本發(fā)明涉及果膠酯酶，特別涉及一種塔賓曲霉發(fā)酵生產(chǎn)果膠酯酶的方法。

背景技術(shù)：

果膠酯酶（PE）又名果膠甲酯酶(pectinesterase, PE, EC 3.1.1.11)，是一種專(zhuān)一催化果膠分子長(zhǎng)鏈上甲酯基水解，生成低酯果膠的一種酶。它不會(huì)減小果膠聚合物的體積，能較好地保持產(chǎn)品的膠凝度。果膠酯酶可用于果汁的制備，能改善過(guò)濾效果，有效提高出汁率，加速澄清效率等。研究表明，在一些蔬菜的加工中，果蔬組織中存在的果膠酯酶能保護(hù)果蔬質(zhì)構(gòu)。果膠酯酶能使果蔬中形成更大的果膠聚合物，使食物的青脆度近于新鮮。除用于果蔬保藏以外，高度專(zhuān)一的PE還可以用于研究酶的行為模式、果膠結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)之間的基本關(guān)系以及制備低酯果膠。

果膠酯酶可從高等植物的果實(shí)和微生物中獲得。其中，微生物果膠酯酶來(lái)源極其廣泛，包括細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌等。隨著果膠酯酶來(lái)源不同，其理化特征等方面亦有差異。Ishii等發(fā)現(xiàn)從黑曲霉中提取的PE隨機(jī)水解果膠分子中的甲酯，獲得的低酯果膠膠凝性?xún)?yōu)于由其他材料來(lái)源的PE制備的低酯果膠。2004年，焦云鵬等人利用從黑曲霉發(fā)酵液中提取的果膠酯酶進(jìn)行脫酯制備低酯果膠。帝斯曼公司研究發(fā)現(xiàn)，其果膠酯酶產(chǎn)品Rapidase. FP Super加入草莓整果中，草莓的硬度和穩(wěn)定性都顯著增強(qiáng)。國(guó)內(nèi)未有生產(chǎn)果膠酯酶的公司, 國(guó)外主要有諾維信、Sigma、帝斯曼等公司, 產(chǎn)品形式為液體和粉末。工業(yè)上果膠酯酶主要是從黑曲霉發(fā)酵液中獲得，而目前對(duì)利用塔賓曲霉發(fā)酵獲得果膠酯酶尚未有報(bào)道。

果膠酯酶在生產(chǎn)上的應(yīng)用已有40多年的歷史，采用固態(tài)法進(jìn)行生產(chǎn)，以商品制劑出售。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，對(duì)外貿(mào)易的發(fā)展，低酯果膠的需求量越來(lái)越大，但至今仍需從國(guó)外進(jìn)口，故對(duì)果膠酯酶的需求日益迫切。有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種塔賓曲霉發(fā)酵生產(chǎn)果膠酯酶的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種塔賓曲霉發(fā)酵生產(chǎn)果膠酯酶的方法。

一種塔賓曲霉發(fā)酵生產(chǎn)果膠酯酶的方法，包括以下步驟：將塔賓曲霉菌種CICC 2651接種于培養(yǎng)基中，180 rpm，30℃培養(yǎng)4 d，發(fā)酵培養(yǎng)后獲得含果膠酯酶發(fā)酵液，分離純化含果膠酯酶發(fā)酵液獲得果膠酯酶。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述培養(yǎng)基為3%(w/v)高酯果膠、0.5% (w/v) (NH₄)₂SO₄、0.04% (w/v) MgSO₄·7H₂O、0.2% (w/v) K₂HPO₄、0.04% (w/v) Na₂SO₄、0.005% (w/v) FeSO₄·7H₂O，100 mL 蒸餾水。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為初始pH 4.5，培養(yǎng)溫度30℃，接種量5% (OD₆₀₀=2.0)，180 rpm，250 mL 三角瓶裝液量40 mL，培養(yǎng)時(shí)間為4 d。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述分離純化含果膠酯酶發(fā)酵液的步驟包括：將發(fā)酵完畢的含果膠酯酶的發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)4℃，10000 rpm，離心15 min，獲取上清液即為粗酶液；將所得粗酶液進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后向粗酶液中加入固體硫酸銨至飽和度70%，充分溶解后在高速冷凍離心機(jī)中4℃，10000 rpm離心15 min，棄沉淀；上清再用硫酸銨沉淀至飽和度100%，充分溶解后于4℃，10000 rpm離心15 min，棄上清，取沉淀用蒸餾水溶解；再用適量蒸餾水于4℃中透析，每隔4 h換透析液，收集透析液得果膠酯酶。

本發(fā)明首次采用了塔賓曲霉發(fā)酵生產(chǎn)果膠酯酶，開(kāi)辟了微生物產(chǎn)果膠酯酶的新道路，并且與固態(tài)發(fā)酵法相比，液態(tài)發(fā)酵具有易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化連續(xù)生產(chǎn)，生產(chǎn)過(guò)程易控制，生產(chǎn)規(guī)模大等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1 為不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；在圖1 中，橫坐標(biāo)為不同的碳源，縱坐標(biāo)為生物量（g/L）和果膠酯酶酶活（U/mL）；

圖2 為高酯果膠濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；在圖2 中，橫坐標(biāo)為高酯果膠濃度（w/v，%），縱坐標(biāo)為果膠酯酶酶活（U/mL）；

圖3 為不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；在圖3 中，橫坐標(biāo)為不同的氮源，縱坐標(biāo)為生物量（g/L）和果膠酯酶酶活（U/mL）；

圖4 為硫酸銨濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；在圖4 中，橫坐標(biāo)為硫酸銨濃度（w/v，%），縱坐標(biāo)為生物量（g/L）和果膠酯酶酶活（U/mL）；

圖5 為無(wú)機(jī)鹽濃度NaSO對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；在圖5中，橫坐標(biāo)為無(wú)機(jī)鹽濃度（w/v，%），縱坐標(biāo)為生物量（g/L）和果膠酯酶酶活（U/mL）；

圖6 為無(wú)機(jī)鹽濃度MgSO₄對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；在圖6中，橫坐標(biāo)為無(wú)機(jī)鹽濃度（w/v，%），縱坐標(biāo)為生物量（g/L）和果膠酯酶酶活（U/mL）；

圖7為無(wú)機(jī)鹽濃度K₂HPO₄對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；在圖7 中，橫坐標(biāo)為無(wú)機(jī)鹽濃度（w/v，%），縱坐標(biāo)為生物量（g/L）和果膠酯酶酶活（U/mL）；

圖8 為優(yōu)化前后生物量（g/L）及酶活(U/mL)變化圖；

圖9為硫酸銨分級(jí)沉淀對(duì)果膠酯酶的影響圖。

具體實(shí)施方式

為使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面列舉本發(fā)明的具體實(shí)施例，并配合說(shuō)明書(shū)附圖，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。需強(qiáng)調(diào)的：實(shí)施例并非本發(fā)明技術(shù)方案所有可能實(shí)施方式的窮舉，故不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的培養(yǎng)基通過(guò)以下方法制備：

（1）材料與方法

菌種：塔賓曲霉CICC 2651 (Aspergillus tubingensis) 由本實(shí)驗(yàn)室篩選所得，并保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)公眾途徑購(gòu)買(mǎi)獲得。

（2）培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基：稱(chēng)取200 g 馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000 mL 煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過(guò)濾，濾液再加20 g 葡萄糖和20 g 瓊脂繼續(xù)煮沸，充分溶解后分裝試管，每試管約5 mL，121℃滅菌20 min 后取出試管擺斜面，冷卻后貯藏備用。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基

稱(chēng)取3% 高酯果膠、 0.5% (w/v) (NH₄)₂SO₄、 0.04% (w/v) MgSO₄·7H₂O、 0.2% (w/v) K₂HPO₄、 0.04% (w/v) Na₂SO₄、 0.005%(w/v) FeSO₄·7H₂O，充分溶解于100 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)初始pH為4.5，分裝40 mL上述溶液于250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min。

（4）主要試劑

1)0.02 mol/L NaOH溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取0.8 g NaOH用蒸餾水溶解，并定容至1 L；

2)1%高酯果膠溶液：稱(chēng)取1 g高酯果膠溶于100 mL蒸餾水中，調(diào)pH至4.5。

（5）試驗(yàn)方法

單孢子菌懸液的制備：將4℃下貯藏的菌種，用無(wú)菌蒸餾水洗下孢子，放到裝有無(wú)菌玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩30 min。待孢子充分打散后，測(cè)菌懸液OD ₆₀₀，并用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整其OD₆₀₀至2.0，即得單孢子菌懸液。

（6）塔賓曲霉發(fā)酵生產(chǎn)果膠酯酶

發(fā)酵培養(yǎng)基配好后，121℃滅菌20 min，冷卻后在無(wú)菌條件下接種5%塔賓曲霉孢子懸液(OD ₆₀₀=2.0)，混勻后置于30℃恒溫振蕩器中，180 rpm，培養(yǎng)4 d。

（7）粗酶液提取

取出恒溫培養(yǎng)振蕩器中已培養(yǎng)4 d含果膠酯酶的發(fā)酵液，在4℃，10000 rpm下離心15 min，取上清液即為粗酶液。

（8）果膠酯酶活力的測(cè)定

取100 ml 1%高酯果膠溶液（pH 4.5）于55℃下恒溫，加入10 ml粗酶液，記錄初始混合液pH，反應(yīng)進(jìn)行10 min，記錄混合液pH。滴入0.02 mol/L NaOH調(diào)pH至初始混合液pH，記錄NaOH消耗體積。定義1個(gè)酶活單位為：55℃下，每分鐘生成1 μmol的酸，所需酶液的量即果膠酯酶酶活，酶活力單位為U/mL。

（9）果膠酯酶發(fā)酵工藝的單因素優(yōu)化

3%(w/v) 高酯果膠、0.5% (w/v) 硫酸銨、0.04%(w/v) MgSO₄·7H₂O、0.2%(w/v) K₂HPO₄、0.04%(w/v) Na₂SO₄、0.005%(w/v) FeSO₄·7H₂O，100 mL 蒸餾水，初始pH 4.5，發(fā)酵溫度30℃，180 rpm，發(fā)酵時(shí)間4 d作為初始發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的內(nèi)容包括碳源選擇及其濃度優(yōu)化、氮源選擇及其濃度優(yōu)化、無(wú)機(jī)鹽（MgSO₄·7H₂O、K₂HPO₄、Na₂SO₄）濃度優(yōu)化。

實(shí)施例 1：果膠酯酶發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

（1）不同碳源及其濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

以高酯果膠、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、柚皮粉、香蕉皮粉為碳源，30℃，180 rpm，發(fā)酵4 d，測(cè)定果膠酯酶活力，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看到，當(dāng)碳源為高酯果膠時(shí)，果膠酯酶活力有最大值。因此，高酯果膠為最適產(chǎn)果膠酯酶的碳源。

為進(jìn)一步確定高酯果膠的用量，選取質(zhì)量濃度（w/v）1%、2%、3%、4%、5%、6%六個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，30℃，180 rpm，發(fā)酵4 d，測(cè)定果膠酯酶活力，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可以看到，隨著高酯果膠濃度增大，果膠酯酶酶活逐漸升高，當(dāng)高酯果膠濃度為3%時(shí)，果膠酯酶酶活達(dá)到最大。因此，選擇高酯果膠濃度為3%。

（2）不同氮源及其濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

以硫酸銨、酵母提取粉、牛肉膏、胰蛋白胨、尿素、硝酸鈉為氮源，30℃，180 rpm，發(fā)酵4 d，測(cè)定果膠酯酶活力，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可以看到，當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@時(shí)，果膠酯酶活力達(dá)到最大值。

為進(jìn)一步確定硫酸銨的用量，選取0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%（w/v）六個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，30℃，180 rpm，發(fā)酵4 d，測(cè)定果膠酯酶活力，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可以看到，隨著硫酸銨濃度增大，果膠酯酶酶活逐漸升高，當(dāng)硫酸銨濃度為0.5%時(shí)，果膠酯酶酶活最大。基于以上結(jié)果，塔賓曲霉發(fā)酵產(chǎn)果膠酯酶的最適氮源為硫酸銨，其濃度為0.5%。

（3）無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

將Na₂SO₄、MgSO₄、K₂HPO₄分別以0.01%、0.01%、0.1%（w/v）為梯度，配制不同濃度梯度的培養(yǎng)基，30℃，180 rpm發(fā)酵4 d。運(yùn)用pH-stat法對(duì)果膠酯酶酶活進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。結(jié)果如圖5、圖6及圖7所示。由圖5 、圖6及圖7可以看到，當(dāng)Na₂SO₄、MgSO₄、K₂HPO₄濃度分別為0.04%、0.04%、0.2%時(shí)，果膠酯酶酶活最大。因此，選擇Na₂SO₄、MgSO₄、K₂HPO₄濃度分別為0.04%、0.04%、0.2%。

實(shí)施例2：果膠酯酶發(fā)酵優(yōu)化工藝與初始發(fā)酵工藝對(duì)照

（1）初始發(fā)酵工藝：

4%(w/v) 高酯果膠、0.4% (w/v) 胰蛋白胨、0.05%(w/v) MgSO₄·7H₂O、0.1%(w/v) K₂HPO₄、0.05%(w/v) Na₂SO₄、0.05%(w/v) FeSO₄·7H₂O，100 mL 蒸餾水，溶液初始pH 4.5，發(fā)酵溫度30℃，180 rpm，發(fā)酵時(shí)間4 d。

（2）優(yōu)化發(fā)酵工藝：3% (w/v) 高酯果膠，0.5% (w/v) (NH₄)₂SO₄，0.04% (w/v) MgSO₄·7H₂O，0.04%(w/v) Na₂SO₄，0.2% (w/v) K₂HPO₄，0.05%(w/v) FeSO₄·7H₂O，100 mL 蒸餾水，溶液初始pH 4.5，發(fā)酵溫度30℃，180 rpm，發(fā)酵時(shí)間4 d。

（3）按照實(shí)施例1的優(yōu)化參數(shù)，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：

①優(yōu)化后培養(yǎng)基的配制：3% (w/v) 高酯果膠，0.5% (w/v) (NH₄)₂SO₄，0.04% (w/v) MgSO₄·7H₂O， 0.04%(w/v) Na₂SO₄，0.2% (w/v) K₂HPO₄，0.05%(w/v) FeSO₄·7H₂O，100 mL 蒸餾水，溶液初始pH 4.5，121℃滅菌15 min。

②菌種的活化：將生產(chǎn)果膠酯酶的菌種塔賓曲霉CICC 2651接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，30℃活化培養(yǎng)4 d。

③發(fā)酵培養(yǎng)：菌種活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)的條件為初始pH 4.5，接種量5%，裝液量40 mL，30℃，180 rpm，培養(yǎng)時(shí)間4 d。

④發(fā)酵完畢后，將上述發(fā)酵液在4℃、10000 rpm離心15 min，收集上清液，即得果膠酯酶粗酶液。

（4）優(yōu)化發(fā)酵工藝與初始發(fā)酵工藝比較

優(yōu)化后果膠酯酶酶活力的測(cè)定，結(jié)果如圖8所示，初始發(fā)酵工藝酶活力為0.41 U/mL，通過(guò)優(yōu)化菌株的果膠酯酶發(fā)酵工藝，優(yōu)化后酶活達(dá)到1.89 U/mL，是優(yōu)化前的4.6倍。

實(shí)施例3：果膠酯酶分離純化

（1）粗酶液的制備

將PDA斜面保藏菌種用無(wú)菌蒸餾水洗下孢子，置于裝有無(wú)菌玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩30 min。待孢子充分打散后，測(cè)菌懸液OD₆₀₀，并用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整其OD₆₀₀至2.0，即得單孢子菌懸液。將單孢子懸浮液按接種量5%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180 rpm培養(yǎng)4 d。將發(fā)酵完畢的含果膠酯酶的發(fā)酵液，經(jīng)4℃，10000 rpm，離心15 min，獲取上清液即為粗酶液。

（2）硫酸銨分段鹽析

分別取粗酶液100 mL于9個(gè)燒杯中，置于冰水浴中，邊攪拌邊加入研細(xì)的固體(NH₄)₂SO₄至飽和度20%， 30%， 40%...100%，充分溶解后放置于4℃，過(guò)夜。在高速冷凍離心機(jī)中10000 rpm離心15 min，棄上清，測(cè)沉淀酶活。由圖9可知，70% (NH₄)₂SO₄濃度條件下沉淀獲得的果膠酯酶活力為1 U/mL，100% (NH₄)₂SO₄濃度下沉淀獲得的果膠酯酶活力為5.2 U/mL，因此，最佳(NH₄)₂SO₄濃度區(qū)間為70%~100%。

（3） 透析

邊攪拌邊向粗酶液中緩慢加入研細(xì)的固體(NH₄)₂SO₄至飽和度70%，充分溶解后放置于4℃，過(guò)夜。在高速冷凍離心機(jī)中10000 rpm離心15 min，棄沉淀。上清再用(NH₄)₂SO₄沉淀至飽和度100%，10000 rpm離心15 min，取沉淀用緩沖液溶解。再用適量的緩沖液于4℃透析24 h，每隔4 h換透析液。透析結(jié)束后，收集透析液，即為果膠酯酶酶液。

以上實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的具體描述，僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非本發(fā)明技術(shù)方案的窮舉，故不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。