本發(fā)明涉及外源表達(dá)破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc的高密度發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
：破傷風(fēng)是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，它是由破傷風(fēng)梭菌感染傷口后，在缺氧的條件下繁殖并產(chǎn)生破傷風(fēng)神經(jīng)毒素，毒素大部分進(jìn)入血液系統(tǒng)，經(jīng)機(jī)體吸收進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)，并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，阻斷神經(jīng)與肌肉間信息的傳遞，導(dǎo)致呼吸功能紊亂，進(jìn)而發(fā)生循環(huán)障礙和血液動(dòng)力學(xué)的擾亂，出現(xiàn)脫水、酸中毒。破傷風(fēng)毒素的毒性非常強(qiáng)烈，約100ng的破傷風(fēng)毒素便可以致人死亡。據(jù)估計(jì)，世界上每年約有100萬(wàn)病例發(fā)生，死亡率在50％左右。在發(fā)展中國(guó)家，新生兒破傷風(fēng)死亡率高達(dá)90％。尋找高效、安全的破傷風(fēng)預(yù)防和治療藥物是各國(guó)致力的方向。破傷風(fēng)毒素可被蛋白酶裂解成由二硫鍵連接的輕鏈和重鏈，根據(jù)毒素在體內(nèi)的作用，可將其分為A、B、C，3個(gè)部分(每部分分子量均為50kD)，分別起到結(jié)合、導(dǎo)入和麻痹的作用，從而抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。天然C片段(Hc)是重鏈的C端，保留了完整毒素與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合等許多性質(zhì)，免疫效價(jià)與毒素相當(dāng)，過(guò)敏原性低，可用于制備亞單位疫苗。傳統(tǒng)的破傷風(fēng)類毒素疫苗是破傷風(fēng)毒素經(jīng)甲醛脫毒、精制而成的，而接種類毒素后有一定的副反應(yīng)發(fā)生，甲醛處理類毒素容易造成污染，處理后的類毒素還可能發(fā)生毒性逆轉(zhuǎn)。因此，現(xiàn)有的類毒素疫苗還需進(jìn)一步改進(jìn)和發(fā)展。開(kāi)發(fā)新型的基因工程疫苗是方向之一。國(guó)內(nèi)外許多研究中對(duì)破傷風(fēng)Hc段的表達(dá)進(jìn)行了改進(jìn)，利用大腸桿菌已經(jīng)獲得了重組Hc蛋白的可溶性表達(dá)產(chǎn)物，如，申請(qǐng)?zhí)枮?00910135972的專利申請(qǐng)公開(kāi)了體外表達(dá)破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗Hc的重組菌以及重組表達(dá)方法，但是，表達(dá)水平低，其可溶性目的蛋白表達(dá)量?jī)H300mg/L。高密度發(fā)酵培養(yǎng)是提高表達(dá)量的一種方式，但是由于發(fā)酵的過(guò)程非常復(fù)雜，受到許多因素的影響，如微生物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)抑制物的積累、溶解氧濃度及補(bǔ)料方式等，因此，要通過(guò)高密度發(fā)酵實(shí)現(xiàn)高表達(dá)目標(biāo)蛋白并不容易。目前Hc蛋白的基因工程菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)研究卻一直沒(méi)有進(jìn)展，仍達(dá)不到大規(guī)模生產(chǎn)的需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種外源高表達(dá)破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc的高密度發(fā)酵方法。本發(fā)明外源高表達(dá)破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc的發(fā)酵方法，步驟如下：(1)取含有破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc核苷酸序列的工程菌，培養(yǎng)至OD600值為3.0-5.0，得種子液；(2)取種子液，加入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至溶氧值及pH值快速上升，且pH的上升幅度大于0.2/min、溶氧值大于10％/min時(shí)，補(bǔ)料；(3)當(dāng)OD600值為17時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，加入終濃度為0.2mM的IPTG，降溫至28℃，繼續(xù)補(bǔ)料，培養(yǎng)至OD600值為40-50。步驟(1)中，所述工程菌是含有SEQIDNO.1的所示DNA序列的大腸桿菌。本發(fā)明表達(dá)破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗Hc的大腸桿菌BL21(DE3)，是公開(kāi)號(hào)為101880675A的專利申請(qǐng)實(shí)施例二中轉(zhuǎn)化有pET32a-Tet-Hc質(zhì)粒的重組大腸桿菌BL21(DE3)，其含有SEQIDNO.1的所示用于編碼破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc的DNA序列，按照該專利申請(qǐng)的實(shí)施例一和實(shí)施例二的方法制備。SEQIDNO.1的所示DNA序列如下：步驟(1)中，培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。步驟(2)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基每1L含有如下組分：Tryptone8～10gYeastExtract2.5～5gNaCl0.5～1.0gNa2HPO4·12H2O14～16gKH2PO43～4gNH4Cl1.8～2.0g泡敵0.35～0.4ml，其余為水。步驟(2)中，所述種子液按照1:30的比例加入發(fā)酵培養(yǎng)基中；所述培養(yǎng)在溫度為37℃、pH為7.00、溶氧值為40％的條件下培養(yǎng)。步驟(2)中，補(bǔ)料的初始補(bǔ)料速度7.5ml/min，一小時(shí)后補(bǔ)料速度為9.75ml/min，兩小時(shí)后補(bǔ)料速度為12.6ml/min，三小時(shí)后補(bǔ)料速度為16.4ml/min，四小時(shí)后補(bǔ)料速度為21.3ml/min，五小時(shí)后補(bǔ)料速度為27.7ml/min，六小時(shí)后補(bǔ)料速度為36ml/min。步驟(3)中，繼續(xù)補(bǔ)料的速度為：從步驟(2)開(kāi)始補(bǔ)料的時(shí)間計(jì)算，一小時(shí)后的補(bǔ)料速度為7.5ml/min，兩小時(shí)后補(bǔ)料速度為9.75ml/min，三小時(shí)后補(bǔ)料速度為12.6ml/min，四小時(shí)后補(bǔ)料速度為16.4ml/min，五小時(shí)后補(bǔ)料速度為21.3ml/min，六小時(shí)后補(bǔ)料速度為27.7ml/min，七小時(shí)后補(bǔ)料速度為36ml/min。步驟(2)和(3)中，所述補(bǔ)料用的培養(yǎng)基每1L含有如下組分：無(wú)水葡萄糖490～500gMgSO4·7H2O22～25gZnCl20.05～0.075gFeCl3·6H2O0.675～1.012gCuSO4·5H2O0.05～0.071gNa2MoO4·2H2O0.05～0.075gCaCl20.05～0.075gH3BO30.015～0.02gCoCl2·6H2O0.05～0.075gMnSO4·H2O0.08～0.095g鹽酸3.5～3.8ml維生素B10.003～0.004g核黃素0.008～0.016g泛酸0.05～0.075g煙酸0.15～0.225g吡哆醇0.045～0.053g生物素0.002～0.003g葉酸0.001～0.002gNaOH0.165～0.25g。本發(fā)明還提供了前述破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc的制備方法，取前述方法制備得到的發(fā)酵液，離心，收集菌體，破菌，取上清，純化，即可。其中，所述純化的方法是：將上清液過(guò)QFF柱進(jìn)行陰離子交換，用20mMTris-HCl緩沖液平衡后，用含0-0.5MNaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫；含有目的蛋白的洗脫液加入終濃度為0.5M的(NH4)2SO4后，過(guò)苯基疏水柱進(jìn)行下一步純化；目的蛋白用含濃度0.5-0M的(NH4)2SO4的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫；含有目的蛋白的洗脫液用脫鹽柱置換緩沖液為20mMNaAc(pH4.0)后，過(guò)SP柱進(jìn)行陽(yáng)離子交換，目的蛋白用含0-0.5MNaCl的20mMNaAc(pH4.0)緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，即可。本發(fā)明方法通過(guò)特定的補(bǔ)料方式以及其他條件的配合，可以高表達(dá)獲得可溶性的破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc，且發(fā)酵工藝簡(jiǎn)便，成本低廉，可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)制備破傷風(fēng)Hc亞單位疫苗，應(yīng)用前景良好。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說(shuō)明圖1為純化后破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc蛋白的SDS-PAGE蛋白電泳圖。其中1為對(duì)比例1中BL21(DE3)菌表達(dá)的Hc；2為實(shí)施例1中BL21(DE3)菌表達(dá)的Hc蛋白稀釋6倍進(jìn)行電泳；3為實(shí)施例1中BL21(DE3)菌表達(dá)的Hc蛋白；4為對(duì)比例2中恒速補(bǔ)料對(duì)照BL21(DE3)菌表達(dá)的Hc蛋白；M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)操作，例如程麗娟、薛泉宏主編的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》。本發(fā)明使用的培養(yǎng)基如下：表1.LB培養(yǎng)基配方組分濃度Tryptone10g/LYeastExtract5g/LNaCl10g/L其余為水表2.基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方組分含量Tryptone8～10g/LYeastExtract2.5～5g/LNaCl0.5～1.0g/LNa2HPO4·12H2O14～16g/LKH2PO43～4g/LNH4Cl1.8～2.0g/L泡敵0.35～0.4ml/L其余為水表3.補(bǔ)料的培養(yǎng)基配方組分含量無(wú)水葡萄糖490～500g/LMgSO4·7H2O22～25g/LZnCl20.05～0.075g/LFeCl3·6H2O0.675～1.012g/LCuSO4·5H2O0.05～0.071g/LNa2MoO4·2H2O0.05～0.075g/LCaCl20.05～0.075g/LH3BO30.015～0.02g/LCoCl2·6H2O0.05～0.075g/LMnSO4·H2O0.08～0.095g/L鹽酸3.5～3.8ml/L維生素B10.003～0.004g/L核黃素0.008～0.016g/L泛酸0.05～0.075g/L煙酸0.15～0.225g/L吡哆醇0.045～0.053g/L生物素0.002～0.003g/L葉酸0.001～0.002g/LNaOH0.165～0.25g/L其余為水實(shí)施例1本發(fā)明破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗Hc的大腸桿菌高密度發(fā)酵一、發(fā)酵方法1.種子的活化本發(fā)明表達(dá)破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗Hc的大腸桿菌BL21(DE3)，是公開(kāi)號(hào)為101880675A的專利申請(qǐng)實(shí)施例二中轉(zhuǎn)化有pET32a-Tet-Hc質(zhì)粒的重組大腸桿菌BL21(DE3)，其含有SEQIDNO.1的所示DNA序列，按照該專利申請(qǐng)的實(shí)施例一和實(shí)施例二的方法制備。配制50mlLB培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中。121℃滅菌30min，冷卻。取出凍存的工作種子一支解凍。使用無(wú)菌操作，先往已滅菌的50mlLB培養(yǎng)基加入氨芐青霉素溶液使其終濃度為100mg/ml，然后接入整支工作種子。溫度37℃，搖速220rpm，培養(yǎng)8-12小時(shí)。次日使用無(wú)菌操作取樣，顯微鏡檢查如無(wú)雜菌則可用于下一步操作。從一級(jí)種子中取出20mL按照1:50的比例接入活化后的種子。開(kāi)啟搖床調(diào)整溫度至37℃，搖速220rpm，培養(yǎng)8-12小時(shí)，生物量達(dá)到OD600值為3.0-5.0時(shí)作為二級(jí)種子。2.發(fā)酵罐培養(yǎng)按照1:30的比例將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐30L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，控制溫度為37℃，pH為7.00，溶氧值為40％。其中，pH用氨水來(lái)控制；溶氧值通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量來(lái)提高，初始攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)400rpm，初始空氣流量為1L/min，最大空氣流量可達(dá)6L/min。發(fā)酵剛開(kāi)始不補(bǔ)料，當(dāng)溶氧及pH值快速上升，且pH的上升幅度大于0.2/min，溶氧值大于10％/min時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)料。補(bǔ)料工藝：初始補(bǔ)料一個(gè)小時(shí)以內(nèi)的補(bǔ)料速度7.5ml/min，一小時(shí)后補(bǔ)料速度為9.75ml/min，兩小時(shí)后補(bǔ)料速度為12.6ml/min，三小時(shí)后補(bǔ)料速度為16.4ml/min，四小時(shí)后補(bǔ)料速度為21.3ml/min，五小時(shí)后補(bǔ)料速度為27.7ml/min，六小時(shí)后補(bǔ)料速度為36ml/min。3.誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白當(dāng)OD600值為17時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，加入終濃度為0.2mM的IPTG，降溫至28℃，繼續(xù)補(bǔ)料，培養(yǎng)至OD600值為40-50，結(jié)束發(fā)酵。開(kāi)始誘導(dǎo)后的細(xì)胞消耗能源物質(zhì)速率會(huì)降低一些，因此繼續(xù)補(bǔ)料速度需下調(diào)一級(jí)，例如誘導(dǎo)是在補(bǔ)料開(kāi)始的第二小時(shí)，此時(shí)補(bǔ)料速度為9.75ml/min，降溫后應(yīng)將補(bǔ)料速度調(diào)整為7.5ml/min，一小時(shí)后補(bǔ)料速度增大為9.75ml/min，如果在初始補(bǔ)料一小時(shí)以內(nèi)進(jìn)入誘導(dǎo)階段，則初始補(bǔ)料一個(gè)小時(shí)以內(nèi)的補(bǔ)料速度仍然為7.5ml/min。也就是說(shuō)，誘導(dǎo)表達(dá)后的補(bǔ)料工藝為：從初始補(bǔ)料開(kāi)始計(jì)算，初始補(bǔ)料一小時(shí)內(nèi)的補(bǔ)料速度為7.5ml/min，一小時(shí)后的補(bǔ)料速度為7.5ml/min，兩小時(shí)后補(bǔ)料速度為9.75ml/min，三小時(shí)后補(bǔ)料速度為12.6ml/min，四小時(shí)后補(bǔ)料速度為16.4ml/min，五小時(shí)后補(bǔ)料速度為21.3ml/min，六小時(shí)后補(bǔ)料速度為27.7ml/min，七小時(shí)后補(bǔ)料速度為36ml/min。4、純化誘導(dǎo)結(jié)束后的發(fā)酵液經(jīng)10,000g，4℃離心收集菌體，菌體用20mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)重懸后勻漿碎菌。12,000g，4℃離心收集上清。上清液過(guò)QFF柱進(jìn)行陰離子交換，用20mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)平衡后，用含0-0.5MNaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。含有目的蛋白的洗脫液加入終濃度為0.5M的(NH4)2SO4后，過(guò)苯基疏水柱進(jìn)行下一步純化。目的蛋白用含濃度0.5-0M的(NH4)2SO4的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。含有目的蛋白的洗脫液用脫鹽柱置換緩沖液為20mMNaAc(pH4.0)后，過(guò)SP柱進(jìn)行陽(yáng)離子交換，目的蛋白用含0-0.5MNaCl的20mMNaAc(pH4.0)緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。經(jīng)QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步純化后，即得純度大于95％以上的目標(biāo)蛋白：破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗Hc。二、檢測(cè)經(jīng)過(guò)檢測(cè)誘導(dǎo)結(jié)束后的發(fā)酵液經(jīng)10,000g，4℃離心收集菌體，菌體濕重為86g/L，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化后得到的目標(biāo)蛋白的得率為0.8g/L(圖1)。對(duì)比例1破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗Hc的普通發(fā)酵一、發(fā)酵方法1.種子的活化活化方法同實(shí)施例1。2.發(fā)酵罐培養(yǎng)按照1:30的比例將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐30L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，控制溫度為37℃，pH為7.00，溶氧值為40％。其中，pH用氨水來(lái)控制；攪拌轉(zhuǎn)速一直維持為400rpm，空氣流量維持在6L/min。本發(fā)酵方法不補(bǔ)料。3.誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白當(dāng)OD600值生長(zhǎng)約為17時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，加入終濃度為0.2mM的IPTG，降溫至28℃，繼續(xù)培養(yǎng)6h。二、檢測(cè)菌體收集以及純化方法同實(shí)施例1。經(jīng)檢測(cè)，離心收集菌體濕重為8g/L。純化結(jié)果顯示可溶性目的蛋白的得率為0.15g/L。對(duì)比例2破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗Hc的間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵一、發(fā)酵方法1.種子的活化活化方法同實(shí)施例1。2.發(fā)酵罐培養(yǎng)按照1:30的比例將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐30L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，控制溫度為37℃，pH為7.00，溶氧值為40％。其中，pH用氨水來(lái)控制；溶氧值通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量來(lái)提高，初始攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)400rpm，初始空氣流量為1L/min,最大空氣流量可達(dá)6L/min。發(fā)酵剛開(kāi)始不補(bǔ)料，當(dāng)溶氧及pH值不可逆轉(zhuǎn)的快速上升，且pH的上升幅度大于0.2/min，溶氧值大于10％/min時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)料。采用間歇定量流加方式繼續(xù)培養(yǎng)，每間隔1h，每次流加450ml的補(bǔ)料液，共流加6-7次。3.誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白誘導(dǎo)方法同對(duì)比例1。二、檢測(cè)菌體收集以及純化方法同實(shí)施例1。經(jīng)檢測(cè)，離心收集菌體濕重為29g/L。純化結(jié)果顯示可溶性目的蛋白的得率為0.4g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，只有采用本發(fā)明特定的發(fā)酵方式，才能高表達(dá)得到目標(biāo)產(chǎn)物，而采用其他補(bǔ)料方式或者不補(bǔ)料，則產(chǎn)量較低，本發(fā)明方法的產(chǎn)量高，成本低，工業(yè)應(yīng)用前景良好。SEQUENCELISTING<110>四川自豪時(shí)代藥業(yè)有限公司中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所<120>外源表達(dá)破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc的高密度發(fā)酵方法<130>GY003-16P1604<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1353<212>DNA<213>編碼破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc的DNA序列<400>1aaaaaccttgattgttgggtcgacaacgaagaagacatcgatgttatcctgaaaaagtct60accattctgaacttggacatcaacaacgatattatctccgacatctctggtttcaactcc120tctgttatcacatatccagatgctcaattggtgccgggcatcaacggcaaagctatccac180ctggttaacaacgaatcttctgaagttatcgtgcacaaggccatggacatcgaatacaac240gacatgttcaacaacttcaccgttagcttctggctgcgcgttccgaaagtttctgcttcc300cacctggaacagtacgacactaacgagtactccatcatcagctctatgaagaaatactcc360ctgtccatcggctctggttggtctgtttccctgaagggtaacaacctgatctggactctg420aaagactccgcgggcgaagttcgtcagatcactttccgcgacctgtctgacaagttcaac480gcgtacctggctaacaaatgggttttcatcactatcactaacgatcgtctgtcttctgct540aacctgtacatcaacggcgttctgatgggctccgctgaaatcactggtctgggcgctatc600cgtgaggacaacaacatcactcttaagctggaccgttgcaacaacaacaaccagtacgta660tccatcgacaagttccgtatcttctgcaaagcactgaacccgaaagagatcgaaaaactg720tataccagctacctgtctatcaccttcctgcgtgacttctggggtaacccgctgcgttac780gacaccgaatattacctgatcccggtagcttacagctctaaagacgttcagctgaaaaac840atcactgactacatgtacctgaccaacgcgccgtcctacactaacggtaaactgaacatc900tac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