本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用，具體是指一種發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油的制備方法。

背景技術(shù)：

微生物發(fā)酵是生物技術(shù)的重要組成部分，它將微生物學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)工程學(xué)的基本原理有機(jī)的結(jié)合起來，是一門利用微生物的生長代謝活動(dòng)來生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)。目前，在香精香料的生物合成中應(yīng)用最廣泛的生物技術(shù)是微生物發(fā)酵工程，以工農(nóng)業(yè)廢料為原料，利用微生物可以生產(chǎn)各種天然香料。由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的風(fēng)味化合物主要有四大類:萜烯類、內(nèi)酯類、吡喃類和酯類。Drawert和BantoS報(bào)道從乳酸克魯維酵母中分離得到單菇類香茅醇、芳樟醇和香葉醇；Lee等應(yīng)用酵母如Sporidiobolus salmonicolor和Yarrowia lipolytica催化蓖麻酸，經(jīng)β-氧化為有桃香味兒的γ-癸內(nèi)酯；Demain等應(yīng)用微生物在其代謝過程中生產(chǎn)香蘭素等芳香族類風(fēng)味化合物；比利時(shí)Gent等以雜醇油為前體物，利用姆拉克漢遜酵母將醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的乙酸酯，產(chǎn)物被活性炭吸附，解吸后的濃縮物可作為天然香蕉香料。

神農(nóng)香菊Dendranthema indicum是神農(nóng)架特有的珍稀植物，屬林區(qū)政府二級(jí)保護(hù)植物。神農(nóng)香菊是多年生草本。植株矮小，全株疏被白色柔毛，花、葉及根均具濃郁香氣；莖基部帶紫紅色；葉片較小而厚，深綠色，上面葉脈隆起，下面具凹陷小腺體；花小，黃色。該種很近似于野菊(D.indicum)，民間稱其為小野菊花，與原變種的主要區(qū)別在于神農(nóng)香菊的葉、花等具有濃郁的特殊香氣。香菊雖小，但渾身是寶。它的花、葉、莖、根都含有濃郁而獨(dú)特的芳香，可以加工成香精、浸膏、芳香油，有清熱、解毒、殺菌、消炎等功能。

神農(nóng)香菊經(jīng)晾制后，進(jìn)行揮發(fā)油萃取，可制備得到淡黃色油狀物，主要成分為萜烯類及芳香化合物，具有明顯的止咳、抗炎、祛痰、平喘的功效，添加到香煙中，使煙氣細(xì)膩柔和，抽吸后可顯著降低副作用，緩解喉部不適反應(yīng)。對(duì)吸煙者的喉部、呼吸道能起到保護(hù)作用，可顯著降低吸煙所引起的咳嗽、多痰等不良癥狀，而且香氣飄逸優(yōu)雅，煙草本香與淡雅的天然植物香氣渾然一體。然而，在目前的制備工藝當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)得油率不高，效率偏低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有不足之處，提供了一種發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油的制備方法，該方法通過微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)具有特征菊花香氣的發(fā)酵型煙用香料。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)稱取神農(nóng)香菊并將神農(nóng)香菊粉碎成80～150目的神農(nóng)香菊粗粉，將神農(nóng)香菊粗粉∶葡萄糖∶水按重量比為6～10∶2～4∶85～92混合，得到混合液；

2)按重量比1︰0～4︰1～2︰1～2將枯草芽孢桿菌、酵母菌、黑曲霉和里氏木霉混合均勻，得到發(fā)酵復(fù)合菌；

3)將發(fā)酵復(fù)合菌接種于混合液中進(jìn)行發(fā)酵，首先在20～30℃條件下發(fā)酵1～7d，然后在8～12℃條件下發(fā)酵10～25d得到發(fā)酵液；其中，發(fā)酵復(fù)合菌的接種量為0.05～0.3；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液放入瓶中，采用揮發(fā)油提取器提取，并在油水分離器中分離，收集所得到的油層即為發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油。

優(yōu)選的，所述神農(nóng)香菊粗粉∶葡萄糖∶水比例為7～9∶2～3∶88～92。

優(yōu)選的，所述枯草芽孢桿菌、黑曲霉和里氏木霉的重量比為3︰2︰3。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵復(fù)合菌的接種量為0.1～0.2。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵條件為pH值為2.5～5.5，攪拌轉(zhuǎn)速為150～250r/min，通氣量為1～3VVM。

香氣成分分析：

(1)前處理

將400ml發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油裝入圓底燒瓶中，用電熱套進(jìn)行加熱至沸騰，另一側(cè)的圓底燒瓶中加入200ml的二氯甲烷，60℃水浴沸騰，待中間分液管處液面出現(xiàn)分層后計(jì)時(shí)萃取2h。萃取結(jié)束后，向二氯甲烷萃取液中加入無水硫酸鈉吸水，放置過夜，過濾并濃縮至1ml，濃縮液用于進(jìn)行GC-MS分析。

(2)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)分析條件

采用HP6890/5973型氣-質(zhì)聯(lián)用儀，分析條件如下：色譜柱：HP-5MS，50cm×0.25mm×0.25μm；載氣：氦氣；進(jìn)樣溫度口：280℃；檢測器：FID，280℃；流量：空氣450ml/min，氫氣40ml/min；柱流速：40cm/min；升溫：60℃(2min)4℃/min，240℃15℃/min，300℃(20min)；進(jìn)樣量：1μl；分流比：20∶1；IE離子源，70ev，掃描范圍50～650amu；使用WILEY和MAINLIB譜庫檢索。

表1發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油成分分析

從分析結(jié)果上來看，發(fā)酵型神農(nóng)香菊精油主要成分為萜烯類化合物。這類化合物多數(shù)是對(duì)卷煙香氣有正面作用的。水芹烯具有柑橘、辛香、黑胡椒香氣和柑橘、辛香、薄荷的味道。α-蒎烯具有松木、樹脂樣的香氣。松油烯具有檸檬樣香氣。α-愈創(chuàng)木烯具有優(yōu)雅的木香。古巴烯具有香脂氣息和芳香微苦的刺激味。α-金合歡烯有萜香、青香、草香、松木香帶有痕量花香的青蔬菜香韻。味道似新鮮的青蔬菜味，木香、杜松子酒味、藥草、類似漿果，帶有芹菜、干草韻味和某種脂肪味以及熱帶水果的后味。石竹烯有留蘭香薄荷香，木香和帶有威士忌辛香風(fēng)韻，添加在卷煙中作為辛香的修飾劑，改善和提調(diào)煙香的自然風(fēng)味，具有香味增效的作用。1,8-桉葉油素具有樟腦樣滲透性新鮮陰涼清香，有清甜的涼味。添加在卷煙中，能抑制苦辣刺激性，可作薄荷煙的涼味頭香。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明以神農(nóng)香菊為原料，通過微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)具有特征菊花香氣的發(fā)酵型煙用香料。方法工藝過程簡單，原料成本極為低廉有效，有工業(yè)化使用前景能得到一種經(jīng)濟(jì)、高效且高質(zhì)生產(chǎn)天然煙用香料的新途徑，并開發(fā)出傳統(tǒng)香料生產(chǎn)法所不能生產(chǎn)的新型煙用香料。本產(chǎn)品增加煙香，提高香氣質(zhì)感，增加口腔回味，略細(xì)膩煙氣。

具體實(shí)施方式

下面列舉一部分實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的有關(guān)技術(shù)問題作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1

發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油1的制備方法，包括以下步驟：

1)稱取神農(nóng)香菊并將神農(nóng)香菊粉碎成80目的神農(nóng)香菊粗粉，將神農(nóng)香菊粗粉∶葡萄糖∶水按重量比為6∶2∶92混合，得到混合液；

2)按重量比1︰1︰2︰2將枯草芽孢桿菌、酵母菌、黑曲霉和里氏木霉混合均勻，得到發(fā)酵復(fù)合菌；

3)按接種量為0.3將發(fā)酵復(fù)合菌接種于混合液中進(jìn)行發(fā)酵，在pH值為2.5，攪拌轉(zhuǎn)速為250r/min，通氣量為1VVM條件下，首先在20℃條件下發(fā)酵5d，然后在8℃條件下發(fā)酵25d得到發(fā)酵液；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液放入瓶中，采用揮發(fā)油提取器提取，并在油水分離器中分離，收集所得到的油層即為發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油1。

實(shí)施例2

發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油2的制備方法，包括以下步驟：

1)稱取神農(nóng)香菊并將神農(nóng)香菊粉碎成100目的神農(nóng)香菊粗粉，將神農(nóng)香菊粗粉∶葡萄糖∶水按重量比為8∶2.5∶89.5混合，得到混合液；

2)按重量比1︰2︰2︰2將枯草芽孢桿菌、酵母菌、黑曲霉和里氏木霉混合均勻，得到發(fā)酵復(fù)合菌；

3)按接種量為0.05將發(fā)酵復(fù)合菌接種于混合液中進(jìn)行發(fā)酵，在pH值為3，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，通氣量為2VVM條件下，首先在20℃條件下發(fā)酵5d，然后在8℃條件下發(fā)酵25d得到發(fā)酵液；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液放入瓶中，采用揮發(fā)油提取器提取，并在油水分離器中分離，收集所得到的油層即為發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油2。

實(shí)施例3

發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油3的制備方法，包括以下步驟：

1)稱取神農(nóng)香菊并將神農(nóng)香菊粉碎成120目的神農(nóng)香菊粗粉，將神農(nóng)香菊粗粉∶葡萄糖∶水按重量比為9∶3∶88混合，得到混合液；

2)按重量比3︰2︰3將枯草芽孢桿菌、黑曲霉和里氏木霉混合均勻，得到發(fā)酵復(fù)合菌；

3)按接種量為0.1將發(fā)酵復(fù)合菌接種于混合液中進(jìn)行發(fā)酵，在pH值為4，攪拌轉(zhuǎn)速為180r/min，通氣量為3VVM條件下，首先在20℃條件下發(fā)酵7d，然后在10℃條件下發(fā)酵22d得到發(fā)酵液；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液放入瓶中，采用揮發(fā)油提取器提取，并在油水分離器中分離，收集所得到的油層即為發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油3。

實(shí)施例4

發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油4的制備方法，包括以下步驟：

1)稱取神農(nóng)香菊并將神農(nóng)香菊粉碎成100目的神農(nóng)香菊粗粉，將神農(nóng)香菊粗粉∶葡萄糖∶水按重量比為8∶3∶890混合，得到混合液；

2)按重量比1︰3︰1︰1將枯草芽孢桿菌、酵母菌、黑曲霉和里氏木霉混合均勻，得到發(fā)酵復(fù)合菌；

3)按接種量為0.2將發(fā)酵復(fù)合菌接種于混合液中進(jìn)行發(fā)酵，在pH值為5，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，通氣量為2VVM條件下，首先在25℃條件下發(fā)酵3d，然后在9℃條件下發(fā)酵10d得到發(fā)酵液；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液放入瓶中，采用揮發(fā)油提取器提取，并在油水分離器中分離，收集所得到的油層即為發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油4。

實(shí)施例5

發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油5的制備方法，包括以下步驟：

1)稱取神農(nóng)香菊并將神農(nóng)香菊粉碎成100目的神農(nóng)香菊粗粉，將神農(nóng)香菊粗粉∶葡萄糖∶水按重量比為6∶3∶88混合，得到混合液；

2)按重量比3︰2︰3將枯草芽孢桿菌、酵母菌、黑曲霉和里氏木霉混合均勻，得到發(fā)酵復(fù)合菌；

3)按接種量為0.25將發(fā)酵復(fù)合菌接種于混合液中進(jìn)行發(fā)酵，在pH值為5.5，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，通氣量為1VM條件下，首先在30℃條件下發(fā)酵1d，然后在12℃條件下發(fā)酵23d得到發(fā)酵液；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液放入瓶中，采用揮發(fā)油提取器提取，并在油水分離器中分離，收集所得到的油層即為發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油5。

實(shí)施例6

發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油6的制備方法，包括以下步驟：

1)稱取神農(nóng)香菊并將神農(nóng)香菊粉碎成100目的神農(nóng)香菊粗粉，將神農(nóng)香菊粗粉∶葡萄糖∶水按重量比為7∶3∶89混合，得到混合液；

2)按重量比1︰2︰2︰2將枯草芽孢桿菌、酵母菌、黑曲霉和里氏木霉混合均勻，得到發(fā)酵復(fù)合菌；

3)按接種量為0.15將發(fā)酵復(fù)合菌接種于混合液中進(jìn)行發(fā)酵，在pH值為4，攪拌轉(zhuǎn)速為230r/min，通氣量為3VVM條件下，首先在28℃條件下發(fā)酵4d，然后在9℃條件下發(fā)酵25d得到發(fā)酵液；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液放入瓶中，采用揮發(fā)油提取器提取，并在油水分離器中分離，收集所得到的油層即為發(fā)酵型煙用神農(nóng)香菊精油6。

其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。