本申請屬于超分子技術(shù)領(lǐng)域，涉及生物大分子與有機高分子相結(jié)合而形成的生物-有機雜化結(jié)構(gòu)，具體地涉及一種超分子組裝體及其制備和形貌調(diào)控方法。

背景技術(shù)：

近年來，將生物大分子與有機高分子相結(jié)合而形成的生物-有機兩嵌段雜化結(jié)構(gòu)成為高分子材料領(lǐng)域一類新的研究熱點，這類雜化材料由于可以保持兩嵌段中每一嵌段各自的性質(zhì)，使它們在溶液中往往會表現(xiàn)出多樣的自組裝行為，同時，其中的生物大分子嵌段還能保持生物大分子所特有的生物學性質(zhì)，使其在生物納米技術(shù)和藥物運輸?shù)确矫婢哂袕V泛的應用前景。特別是由核酸(DNA)與合成高分子相結(jié)合而形成的DNA-合成高分子嵌段共聚物，由于DNA嵌段在構(gòu)筑納米自組裝結(jié)構(gòu)過程中所表現(xiàn)出來的可控的二級結(jié)構(gòu)、精確的識別性質(zhì)以及多樣的刺激響應性等特點，使得“DNA-合成高分子雜化共聚物”在生物材料和分子檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。

利用簡單高效的方法構(gòu)建結(jié)構(gòu)可控、性能穩(wěn)定、生物相容并可降解的功能材料，是目前材料科學的一個重要發(fā)展方向。其中，基于非共價弱相互作用力的超分子材料，由于能夠充分利用大量已合成的或天然存在的各種分子及其聚集體作為基本構(gòu)造單元，具有原料來源的廣泛性、構(gòu)建過程的可逆性和組裝結(jié)構(gòu)的有序性等特點，受到研究人員的廣泛關(guān)注。超分子材料的發(fā)展不僅能夠極大地簡化功能材料的構(gòu)筑方法，還能拓展功能材料的應用領(lǐng)域。而在各種超分子非共價作用力當中，靜電作用比之氫鍵、金屬配體螯合作用、主客體作用等具有諸多優(yōu)勢：通過靜電結(jié)合的方法可能制出通過普通合成方法難以制備出來的嵌段共聚物；末端帶有正電或負電功能基團的聚合物能夠通過自由基聚合時的鏈轉(zhuǎn)移反應比較容易地獲得，而不需要復雜繁瑣的離子或可控自由基聚合物反應操作；靜電作用在生物體系中極為普遍，故其毒性更低；更為重要的是，靜電相互作用由于其良好的響應性與可逆性，使基于靜電作用的自組裝體系具有很好的動態(tài)可控性。因此，分子間的靜電作用是構(gòu)筑超分子自組裝結(jié)構(gòu)的重要非共價驅(qū)動力，通過靜電作用制備的超分子組裝體更可能實現(xiàn)形貌調(diào)控進而實現(xiàn)功能可控，并進一步拓展超分子材料的應用領(lǐng)域，然而目前并未有關(guān)于超分子組裝體形貌調(diào)控方法的確切報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用聚氨基酸與DNA之間的靜電作用為主的非共價相互作用，提供一種超分子組裝體及其制備方法。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種超分子組裝體的形貌調(diào)控方法，其可以有效地對上述超分子組裝體的形貌進行調(diào)控。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

在本發(fā)明的一方面，提供一種超分子組裝體，其為基于聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚樹狀分子-DNA雜化體的超分子組裝體。

本發(fā)明所述的聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)由單甲氧基聚乙二醇伯胺(mPEG-NH₂)和L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)合成。

優(yōu)選的，所述單甲氧基聚乙二醇伯胺(mPEG-NH₂)的M_n＝2000g/mol。

優(yōu)選的，所述L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)按照如下方法合成：將L-賴氨酸(H-Lys(Z)-OH)和當量20％過量的三光氣，于四氫呋喃(THF)溶劑中50℃反應至澄清后再反應1h，即轉(zhuǎn)化成L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(NCA)。

進一步優(yōu)選的，所述聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)按照如下方法合成：(1)首先將單甲氧基聚乙二醇伯胺(mPEG-NH₂)在Schlenk瓶(施蘭克瓶)中50℃油浴真空干燥6h，后冷卻到室溫；(2)L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)在手套箱中溶解于干燥二甲基甲酰胺(DMF)中，轉(zhuǎn)移至前一步的Schlenk瓶中在氮氣保護及室溫下反應；(3)加入過量乙醚沉淀產(chǎn)物，再用三氟乙酸(TFA)溶解產(chǎn)物；(4)加入5倍當量的氫溴酸(HBr)或冰醋酸(CH₃COOH)，在冰水浴中反應4h后用乙醚沉淀；(5)用稀HCl調(diào)節(jié)pH值使產(chǎn)物溶于水中，透析后冷凍干燥即得。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)按照如下方法合成：

(1)合成L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)：將L-賴氨酸(H-Lys(Z)-OH)和當量20％過量的三光氣，于四氫呋喃(THF)溶劑中50℃反應至澄清后再反應1h，即轉(zhuǎn)化成L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)；獲得的L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)單體粗產(chǎn)物在手套箱中經(jīng)四氫呋喃(THF)與正己烷重結(jié)晶純化三次后得最終產(chǎn)物待用。

(2)合成聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)：首先將單甲氧基聚乙二醇伯胺(mPEG-NH₂，M_n＝2000g mol^-1)在Schlenk瓶(施蘭克瓶)中50℃油浴真空干燥約6h，后冷卻到室溫；步驟(1)得到的L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)在手套箱中溶解于干燥二甲基甲酰胺(DMF)中，然后用注射器抽取后轉(zhuǎn)移至Schlenk瓶中在氮氣保護及室溫下反應；利用FT-IR(傅里葉變換紅外光譜分析儀)光譜確認反應完成后，取少量樣品配制成5mg/mL進行SEC/LLS(體積排除色譜/激光散射)測試，確定多分散性(PDI)與分子量(M_n)；過量乙醚沉淀后，用少量三氟乙酸(TFA)溶解產(chǎn)物，加入5倍當量的氫溴酸(HBr)或冰醋酸(CH₃COOH)，在冰水浴中4h后用乙醚沉淀；用稀HCl調(diào)節(jié)pH值使產(chǎn)物溶于水中，透析后冷凍干燥得到產(chǎn)物。通過1H-NMR(氫譜)確認脫保護進行完全，并計算引發(fā)的聚氨基酸嵌段的聚合度DP_n。

優(yōu)選的，所述引發(fā)的聚氨基酸嵌段的聚合度DP_n為109，得到最終產(chǎn)物為PEG₄₅-b-PLL₁₀₉。

本發(fā)明所述的聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體按照如下方法合成：羥基為核心端的三代脂肪族聚醚型樹枝分子(G3-ol)與2-氰乙基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺反應得亞磷酰胺活化試劑(G3-P)，然后與負載于多孔玻璃小球(CPG)上的DNA進行半固相合成，再依次通過四唑的活化、碘水氧化、濃氨水的脫保護并切掉CPG小球，最終得到聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體。

優(yōu)選的，所述的DNA序列是經(jīng)過設計后不具有特定二級結(jié)構(gòu)的單鏈，其序列為：5’-TTTTAC ACA TCT ACT TCA-3’(DNA18)；此時合成的聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體為G3-b-DNA18，

上述聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)的合成過程如圖1所示。

進一步的，本發(fā)明將合成的聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體溶解于純水中建立聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體的自組裝體系，因為沒有加入NaCl等電解質(zhì)溶液，因此避免了電解質(zhì)溶液對靜電作用的屏蔽效應，從而可以利用電荷間的靜電相互作用來對組裝結(jié)構(gòu)進行調(diào)控。在純水體系中，聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體仍然能自組裝形成球形的膠束結(jié)構(gòu)，在該膠束結(jié)構(gòu)中，依然是以樹狀分子組成膠束的疏水性內(nèi)核，而膠束外殼結(jié)構(gòu)為親水性的帶負電的DNA。該膠束具有這樣的結(jié)構(gòu)特征，更容易通過加入帶正電荷的聚賴氨酸(PLL)與膠束帶負電的DNA外殼發(fā)生靜電相互作用，從而也有利于通過電荷相互作用調(diào)控組裝結(jié)構(gòu)的形貌。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種超分子組裝體的制備方法。

一種基于聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體的超分子組裝體的制備方法，包括如下步驟：將聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體分別溶于水后制成溶液，再將聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)溶液加入到聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體溶液中混合均勻。

在本發(fā)明的又一方面，提供一種超分子組裝體的形貌調(diào)控方法。

一種基于聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體的超分子組裝體的形貌調(diào)控方法，包括如下步驟：(1)先將聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體按照等電荷比例混合；(2)再逐步增加體系中聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)的含量，直至體系中聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體達到等摩爾比。

優(yōu)選的，所述聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸為PEG₄₅-b-PLL₁₀₉。

優(yōu)選的，所述聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體為G3-b-DNA18。

進一步優(yōu)選的，所述步驟(2)中，當聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG₄₅-b-PLL₁₀₉)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)的電荷比為6:1時，體系中聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG₄₅-b-PLL₁₀₉)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)達到等摩爾比。

當聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體與聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸等電荷比例混合時，由于聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸中帶正電荷的聚賴氨酸(PLL)嵌段數(shù)較多，因此每條聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸與多條聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體通過PLL和DNA間的電荷相互作用，形成電荷中性的錐形組裝體參與到整個自組裝過程中，這些錐形結(jié)構(gòu)由于PEG嵌段的親水性、G3-(DNA-PLL)嵌段的疏水性，使它們通過交叉并排的方式排列形成具有條紋狀結(jié)構(gòu)的片層形貌，如圖2所示。

當體系中聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸的含量繼續(xù)增加時，優(yōu)選的，當聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸與聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體的電荷比增加到6:1時，破壞了原來組裝結(jié)構(gòu)中電荷平衡的狀態(tài)。由于嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸中聚賴氨酸多余正電荷之間的互相排斥作用，使新形成的組裝結(jié)構(gòu)中帶狀條紋發(fā)生彎曲，曲率的變化最終導致組裝形貌的變化，從而形成具有不同尺寸大小的盤狀結(jié)構(gòu)。在新形成的盤狀結(jié)構(gòu)中，內(nèi)部的分子排列方式與電荷中性時的結(jié)構(gòu)具有相似性，可以認為聚賴氨酸嵌段多余正電荷的排斥作用是導致組裝形貌發(fā)生改變的直接原因。

上述聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體在不同摩爾比例混合時的自組裝過程參見圖2所示。

本發(fā)明提供了一種基于聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸和聚脂肪醚樹狀分子-DNA雜化體的超分子組裝體及其制備方法，并通過改變超分子組裝體中二者的比例關(guān)系實現(xiàn)了對于超分子組裝體的形貌調(diào)控，從而為超分子組裝結(jié)構(gòu)的性質(zhì)與組裝機理研究拓展了新的思路，并使進一步拓寬超分子材料的應用領(lǐng)域成為可能。

附圖說明

圖1為聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)的合成示意圖。

圖2為聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG₄₅-b-PLL₁₀₉)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)不同摩爾比例混合時的自組裝過程示意圖。

圖3為實施例5聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)在純水溶液中形成的自組裝結(jié)構(gòu)在透射電子顯微鏡(TEM)下的形貌。

圖4為實施例6聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG₄₅-b-PLL₁₀₉)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)的等電荷比共混超分子組裝體在透射電子顯微鏡(TEM)下的形貌。

圖5為實施例7聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG₄₅-b-PLL₁₀₉)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)的等摩爾比共混超分子組裝體在透射電子顯微鏡(TEM)下的形貌。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1：合成α-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)

(1)將L-賴氨酸(H-Lys(Z)-OH)和當量20％過量的三光氣，于四氫呋喃(THF)溶劑中50℃反應至澄清后再反應一個小時，即轉(zhuǎn)化成L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)的結(jié)構(gòu)。

(2)獲得的L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)單體粗產(chǎn)物在手套箱中經(jīng)四氫呋喃與正己烷重結(jié)晶純化三次后得最終產(chǎn)物待用。

實施例2：合成聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)

(1)首先將單甲氧基聚乙二醇伯胺(mPEG-NH₂，M_n＝2000g mol^-1)在Schlenk瓶中50℃油浴真空干燥大約6h，后冷卻到室溫；

(2)將實施例1的L-賴氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)在手套箱中溶解于干燥二甲基甲酰胺(DMF)中，然后用注射器抽取后轉(zhuǎn)移至Schlenk瓶中在氮氣保護及室溫下反應；利用FT-IR(傅里葉變換紅外光譜分析儀)光譜確認反應完成后，取少量樣品配制成5mg/mL進行SEC/LLS(體積排除色譜/激光散射)測試，確定多分散性(PDI)與分子量(M_n)；

(3)過量乙醚沉淀后，用少量三氟乙酸(TFA)溶解產(chǎn)物，加入5倍當量的氫溴酸(HBr)或冰醋酸(CH₃COOH)，在冰水浴中4h后用乙醚沉淀；(4)用稀HCl調(diào)節(jié)pH值使產(chǎn)物溶于水中，透析后,冷凍干燥得到產(chǎn)物；

(5)通過1H-NMR確認脫保護進行完全，并計算引發(fā)的聚氨基酸嵌段的聚合度DP_n為109，得到最終產(chǎn)物PEG₄₅-b-PLL₁₀₉。

實施例3：制備聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG₄₅-b-PLL₁₀₉)溶液

將實施例2的PEG₄₅-b-PLL₁₀₉溶于水，配置成摩爾濃度為9.175μM的溶液，測得溶液中聚賴氨酸側(cè)鏈質(zhì)子化的氨基正電荷摩爾濃度為1mM。

實施例4：合成聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)

(1)羥基為核心端的三代脂肪族聚醚型樹枝分子(G3-ol)與2-氰乙基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺反應得亞磷酰胺活化試劑(G3-P)，

(2)然后與負載于多孔玻璃小球(CPG)上的DNA進行半固相合成，所述的DNA序列是經(jīng)過設計后不具有特定二級結(jié)構(gòu)的單鏈，其序列為：5’-TTT TAC ACA TCT ACT TCA-3’，

(3)再依次通過四唑的活化、碘水氧化、濃氨水的脫保護并切掉CPG小球，最終得到聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)。

實施例5：構(gòu)建聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)自組裝體系

將實施例4獲得的聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)溶于水，配置成摩爾濃度為200μM的溶液，測得聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)，主鏈DNA磷酸二酯鍵中的負電荷摩爾濃度為3.6mM。

常溫下靜置過夜后，透射電子顯微鏡(TEM)下觀察聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)的自組裝結(jié)構(gòu)的形貌，結(jié)果如圖3所示。

透射電子顯微鏡(TEM)的表征結(jié)果表明，在純水體系中，聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)能自組裝形成球形的膠束結(jié)構(gòu)，在該膠束結(jié)構(gòu)中，依然是以樹狀分子組成膠束的疏水性內(nèi)核，而膠束外殼結(jié)構(gòu)為親水性的帶負電的DNA。

實施例6：建立聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG₄₅-b-PLL₁₀₉)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)的等電荷比共混超分子組裝體

將實施例3的聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG₄₅-b-PLL₁₀₉)溶液加入到實施例5的聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)自組裝體系中，PEG₄₅-b-PLL₁₀₉與G3-b-DNA18的摩爾比為0.165:1，由于單鏈DNA的嵌段數(shù)相對較少(18)，而聚賴氨酸嵌段數(shù)相對較多(109)，此時DNA與聚賴氨酸嵌段已經(jīng)是等電荷比混合。

常溫下靜置過夜后，透射電子顯微鏡(TEM)下觀察共混超分子組裝體的形貌，結(jié)果如圖4所示。

圖4的TEM的表征結(jié)果表明，由于PEG₄₅-b-PLL₁₀₉兩嵌段共聚物中帶正電荷的聚賴氨酸(PLL)嵌段與G3-b-DNA18膠束結(jié)構(gòu)中帶負電的DNA外殼發(fā)生靜電相互作用，使自組裝結(jié)構(gòu)從球狀膠束狀態(tài)轉(zhuǎn)變成帶條紋的無定形片層狀組裝形貌。形成的組裝結(jié)構(gòu)中條紋的寬度大約為7nm左右，這與G3-b-DNA18的尺寸基本吻合(在自由伸展狀態(tài)下G3-b-DNA18的分子尺寸大約為8.7nm)，推測兩親性分子G3-b-DNA18在條紋狀組裝結(jié)構(gòu)的形成過程中發(fā)揮了模板性骨架作用。

實施例7：建立聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG₄₅-b-PLL₁₀₉)和聚脂肪醚樹狀分子-b-DNA雜化體(G3-b-DNA18)的等摩爾比共混超分子組裝體

向?qū)嵤├?的共混超分子組裝體中繼續(xù)加入實施例3的聚乙二醇-b-聚-L-賴氨酸(PEG₄₅-b-PLL₁₀₉)溶液，直至G3-b-DNA18與PEG₄₅-b-PLL₁₀₉按照等摩爾比混合，此時G3-b-DNA18與PEG₄₅-b-PLL₁₀₉的電荷比例增加到1:6。

常溫下靜置過夜后，透射電子顯微鏡(TEM)下觀察共混超分子組裝體的形貌，結(jié)果如圖5所示。

圖5的TEM的表征結(jié)果表明，由于聚賴氨酸的嵌段數(shù)較多，所帶有的正電荷數(shù)量也比DNA多，共混超分子組裝體的組裝形貌從等電荷比例時的條紋狀無定形組裝形貌轉(zhuǎn)變?yōu)榈饶柋壤龝r不同大小尺寸的、仍具條紋結(jié)構(gòu)的圓盤狀形貌。

本說明書上文中結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行了闡釋，但應理解，這些描述和闡釋只是為了更好地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本申請說明書之后可對本發(fā)明的具體實施方式進行必要的改動而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。本發(fā)明的保護范圍由所附的權(quán)利要求書限定，并且涵蓋了權(quán)利要求的等同變換。