本發(fā)明涉及一種對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物及其制備方法，以及其與異構(gòu)體的應(yīng)用，屬于藥物化學的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

唇形科香茶菜屬植物全球約有150種，其中有我國產(chǎn)90種、21變種，資源豐富。冬凌草Rabdosiarubescens系唇形科香茶菜屬，為多年生植物，植株高50-120cm，廣泛分布在全國各地，包括河南、陜西、貴州、浙江等省。(中國植物志編委會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1997，66：457.)作為中國藥典收錄的中草藥，冬凌草具有清熱解毒、活血止痛之功效，常用于咽喉腫痛、蛇蟲咬傷等疾病的治療。此外，冬凌草的使用具有地域特色：在河南地區(qū)，主要用于治療炎癥疾病和癌癥；在貴州省鳳崗縣，則用于治療感冒頭痛和關(guān)節(jié)痛。(中國植物志編委會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1997，66：457.；中國藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015，一部：115.)

迄今為止，對冬凌草的化學成分進行了大量的研究，并發(fā)現(xiàn)其含有豐富的二萜，且其中的對映-貝殼杉烷型和對映-貝殼杉烯型二萜被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性、細胞毒活性、抗菌和抗炎活性等，是冬凌草的主要有效成分。(Bai NS,He K,Zhou Z,et al.ent-Kaurane diterpenoids from Rabdosia rubescens and their cytotoxic effects on human cancer cell lines[J].PlantaMedica,2010,76:140-145；Xie RJ,Yan FL,Hai GF,et al.Two new diterpenoids and other constituents from Isodon rubescens[J].Fitoterapia,2011,82:726-730；Liu X,Xue YB,Dong K,et al.Three new ent-kaurane diterpenoids from Isodon rubescens and their cytotoxicities[J].ChineseJNatMed,2012,10:464-470；莫艷珠，潘爐臺，續(xù)梅等.Guidongnin抗炎、抑菌藥理作用研究.貴州科學，1996,14(4):48-50.)同時，香茶菜屬植物的化學成分受生態(tài)環(huán)境影響顯著，不同的生態(tài)環(huán)境下的同種植物的次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)差異頗大，結(jié)構(gòu)類型多樣化。(Hu Z,Zhan R,Du X,et al.Cytotoxic ent-kaurane diterpenoids from Isodon henryi[J].Chem Pharm Bull,2011,59:1562-1566.)因此，進一步研究開發(fā)該種植物，尤其是具有良好的抗腫瘤活性的對映-貝殼杉烷型和對映-貝殼杉烯型二萜類成分，具有重要的理論和實用價值。

本發(fā)明所述的對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物為首次從冬凌草中分離提取得到，在現(xiàn)有技術(shù)中未有報道。實驗證明此化合物及其C-6位的異構(gòu)體具有明顯的抗肺癌、抗白血病的活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物(命名為：6-表-11-O-乙酰基狹葉香茶菜素)及其制備方法和，其與異構(gòu)體的應(yīng)用，所述化合物及其C-6位的異構(gòu)體具有明顯的抗肺癌、抗白血病的活性。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物，所述化合物化學名為對映-6α-甲氧基-11α-乙酰氧基-15-氧代-6,7-螺斷-6,19-醚-7,20-內(nèi)酯-16-貝殼杉烯，分子式為C₂₃H₃₀O₇，化學結(jié)構(gòu)式如下：

前述對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物的制備方法為：

(1)甲醇冷浸提?。喝￡幐傻亩璨葜θ~，經(jīng)粉碎后用甲醇冷浸提取，減壓濃縮，得稀甲醇提取液；

(2)濃縮稀甲醇提取液：將稀甲醇提取液減壓濃縮得甲醇浸膏；

(3)柱層析分離：將甲醇浸膏與硅膠拌樣，轉(zhuǎn)入層析柱，硅膠粒度200～300目，用石油醚-乙酸乙酯洗脫液洗脫，將洗脫液進行薄層檢測，濃縮合并類似洗脫流分，靜置，過濾，得粗品。

(4)單體化合物的純化：將粗品經(jīng)半制備高效液相色譜分離，以甲醇-水洗脫液洗脫，反復(fù)收集同一保留時間的色譜峰，濃縮除去溶劑，即得。

所述步驟(1)中，甲醇濃度為85％～95％，提取次數(shù)為2-4次，每次2-4日。

具體地說，甲醇濃度為95％，提取次數(shù)為3次，每次3日。

所述步驟(3)中，洗脫劑石油醚-乙酸乙酯的體積比為1：0、10：1、7：1、5：1或0：1。

具體地說，洗脫劑石油醚-乙酸乙酯的體積比為10：1。

所述步驟(3)中，類似洗脫流分是指主要斑點的Rf值為0.2-0.8的洗脫流分。

具體地說，類似洗脫流分是指主要斑點的Rf值為0.4的洗脫流分。

所述步驟(4)中，洗脫劑甲醇-水的體積比為95：5、85：15、80：20或75:25。

具體地說，洗脫劑甲醇-水的體積比為85：15

所述步驟(4)中，同一保留時間的色譜峰是指保留時間為14min的色譜峰。

前述對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物及其C-6位異構(gòu)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

前述對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物及其C-6位異構(gòu)體在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。

前述對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物及其C-6位異構(gòu)體在制備抗白血病藥物中的應(yīng)用。

前述的對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物C-6位異構(gòu)體的化學名為對映-6β-甲氧基-11α-乙酰氧基-15-氧代-6,7-螺斷-6,19-醚-7,20-內(nèi)酯-16-貝殼杉烯，分子式為C₂₃H₃₀O₇，化學結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明從貴州省遵義市習水縣產(chǎn)的冬凌草(Rabdosia rubescens)中首次提取分離得到的一種對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物，名為6-表-11-O-乙酰基狹葉香茶菜素。本發(fā)明產(chǎn)品經(jīng)超導(dǎo)核磁共振波譜、高分辨質(zhì)譜、傅立葉變換紅外光譜等多種手段檢測，確定6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素的分子式為C₂₃H₃₀O₇，化學結(jié)構(gòu)式為：

產(chǎn)品6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素為白色固體，易溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇等有機試劑。光學活性[α]²⁰D-150.5°(c0.558，MeOH)；UV(MeOH)λ_max 268nm；IR(KBr)νmax 1745,1690cm-¹。

我們對這個化合物及其C-6位的異構(gòu)體測試了一系列的生物活性，包括抗癌、抗白血病。實驗證明6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素及其C-6位異構(gòu)體11-O-乙?；M葉香茶菜素在制備抗肺癌藥物和抗白血病藥物中的應(yīng)用價值，二者對人肺癌細胞A549的IC₅₀值分別為15.81M和9.89M，對人白血病細胞K562的IC₅₀值分別為1.93M和0.59M。

附圖說明

圖1為低分辨質(zhì)譜圖，說明了6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素的分子量；

圖2為高分辨質(zhì)譜圖，說明了6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素的分子式；

圖3為核磁共振¹H-NMR譜圖，說明了6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素結(jié)構(gòu)中氫的歸屬；

圖4為核磁共振¹³C-NMR譜圖，說明了6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素結(jié)構(gòu)中碳的歸屬；

圖5為本發(fā)明所述化合物的關(guān)鍵¹H-¹H COSY(H-H)、HMBC和ROESY相關(guān)譜圖；

圖6為本發(fā)明所述化合物C-6位的異構(gòu)體11-O-乙酰基狹葉香茶菜素的晶體結(jié)構(gòu)；

圖7為本發(fā)明所述化合物及其C-6位的異構(gòu)體對人肺癌細胞A549和人白血病細胞K562的抑制作用。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步闡述。必須說明下述實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

實施例1：

旋光Rudolph-型旋光儀(美國魯?shù)婪蚬?測定；核磁共振氫譜¹H-NMR，核磁共振碳譜¹³C-NMR和2D-NMR由JEOL500MHZ超導(dǎo)核磁共振波譜儀測定(四甲基硅醚TMS為內(nèi)標)；高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS由VGAutospec-3000質(zhì)譜儀(在70eV)測定；紫外光譜UV由HP8453紫外可見分光光度計(惠普公司)測定；紅外光譜IR由VECTOR22型傅立葉變換紅外光譜儀(德國BRUKER儀器公司，KBr壓片)測定；柱層析硅膠(200-300目)及薄層層析硅膠均為青島海洋化工產(chǎn)；采用安捷倫1100HPLC設(shè)備和安捷倫Eclipse XDB-C18色譜柱(9.4×250mm,5μm)進行半制備分離；其它試劑均為分析純。

一、冬凌草中對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜化合物6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素的提取分離方法：

本發(fā)明實驗所用藥材于2014年10月采自貴州省遵義市習水縣，由貴陽中醫(yī)學院趙俊華教授鑒定為冬凌草Rabdosia rubescens，植物標本存放在貴陽中醫(yī)學院中藥研究所(標本憑證：20141001)

6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素的制備步驟依次如下：

(1)甲醇冷浸提?。憾璨葜θ~經(jīng)自然風干后粉碎，取粉碎的冬凌草枝葉5.5Kg，用95％的甲醇冷浸提取3次，得稀甲醇提取液；

(2)濃縮稀甲醇提取液：將稀甲醇提取液減壓濃縮得甲醇浸膏100g，在減壓濃縮過程中回收甲醇；

(3)柱層析分離：將甲醇浸膏與硅膠拌樣，轉(zhuǎn)入層析柱，硅膠粒度200～300目，用石油醚-乙酸乙酯(10：1)洗脫液洗脫，石油醚與乙酸乙酯體積比10：1，將洗脫液進行薄層檢測，濃縮合并主要斑點的Rf值為0.4的洗脫流分，靜置，過濾，得6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素粗品。

(4)單體化合物的純化：6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素粗品經(jīng)半制備高效液相色譜分離，以甲醇-水洗脫液洗脫，洗脫劑甲醇-水的體積比為85：15。反復(fù)收集保留時間為14min的色譜峰，濃縮除去溶劑，即得(20mg)。

二、結(jié)構(gòu)鑒定

6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素的理化性狀如下：白色固體，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有機試劑，光學活性[α]²⁰D-37.6°(c0.558，MeOH)；UV(MeOH)λ_max 268nm；IR(KBr)νmax 1745,1690cm^-1；低分辨質(zhì)譜給出分子離子峰441.2[M+Na]⁺及其二倍峰859.2[2M+Na]⁺；高分辨質(zhì)譜給出分子離子峰m/z 441.18936[M+Na]⁺(計算值為441.18837，得出分子式為C₂₃H₃₀O₇)及其二倍峰m/z 859.38947[2M+Na]⁺(計算值為859.38753，亦得出分子式為C₂₃H₃₀O₇)。¹H與¹³C NMR數(shù)據(jù)見表1。同時，通過測定二維H-H相關(guān)譜(¹H-¹H COSY)、¹H-¹³C相關(guān)譜(HMQC)、¹H-¹³C遠程相關(guān)譜(HMBC)和旋轉(zhuǎn)坐標系NOE譜(NOESY)，確定了所有碳原子和氫原子的信號歸屬及該化合物的化學結(jié)構(gòu)。

表1.本發(fā)明化合物的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)^a.

注：JEOL 500MHz；δ為化學位移，單位為ppm，且¹H-NMR和¹³C-NMR分別以溶劑中殘存的氯仿(δ_H 7.26ppm；δ_C 77.16ppm)為內(nèi)標。

核磁共振信號的歸屬是在HMQC和HMBC等二維譜圖的基礎(chǔ)上完成的。通過分析HMBC圖譜的碳氫遠程相關(guān)和HMQC碳氫近程相關(guān)以及¹H-¹H COSY光譜數(shù)據(jù)，可確定本發(fā)明所述化合物為對映-6,7-螺斷貝殼杉烯型二萜，并含有一個甲氧基和乙酰氧基取代基。同時，還可確定C7與C20形成的六元內(nèi)酯環(huán)以及C-6與C-19形成的呋喃環(huán)。此外，根據(jù)甲氧基信號(δ_H:3.31ppm)與C-6(δ_C 106.71ppm)、H-11(δ_H:5.22ppm)與乙酰羰基(δ_C 169.55ppm)可分別確定C-6位的甲氧基取代和C-11位的乙酰氧基取代。NOESY相關(guān)譜中，H-5與H-6、H-9與H-11的相關(guān)信號分別表明6-OMe和11-OAc的α取代。

因此本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)被確定為對映-6α-甲氧基-11α-乙酰氧基-15-氧代-6,7-螺斷-6,19-醚-7,20-內(nèi)酯-16-貝殼杉烯，并因此命名為6-表-11-O-乙酰基狹葉香茶菜素。

三、生物活性測定

本發(fā)明所述化合物及其異構(gòu)體的抗腫瘤活性實驗是通過人肺癌細胞A549細胞和人白血病細胞K562測試的?；诨罴毎木€粒體中存在與NADP相關(guān)的脫氫酶，可將黃色的MTT還原為不溶性的藍紫色Formanzan，而死細胞此酶消失，MTT不被還原，采用MTT法，根據(jù)A549細胞或K562細胞對MTT的還原程度，來檢測樣品對腫瘤細胞的作用情況。活性計算公式：抑制率(％)＝[(對照組OD值—樣品組OD值)/對照組OD值]×100。測試結(jié)果表明，本發(fā)明所述化合物6-表-11-O-乙酰基狹葉香茶菜素及其C-6位異構(gòu)體對人肺癌細胞A549的IC₅₀值分別為15.81M和9.89M，對人白血病細胞K562的IC₅₀值分別為1.93M和0.59M，詳見表2。

表2.本發(fā)明所述化合物及其異構(gòu)體對人肺癌細胞A549和人白血病細胞K562的抑制作用

總結(jié)：6-表-11-O-乙?；M葉香茶菜素及其異構(gòu)體狹葉香茶菜素對人肺癌細胞A549和人白血病細胞K562均由抑制作用，可用于研制治療肺癌和白血病的藥物。