā)酵罐上實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵中期，即CER、OUR、Kla開(kāi)始下降時(shí)，流加含有15％葡萄糖和無(wú)菌水，并根據(jù)CER、OUR的變化，調(diào)整補(bǔ)糖速率，維持CER、OUR平穩(wěn)。當(dāng)CER、OUR、Kla上升并平穩(wěn)后停止補(bǔ)水。發(fā)酵單位與不補(bǔ)加葡萄糖和無(wú)菌水相比，各實(shí)施例均提高了20％以上，發(fā)酵效價(jià)最高達(dá)到1120mg/L。