本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于抗炎的9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺類衍生物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

炎癥(inflammation)是機(jī)體對(duì)病原體刺激所發(fā)生的防御反應(yīng)，以血管反應(yīng)為中心，伴隨實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞的再生以修復(fù)受損組織。通常情況下，炎癥是一個(gè)自限性過(guò)程，隨著致炎因素消失，促炎反應(yīng)介質(zhì)與抗炎反應(yīng)介質(zhì)達(dá)到平衡，炎癥消退，但在某些特殊情況下，致炎因素持續(xù)性低強(qiáng)度刺激，使炎癥反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，轉(zhuǎn)為慢性炎癥(chronic inflammation)，這種持續(xù)存在、無(wú)法消退的炎癥也稱為非可控性炎癥(non-resolving inflammation)。適度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，而慢性非可控性炎癥對(duì)機(jī)體造成的損傷則遠(yuǎn)甚于致炎因素本身機(jī)體產(chǎn)生炎癥，會(huì)引起物質(zhì)代謝障礙，細(xì)胞變性和壞死。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體炎癥在某些因素的影響下，還會(huì)誘發(fā)心血管疾病和癌癥等嚴(yán)重危害人們健康的疾病。

6-芐基嘌呤化合物絡(luò)合金離子(inhibitor 3)具有很強(qiáng)的抗炎活性，能夠顯著降低由LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多種炎癥因子的表達(dá)量，包括TNF-α、IL-1β等，產(chǎn)生的抗炎效果可以達(dá)到目前臨床上使用的吲哚美辛水平。但對(duì)化合物inhibitor 3進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析后，發(fā)現(xiàn)inhibitor 3存在一些不足之處，具體如下：由于inhibitor 3含有金離子，使得藥物生產(chǎn)成本增加，加重了患者的治療負(fù)擔(dān)；如果長(zhǎng)期服用，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)金元素的堆積，誘發(fā)藥物的副作用，限制了其對(duì)慢性炎癥的治療；化合物含有重金屬元素，改變嘌呤化合物的極性，導(dǎo)致化合物在體內(nèi)的溶解性和生物學(xué)利用度不高?；谏鲜龅姆治?，可以對(duì)inhibitor 3進(jìn)行有針對(duì)性的設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化(見(jiàn)圖1)，以期待得到一種高效和廉價(jià)的抗炎效果好的化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺類衍生物及其制備方法和應(yīng)用，該9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺類衍生物具有較好的抗炎活性，具有作為抗炎藥物的潛力。

一種9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺類衍生物，結(jié)構(gòu)如式(I)所示：

式(I)中，R選自氫原子、C₁～C₄烷基、取代或者未取代的芐基中的一種，其中，芐基上的取代基獨(dú)立地選自鹵素、-CF₃、C₁～C₄烷氧基、C₁～C₄烷基和硝基中的一個(gè)或者多個(gè)；

R₄為取代或者未取代的苯基或者芐基，其中，苯基或者芐基上的取代基為鹵素或者甲氧基中的一個(gè)或者多個(gè)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，同6-芐基嘌呤化合物絡(luò)合金離子(inhibitor 3)相比，本發(fā)明的9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺衍生物對(duì)炎癥因子的抑制率更高，具有更好的抗炎活性，具有作為抗炎藥物的潛力。

作為優(yōu)選，所述的R₄為其中表示連接位置。

即所述的9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺類衍生物的結(jié)構(gòu)如下：

作為優(yōu)選，所述的9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺衍生物，結(jié)構(gòu)如式(Ⅱ)～(Ⅳ)中的一種所示：

式(II)中，R₁獨(dú)立地選自H、-CH₃；

式(III)中，R₂獨(dú)立地選自F、Cl、-C(CH₃)₃、異丁基、-CF₃、-OCH₃和-NO₂中的一個(gè)或者多個(gè)。

作為優(yōu)選，式(II)所示的化合物為L(zhǎng)₁～L₂中的一種，式(III)所示的化合物為L(zhǎng)₃～L₁₀中的一種，取代基的種類和位置如具體實(shí)施方式中的表1所示。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺衍生物為下列具體化合物

中的一種：

N-(2-氯芐基)-9-甲基-9H-嘌呤-6-胺，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

N-(2-氯芐基)-9-(4-氯芐基)-9H-嘌呤-6-胺，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

N-(2-氯芐基)-9-(3,5-二甲氧基芐基)-9H-嘌呤-6-胺，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

本發(fā)明還提供了一種所述的9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺衍生物的制備方法，包括以下步驟

步驟1：6-氯嘌呤為原料與鄰氯芐胺取代反應(yīng)制得N-(2-氯芐基)-9H-嘌呤-6-胺。

步驟2：所述步驟1中制得的N-(2-氯芐基)-9H-嘌呤-6-胺為中間體經(jīng)過(guò)取代反應(yīng)引入9位取代基。

進(jìn)一步地說(shuō)，具體包括如下步驟：

步驟1：稱取80mg 6-氯嘌呤于25mL圓底燒瓶中并加入5mL正丁醇，超聲溶解，然后加入147mg 2-氯芐胺，2-氯芐胺與6-氯嘌呤的摩爾比為2:1，并加入50μL三乙胺作為催化劑。在110℃油浴加熱回流攪拌5h，取反應(yīng)液進(jìn)行TLC跑板，紫外熒光下觀察反應(yīng)完全，冷卻，抽濾得固體，重結(jié)晶得到6-(2-氯芐胺基)嘌呤。

步驟2：稱取90mg 6-(2-氯芐胺基)嘌呤以及L₂-L₉對(duì)應(yīng)的不同結(jié)構(gòu)的鹵代烴于適量的圓底燒瓶中，鹵代烴與6-(2-氯芐胺基)嘌呤的摩爾比為2：1，量取適量溶劑乙腈，并加入80mg碳酸鉀作為催化劑。在80℃油浴加熱回流攪拌24h，進(jìn)行減壓旋干。加入適量水，所得固體抽濾取出，液體用乙酸乙酯萃取后旋干制沙，合并所有固體，利用柱層析進(jìn)行純化。所述的R選自甲基取代或者未取代的芐基。

結(jié)構(gòu)如式(I)～(Ⅲ)共合成了10個(gè)化合物，L_1-10，抗炎活性L₁最好

本發(fā)明還提供了一種所述的9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺類衍生物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述的抗炎藥物包含治療有效量的9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺衍生物和藥用輔料。

所述的抗炎藥物的劑型為注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、軟膏劑、控釋劑、緩釋劑或納米制劑。

同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明的9-取代-N-(2-氯芐基)嘌呤-6-胺衍生物對(duì)試驗(yàn)用細(xì)胞有一定抑制作用，表現(xiàn)出一定的抗炎活性。合成的化合物L(fēng)₁、L₄對(duì)炎癥因子的抑制率普遍高于陽(yáng)性對(duì)照藥6-芐基嘌呤化合物絡(luò)合金離子(inhibitor 3)，所以這類化合物具有較好的抗炎作用。

附圖說(shuō)明

圖1為現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)6-芐基嘌呤化合物絡(luò)合金離子(inhibitor 3)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化的方式；

圖2為本發(fā)明所有目標(biāo)化合物毒性檢測(cè)的示意圖；

圖3為本發(fā)明所有目標(biāo)化合物作用于抑制炎癥因子的抑制率的示意圖；

圖4為本發(fā)明所有目標(biāo)化合物作用于抑制炎癥因子的抑制率的示意圖；

圖5為本發(fā)明所有目標(biāo)化合物作用于NO的抑制率的示意圖；

圖6為本發(fā)明所有目標(biāo)化合物作用于抑制COX和iNOS的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。

一、化合物的合成

實(shí)施例1～2 L1-L2的合成

步驟1：稱取80mg 6-氯嘌呤于25mL圓底燒瓶中并加入5mL正丁醇，超聲溶解，然后加入147mg 2-氯芐胺，2-氯芐胺與6-氯嘌呤的摩爾比為2:1，并加入50μL三乙胺作為催化劑。在110℃油浴加熱回流攪拌5h，進(jìn)行TLC跑板監(jiān)測(cè)，紫外熒光下觀察反應(yīng)完全，冷卻，抽濾得固體，重結(jié)晶得到6-(2-氯芐胺基)嘌呤。

步驟2：稱取90mg 6-(2-氯芐胺基)嘌呤與氯代甲烷于適量的圓底燒瓶中，氯代甲烷與6-(2-氯芐胺基)嘌呤的摩爾比為2：1，量取適量溶劑乙腈，并加入80mg碳酸鉀作為催化劑。在80℃油浴加熱回流攪拌24h，進(jìn)行減壓旋干。加入適量水，所得固體抽濾取出，液體用乙酸乙酯萃取后旋干制沙，合并所有固體，利用柱層析進(jìn)行純化得到L₁-L₂化合物的純品。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和分子量見(jiàn)表1。

反應(yīng)式如下：

實(shí)施例3～10 L₃-L₁₀的合成

步驟1：稱取80mg 6-氯嘌呤于25mL圓底燒瓶中并加入5mL正丁醇，超聲溶解，然后加入147mg 2-氯芐胺，2-氯芐胺與6-氯嘌呤的摩爾比為2:1，并加入50μL三乙胺作為催化劑。在110℃油浴加熱回流攪拌5h，取反應(yīng)液進(jìn)行TLC跑板，紫外熒光下觀察反應(yīng)完全，冷卻，抽濾得固體重結(jié)晶得到6-(2-氯芐胺基)嘌呤。

步驟2：稱取90mg 6-(2-氯芐胺基)嘌呤以及L₃-L₁₀對(duì)應(yīng)的不同結(jié)構(gòu)的鹵代烴于適量的圓底燒瓶中，鹵代烴與6-(2-氯芐胺基)嘌呤的摩爾比為2：1，量取適量溶劑乙腈，并加入80mg碳酸鉀作為催化劑。在80℃油浴加熱回流攪拌24h，進(jìn)行減壓旋干。加入適量水，所得固體抽濾取出液體用乙酸乙酯萃取后旋干制沙，合并所有固體，利用柱層析進(jìn)行純化。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和分子量見(jiàn)表1。

反應(yīng)式如下：

R＝F、Cl、-C(CH₃)₃、-CF₃、-OCH₃或-NO₂

實(shí)施例11 W₁的合成

稱取1mmol的6-氯嘌呤以及2mmol的對(duì)氟芐胺于25mL圓底燒瓶中，其兩種原料的摩爾比為1：2，并加入5mL溶劑正丁醇，并加入50μL的三乙胺作為催化劑，在110℃油浴加熱回流攪拌5h，取反應(yīng)液進(jìn)行TLC跑板，紫外熒光下觀察反應(yīng)完全，冷卻，抽濾，重結(jié)晶得到W₁產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和分子量見(jiàn)表2。

反應(yīng)式如下：

實(shí)施例12-18 W₂-W₈的合成

稱取1mmol的6-氯嘌呤以及2mmol的W₂-W₈對(duì)應(yīng)的苯胺類化合物于25mL圓底燒瓶中，其兩種原料的摩爾比為1：2，并加入5mL溶劑正丁醇，并加入50μL的三乙胺作為催化劑，在110℃油浴加熱回流攪拌5h，取反應(yīng)液進(jìn)行TLC跑板，紫外熒光下觀察反應(yīng)完全，冷卻，抽濾，重結(jié)晶得到W₂-W₈。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和分子量見(jiàn)表2。

反應(yīng)式如下：

R＝F、Cl、OH、-OCH₃；其中，表示取代位置

實(shí)施例19-20 W₉-W₁₀的合成

稱取1mmol的6-氯嘌呤以及2mmol的W₉-W₁₀對(duì)應(yīng)的胺類化合物于25mL圓底燒瓶中，其兩種原料的摩爾比為1：2，并加入5mL溶劑正丁醇，并加入50μl的三乙胺作為催化劑，在110℃油浴加熱回流攪拌5h，取反應(yīng)液進(jìn)行TLC跑板，紫外熒光下觀察反應(yīng)完全，冷卻，抽濾，重結(jié)晶得到W₉-W₁₀。

反應(yīng)式如下：

其中，表示取代位置

表1 化合物L(fēng)₁-L₁₀的結(jié)構(gòu)及物理數(shù)據(jù)

表2 化合物W₁-W₁₀的結(jié)構(gòu)及物理數(shù)據(jù)

化合物L(fēng)₁-L₁₀、W₁-W₁₀的ESI-MS，¹H-NMR和¹³C-NMR數(shù)據(jù)

N-(2-chlorobenzyl)-9H-purin-6-amine(L1)

White powder,Yield：85.6％,Mp:156.1-158.9℃,ESI-MS[M+H]+:260.2,¹H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm):12.987(m,1H,9-Purine-H),8.140-8.157(m,3H,2,8-Purine-H+NH),7.432-7.439(m,1H,3'-2-Cl-Ph-H),7.252-7.283(m,3H,4',5',6'-2-Cl-Ph-H),4.760(s,2H,CH₂).¹³C-NMR(600MHz,DMSO-d6):152.343,139.107,131.711,129.020,128.226,127.970,127.052.

N-(2-chlorobenzyl)-9-methyl-9H-purin-6-amine(L2)

White powder,Yield:50.5％；Mp:120.1-123.2℃；ESI-MS[M+H]+:274.3；¹H-NMR(600MHz,CD₃Cl):δ(ppm):8.414(s,1H,2-Purine-H),7.752(s,1H,8-P urine-H),7.473-7.487(m,1H,3-Ph-H),7.370-7.385(m,1H,6-Ph-H),7.201-7.260(m,2H,4,5-Ph-H),6.474(s,1H,NH),4.975(s,2H,CH₂),4.226(s,3H,9-CH₃).¹³C-N MR(600MHz,CD₃Cl):δ(ppm):154.828,153.181,139.476,136.192,133.816,129.689128.912,127.083,120.112,38.954,15.722.

N-(2-chlorobenzyl)-9-(4-fluorobenzyl)-9H-purin-6-amine(L3)

Light Yellow powder,Yield:45.2％；Mp:150.1-152.9℃；ESI-MS[M+H]+:368.2；¹H-NMR(600MHz,CD₃Cl):δ(ppm):8.435(s,1H,2-Purine-H),7.678(s,1H,8-Purine-H),7.493-7.502(m,1H,3'-2-Cl-Ph-H),7.363-7.366(m,1H,6'-2-Cl-Ph-H),7.260-7.286(m,2H,4',5'-2-Cl-Ph-H),7.193-7.213(m,2H,2',6'-4-F-Ph-H),7.013-7.041(m,2H,3',5'-4-F-Ph-H),6.459(s,1H,NH),5.319(s,2H,9-CH₂),4.926(s,2H,NHCH₂).¹³C-NMR(600MHz,CD₃Cl):163.612,161.971,154.872,139.684,136.095,133.853,131.658,129.956,129.756,128.974,127.100,116.235,46.635,32.075,29.507.

9-(4-(tert-butyl)benzyl)-N-(2-chlorobenzyl)-9H-purin-6-amine(L4)

Yellow powder,Yield:45.2％；Mp:140.1-142.8℃；ESI-MS[M+H]+:406.2；¹H-NMR(600MHz,CD₃Cl):δ(ppm):8.440(s,1H,2-purine-H),7.673(s,1H,8-pur ine-H),7.192-7.484(m,8H,Ph-H),6.465(s,1H,NH),5.434(s,2H,9'-CH₂),4.966(s,2H,N-CH₂),1.257(s,9H,CH₃).¹³C-NMR(600MHz,CD₃Cl):154.916,153.709,139.803,139.671,133.894,130.029,130.723,129.747,129.035,128.039,127.126,126.196,46.752.

N-(2-chlorobenzyl)-9-(4-chlorobenzyl)-9H-purin-6-amine(L5)

Green powder,Yield:56.2％；Mp:149.2-152.8℃；ESI-MS[M+H]+:384.6；¹H-NMR(600MHz,CD₃Cl):δ(ppm):8.412(s,1H,2-Purine-H),7.672(s,1H,8-Pur ine-H),7.474-7.484(m,1H,3'-2-Cl-Ph-H),7.335-7.365(m,1H,6'-2-Cl-Ph-H),7.302-7.326(m,2H,4',5'-2-Cl-Ph-H),7.183-7.236(m,4H,2',3',5',6'-4-Cl-Ph-H),6.456(s,1H,NH),5.316(s,2H,9-CH₂),4.964(s,2H,N-CH₂).¹³C-NMR(600MHz,CD₃C l):154.891,153.652,145.231,139.710,136.027,133.176,130.419,129.394,129.099,128.721,128.929,127.142,125.915,46.651,29.835.

N-(2-chlorobenzyl)-9-(3-nitrobenzyl)-9H-purin-6-amine(L6)

Yellow powder,Yield：46.9％；Mp:160.8-162.7℃；ESI-MS[M+H]+:395.1；¹H-NMR(600MHz,CD₃Cl):δ(ppm):8.425(s,1H,2-Purine-H),8.177(s,1H,2'-3-NO₂Ph-H),8.163(m,1H,4'-3-NO₂Ph-H),7.744(s,1H,8-Purine-H),7.599-7.612(m,1H,2'-2-Cl-Ph-H),7.481-7.536(m,2H,5',6'-3-NO₂Ph-H),7.360-7.375(m,1H,6'-2-Cl-Ph-H),7.199-7.215(m,2H,4',5'-2-Cl-Ph-H),6.456(s,1H,NH),5.316(s,2H,9-CH₂),4.964(s,2H,N-CH₂).¹³C-NMR(600MHz,CD₃Cl):154.921,153.728,148.732,139.484,137.947,135.928,130.332,130.032,129.724,129.014,123.527,122.730,46.501.

N-(2-chlorobenzyl)-9-(4-methoxybenzyl)-9H-purin-6-amine(L7)

Light Yellow powder，Yield:47.3％；Mp:164.3-166.9℃；ESI-MS[M+H]+:380.7；¹H-NMR(600MHz,CD₃Cl):δ(ppm):8.445(s,1H,2-Purine-H),7.675(s,1H,8-Purine-H),7.498-7.513(m,1H,3'-2-Cl-Ph-H),7.362-7.373(m,1H,6'-2-Cl-Ph-H),7.210-7.289(m,2H,4',5'-2-Cl-Ph-H),7.191-7.248(m,2H,2,6'-4-OCH₃-Ph-H),6.860-6.886(m,2H,3',5'-4-OCH₃-Ph-H),6.350(s,1H,NH),5.277(s,2H,9-C H₂),4.615(s,2H,NHCH₂),3.801(s,3H,OCH₃).¹³C-NMR(600MHz,CD₃Cl):159.831,154.802,154.402,139.833,133.864,129.974,129.721,137.102,114.547,55.426,46.922.

N-(2-chlorobenzyl)-9-(3,5-dimethoxybenzyl)-9H-purin-6-amine(L8)

White powder,Yield:45.6％；Mp:175.2-178.1℃；ESI-MS[M+H]+:410.1；¹H-NMR(600MHz,CD₃Cl):δ(ppm):8.432(s,1H,2-Purine-H),7.665(s,1H,8-Pu rine-H),7.464-7.578(m,1H,3'-2-Cl-Ph-H),7.352-7.365(m,1H,6'-2-Cl-Ph-H),7.174-7.210(m,2H,4',5'-2-Cl-Ph-H),6.515-6.525(m,1H,4'-3,5-OCH₃-Ph-H),6.404(s,2H,2',6'-3,5-OCH₃-Ph-H),6.388(s,1H,NH),5.268(s,2H,9-CH₂),4.905(s,2H,N-CH₂),3.737(s,6H,OCH₃).¹³C-NMR(600MHz,CD₃Cl):161.441,154.862,153.439,139.934,137.936,136.123,133.822,129.914,129.694,128.943,127.033,106.022,100.132,55.512,47.313.

N-(2-chlorobenzyl)-9-(4-(trifluoromethyl)benzyl)-9H-purin-6-amine(L9)

White powder,Yield:81.3％；Mp:170.7-172.5℃；ESI-MS[M+H]+:418.3；¹H-NMR(600MHz,CD₃Cl)：δ(ppm)：8.343(s,1H,2-Purine-H),7.874(s,1H,8-Pur ine-H),7.593-7.606(d,2H,3',5'-4-CF₃-Ph-H,J＝7.8Hz),7.480-7.495(m,1H,3'-2-Cl-Ph-H),7.369-7.383(m,3H,4',5',6'-2-Cl-Ph-H),7.191-7.229(m,2H,2',6'-4-CF₃-Ph-H),6.251(s,1H,NH),5.464(s,2H,9-CH₂),4.872(s,2H,N-CH₂).¹³C-NMR(600MH z,CD₃Cl):154.922,153.714,139.805,139.676,133.892,130.203,129.735,129.034,128.034,127.143,126.204,46.745.

N-(2-chlorobenzyl)-9-(3-methoxybenzyl)-9H-purin-6-amine(L10)

White powder,Yield：47.3％；Mp:145.2-147.1℃；ESI-MS[M+H]+:380.4；¹H-NMR(600MHz,CD₃Cl):δ(ppm):8.423(s,1H,2-Purine-H),7.654(s,1H,8-Purine-H),7.489-7.532(m,1H,3'-2-Cl-Ph-H),7.384-7.396(m,1H,6'-2-Cl-Ph-H),7.195-7.213(m,2H,4',5'-2-Cl-Ph-H),6.819-6.855(m,4H,2',4',5',6'-3-OCH₃-Ph-H),6.591(s,1H,NH),5.834(s,2H,9-CH₂),4.956(s,2H,N-CH₂),3.873(s,3H,-OCH₃).¹³C-NMR(600MHz,CD₃Cl):160.223,154.821,153.452,139.953,137.251,136.121,133.833,130.237,129.492,129.751,128.954,127.106,120.130,113.823,55.243,47.244,42.446.

N-(4-fluorobenzyl)-9H-purin-6-amine(W1)

Yellow powder,Yield：80.1％；Mp:155.2-157.1℃；ESI-MS[M+H]⁺:244.2；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm):12.961(s,1H,9-Purine-H),8.653(s,1H,2-Purine-H),8.093(s,1H,8-Purine-H),7.285-7.337(d,2H,2,6-Ph-H,J＝8.0Hz),7.124-7.243(d,2H,3,5-Ph-H,J＝8.0Hz),6.721(s,1H,NH),5.901(s,2H,N-CH₂).¹³C-N MR(600MHz,DMSO-d6):154.787,152.314,151.236,139.154,128.546,126.784,119.414,43.024.

N-(3-methoxyphenyl)-9H-purin-6-amine(W2)

Yellow powder,Yield/％:76.5；Mp:146.2-149.1℃；ESI-MS[M+H]⁺:242.3；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm):10.891(s,1H,9-Purine-H),8.621(s,1H,2-Purine-H),8.232(s,1H,8-Purine-H),7.209-7.232(m,1H,6-Ph-H),7.120-7.134(m,2H,4,5-Ph-H),6.825-6.825(m,1H,2-Ph-H),6.571(s,1H,NH),3.762(s,3H,CH₃).¹³C-NMR(600MHz,DMSO-d6):162.121,152.914，150.346,143.734,141.236,129.456,119.224,109.523,108.455,100.235,56.348.

N-(3-chlorophenyl)-9H-purin-6-amine(W3)

Green powder,Yield：86.2％；Mp:135.1-137.9℃；ESI-MS[M+H]⁺:246.7；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm):10.842(s,1H,9-Purine-H),8.622(s,1H,2-Purine-H),7.802(s,1H,8-Purine-H),7.509-7.472(m,1H,6-Ph-H),7.220-7.324(d,2H,4,5-Ph-H),6.927-7.125(d,1H,2-Ph-H),6.651(s,1H,NH).¹³C-NMR(600MHz,DMSO-d6):153.965,152.673,144.984,139.761,136.128,131.245,121.786,118.745,117.563.

N-(4-chloro-3-fluorophenyl)-9H-purin-6-amine(W4)

White powder,Yield:73.9％；Mp:135.1-138.2℃；ESI-MS[M+H]⁺:264.6；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm):10.636(s,1H,9-Purine-H),8.552(s,1H,2-Purine-H),7.792(s,1H,8-Purine-H),7.420-7.424(m,1H,6-Ph-H),7.217-7.255(m,1H,5-Ph-H),7.127-7.225(m,1H,2-Ph-H),6.672(s,1H,NH).¹³C-NMR(600MHz,D MSO-d6):164.39,151.93,150.73,144.96,139.83,131.49,118.18,109.84,107.39.N-(4-chlorophenyl)-9H-purin-6-amine(W5)

White powder,Yield：73.9％；Mp:156.7-158.2℃；ESI-MS[M+H]+:246.2；¹H-NMR(600 MHz,DMSO-d6):δ(ppm)：12.531(s,1H,9-Purine-H),8.141(s,1H,2-Purine-H),7.562(s,1H,8-Purine-H),7.485-7.524(d,2H,2,6-Ph-H,J＝7.6Hz),6.934-7.143(d,2H,3,5-Ph-H,J＝8.0Hz),6.456(s,1H,NH).¹³C-NMR(600MHz,DM SO-d6):153.965,152.674,144.984,139.763,136.124,131,245,121.784,118.741,117.568.

N-(furan-2-ylmethyl)-9H-purin-6-amine(W6)

White powder,Yield:76.4％；Mp:162.2-164.8℃；ESI-MS[M+H]⁺:216.2；¹H-NMR(600 MHz,DMSO-d6):δ(ppm)：12.942(s,1H,9-Purine-H),8.113-8.202(s,3H,2,8-Purine-H+NH),7.538(s,1H,4'-Furan-H),6.358(s,1H,3'-Furan-H),6.230(s,1H,2'-Furan-H),4.694(s,2H,N-CH₂).¹³C-NMR(600MHz,DMSO-d6):154.846,152.795,151.592,146.713,143.575,137.414,119.723,113.454,107.232,39.734.

N-(4-methoxyphenyl)-9H-purin-6-amine(W7)

Grey powder,Yield:74.8％；Mp:161.9-164.2℃；ESI-MS[M+H]⁺:242.2；¹H-NMR(600 MHz,DMSO-d6):δ(ppm):11.291(s,1H,9-Purine-H),8.742(s,1H,2-Purine-H),8.033(s,1H,8-Purine-H),7.585-7.624(d,2H,2,6-Ph-H,J＝8.0Hz),7.034-7.123(d,2H,3,5-Ph-H,J＝8.0Hz),6.744(s,1H,NH),3.963(s,3H,-CH₃).¹³C-N MR(600MHz,DMSO-d6):153.756,153.746,149.243,136.794,133.722,129.563,122.135,119.233,114.483,60.235.

N-((4-((9H-purin-6-yl)amino)phenyl)sulfonyl)acetamide(W8)

Grey powder,Yield：74.3％；Mp:200.1-202.7℃；ESI-MS[M+H]⁺:333.4；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm):12.052(s,1H,9-Purine-H),11.461(s,1H,NH-C＝O),8.843(s,1H,2-Purine-H),8.731(s,1H,8-Purine-H),7.475-7.524(d,2H,3,5-Ph-H,J＝8.0Hz),7.204-7.243(d,2H,2,6-Ph-H,J＝7.8Hz),6.632(s,1H,NH),1.923(s,3H,-CH₃).¹³C-NMR(600MHz,DMSO-d6):172.095,154.283,152.863,144.264,143.791,139.855,129.986,119.778,111.793,28.372.

4-((9H-purin-6-yl)amino)phenol(W9)

White powder，Yield：77.3％；Mp:156.1-157.3℃；ESI-MS[M+H]⁺:228.1；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm):12.091(s,1H,9-Purine-H),8.782(s,1H,2-Purine-H),7.892(s,1H,8-Purine-H),7.285-7.324(d,2H,2,6-Ph-H,J＝7.6Hz),6.934-7.143(d,2H,3,5-Ph-H,J＝8.0Hz),6.561(s,1H,NH),5.534(s,1H,OH).¹³C-NMR(600MHz,DMSO-d6):153.236,151.837,143.924,140.713,138.242,131.232,129.652,123.522,119.235.

6-(pyrrolidin-1-yl)-9H-purine(W10)

White powder,Yield：85.2％；Mp:162.1-164.2℃；ESI-MS[M+H]⁺:190.2；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆):δ(ppm):13.241(s,1H,9-Purine-H),8.742(s,1H,2-Purine-H),8.121(s,1H,8-Purine-H),3.786(m,4H,N-CH₂+N-CH₂),1.879(m,4H,CH₂CH₂).¹³C-NMR(600MHz,DMSO-d₆):159.122,155.124,153.527,149.238,138.955,127.944,125.734,117.684,60.235,42.824.

本發(fā)明所合成目標(biāo)化合物的性狀及其溶解性如下：

化合物L(fēng)_1-2，L_8-10，W_4-6，W_9-10為白色固體。L₃，L₇為淺黃色，W_1-2，L₄，L₆為黃色，L₅，W₃為綠色，W_7-8為灰色。易溶于DMSO、DMF中。

本發(fā)明所合成的化合物，進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)試，正極均顯示了[M+1]⁺，且信號(hào)較強(qiáng)，本發(fā)明所合成的化合物，進(jìn)行¹H-NMR和¹³C-NMR測(cè)試，從¹H-NMR和¹³C-NMR圖譜上可以清楚的看到化合物的氫信號(hào)及其所處的化學(xué)位移。

二、化合物抗炎活性數(shù)據(jù)

1、合成化合物細(xì)胞毒性測(cè)試

(1)細(xì)胞鋪板：1)計(jì)算實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞的密度，小心地吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，接著加入一定量的PBS液把培養(yǎng)液洗干凈，再用胰酶溶液(0.25％)溶解貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞3min，然后往培養(yǎng)基中加入10％的血清，用來(lái)中止胰酶繼續(xù)消化細(xì)胞，吹打瓶壁使得貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞脫離進(jìn)入并且均勻地分散于培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)瓶中加入1640培養(yǎng)液，并將細(xì)胞稀釋至所需的密度44000cells/mL；2)按每個(gè)孔的濃度90μl/well的標(biāo)準(zhǔn)，將所配好的細(xì)胞溶液均勻地加入到96孔酶標(biāo)孔中，用無(wú)菌的PBS填充邊緣孔；3)取出96孔酶標(biāo)培養(yǎng)板，按照要求合理地設(shè)置好實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。其中以inhibitor3作為陽(yáng)性對(duì)照藥，實(shí)驗(yàn)組各組使用一種化合物，每種化合物分別設(shè)成9個(gè)相同的濃度梯度，每個(gè)梯度濃度設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，作為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)照組中的每一個(gè)孔則直接接種100μl細(xì)胞懸液，不加入任何物質(zhì)，可以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是否受到污染；4)最后合適的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，具體要求是在5％CO₂，37℃的條件下，孵育24h。

(2)加入測(cè)試化合物：1)將所合成的測(cè)試化合物和陽(yáng)性對(duì)照物均溶解于100％的DMSO中配置成濃度為200x的溶液；2)用移液槍準(zhǔn)確地吸取上述配置好的溶液7μl到含有133μl的完全培養(yǎng)基中(即稀釋20倍，最后得到為10x的溶液)；3)吸取上述稀釋后的溶液10μL均勻地加入到96孔酶標(biāo)板中(最后得到為1x的溶液)，4)最后在合適的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，具體要求是在5％CO₂，37℃的條件下，孵育24h。

(3)、結(jié)果測(cè)定：1)將步驟(2)中，經(jīng)過(guò)24h孵育的96孔酶標(biāo)板取出，按要求先放置在室溫下30min，備用；2)根據(jù)先前計(jì)算好的量，向每孔加入30μl的Cell Titer-Glo試劑并且搖晃10min用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞并且促使細(xì)胞溶解作用；3)放置在室溫2min后，使得熒光信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)；4)用酶聯(lián)免疫的方法檢測(cè)波長(zhǎng)在570nm處各孔的吸光值，并且準(zhǔn)確地記錄下結(jié)果。最后按照給出的公式，計(jì)算出化合物的抑制率。具體的公式如下：抑制率(％)＝(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/對(duì)照孔OD值X100％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖2為本發(fā)明所有目標(biāo)化合物毒性檢測(cè)的示意圖。從圖2可以看出：合成的化合物毒性均普遍低于陽(yáng)性對(duì)照藥inhibitor 3。

2、ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-1β含量

操作方法：

1)配制肉湯——刺激小鼠產(chǎn)生大量巨噬細(xì)胞

稱取牛肉膏0.15g，蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，可溶性淀粉3g，將肉湯煮至透明，降至室溫才可以腹腔注射。

2)給小鼠注射肉湯2mL，三天后提細(xì)胞(此期間可以將化合物配制好，用DMSO溶解)。

3)提細(xì)胞鋪板：小鼠摘眼，放血減少腹腔中紅細(xì)胞，后斷髓處死，身體用75％酒精消毒，仰位定在泡沫上，固定頭，四肢，尾。在胸廓正中線中位處，用彎鑷夾起隔膜，用注射器向腹腔內(nèi)注射RPMI-1640培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS)3～4ml，輕揉腹部，使巨噬細(xì)胞與培養(yǎng)基混勻。用彎鑷夾起中間隔膜，用手術(shù)剪(豎直方向拿)，剪開隔膜，用移液槍將腹腔內(nèi)液體吸起，移入15ml離心管內(nèi)，離心1100r，5min，棄上清。向已離心的細(xì)胞內(nèi)加入含有FBS的培養(yǎng)基約2ml，反復(fù)輕輕吹打成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)(20μL/孔)，將細(xì)胞分到六孔板1ml上培養(yǎng)(5×10⁵/孔)于37℃，5％CO₂培養(yǎng)。4～6h后，取出用PBS洗，換液。

4)加10μmol濃度的合成化合物1μl，30min后加入LPS(0.5μg/ul)1μl刺激，分為三組：同種類藥+LPS，LPS(刺激組)，con(對(duì)照組，只有細(xì)胞與DMSO)。

5)上述處理完畢后再放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育>24h。

檢測(cè)方法：

(1)包被：取出經(jīng)過(guò)孵化后的培養(yǎng)基，加入40μl的一抗(capure antibody)，1mL的coating buffer(10X)，用移液槍吹打均勻混勻，加入到ELISA板中，每個(gè)孔均加入100μl，用保鮮膜對(duì)ELISA板進(jìn)行包埋，在4℃的條件下過(guò)夜。在此期間配置PBST：將500μl的吐溫20溶解于1000mL的PBS溶液之中。

(2)加入AD進(jìn)行封閉：將過(guò)夜培養(yǎng)之后的培養(yǎng)基倒掉，用PBST洗三次，每個(gè)孔加入250μl的量，每次用移液槍吹打1～2min，最后一次將培養(yǎng)基倒過(guò)來(lái)，輕輕在紙上拍干，按每孔200μl的量加入AD溶液，加完之后，用保鮮膜包好，在搖床上封閉1h。當(dāng)培養(yǎng)基封閉完之后，繼續(xù)用PBST溶液洗三次，每次依舊加入250μl的量，用移液槍輕輕吹打1～2min。在進(jìn)行上述封閉的過(guò)程中，可以將上清液拿出解凍。

(3)加樣：按照每孔100μl的量加入一定的混合溶液，其中樣品占5％，AD占95％，用保鮮膜繼續(xù)包好，并且在搖床上孵育2h。

(4)加入二抗：取出二抗40μl，AD100mL,充分混勻之后，按照每孔100μl的量，加入到上述的ELISA板中，繼續(xù)用保鮮膜進(jìn)行包好，放在搖床上繼續(xù)孵育1h。

(5)加入酶：取出ELISA板后，用PBST洗三次，每孔加入250μl的量，每次用移液槍吹打1～2min，加入HRP酶，每孔的量為100μl，繼續(xù)用保鮮膜進(jìn)行包好，然后放在搖床上繼續(xù)孵育1h。

(6)加入顯色劑：用PBST洗三次，每孔加入250μl的量，每次用移液槍吹打1～2min，在避光的條件下，按照每孔100μl的量加入顯色劑TMP，顯色至藍(lán)色即可。

(7)終止反應(yīng)：取出ELISA板后，向每個(gè)孔加入50μl加入濃度為2mol/L的H₂SO₄。

(8)測(cè)OD值：在波長(zhǎng)為450nm的條件下，測(cè)定對(duì)炎癥因子的吸光度，根據(jù)公式計(jì)算。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖3為本發(fā)明所有目標(biāo)化合物作用于抑制炎癥因子的抑制率的示意圖。從圖3可以看出：合成的化合物L(fēng)₁，L₄，W₂，W₄對(duì)炎癥因子的抑制率高于陽(yáng)性對(duì)照藥inhibitor 3，所以這幾種化合物具有較好的抗炎作用。

通過(guò)比較目標(biāo)化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥可以發(fā)現(xiàn)：化合物L(fēng)₁，L₄，W₂，W₄對(duì)炎癥因子TNF-a和IL-6的抑制率達(dá)到都超過(guò)了50％，最高為80％左右，初步推斷2、9-二取代嘌呤衍生物對(duì)抗炎藥物的研發(fā)有一定的潛力。4個(gè)優(yōu)選化合物抗炎活性的進(jìn)一步研究

通過(guò)第一部分化合物在10μM濃度下對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β含量抑制作用的初篩結(jié)果，得到化合物L(fēng)₁，L₄，W₂和W₄對(duì)炎癥因子TNF-α和IL-1β具有較強(qiáng)的抑制作用。因此，本部分將選取這4個(gè)化合物進(jìn)一步研究其抗炎活性。

3、ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、PGE2和IL-6的含量

具體的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

(1)、包被：取出經(jīng)過(guò)孵化后的培養(yǎng)基，加入40μl的一抗(capure antibody)，1mL的coating buffer(10X)，用移液槍吹打均勻混勻，加入到ELISA板中，每個(gè)孔均加入100μl，用保鮮膜對(duì)ELISA板進(jìn)行包埋，在4℃的條件下過(guò)夜。在此期間配置PBST：將500μl的吐溫20溶解于1000mL的PBS溶液之中。

(2)、加入AD進(jìn)行封閉：將過(guò)夜培養(yǎng)之后的培養(yǎng)基倒掉，用PBST洗三次，每個(gè)孔加入250μl的量，每次用移液槍吹打1～2min，最后一次將培養(yǎng)基倒過(guò)來(lái)，輕輕在紙上拍干，按每孔200μl的量加入AD溶液，加完之后，用保鮮膜包好，在搖床上封閉1h。當(dāng)培養(yǎng)基封閉完之后，繼續(xù)用PBST溶液洗三次，每次依舊加入250μl的量，用移液槍輕輕吹打1～2min。在進(jìn)行上述封閉的過(guò)程中，可以將上清液拿出解凍。

(3)、加樣：按照每孔100μl的量加入一定的混合溶液，其中樣品占5％，AD占95％，用保鮮膜繼續(xù)包好，并且在搖床上孵育2h。

(4)、加入二抗：取出二抗40μl，AD100mL,充分混勻之后，按照每孔100μl的量，加入到上述的ELISA板中，繼續(xù)用保鮮膜進(jìn)行包好，放在搖床上繼續(xù)孵育1h。

(5)、加入酶：取出ELISA板后，用PBST洗三次，每孔加入250μl的量，每次用移液槍吹打1～2min，加入HRP酶，每孔的量為100μl，繼續(xù)用保鮮膜進(jìn)行包好，然后放在搖床上繼續(xù)孵育1h。

(6)、加入顯色劑：用PBST洗三次，每孔加入250μl的量，每次用移液槍吹打1～2min，在避光的條件下，按照每孔100μl的量加入顯色劑TMP，顯色至藍(lán)色即可。

(7)、終止反應(yīng)：取出ELISA板后，向每個(gè)孔加入50μl加入濃度為2mol/L的H₂SO₄。

(8)、測(cè)OD值：在波長(zhǎng)為450nm的條件下，測(cè)定對(duì)炎癥因子的吸光度，根據(jù)公式計(jì)算。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖4為本發(fā)明所有目標(biāo)化合物作用于抑制炎癥因子的抑制率的示意圖。從圖4可以看出：合成的化合物L(fēng)₁，L₄，W₂和W₄對(duì)幾種炎癥因子的抑制率普遍接近或高于陽(yáng)性對(duì)照藥inhibitor 3，且有一定劑量依賴性，所以這類化合物具有較好的抗炎作用。

通過(guò)比較目標(biāo)化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥可以發(fā)現(xiàn)：化合物L(fēng)₁，L₄，W₂和W₄對(duì)幾種炎癥因子抑制率普遍接近或高于陽(yáng)性對(duì)照藥inhibitor 3，初步推斷2,9-二取代嘌呤衍生物對(duì)抗炎藥物的研發(fā)有一定的潛力。

4、NO含量的測(cè)定

具體的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

(1)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞株購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海分院的細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)條件：雙抗生素(鏈霉素和青霉素)和10％的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，并放在37℃，5％CO₂培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)。

(2)Griess法檢測(cè)NO的含量：取對(duì)數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，加入LPS，培養(yǎng)30min，加入藥物2.5,5,10,20μmol，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。取細(xì)胞培養(yǎng)液，離心(6000rpm,5min)，取10μl細(xì)胞上清液，加入Griess試劑(2％對(duì)氨基苯磺酰胺用5％H₃PO₄配制，0.2％的奈乙烯二胺)100μl與之混勻,室溫避光靜置10min,用酶標(biāo)儀于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,計(jì)算樣品中的NO含量。

抑制NO含量結(jié)果：圖5為本發(fā)明所有目標(biāo)化合物作用于NO的抑制率的示意圖。從圖5可以看出：合成的化合物合成的化合物L(fēng)₁，L₄，W₂和W₄對(duì)幾種炎癥因子的抑制率普遍接近或高于陽(yáng)性對(duì)照藥inhibitor 3，且有一定劑量依賴性，所以這類化合物具有較好的抗炎作用。

通過(guò)比較目標(biāo)化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥可以發(fā)現(xiàn)：化合物L(fēng)₁，L₄，W₂和W₄對(duì)幾種炎癥因子的抑制率普遍接近或高于陽(yáng)性對(duì)照藥inhibitor 3，且有一定劑量依賴性，初步推斷2,9-二取代嘌呤衍生物對(duì)抗炎藥物的研發(fā)有一定的潛力。

5、RT-PCR的測(cè)定

具體的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

(1)、RNA含量的測(cè)定：利用TRIzol方法提取RNA，根據(jù)計(jì)算加入和適量的TRIzol試劑，混合后靜置5min,按TRIzol:氯仿＝5:1的量加入氯仿，靜置3min，然后在12000rpm，4℃離心15min，吸取含有RNA水層進(jìn)入新的離心管；按TRIzol:異丙醇＝1:2的量加入異丙醇，靜置10min，然后12000rpm，4℃離心10min，留沉淀，棄上清；按TRIzol:75％的乙醇(DEPC配置)，離心，小心棄去上清。

(2)、RNA濃度和純度的測(cè)定：分別用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA的完整性和濃度。

(3)、RT-PCR:

反應(yīng)體系：

引物序列：qmCOX2(74bp)：

Forward Primer5'TGAGCAACTATTCCAAACCAGC3'

Reverse Primer5'GCACGTAGTCTTCGATCACTATC3'

qmGAPDH(149bp)：

Forward Primer5'TATGTCGTGGAGTCTACTGGT 3'

Reverse Primer 5'GAGTTGTCATATTTCTCGTGG 3'

qmiNOS(127bp)：

Forward Primer5'GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA3'

Reverse Primer 5'GTGGACGGGTCGATGTCAC 3'

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖6為本發(fā)明所有目標(biāo)化合物作用于抑制COX和iNOS的示意圖。從圖6可以看出：合成的化合物L(fēng)₁，L₄，W₂和W₄對(duì)COX和iNOS的抑制率普遍接近或高于陽(yáng)性對(duì)照藥inhibitor 3，且有一定劑量依賴性，所以這類化合物具有較好的抗炎作用。

通過(guò)比較目標(biāo)化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥可以發(fā)現(xiàn)：化合物L(fēng)₁，L₄，W₂和W₄對(duì)幾種炎癥因子的抑制率普遍接近或高于陽(yáng)性對(duì)照藥inhibitor 3，且有一定劑量依賴性，初步推斷2,9-二取代嘌呤衍生物對(duì)抗炎藥物的研發(fā)有一定的潛力。

化合物的抗炎活性實(shí)驗(yàn)總結(jié)

所合成的20個(gè)6，9-二取代嘌呤衍生物先在10μM的濃度條件下，用ELISA法檢測(cè)其對(duì)TNF-α和IL-1β的抑制作用，初篩選出具有良好抗炎活性的化合物。我們發(fā)現(xiàn)化合物L(fēng)1、L4、W2和W4對(duì)炎癥因子顯示出較好的抑制作用，于是開始對(duì)這4個(gè)化合物進(jìn)行深入的抗炎活性研究?？寡谆钚缘纳钊胙芯恐饕w現(xiàn)在以下三個(gè)方面，首先是化合物檢測(cè)濃度的增加，檢測(cè)濃度范圍從10μM，增加到5,2.5μM，探討化合物濃度對(duì)抗炎活性的影響?；衔風(fēng)1、L4、W2和W4濃度與抑制作用呈線性關(guān)系，即隨著化合物的濃度增加，其抗炎能力增強(qiáng)。其次是炎癥因子種類的增多，從初篩的兩種炎癥因子(TNF-α和IL-1β)增加到包括IL-6、PGE2和NO在內(nèi)的五種炎癥因子?；衔風(fēng)1、L4、W2和W4對(duì)這五種炎癥因子均具有抑制作用。最后是檢測(cè)水平的增加，從初篩單純考慮炎癥因子水平到深入研究考慮炎癥相關(guān)mRNA水平的變化?；衔風(fēng)1、L4、W2和W4能夠在mRNA水平上，抑制COX-2和iNOS，從而起到抗炎作用。