本發(fā)明涉及一種溶酶體靶向次氯酸比率熒光探針及其制備方法與應(yīng)用，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

次氯酸(HClO)是自然界中的多種生物用于防御的天然殺菌劑。在生物細胞中，次氯酸由過氧化氫和氯離子在髓過氧化酶(MPO)的催化作用下產(chǎn)生。作為一種重要的活性氧物種，次氯酸在維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡狀態(tài)起著非常重要的作用，但是一旦細胞中次氯酸的濃度發(fā)生異常，就會引起包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病和癌癥在內(nèi)的多種疾病，檢測生物體系中次氯酸的濃度已成為一個重要的課題。

文獻報道，中性粒(白)細胞發(fā)炎的情況下可以每小時產(chǎn)生20-400μM的次氯酸，由于次氯酸的pK_a為7.46，在生物體內(nèi)，部分次氯酸(HClO)是以次氯酸跟(ClO^-)的形式存在的。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，熒光光譜法作為一種非侵入性檢測技術(shù)，以其眾多的優(yōu)勢。如靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)迅速、原位檢測、實時監(jiān)測等。

生物體內(nèi)廣泛存在很多內(nèi)源性活性物種，活性氧物種是非常重要的一類，而次氯酸只是活性氧家族的一員，在其他干擾活性氧物種的存在的條件下，專一性對體內(nèi)的次氯酸進行識別，需要探針分子具有較好的抗干擾性。與此同時，對于探針濃度、檢測溫度、響應(yīng)時間以及儀器誤差都對識別產(chǎn)生影響。目前，多數(shù)報道的次氯酸探針為單一熒光強度的變化型探針，比率型探針較少。本專利通過分子結(jié)構(gòu)設(shè)計，利用FRET原理，在反應(yīng)位點增加溶酶體定位基團，設(shè)計出比率型識別次氯酸的探針且響應(yīng)時間非常速度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前次氯酸分子熒光探針檢測所面臨的問題的現(xiàn)狀，本發(fā)明通過分子設(shè)計，合成出一種具有響應(yīng)時間快的比率型次氯酸熒光探針。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種溶酶體靶向次氯酸比率熒光探針，該探針分子的分子式為：C₄₉H₅₅N₇O₅，具有如下所示結(jié)構(gòu)：

所述探針隨著NaClO當(dāng)量的增加，該熒光探針在385nm的吸收逐漸降低，而在560nm的吸收逐漸增強，紫外光譜成比率變化。

所述探針在沒有加入次氯酸的條件下，以380nm激發(fā)波長激發(fā)，只有在455nm處有很強的熒光發(fā)射，以500nm激發(fā)波長激發(fā)，沒有熒光發(fā)射；隨著NaClO加入當(dāng)量的增加，455nm處的熒光強度逐漸減弱，584nm處的熒光強度逐漸增強，熒光光譜成比率變化。

上述的溶酶體靶向次氯酸比率熒光探針的制備方法，它包括以下步驟：

1)將1eq的4-二乙胺基酮酸和1eq的間羥基苯基哌嗪溶于3ml濃硫酸中，90℃加熱3小時，冷卻到室溫，冰浴下，加入4ml高氯酸，得到粗產(chǎn)品，柱層析分離得化合物1；

2)將1eq的化合物1溶于乙醇，滴加10eq的80％水合肼，回流3小時，反應(yīng)完成后，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品并用柱層析分離后得化合物2；

3)將1eq化合物2和1eq的6-二乙胺基萘羧酸、1eq的HOBt、1eq的EDCI溶于DMF中，室溫反應(yīng)6h，反應(yīng)完全后，加水，乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后得粗產(chǎn)品，并用柱層析后分離得化合物；

4)將1eq的化合物3溶于氯仿中，向其中滴加3-4滴三乙胺，然后將20μl溴乙酰溴溶于1ml氯仿中，再于0℃條件下緩慢滴加于混合溶液中，滴加完畢后室溫反應(yīng)3-4小時，反應(yīng)完全后，用二氯甲烷萃取，然后依次水洗、鹽水洗、無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后得粗產(chǎn)品，并用柱層析分離得到化合物4；

5)將1eq的化合物4，3eq的碳酸鉀，微量碘化鉀以及3eq的嗎啉溶解在DMF中，室溫反應(yīng)6h，反應(yīng)完全后，乙酸乙酯萃取，水洗2-3次，無水硫酸鈉干燥，旋出溶劑得到粗產(chǎn)品后，用柱層析得到目標探針化合物，簡記為Lyso-HClO。

所述步驟(1)中柱層析的洗脫劑配比為：二氯甲烷/甲醇＝20:1。

所述步驟(2)中柱層析的洗脫劑配比為：二氯甲烷/甲醇＝20:1。

所述步驟(3)中柱層析的洗脫劑配比為：二氯甲烷/甲醇＝30:1。

所述步驟(4)中柱層析的洗脫劑配比為：二氯甲烷/甲醇＝20:1。

所述步驟(5)中柱層析的洗脫劑配比為：二氯甲烷/石油醚＝1:1。

上述的次氯酸熒光探針的合成路線如下：

本發(fā)明所述的溶酶體靶向次氯酸比率熒光探針的應(yīng)用，該熒光探針可以應(yīng)用于生物細胞體系中次氯酸的傳感檢測；所述的傳感檢測包含熒光檢測，目視定性檢測，細胞成像檢測。

該熒光分子結(jié)構(gòu)增加嗎啉作為溶酶體定位基團，在細胞成像過程可以有效的專一的定位到溶酶體區(qū)域?；贔RET機理，在沒有加入次氯酸的條件下，該熒光探針只在385nm處出現(xiàn)紫外吸收，隨著NaClO當(dāng)量的增加，該熒光探針在385nm的吸收逐漸降低，而在560nm的吸收逐漸增強，紫外光譜成比率變化。在沒有加入次氯酸的條件下，該熒光探針在激發(fā)波長(380nm)條件下，該熒光探針只有在455nm處有很強的熒光發(fā)射，在激發(fā)波長(500nm)條件下，該熒光探針沒有熒光發(fā)射。隨著NaClO加入當(dāng)量的增加，熒光強度逐漸減弱(455nm)；在激發(fā)波長(500nm)條件下隨著NaClO加入當(dāng)量的增加，熒光強度逐漸增強(584nm)，熒光光譜同樣成比率變化，熒光強度比率變化可有效減弱單一熒光強度變化造成的一定誤差。利用共聚焦顯微鏡成像，沒有加入次氯酸鈉的細胞中，通過405nm為激發(fā)光的藍通道有熒光發(fā)出，而561nm激發(fā)的紅通道幾乎觀察不到熒光發(fā)出。然而，加入次氯酸鈉的細胞中可以同時在藍通道和紅通道觀察到熒光成像。

本發(fā)明的優(yōu)點：(1)探針的合成成本比較低，且后處理過程相對簡單；(2)本發(fā)明實現(xiàn)了次氯酸分子探針的選擇性快速檢測，并且選擇性好，抗其他分子干擾能力強。此外，用肉眼就可以觀察到溶液顏色的變化。基于其特異性且顯著的顏色變化，該試劑可作為顯示水溶液中和生物細胞內(nèi)次氯酸分子存在的專一性指示劑，可進行實時定性及定量的目視比色法檢測。故而，本發(fā)明是一種簡單，快速，靈敏的次氯酸分子特異性檢測試劑，在生物分子檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。其性能將在實施例中結(jié)合附圖給予詳細說明。

附圖說明

圖1是實施例1中探針Lyso-HClO的¹H NMR圖譜；

圖2是探針Lyso-HClO隨次氯酸鈉的加入熒光譜圖的變化情況；

圖3是探針Lyso-HClO對不同分析物加入后熒光強度的變化情況，其中(1)blank；(2)t-butylhydroperoxide；(3)H₂O₂；(4)NO；(5)peroxide tert-butyl ether；(6)OH^—；(7)NO₂^—；(8)NO₃^2—；(9)I^—；(10)S^2—；(11)Cys；(12)GHS；(13)Hcy；(14)Cu²⁺；(15)；Co²⁺(16)Ca²⁺；(17)Mg²⁺；(18)K⁺,(19)ClO^—；

圖4是探針Lyso-HClO溶液在次氯酸加入前后溶液顏色的變化；

圖5是探針Lyso-HClO應(yīng)用于細胞中對外源性次氯酸進行熒光成像。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限制，實施例中化合物的號碼對于上述方案中化合物的號碼。

實施例1

化合物L(fēng)yso-HClO次氯酸熒光探針的合成

化合物1的合成：

4-二乙胺基酮酸(10mmol,3g)和間羥基苯基哌嗪(10mmol,1.77g)溶于3ml濃硫酸中，90℃加熱3h，冷卻到室溫，冰浴下加入4ml高氯酸，得到粗產(chǎn)品，柱層析分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/甲醇＝20:1，產(chǎn)量為80％。

化合物2的合成：

將化合物1(2.5g，5mmol,1eq)溶于20mL乙醇中，滴加80％水合肼5ml加熱回流反應(yīng)3h，用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，減壓旋干溶劑后得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/甲醇＝20:1，產(chǎn)量為85％。

化合物3的合成：

將化合物2(0.23g,5mmol,1eq)和6-二乙胺基萘羧酸(1.2g，5mmol,1eq)、HOBt(0.675g，5mmol,1eq)、EDCI(0.96g,5mmol，1eq)溶于DMF中，室溫反應(yīng)6h，反應(yīng)完全后，加水，乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/甲醇＝30:1，產(chǎn)量為50％。

化合物4的合成：

將化合物3(100mg，1mmol,1eq)溶于2ml CHCl₃中，滴加3-4滴三乙胺，溴乙酰溴20μl溶于1ml氯仿中，0℃條件下緩慢滴加。用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗1次，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/甲醇＝20:1，產(chǎn)量為86％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.41(s,1H),7.85(d,J＝6.8Hz,1H),7.78(d,J＝8.5Hz,2H),7.66(d,J＝8.6Hz,1H),7.59(p,J＝7.2Hz,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,1H),7.20(d,J＝9.1Hz,1H),7.06(d,J＝7.1Hz,1H),6.92(s,1H),6.66(s,2H),6.55(d,J＝9.3Hz,1H),6.46(d,J＝8.8Hz,1H),6.45–6.26(m,2H),3.67(s,4H),3.47(d,J＝6.9Hz,4H),3.32(d,J＝6.9Hz,4H),3.25(s,4H),2.96–2.76(m,2H),2.12(s,4H),1.16(t,J＝6.9Hz,6H),1.08(t,J＝6.8Hz,6H).

化合物L(fēng)yso-HClO的合成：

將化合物4(50mg，0.1mmol,1eq)，K₂CO₃(45mg，0.3mmol,3eq),KI微量，溶于2mLDMF中，嗎啉(26mg,3eq)溶于DMF中加入，室溫反應(yīng)6小時，用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，乙酸乙酯萃取，水洗2-3次，無水硫酸鈉干燥，旋出溶劑。硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/石油醚＝1:1，產(chǎn)量為81％。

實施例2

化合物L(fēng)yso-HClO次氯酸熒光探針隨NaClO加入當(dāng)量的增加熒光譜圖的變化

取實施例1制備的Lyso-HClO次氯酸熒光探針溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制成1mmol/L儲備液。從儲備液中取出40μL加入到5mL的離心管當(dāng)中，用PBS緩沖溶液(0.1mol/L，pH＝7.4)與DMF體積比為1:1的溶液稀釋至4mL，加入不同當(dāng)量(0-12eq)的NaClO標準溶液，測量其熒光性質(zhì)。熒光光譜如圖2所示。左圖為該熒光探針在激發(fā)波長(380nm)條件下隨著NaClO加入當(dāng)量的增加，熒光強度逐漸減弱(455nm)，右圖為該熒光探針在激發(fā)波長(500nm)條件下隨著NaClO加入當(dāng)量的增加，熒光強度逐漸增強(584nm)。二者在一定濃度范圍內(nèi)成線型比例關(guān)系，可以定量檢測低濃度次氯酸。

實施例3

化合物L(fēng)yso-HClO次氯酸熒光探針對不同分子或離子的選擇性

從實施例2中熒光探針儲備液中取出30μL加入到5mL的離心管當(dāng)中，分別加入等摩爾量的競爭分子標準溶液，其中一個加入等摩爾量的次氯酸標準溶液[(1)blank；(2)t-butylhydroperoxide；(3)H₂O₂；(4)NO；(5)peroxide tert-butyl ether；(6)OH^—；(7)NO₂^—；(8)NO₃^2—；(9)I^—；(10)S^2—；(11)Cys；(12)GHS；(13)Hcy；(14)Cu²⁺；(15)；Co²⁺(16)Ca²⁺；(17)Mg²⁺；(18)K⁺,(19)OCl^—]，30min后以PBS:DMF(1:1)為溶劑，365nm為激發(fā)光，檢測溶液的熒光發(fā)射光譜變化，結(jié)果如圖3所示。同時還研究了其他金屬離子對本發(fā)明探針熒光強度的影響，在以PBS:DMF(1:1)為溶劑，380nm為激發(fā)光。由圖3看可以發(fā)現(xiàn)，其他金屬離子對化合物L(fēng)yso-HClO在584nm處的熒光幾乎沒有影響，而次氯酸溶液的加入使化合物L(fēng)yso-HClO在584nm處的熒光顯著增強。

實施例4

化合物L(fēng)yso-HClO熒光探針對次氯酸的可視化檢測

從實施例2中熒光探針儲備液中取出30μL加入到5mL的樣品管當(dāng)中，加入80摩爾量的次氯酸標準溶液，次氯酸可以使合物L(fēng)yso-HClO熒光探針的PBS：DMF體積比為1:1的緩沖溶液，溶液發(fā)生明顯的顏色變化，溶液顏色從無色變成紅色，如圖4所示。這說明是一種具有生色傳感功能的熒光探針。

實施例5

化合物L(fēng)yso-HClO次氯酸熒光探針對細胞外源性次氯酸熒光比率成像

我們將本發(fā)明探針應(yīng)用于HeLa細胞中對外源性的次氯酸進行熒光成像。具體操作步驟如下：將5μM Lyso-HClO次氯酸探針DMSO溶液加入到兩份育有HeLa細胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min然后向其中的一份加入20μM的次氯鈉水溶液后，另一份加入相同體積的蒸餾水，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min用PBS進行洗滌三次后，用共聚焦顯微鏡進行成像。成像結(jié)果如圖5所示。作為參比，沒有加入次氯酸鈉的細胞中，通過405nm為激發(fā)光的藍通道有熒光發(fā)出，而561nm激發(fā)的紅通道幾乎觀察不到熒光發(fā)出。然而，加入次氯酸鈉的細胞中可以同時在藍通道和紅通道觀察到熒光成像，通過兩個通道的比率成像，可以發(fā)現(xiàn)兩者之間有明顯的差異，說明此熒光探針可以對外源性的次氯酸進行熒光比率成像。