本發(fā)明涉及多糖領(lǐng)域，且特別涉及一種泡葉藻硫酸酯化多糖及其制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

硫酸酯化多糖是指在分子中的羥基被硫酸基取代的多糖，也稱硫酸多糖或多糖硫酸酯。天然的硫酸酯化多糖主要來源海藻、肝素、植物及真菌,具有非常廣泛的生物活性，除最主要的抗凝血作用外，還具有降血脂、抗衰老、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗輻射、抗血栓等多種生物活性功能。

泡葉藻(Ascophyllum nodosum)屬于褐藻門，主要生于北冰洋海域附近海岸。泡葉藻是海藻工業(yè)生產(chǎn)常用原料，被用于提取碘、甘露醇、褐藻酸鈉，并且含有豐富的礦物質(zhì)元素及營養(yǎng)，因此也用作肥料的上等原料。褐藻多糖是一類天然的含有硫酸基的雜多糖，存在于細(xì)胞壁基質(zhì)中，具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗凝血、抗腫瘤等。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，硫酸酯化多糖由于單糖組分的種類和比例、糖苷鍵的種類不同，硫酸基的多少和所在位置不同，立體結(jié)構(gòu)不同，化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，硫酸酯化多糖因此具有不同的生物活性。而目前對硫酸酯化多糖的研究主要集中對海帶多糖的研究，對泡葉藻多糖的研究較少。同時，對硫酸酯化多糖的研究一般是對低分子量的多糖進(jìn)行研究，而較少涉及對大分子量硫酸酯化多糖的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種泡葉藻硫酸酯化多糖的制備方法，此制備方法操作簡單、原料利用率高、工藝溫和、適合規(guī)?；a(chǎn)。

本發(fā)明的另一目的在于一種泡葉藻硫酸酯化多糖，其硫酸基含量高，分子量相對較大，活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有調(diào)節(jié)腸道功能。

本發(fā)明的第三個目的在于提供泡葉藻硫酸酯化多糖在制備調(diào)節(jié)腸道功能產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

本發(fā)明提出一種泡葉藻硫酸酯化多糖的制備方法，其包括以下步驟：

用溶劑對泡葉藻進(jìn)行浸泡，然后除去泡葉藻中的溶劑，溶劑為醇或醇的水溶液。

以水為提取劑，60～100℃下對除雜后的泡葉藻進(jìn)行提取、分離得到水提物。

對水提物進(jìn)行醇沉，控制醇沉體系中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60～80％，沉淀后分離出沉淀物。

用水復(fù)溶沉淀物，經(jīng)截留量為8000～14000Da的透析膜透析后，濃縮、干燥得到的多糖粗品。

以氯化鈉-水溶液為洗脫液，將多糖粗品于陰離子交換柱中梯度洗脫，收集多糖分子量大于100kDa的洗脫組分，經(jīng)透析、濃縮、干燥得到大分子量多糖組分。

以氯化鈉-水溶液為洗脫液，將大分子量多糖組分于凝膠柱中等度洗脫，收集含多糖的洗脫組分，經(jīng)透析、濃縮、干燥得到泡葉藻硫酸酯化多糖。

本發(fā)明提出一種泡葉藻硫酸酯化多糖，其根據(jù)上述的制備方法制備得到。

本發(fā)明提出一種泡葉藻硫酸酯化多糖在制備調(diào)節(jié)腸道功能產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明實施例的泡葉藻硫酸酯化多糖及其制備方法、應(yīng)用的有益效果是：

采用醇或醇的水溶液對泡葉藻進(jìn)行浸泡，能夠有效地除去泡葉藻中的色素、多酚、單糖及低聚糖等物質(zhì)，減少泡葉藻中的雜質(zhì)，便于后續(xù)的提取分離。

采用水提法進(jìn)行提取，水提溫度為60～100℃，溫度較高，能夠有效提取出泡葉藻中多糖成分，浸出速度快，浸出物含量高，不使用酸堿等有毒有害試劑，成本低。

對水提物進(jìn)行醇沉，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60～80％的醇沉體系能夠有效沉淀出硫酸酯化多糖成分。進(jìn)一步對沉淀物進(jìn)行透析處理，經(jīng)截留量為8000-14000Da的透析膜能有效去除乙醇、小分子糖、蛋白質(zhì)和鹽，得到多糖粗品。

采用陰離子交換柱和凝膠柱純化多糖粗品，能夠得到高純度的泡葉藻硫酸酯化多糖。硫酸酯化多糖含有豐富的羧基和羥基，帶負(fù)電荷，采用陰離子交換柱，可以吸附離子型物質(zhì)，比如蛋白質(zhì)、酸性多糖等。經(jīng)陰離子交換柱純化后，收集多糖分子量大于100kDa的洗脫組分，使用凝膠柱再次進(jìn)行純化，得到泡葉藻硫酸酯化多糖。經(jīng)過兩次純化過程，得到的泡葉藻硫酸酯化多糖純度高，硫酸基含量高，分子量相對較大，活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有調(diào)節(jié)腸道功能的生理活性，能夠應(yīng)用于制備調(diào)節(jié)腸道功能產(chǎn)品。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例1提供的Sepharose Fast Flow柱的洗脫曲線；

圖2為本發(fā)明實施例1提供的Sephacryl S-300柱的洗脫曲線；

圖3為本發(fā)明實施例提供的泡葉藻硫酸酯化多糖AnP2-1的紅外光譜圖；

圖4為本發(fā)明試驗例2提供的泡葉藻硫酸酯化多糖AnP2-1體外發(fā)酵體系pH變化圖；

圖5為本發(fā)明試驗例2提供的泡葉藻硫酸酯化多糖AnP2-1體外發(fā)酵過程中SCFA變化圖；

圖6為本發(fā)明試驗例2提供的泡葉藻硫酸酯化多糖AnP2-1體外發(fā)酵過程中菌群的在門水平的相對豐度值。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實施例的泡葉藻硫酸酯化多糖及其制備方法、應(yīng)用進(jìn)行具體說明。

本發(fā)明實施例提供的一種泡葉藻硫酸酯化多糖的制備方法，以泡葉藻為原料，先對泡葉藻進(jìn)行粉碎處理，以增加物料和溶劑之間的接觸面積，提高浸出速度和有效成分的浸出量。粉碎粒度優(yōu)選為50～70目，進(jìn)一步優(yōu)選為60目，上述粒度范圍內(nèi)物料的有效成分含量最高，提取效率最優(yōu)，保證最大化利用原料?？梢岳斫獾氖牵诒景l(fā)明的其他實施例中，也可以不經(jīng)過粉碎直接對泡葉藻進(jìn)行處理。

采用醇或醇的水溶液浸泡粉碎后的泡葉藻，除去泡葉藻中的溶劑。泡葉藻屬于褐藻類，含有較多的色素、多酚等雜質(zhì)，使用醇或醇的水溶液處理，可以有效將上述雜質(zhì)去除，便于后續(xù)的提取分離以及純化操作，避免因為色素等物質(zhì)的存在增加后續(xù)分離純化的難度，降低產(chǎn)品的純度。可以選用乙醇、正丁醇、乙醚、石油醚等對泡葉藻進(jìn)行浸泡，均能有效對泡葉藻進(jìn)行脫脂脫色處理。優(yōu)選為采用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇溶液處理粉碎后的泡葉藻，其能夠有效去除泡葉藻中的色素、多酚、單糖、低聚糖等成分，便于后續(xù)的提取分離以及純化操作，且乙醇的毒性小，成本低，更易操作。

以水為提取劑，60～100℃下對除雜后的泡葉藻進(jìn)行提取、分離得到水提物。硫酸酯化多糖是一種極性大分子化合物，因含有大量的羥基而易溶于水，采用熱水進(jìn)行提取，提取速度快，工藝簡單，操作方便，成本低，既能保證多糖的提取率，又不使用酸堿等有毒有害試劑，健康環(huán)保。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實施例中，以5～30mL/g的液料比對泡葉藻提取3～5h，提取2～4次，離心后合并提取液即得到水提物。該液料比下，有效成分溶出多，提取效率高，多糖類物質(zhì)的提取效果最佳。進(jìn)一步地，提取時間優(yōu)選為4h，提取時間過短則不利于多糖成分的溶出，提取時間過長，則容易造成多糖結(jié)構(gòu)的破壞。提取次數(shù)優(yōu)選為提取3次，3次提取能夠提取出泡葉藻中絕大部分的多糖成分，既保證最大化利用了原料，又節(jié)約提取時間。

在本發(fā)明的其他實施例中，為進(jìn)一步保證產(chǎn)品的提取率，在水提取過程中，可以采用超聲波輔助提取或者微波輔助提取工藝對泡葉藻進(jìn)行提取。

對水提物進(jìn)行醇沉，控制醇沉體系中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60～80％，沉淀后分離出沉淀物。在多糖水溶液中加入乙醇，會破壞多糖水溶液中的氫鍵，從而降低多糖在水中的溶解度，使多糖以沉淀的形式析出。利用多糖溶于水而不溶于高體積分?jǐn)?shù)乙醇，可使多糖從水溶液中沉淀出來。醇沉體系中的乙醇的濃度過低，會導(dǎo)致沉淀成絮狀，難以下沉，沉淀析出效果差，且乙醇用量大，浪費材料，回收不方便。醇沉體系中乙醇的濃度過高，沉淀中含有大量的物質(zhì)，會將雜質(zhì)一同析出，不利于后續(xù)的分離純化操作。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，醇沉體系中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70％，該體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液能夠有效沉淀出多糖組分，且雜質(zhì)含量少。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，醇沉的條件為置于1～8℃中12～24h，離心分離得到沉淀物，保證多糖成分沉淀完全，提高多糖的提取率。

用水復(fù)溶醇沉得到的沉淀物，經(jīng)截留量為8000～14000Da的透析膜透析后，濃縮、干燥得到的多糖粗品。對沉淀物進(jìn)行復(fù)溶、透析，能有效去除乙醇、小分子糖、蛋白質(zhì)和鹽等，得到純度較高的多糖粗品，便于后續(xù)的純化操作。對透析得到的保留液進(jìn)行減壓濃縮后冷凍干燥得到多糖粗品，先進(jìn)行減壓濃縮再進(jìn)行冷凍干燥，有利于在回收溶劑時保證物質(zhì)的活性成分不受到破壞，同時除去大部分的溶劑，縮短干燥時間。采用冷凍干燥技術(shù)，可以得到纖維狀的多糖粗品，便于后續(xù)操作，且最大限度保證多糖粗品的功能活性不遭受破化。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，透析時間優(yōu)選為3～7天。該透析時間下，能夠保證沉淀物中的小分子物質(zhì)充分透出，透析效果最佳。

以氯化鈉-水溶液為洗脫液，將多糖粗品于陰離子交換柱中梯度洗脫。優(yōu)選地，采用濕法上樣，具體為：將多糖粗品溶解在水中，離心后上樣，以提高純化效果。硫酸酯化多糖含有豐富的羧基和羥基，帶負(fù)電荷，采用陰離子交換柱，可以吸附離子型物質(zhì)，比如蛋白質(zhì)、酸性多糖等。加樣后，負(fù)電基團(tuán)可以與平衡離子進(jìn)行可逆的置換反應(yīng)，而結(jié)合到離子交換劑上，通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液，改變各種離子與離子交換劑的結(jié)合力達(dá)到分離目的。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，陰離子交換柱選用DEAE Sepharose Fast Flow柱或DEAE Cellulose離子交換柱。進(jìn)一步優(yōu)選為DEAE Sepharose Fast Flow柱，即DEAE瓊脂糖凝膠Fast Flow柱，其具有高化學(xué)穩(wěn)定性、高流速、高載量、好的機(jī)械性能、多次重復(fù)使用等特點，非特異性吸附低，回收率高，適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。采用DEAE Sepharose Fast Flow柱進(jìn)行初純化，其基質(zhì)與水具有較強(qiáng)的親和力，能夠?qū)Χ嗵谴制愤M(jìn)行快速分離純化，純化效果好。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，梯度洗脫過程的氯化鈉-水溶液中，氯化鈉的物質(zhì)的量濃度依次為0M、0.5M、1M和1.5M。該洗脫梯度下，能夠?qū)Χ嗵谴制愤M(jìn)行有效的分離純化，多糖中的羧基、硫酸基的取向、類型及數(shù)量有差異，利用不同濃度的氯化鈉溶液洗脫，能夠分離得到不同的多糖組分，純化效果好。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，梯度洗脫的洗脫速度為1～3mL/min，優(yōu)選為2mL/min。該洗脫速度下多糖粗品的分離效果最優(yōu)。

具體地，分別用200mL的水、0.5M、1M和1.5M的氯化鈉水溶液依次進(jìn)行洗脫。每10mL洗脫液收集為一個洗脫組分，共收集得到80個洗脫組分。

進(jìn)一步的，采用苯酚-硫酸法檢測各洗脫組分中多糖含量，收集多糖分子量大于100kDa的洗脫組分，經(jīng)透析、濃縮、干燥得到大分子量多糖組分。優(yōu)選地，為了除去因為洗脫液而引入洗脫組分中的鹽分，采用截留量為3500Da的透析膜對洗脫組分進(jìn)行透析，除去洗脫組分中的鹽分，保證純化效果。分子量大于100kDa的多糖因其分子量較大，硫酸基含量相對較高，具有低分子量多糖所不具備的生理活性功能。

對大分子量多糖組分進(jìn)行再純化，以0.1M的氯化鈉-水溶液為洗脫液，將大分子量多糖組分于凝膠柱中等度洗脫。優(yōu)選地，采用濕法上樣，用0.1M的氯化鈉溶液溶解大分子量多糖組分，離心后上樣，以提高純化效果。采用凝膠柱對大分子量多糖組分進(jìn)行進(jìn)一步的精制，根據(jù)分子的大小對多糖進(jìn)行分離純化。優(yōu)選地，凝膠柱選用Sephacryl S柱或Sephadex G柱，該凝膠柱能夠有效對多糖進(jìn)行分離純化。進(jìn)一步優(yōu)選地，選用Sephacryl S-300柱對多糖進(jìn)行純化，其對大分子量多糖組分進(jìn)行純化后能夠得到單一的對稱峰，洗脫效果好。具體地，用300mL的0.1M氯化鈉水溶液進(jìn)行梯度洗脫。每10mL洗脫液收集為一個洗脫組分，共收集得到30個洗脫組分。

收集含多糖的洗脫組分，經(jīng)透析、濃縮、干燥得到泡葉藻硫酸酯化多糖。

本發(fā)明實施例還提供根據(jù)上述方法制備得到的泡葉藻硫酸酯化多糖，平均分子量為370±23kDa，硫酸基含量為23.8±0.02％。該泡葉藻硫酸酯化多糖活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，硫酸基含量高，具有調(diào)節(jié)腸道功能。

本發(fā)明實施例還提供上述泡葉藻硫酸酯化多糖在制備調(diào)節(jié)腸道功能產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明實施例還提供上述泡葉藻硫酸酯化多糖在制備減肥功能產(chǎn)品中的應(yīng)用。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實施例1

本實施例提供的一種泡葉藻硫酸酯化多糖的制備方法，其包括：

將泡葉藻樣品粉碎過60目篩后，用80％乙醇浸泡后晾干，重復(fù)數(shù)次，去除色素、多酚、單糖及低聚糖。

用水于60～100℃水中以液料比為20mL/g提取除雜后的泡葉藻3次，每次提取4h，離心后合并三次提取液，濃縮得到水提物。

在水提物中加入無水乙醇進(jìn)行醇沉，并控制醇沉體系中的乙醇濃度為70％，在4℃條件下過夜，離心，收集沉淀得到沉淀物。

將沉淀物復(fù)溶于純水中，將樣品裝入截留量為8000-14000Da透析袋進(jìn)行透析5天，然后濃縮冷凍干燥，得到多糖粗品。

取多糖粗品溶解于去離子水中，離心后上樣于DEAE Sepharose Fast Flow柱，分別用純水、0.5M、1.0M及1.5M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為2mL/min。利用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖含量，該步驟的洗脫曲線如圖1所示。由圖1可得，多糖粗品經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow柱純化得到兩個洗脫峰，且兩個洗脫峰均為單一的對稱峰，表明純化效果良好。收集兩個洗脫峰，分別經(jīng)過透析(截留量為3500Da)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到兩個洗脫組分，分別記為AnP-1和AnP-2。分別測定AnP-1和AnP-2的分子量，得到分子量大于100kDa的大分子量多糖組分AnP-2。

將大分子量多糖組分AnP-2用適量0.1M的NaCl進(jìn)行溶解，離心后上樣Sephacryl S-300凝膠柱，用0.1M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為1mL/min。利用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖含量，該步驟的洗脫曲線如圖2所示。由圖2可得，AnP-2經(jīng)Sephacryl S-300柱純化得到一個洗脫峰，該洗脫峰均為單一的對稱峰，表明該多糖組分為均一多糖，純化效果良好。收集該洗脫峰，經(jīng)過透析(截留量為3500Da)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到泡葉藻硫酸酯化多糖，記為AnP2-1，AnP2-1的提取率為9.0％。

實施例2

本實施例提供的一種泡葉藻硫酸酯化多糖的制備方法，其包括：

將泡葉藻樣品粉碎過60目篩后，用70％乙醇浸泡后晾干，重復(fù)數(shù)次，去除色素、多酚、單糖及低聚糖。

用水于60～100℃水中以液料比為5mL/g提取除雜后的泡葉藻4次，每次提取5h，離心后合并四次提取液，濃縮得到水提物。

在水提物中加入無水乙醇進(jìn)行醇沉，并控制醇沉體系中的乙醇濃度為60％，在1℃條件下過夜，離心，收集沉淀得到沉淀物。

將沉淀物復(fù)溶于純水中，將樣品裝入截留量為8000-14000Da透析袋進(jìn)行透析3天，然后濃縮冷凍干燥，得到多糖粗品。

取多糖粗品溶解于去離子水中，離心后上樣于DEAE Cellulose離子交換柱，分別用純水、0.5M、1.0M及1.5M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為3mL/min。利用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖含量，收集得到多糖分子量大于100kDa的洗脫組分，經(jīng)過透析(截留量為3500Da)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到大分子量多糖組分，記為AnP-2。

將AnP-2用適量0.1M的NaCl進(jìn)行溶解，離心后上樣Sephadex G凝膠柱，用0.1M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為2mL/min。利用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖含量，收集含多糖的洗脫組分，經(jīng)過透析(截留量為3500Da)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到泡葉藻硫酸酯化多糖，記為AnP2-1，AnP2-1的提取率為4.5％。

實施例3

本實施例提供的一種泡葉藻硫酸酯化多糖的制備方法，其包括：

將泡葉藻樣品粉碎過80目篩后，用90％乙醇浸泡后晾干，重復(fù)數(shù)次，去除色素、多酚、單糖及低聚糖。

用水于60～100℃水中以液料比為30mL/g提取除雜后的泡葉藻2次，每次提取3h，離心后合并兩次提取液，濃縮得到水提物。

在水提物中加入無水乙醇進(jìn)行醇沉，并控制醇沉體系中的乙醇濃度為80％，在8℃條件下過夜，離心，收集沉淀得到沉淀物。

將沉淀物復(fù)溶于純水中，將樣品裝入截留量為8000-14000Da透析袋進(jìn)行透析7天，然后濃縮冷凍干燥，得到多糖粗品。

取多糖粗品溶解于去離子水中，離心后上樣于DEAE Cellulose離子交換柱，分別用純水、0.5M、1.0M及1.5M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為3mL/min。利用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖含量，收集多糖分子量大于100kDa的洗脫組分，經(jīng)過透析(截留量為3500Da)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到大分子量多糖組分，記為AnP-2。

將AnP-2用適量0.1M的NaCl進(jìn)行溶解，離心后上樣Sephacryl S-300凝膠柱，用0.1M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為3mL/min。利用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖含量，收集含多糖的洗脫組分，經(jīng)過透析(截留量為3500Da)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到泡葉藻硫酸酯化多糖，記為AnP2-1，AnP2-1的提取率為7.3％。

實施例4

本實施例提供的一種泡葉藻硫酸酯化多糖的制備方法，其包括：

將泡葉藻樣品粉碎過70目篩后，用石油醚浸泡后晾干，重復(fù)數(shù)次，去除色素、多酚、單糖及低聚糖。

用水于60～100℃水中以液料比為15mL/g提取除雜后的泡葉藻2次，并采用超聲波輔助提取，每次提取2h，離心后合并兩次提取液，濃縮得到水提物。

在水提物中加入無水乙醇進(jìn)行醇沉，并控制醇沉體系中的乙醇濃度為75％，在5℃條件下過夜，離心，收集沉淀得到沉淀物。

將沉淀物復(fù)溶于純水中，將樣品裝入截留量為8000-14000Da透析袋進(jìn)行透析6天，然后濃縮冷凍干燥，得到多糖粗品。

取多糖粗品溶解于去離子水中，離心后上樣于DEAE Sepharose Fast Flow柱，分別用純水、0.5M、1.0M及1.5M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為2mL/min。利用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖含量，收集多糖分子量大于100kDa的洗脫組分，經(jīng)過透析(截留量為3500Da)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到大分子量多糖組分，記為AnP-2。

將AnP-2用適量0.1M的NaCl進(jìn)行溶解，離心后上樣Sephacryl S-300凝膠柱，用0.1M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為0.5mL/min。利用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖含量，收集含多糖的洗脫組分，經(jīng)過透析(截留量為3500Da)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到泡葉藻硫酸酯化多糖，記為AnP2-1，AnP2-1的提取率為8.7％。

試驗例1

實施例1～4中制得的泡葉藻硫酸酯化多糖AnP2-1的結(jié)構(gòu)分析。

1.分子量的測定：采用高效凝膠色譜法測定AnP-1和AnP-2的分子量大小，測定結(jié)果表明，AnP-1的分子量為65.92±9kD，AnP-2的分子量為370±23kDa，質(zhì)量分布較為均一。

2.硫酸根含量的測定--明膠氯化鋇法

2.1明膠氯化鋇溶液的配制：稱取1g明膠溶于100mL 60-70℃蒸餾水溶解，冷卻后冰箱靜置過夜，第二天稱取0.5g氯化鋇溶于溶液中，靜置2h后使用。

2.2硫酸鉀溶液的配制：將K₂SO₄于105-110℃烘3h，放干燥器中冷至室溫，準(zhǔn)確稱取35mg，配成100mL溶液，并換算成硫酸根離子的濃度(mg/mL)，分子量：硫酸根96，硫酸鉀174。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取標(biāo)準(zhǔn)K₂SO₄液分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL。樣品取0.25mL，加蒸餾水定容至3mL，加0.2M HCl 3.8mL，明膠氯化鋇1mL，充分搖勻，放置30min后于500nm處測其吸光度。

2.4樣品測定：把0.1g的樣品AnP2-1左右放入小瓶中，加2M HCl 8mL，待樣品溶脹后，封管，在水浴鍋中加熱4h，取出冷至室溫。把樣品從瓶中取出，放入小燒杯中加氨水中和至pH＝6-7后加活性炭，放置一段時間后用濾紙過濾，用蒸餾水慢慢少量沖洗，然后定容至25mL。按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方測定吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算硫酸根含量。

經(jīng)測定得，AnP2-1的硫酸基含量為23.8±0.02％。

3.單糖組成的測定：

3.1多糖水解：分別稱取5mg的樣品AnP2-1，加入2.5mL的三氟乙酸，放入110℃的烘箱中水解6h。將小瓶敞口放在100℃水浴鍋內(nèi)，加入3mL左右的無水乙醇，進(jìn)行蒸干，重復(fù)3-4次。向蒸干的樣品加入200μL的0.5mol/L PMP和200μL的0.3mol/L的NaOH溶液，混勻后放在70℃的水浴鍋中衍生30min。待冷卻后，用0.3mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH，至中性。向溶液中加入2mL的超純水和4mL的乙酸異戊酯，用渦旋混合器混合搖勻1min后，靜止10min，棄上層廢液。再向其中加入4mL乙酸異戊酯，用渦旋混合器混合搖勻1min后，靜止10min，棄上層廢液，最后加入4mL的氯仿溶液，用渦旋混合器混合搖勻1min后，靜止10min，用于去除多余的乙酸異戊酯及其余雜質(zhì)。將萃取后的溶液，定容到5mL，得到1mg/mL的溶液。溶液經(jīng)濾膜過濾后進(jìn)行單糖測定。

3.2液相色譜法測定：Agilent 1200液相色譜儀，色譜柱為Eclipse Plus C18柱。選擇不同濃度的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品，以單糖濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制每種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行單糖定性定量檢測。

結(jié)果表明，AnP2-1的單糖組成為甘露糖：葡萄糖醛酸：阿拉伯糖：巖藻糖＝1.91:2.87:2.65:15.9。

4.紅外光譜分析：如圖3所示為AnP2-1的紅外光譜圖。其中，3435.98cm^-1出現(xiàn)強(qiáng)的寬吸收峰，是O-H伸縮振動，2937.06cm^-1出現(xiàn)強(qiáng)的弱吸收峰是C-H伸縮振動，1636.53cm^-1和1418.80cm^-1出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰是羧基(C＝O)伸縮振動，1225.85cm^-1出現(xiàn)吸收峰是C-O-C非對稱伸縮振動，1029.48cm^-1出現(xiàn)的吸收峰顯示AnP2-1具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)。紅外光譜顯示該物質(zhì)確實為硫酸酯化多糖化合物。

試驗例2體外厭氧發(fā)酵

2.1試驗方法

1.人體糞便混合物制備：分別向4名志愿者收集新鮮糞便(提供糞便的4名志愿者攝入正常的飲食，沒有消化疾病，至少3個月沒有服用抗生素)。從每名志愿者糞便中取等量的糞便混合，并立即儲存于厭氧罐中。

2.糞便預(yù)培養(yǎng)：取糞便混合物(120g)在1L預(yù)培養(yǎng)基中厭氧條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)(1L預(yù)培養(yǎng)基中含10g胰蛋白胨，5g酵母，10g NaCl，5g葡萄糖和6g麥芽糖)。過夜培養(yǎng)后，將120mL的預(yù)培養(yǎng)物通過已滅菌的紗布過濾除去大顆粒物后轉(zhuǎn)移至一個厭氧罐中，得已預(yù)培養(yǎng)的糞便菌群。

3.酵解：1L酵解培養(yǎng)基中含：4.5g NaCl、4.5g KCl、1.5g NaHCO₃、0.69g MgSO₄·H₂O、0.8g L-半胱氨酸HCl·H₂O、0.5g KH₂PO₄、0.5g K₂HPO₄、0.4g膽汁鹽、0.08g CaCl₂、0.005g FeSO₄·7H₂O、1mL吐溫80和4mL樹脂天青溶液(0.0025％，w/v，厭氧指示劑)。培養(yǎng)基在121℃下滅菌15min后分別裝入已預(yù)先滅菌的厭氧管中。

將AnP2-1加入已預(yù)培養(yǎng)的糞便菌群中進(jìn)行體外酵解。所有樣品和糞便培養(yǎng)物在Forma厭氧系統(tǒng)(10％H₂，10％CO₂和80％N₂)中，加入不同厭氧密閉管(已含有酵解培養(yǎng)基)中。將所有厭氧密閉管在TC-2112B恒溫?fù)u床中進(jìn)行酵解培養(yǎng)(37℃，160rpm)。

2.2試驗結(jié)果

1.pH測定

在酵解0、12和24h時，取樣進(jìn)行酵解pH測定分析。吸取酵解培養(yǎng)物于測試管，并將測試管置于冰水浴中20min。通過pH計測定酵解培養(yǎng)物中的pH值。每個樣品重復(fù)測定3次。計算均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

測定結(jié)果見圖4。pH值變化時酵解過程總的指標(biāo)之一。在體外厭氧發(fā)酵中濃度為10mg/mL時，酵解培養(yǎng)物的最初pH值為7.5左右，隨著酵解時間的延長(0h至24h)，pH值逐漸減低。研究發(fā)現(xiàn)，在酵解24h內(nèi)，具有泡葉藻硫酸酯化多糖的酵解培養(yǎng)物(AnP2-1)的pH值始終低于空白酵解培養(yǎng)物(Blank)的pH值。與空白組相比，泡葉藻硫酸酯化多糖可以降低厭氧發(fā)酵體系的pH值，這與AnP2-1酵解培養(yǎng)物含有比Blank酵解培養(yǎng)物顯著增加的短鏈脂肪酸有關(guān)。腸道內(nèi)pH值的降低會使有害菌無法生長繁殖，有效減少甲酸、吲哚、和對-苯甲酚等有毒有害腸道腐敗物生成，并降低有害酶，如β-葡萄糖醛酸酶等的生成量和代謝活性，有益于機(jī)體健康。

2.短鏈脂肪酸(SCFA)測定

將糞便培養(yǎng)物離心15min，上清液用于測定。色譜分析通過Agilent 6890N氣相色譜和HP-INNOWAX色譜柱進(jìn)行。GC分析條件：FID檢測器，載氣為N₂；N₂的流速為19.0mL/min，分流比為1:10?？諝獾牧魉贋?00mL/min，H₂的流速30mL/min；檢測器溫度為240℃，進(jìn)樣口溫度為240℃；升溫程序為100℃(0.5min)-180℃(4℃/min)。樣品進(jìn)樣量為0.2μL，每次測定時間為20.5min。每個樣品均進(jìn)行3次獨立重復(fù)測定。通過HP Chem工作站軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。同時進(jìn)行統(tǒng)計分析。

對建立的GC方法的方法學(xué)驗證參照食品藥品監(jiān)督局(FDA)關(guān)于生物分析方法驗證的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。每個分析物的最低檢測限(LLOD)等于每個分析物相對于噪音信號5倍的濃度(峰面積)，即測定5個空白中添加的某種標(biāo)準(zhǔn)分析物的濃度。不同標(biāo)準(zhǔn)分析物繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為：乙酸2-80mmol/L；丙酸1.5-60mmol/L；正丁酸1-50mmol/L；異丁酸0.1-5mmol/L；正戊酸0.1-5mmol/L；異戊酸0.1-5mmol/L(每個標(biāo)準(zhǔn)分析物設(shè)定10個濃度梯度，每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)分析物平行測定三次)。通過測定樣品的回收率確定方法的準(zhǔn)確度。

測定結(jié)果見圖5。腸道代謝物是生物化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物，并能從某種程度上反映生命過程的本質(zhì)。功能性多糖不能在消化道前段降解，但可被胃腸道特別是盲腸微生物代謝利用，從而改變微生物菌群的構(gòu)成，促進(jìn)腸道有益菌的生長，抑制病原菌的滋生，并產(chǎn)生大量的酵解產(chǎn)物，主要是乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸(SCFA)。這些SCFA的氧化能夠為人體結(jié)腸組織提供超過70％的氧供組織消耗。同時，乙酸能被大腦、心臟和外周組織氧化。丙酸可抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A的活性，從而降低膽固醇的合成，影響肝臟和膽固醇代謝。丁酸可以被上皮細(xì)胞吸收利用，具有抗炎性，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，并能影響粘液層的組成。SCFA對于維持水電解質(zhì)平衡、抗病原微生物以及調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道功能等具有重要作用。圖5表明，與Blank組相比，AnP2-1組能夠顯著促進(jìn)乙酸、乳酸、丙酸和丁酸的生成，有利于維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和平衡。

3.實時定量PCR技術(shù)定量分析腸道菌群

以低聚果糖(FOS)為陽性對照，采取與AnP2-1相同的試驗條件進(jìn)行體外厭氧發(fā)酵試驗，通過實時定量PCR技術(shù)定量分析技術(shù)得到糞便的菌群組成。糞便中腸道菌群主要門的相對豐度如圖6所示。

人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，其中大量的微生物稱腸道菌群。腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)的改變和一些復(fù)雜得到疾病如行為失調(diào)、代謝性疾病等有關(guān)。比如自閉癥、肝性腦病、過敏癥、肥胖病、糖尿病及各種神經(jīng)疾病等。腸道菌群主要是由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)等組成。其中最主要的是擬桿菌門和厚壁菌門，占據(jù)著超過98％的絕對優(yōu)勢。

厚壁菌門是人體及高等哺乳動物腸道內(nèi)最具優(yōu)勢的一大類細(xì)菌，能夠幫助宿主從飲食中吸收能量，從而與肥胖、糖尿病代謝性疾病的發(fā)生相關(guān)。厚壁菌門也具有降解人體所不能降解的多糖、為人體提供能量的作用。擬桿菌門是人體腸道內(nèi)第二大類優(yōu)勢類群，具有碳水化合物發(fā)酵、參與多糖代謝、膽汁酸和類固醇代謝、維持腸道正常生理等諸多功能，對人體健康有重要影響。

如圖6所示，為發(fā)酵24h后菌群的在門水平的變化情況。由圖6可得，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度最高，為糞便中的優(yōu)勢菌群。相比于空白對照組(Blank)，陽性對照組(FOS)中的放線菌門的相對豐度較高，說明低聚果糖作為一種益生元，主要通過促進(jìn)益生菌群的生長繁殖進(jìn)行腸道功能的調(diào)節(jié)。而泡葉藻硫酸酯化多糖AnP2-1有明顯的富集擬桿菌門的作用，顯著降低厚壁菌門/擬桿菌門的比例，同時降低梭桿菌門的比例?，F(xiàn)代研究表明，厚壁菌門與擬桿菌門比值與肥胖等慢性代謝性疾病相關(guān)，患有全身性代謝疾病的人體內(nèi)的厚壁菌門/擬桿菌門水平較高。由此可見，AnP2-1對腸道功能的調(diào)節(jié)機(jī)制不同于低聚果糖，AnP2-1可顯著降低厚壁菌門/擬桿菌門的比例，其是通過調(diào)節(jié)腸道菌群的比例，促進(jìn)腸道平衡，對調(diào)節(jié)腸道功能具有重要作用。

試驗例3

1.實驗動物：

剛斷乳的雄性SD大鼠，100只，購于江蘇省實驗動物中心。

2.食源性肥胖大鼠造模：

10只為標(biāo)準(zhǔn)全價鼠飼料喂養(yǎng)，90只采用高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4個月后，以體重超過正常飼料喂養(yǎng)老鼠體重平均值的40％為肥胖標(biāo)準(zhǔn)，造模成功58只。高脂飼料的配方為：標(biāo)準(zhǔn)全價鼠飼料50％、豬油17％、蔗糖10％、奶粉5％、花生5％、雞蛋10％、麻油1％、及食鹽2％。

3.分組及處理方法：

將肥胖大鼠隨機(jī)分為3組，每組18只。

空白組：模型對照大鼠，灌胃等溶劑生理鹽水，連續(xù)2個月。

實驗組：將實施例1制備的AnP-1和AnP2-1溶于水，以40mg/kg·bw的劑量，連續(xù)灌胃2個月。

4.觀察指標(biāo)

在實驗前后，分別用電子稱稱量大鼠的體重(g)，并計算降低率，降低率＝給藥后的降低的體重/給藥前的體重×100％，結(jié)果如表1所示：

表1.大鼠體重變化情況表

由表1可知：在連續(xù)給藥2個月后，相比于空白組，AnP-1組的大鼠體重的降低幅度很小，AnP2-1組的大鼠體重顯著降低。具體地，AnP-1組的大鼠體重降低19±10.57g，降低率為2.92±1.36％；AnP2-1組的大鼠體重降低127±13.71g，降低率為19.9±6.18％。由此表明AnP2-1具有很好的減肥功效。這主要是由于AnP2-1能夠調(diào)節(jié)腸道菌群水平，維持腸道正常功能，促進(jìn)乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的生產(chǎn)，降低膽固醇等的生成。同時，通過調(diào)節(jié)腸道菌群水平，降低腸道中厚壁菌門/擬桿菌門水平，減少機(jī)體對于能量物質(zhì)的吸收和利用，達(dá)到減肥功效。

綜上所述，本發(fā)明實施例的泡葉藻硫酸酯化多糖的分子量較大，具有穩(wěn)定的活性結(jié)構(gòu)，硫酸根含量高，具有腸道益生功能，能夠應(yīng)用于制備腸道益生功能產(chǎn)品。其制備方法簡單，工藝條件溫和，制備過程中不使用酸堿等有毒有害試劑，適合規(guī)模化生產(chǎn)，且制得的產(chǎn)品純度高。

以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。