本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉為配體的氯化銅配合物及其合成方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β-咔啉是一類廣泛分布于自然界的生物堿，它們主要存在于多種陸生植物和海洋生物中。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上分類，β-咔啉生物堿屬于吲哚類生物堿，它是由吲哚并吡啶構(gòu)成的三環(huán)體系，它的骨架是一個平面分子，其中2位和9位的兩個氮原子以不同的雜化狀態(tài)存在，在9位氮原子為sp3雜化，為富π電子體系，2位氮原子為sp2雜化，為缺π電子體系。兩個氮原子與該類化合物的化學(xué)性質(zhì)及生物活性密切相關(guān)。該類化合物具有廣泛的的生物學(xué)和藥理學(xué)活性，其中包括：鎮(zhèn)靜劑、抗焦慮、催眠、抗痙攣、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲和抗菌活性等。因此β-咔啉生物堿越來越受到研究人員的重視。
另一方面，基于藥用活性配體的藥物無機化學(xué)研究在近年來隨著生物無機化學(xué)的蓬勃發(fā)展而成為熱點研究領(lǐng)域，尤其以順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等為代表的第一、二、三代鉑類抗癌藥物作為一線化療藥物的成功應(yīng)用，真正標(biāo)志著金屬藥物研究與應(yīng)用新時代的到來。但目前尚未見有以1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉為配體的氯化銅(II)配合物及其合成方法和應(yīng)用的相關(guān)報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供結(jié)構(gòu)新穎的以1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉為配體的氯化銅(II)配合物，以及它的合成方法和應(yīng)用。
本發(fā)明涉及下式(I)所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：
上述式(I)所示化合物的合成方法為：取如下式(II)所示化合物和氯化銅(CuCl2·2H2O)，溶于極性溶劑中，進行配位反應(yīng)，即得到目標(biāo)產(chǎn)物；其中，所述的極性溶劑為選自甲醇和乙醇中的一種或兩種與選自水、丙酮、氯仿、二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺中的一種或兩種以上的組合；
上述合成方法中涉及的原料式(II)所示化合物作為配體參與反應(yīng)，其化學(xué)名稱為1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉，在本申請中也簡稱為L。該式(II)所示化合物可自行設(shè)計合成路線進行制備，優(yōu)選按下述方法進行制備：
以色胺和吡啶-2-甲醛為原料，在第一有機溶劑中反應(yīng)，經(jīng)過脫水縮合得到化合物1；然后將化合物1置于第二有機溶劑中，加入氧化劑關(guān)環(huán)并脫氫得到化合物2(1-(2-吡啶)-β-咔啉)；再將化合物2置于堿性物質(zhì)的非質(zhì)子極性溶劑中，加入1-溴庚烷進行取代反應(yīng)，即得；其中：
所述的第一有機溶劑為選自甲苯、甲醇、乙醇、二氯甲烷和三氯甲烷中的一種或兩種以上的組合；
所述的第二有機溶劑為選自苯、甲苯、對二甲苯、冰乙酸和二氯甲烷中的一種或兩種以上的組合；
所述的氧化劑為鈀碳、醋酸錳水合物(Mn(Ac)3·nH2O)、四乙酸鉛(Pb(Ac)4)或2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌(DDQ)；
所述的堿性物質(zhì)為無機堿；
所述的非質(zhì)子極性溶劑為選自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和丙酮中的一種或兩種以上的組合。
上述制備式(II)所示化合物方法的合成路線如下：
試劑：(a)第一有機溶劑；(b)氧化劑，第二有機溶劑；(c)堿性物質(zhì)，非質(zhì)子極性溶劑。
上述式(II)所示化合物更為具體的制備方法，包括以下步驟：
①以色胺和吡啶-2-甲醛為原料，在第一有機溶劑中反應(yīng)，反應(yīng)過程中排出反應(yīng)生成的水，待反應(yīng)結(jié)束后蒸干溶劑，得到化合物1；
②將化合物1置于第二有機溶劑中，加入氧化劑，加熱條件下反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束，過濾，收集濾液，蒸干，得到化合物2；
③取堿性物質(zhì)溶于非質(zhì)子極性溶劑中，然后加入化合物2和1-溴庚烷進行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)物投入冰水中，對所得冰水混合物進行萃取，收集有機相，蒸干溶劑，即得到式(II)所示化合物(即化合物3)。
上述式(II)所示化合物合成方法的步驟①中，色胺和吡啶-2-甲醛的物質(zhì)的量之比通常為0.8～1.2：1，反應(yīng)可以在加熱或不加熱的條件下進行，反應(yīng)過程中可以用分水器排出反應(yīng)生成的水，反應(yīng)是否完全可以可采用薄層層析(TLC)跟蹤檢測；優(yōu)選地，反應(yīng)采用加熱回流反應(yīng)，此時反應(yīng)的時間控制在2～6h較合適。該步驟中，得到的是化合物1的粗產(chǎn)物，為了減少后續(xù)反應(yīng)中的雜質(zhì)，提高后序反應(yīng)的產(chǎn)率，優(yōu)選是對所得殘渣進行純化操作后再進行后序反應(yīng)。具體的純化操作可以是對所得殘渣用小極性溶劑重結(jié)晶，所得重結(jié)晶產(chǎn)物再用于后序反應(yīng)。所述用于重結(jié)晶的小極性溶劑與現(xiàn)有技術(shù)相同，具體可以是石油醚和/或正己烷等。
上述式(II)所示化合物合成方法的步驟②中，反應(yīng)優(yōu)選采用加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)是否完全可以可采用薄層層析跟蹤檢測。該步驟中，得到的是化合物2的粗產(chǎn)物，為了減少后續(xù)反應(yīng)中的雜質(zhì)，提高后序反應(yīng)的產(chǎn)率，優(yōu)選是對所得殘渣進行純化操作后再進行后序反應(yīng)。具體的純化操作可以是對所得殘渣用選自甲醇、乙醇和二氯甲烷中的一種或兩種以上的組合溶劑進行重結(jié)晶，或者是將所得殘渣上硅膠柱層析純化，在上硅膠柱層析時，所用的洗脫劑為石油醚和二氯甲烷按6：1～1：1的體積比組成的混合溶劑。
上述式(II)所示化合物合成方法的步驟②中，根據(jù)氧化劑的不同，選用不同的第二有機溶劑，具體如下：
(1)當(dāng)氧化劑的選擇為鈀碳時，第二有機溶劑優(yōu)選為苯、甲苯和對二甲苯中的一種或兩種以上的組合，當(dāng)二有機溶劑的選擇為上述兩種以上的組合時，它們之間的配比可以為任意配比。所述的鈀碳可以是5％Pd/C或10％Pd/C，所述鈀碳的加入量通常按10mmol化合物1加入2～4g鈀碳計算。
(2)當(dāng)氧化劑的選擇為醋酸錳水合物或四乙酸鉛時，第二有機溶劑優(yōu)選為冰乙酸；所述醋酸錳水合物或四乙酸鉛的加入量通常為化合物1物質(zhì)的量的2～8倍。當(dāng)氧化劑的選擇為醋酸錳水合物或四乙酸鉛時，優(yōu)選反應(yīng)結(jié)束后用堿液調(diào)節(jié)體系的pH≥7，再對其進行萃取，收集有機相，蒸干溶劑所得的殘渣再上硅膠柱層析純化；其中，所述的堿液可以是氨水、乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸鈉、碳酸氫鈉或碳酸鉀等堿性物質(zhì)的水溶液，所述堿液的濃度優(yōu)選為5～30w/w％；用于萃取調(diào)pH值后體系的溶劑具體可以是乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或乙醚等。
(3)當(dāng)氧化劑的選擇為2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌時，第二有機溶劑優(yōu)選為苯、甲苯和二氯甲烷的一種或兩種以上的組合，當(dāng)二有機溶劑的選擇為上述兩種以上的組合時，它們之間的配比可以為任意配比。所述2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌的加入量通常為化合物1物質(zhì)的量的1～4倍。
上述式(II)所示化合物合成方法的步驟③中，所述堿性物質(zhì)、化合物2和1-溴庚烷的物質(zhì)的量之比通常為1～4：1：1～3，其中的堿性物質(zhì)進一步可以是氫化鈉、氫化鈣、氫氧化鈣、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸銫和碳酸鉀中的一種或兩種以上的組合，當(dāng)堿性物質(zhì)的選擇為上述兩種以上的組合時，它們之間的配比可以為任意配比。該步驟中，反應(yīng)可以在0～80℃條件下進行，反應(yīng)是否完全可以可采用薄層層析(TLC)跟蹤檢測；優(yōu)選地，反應(yīng)在20～50℃，此時反應(yīng)的時間控制在1～6h較合適。對冰水混合物進行萃取的溶劑具體可以是乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、石油醚或乙醚等常規(guī)萃取溶劑。
上述式(II)所示化合物合成方法中所涉及的各種溶劑(如第一有機溶劑、第二有機溶劑以及非質(zhì)子極性溶劑等)的用量，以能夠溶解各步驟中參與反應(yīng)的原料為宜。
上述方法制備得到的是式(II)所示化合物的粗產(chǎn)物，為了進一步提高式(II)所示化合物的純度，更有利于后續(xù)反應(yīng)的進行，優(yōu)選是對上述所得粗產(chǎn)物進行純化操作后再用于本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物的合成方法中。所述的純化操作與現(xiàn)有技術(shù)相同，具體可以是將粗產(chǎn)物上硅膠柱層析純化，以得到式(II)所示化合物純品；在上硅膠柱層析時，所用的洗脫劑為二氯甲烷和甲醇按1000：1～50：1的體積比組成的混合溶劑。
本發(fā)明所述式(I)所示化合物的合成方法中，在極性溶劑的組成中，甲醇或乙醇或者是甲醇和乙醇的組合在極性溶劑中所占的比例優(yōu)選為50～98v/v％；當(dāng)極性溶劑中含有水、丙酮、氯仿、二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺中的兩種以上的選擇時，在它們的總量不超出50％的前提條件下，它們的配比可以為任意配比。所述極性溶劑的用量可根據(jù)需要確定，通常情況下，1mmol的氯化銅和1mmol式(II)所示化合物用5～80mL的極性溶劑來溶解。在具體的溶解步驟中，一般將氯化銅和式(II)所示化合物混合后再加極性溶劑；也可將氯化銅和式(II)所示化合物分別用極性溶劑溶解，再混合在一起反應(yīng)。
本發(fā)明所述式(I)所示化合物的合成方法中，所述氯化銅和式(II)所示化合物的物質(zhì)的量之比可以是1～6：1。
本發(fā)明所述的式(I)所示化合物具體在合成時，可采用常壓溶液法或高壓溶劑熱法進行合成。
當(dāng)采用常壓溶液法時，其合成方法包括：取式(II)所示化合物和氯化銅，溶于極性溶劑中，所得混合液于加熱或不加熱條件下反應(yīng)，反應(yīng)物除去部分溶劑，靜置，析出，分離出晶體，即得目標(biāo)產(chǎn)物。
上述常壓溶液法中，反應(yīng)可以在20℃至極性溶劑的回流溫度范圍內(nèi)進行，優(yōu)選采用回流反應(yīng)，進一步優(yōu)選反應(yīng)是在50℃至極性溶劑的回流溫度范圍內(nèi)進行，更優(yōu)選是在60℃條件下反應(yīng)。反應(yīng)是否完全可采用薄層層析跟蹤檢測。本方法中，產(chǎn)物一般以晶體的形式大量生成，如果前序步驟中極性溶劑的加入量較大(如接近配比的上限)或溶劑對產(chǎn)物的溶解性較好，則反應(yīng)后溶液可能呈澄清狀態(tài)，這是因為所形成的產(chǎn)物沉淀被極性溶劑溶解所致，此時可將所得反應(yīng)液濃縮或減壓蒸餾以除去部分溶劑，通常是濃縮除去極性溶劑加入量的50～90％。分離得到的固體可進一步用乙醚、丙酮、乙醇、甲醇或二氯甲烷進行洗滌，之后再進行干燥。
當(dāng)高壓溶劑熱法時，其合成方法包括：取式(II)所示化合物和氯化銅，溶于極性溶劑中，所得混合液置于容器中，經(jīng)液氮冷凍后抽至真空，熔封，然后于30～140℃條件下反應(yīng)，得到目標(biāo)產(chǎn)物。
上述高壓溶劑熱法中，所述的容器通常為厚壁硼硅玻璃管，反應(yīng)通常在30～140℃條件下進行，在此溫度條件下，反應(yīng)的時間優(yōu)選控制在2～24h，也可根據(jù)實際情況延長至24h以上。進一步優(yōu)選混合溶液是在50～140℃條件下進行反應(yīng)，更優(yōu)選混合溶液是在80～100℃條件下進行反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)在80℃以下的常溫或加熱條件下進行時，反應(yīng)需要更長的時間才可獲得較高的產(chǎn)率。
本發(fā)明還包括上述式(I)所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還包括以上述式(I)所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分制備的抗腫瘤藥物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種新的以1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉為配體的氯化銅(II)配合物，以及它的合成方法和應(yīng)用。申請人通過考察其對多種腫瘤細(xì)胞株的抑制作用，結(jié)果表明該配合物具有較強的體外抗腫瘤活性，且明顯高于順鉑，具有較好的潛在藥用價值，有望用于各種抗腫瘤藥物的制備。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例5制得的最終產(chǎn)物的X射線單晶結(jié)構(gòu)圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳述,以更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容,但本發(fā)明并不限于以下實施例。
實施例1：式(II)所示化合物即1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉(L)的合成
1)將1.6g(10mmol)色胺、1.1g(10mmol)吡啶-2-甲醛和50ml甲苯加入150ml圓底燒瓶，加上分水器、冷凝管組成分水回流裝置，加熱回流4小時，待反應(yīng)結(jié)束后蒸干溶劑，殘渣用100ml正己烷重結(jié)晶得到化合物1(2.3g,產(chǎn)率92％)；
2)將2.5g(10mmol)化合物1、2.5g鈀碳(10％Pd/C)和100ml對二甲苯加入250ml圓底燒瓶，加熱至回流，并用薄層層析跟蹤檢測至反應(yīng)結(jié)束，靜置抽濾并將濾液蒸干，所得殘渣上硅膠柱層析純化(V石油醚：V二氯甲烷＝1:1)，得到化合物2(2.1g,產(chǎn)率86％)；
3)將0.24g(10mmol)氫化鈉和15ml N,N-二甲基甲酰胺加入到50ml圓底燒瓶，室溫攪拌10分鐘，再加入2.5g(10mmol)化合物2和10mmol 1-溴庚烷，并用薄層層析跟蹤檢測至反應(yīng)結(jié)束，然后將反應(yīng)液投入500ml冰水中，用100ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機相，蒸干溶劑，所得殘渣上硅膠柱層析純化(V二氯甲烷：V甲醇＝100:1)，得到化合物3(2.8g,產(chǎn)率82％)。
對所得產(chǎn)物進行表征：
(1)核磁共振氫譜和碳譜，它們的波譜數(shù)據(jù)如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.75(d,J＝4.3Hz,1H),8.54(d,J＝5.1Hz,1H),8.17(dd,J＝7.9,0.7Hz,1H),8.07(dd,J＝5.2,1.3Hz,1H),7.96(d,J＝7.7Hz,1H),7.92(td,J＝7.6,1.7Hz,1H),7.63–7.57(m,1H),7.46(d,J＝8.4Hz,1H),7.44–7.38(m,1H),7.30(ddd,J＝7.9,7.2,0.9Hz,1H),4.17(t,J＝8.0Hz,2H),1.43–1.34(m,2H),1.21–1.12(m,2H),1.11–0.96(m,4H),0.87(dd,J＝15.1,7.8Hz,2H),0.81(t,J＝7.3Hz,3H).
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ158.04,148.48,142.62,142.03,137.33,136.99,134.14,131.69,128.84,125.38,123.32,121.66,121.24,120.00,114.73,110.31,45.32,31.65,28.93,28.82,26.71,22.52,14.06.
(2)高分辨質(zhì)譜，ESI-MS m/z:344.2[M+H]+.
因此，可確定上述產(chǎn)物即為1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下述式(II)所示：
實施例2：配體L的合成
重復(fù)實施例1，不同的是：
步驟2)中，用Mn(Ac)3代替鈀碳，用冰乙酸代替對二甲苯，控制Mn(Ac)3的加入量為化合物1物質(zhì)的量的2倍，反應(yīng)在70℃條件下進行，TLC跟蹤檢測至反應(yīng)結(jié)束，然后用氨水將體系的pH調(diào)至7，再用乙酸乙酯萃取三次，合并有機相，蒸干溶劑，所得殘渣上硅膠柱(層析純化(V石油醚：V二氯甲烷＝1:1)，得到化合物2。
對本實施例所得產(chǎn)物進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和高分辨質(zhì)譜分析，確定為目標(biāo)產(chǎn)物1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉。
實施例3：配體L的合成
重復(fù)實施例2，不同的是：
步驟2)中，用Pb(Ac)4代替Mn(Ac)3，控制Pb(Ac)4的加入量為化合物1物質(zhì)的量的5倍，反應(yīng)在60℃條件下進行。
對本實施例所得產(chǎn)物進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和高分辨質(zhì)譜分析，確定為目標(biāo)產(chǎn)物1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉。
實施例4：配體L的合成
重復(fù)實施例1，不同的是：
步驟2)中，用2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌代替鈀碳，用二氯甲烷代替對二甲苯，2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌的加入量與化合物1的物質(zhì)的量相等。
對本實施例所得產(chǎn)物進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和高分辨質(zhì)譜分析，確定為目標(biāo)產(chǎn)物1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉。
實施例5：目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]的合成
在一端開口的厚壁硼硅玻璃管中，直接加入0.1mmol CuCl2·2H2O和0.1mmol配體L,再加入0.6ml甲醇/二氯甲烷混合溶液(甲醇和二氯甲烷的體積比為3:1)，在抽真空的條件下，將開口端熔封，然后在50℃條件下充分反應(yīng)20小時，得到綠色結(jié)晶型固體產(chǎn)物。
對所得產(chǎn)物進行表征：
(1)高分辨質(zhì)譜，ESI-MS m/z:519[Cu(L)(DMSO)Cl]+.(DMSO來自質(zhì)譜測試時使用的溶劑)
(2)X射線單晶衍射分析，如圖1所示。
因此可確定上述產(chǎn)物即為以1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉為配體的銅(II)配合物即目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]，其結(jié)構(gòu)式如下述式(I)所示：
實施例6：目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]的合成
在一端開口的厚壁硼硅玻璃管中，直接加入0.2mmol CuCl2·2H2O和0.1mmol配體L,再加入0.6ml乙醇/氯仿混合溶液(乙醇和氯仿的體積比為3:1)，在抽真空的條件下，將開口端熔封，然后在80℃條件下充分反應(yīng)12小時，得到綠色結(jié)晶型固體產(chǎn)物。
所得產(chǎn)物經(jīng)過高分辨質(zhì)譜和X射線單晶衍射分析進行結(jié)構(gòu)測定，確定為目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]。
實施例7：目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]的合成
在一端開口的厚壁硼硅玻璃管中，直接加入0.3mmol CuCl2·2H2O和0.1mmol配體簡稱L,再加入0.6ml甲醇/乙醇/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液(甲醇、乙醇和N,N-二甲基甲酰胺的體積比為5：1：1)，在抽真空的條件下，將開口端熔封，然后在100℃條件下充分反應(yīng)4小時，得到綠色結(jié)晶型固體產(chǎn)物。
所得產(chǎn)物經(jīng)過高分辨質(zhì)譜和X射線單晶衍射分析進行結(jié)構(gòu)測定，確定為目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]。
實施例8：目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]的合成
在一端開口的厚壁硼硅玻璃管中，直接加入0.4mmol CuCl2·2H2O和0.1mmol配體L,再加入0.6ml乙醇/丙酮混合溶液(乙醇和丙酮的體積比為10:1)，在抽真空的條件下，將開口端熔封，然后在80℃條件下充分反應(yīng)4小時，得到綠色結(jié)晶型固體產(chǎn)物。
所得產(chǎn)物經(jīng)過高分辨質(zhì)譜和X射線單晶衍射分析進行結(jié)構(gòu)測定，確定為目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]。
實施例9：目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]的合成
取6mmol CuCl2·2H2O和1mmol配體L置于圓底燒瓶中，向其中加入80ml乙醇/水混合溶液(乙醇和水的體積比為1:1)，攪拌溶解后，加熱至60℃反應(yīng)12小時，反應(yīng)物減壓濃縮除去部分溶劑，靜置，有綠色晶體析出，分離出固體，用乙醇洗滌，干燥，得到綠色晶體。
所得產(chǎn)物經(jīng)過高分辨質(zhì)譜和X射線單晶衍射分析進行結(jié)構(gòu)測定，確定為目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]。
實施例10：目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]的合成
取2mmol CuCl2·2H2O和1mmol配體L置于圓底燒瓶中，向其中加入50ml甲醇/丙酮/水混合溶液(甲醇、丙酮和水的體積比為30：1：10)，攪拌溶解后，加熱至50℃反應(yīng)12小時，反應(yīng)物減壓濃縮除去部分溶劑，靜置，有綠色晶體析出，分離出固體，用乙醇洗滌，干燥，得到綠色晶體。
所得產(chǎn)物經(jīng)過高分辨質(zhì)譜和X射線單晶衍射分析進行結(jié)構(gòu)測定，確定為目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]。
實施例11：目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]的合成
取3mmol CuCl2·2H2O和1mmol配體L置于圓底燒瓶中，向其中加入30ml甲醇/氯仿混合溶液(甲醇和氯仿的體積比為1：1)，攪拌溶解后，于20℃反應(yīng)18小時，反應(yīng)物減壓濃縮除去部分溶劑，靜置，有綠色晶體析出，分離出固體，用乙醇洗滌，干燥，得到綠色晶體。
所得產(chǎn)物經(jīng)過高分辨質(zhì)譜和X射線單晶衍射分析進行結(jié)構(gòu)測定，確定為目標(biāo)配合物[Cu(L)Cl2]。
為了充分說明本發(fā)明所述配合物在制藥中的用途，申請人對其進行了體外抗腫瘤活性實驗。
實驗例1：以1-(2-吡啶)-9-庚基-β-咔啉為配體的氯化銅(II)配合物(按本發(fā)明實施例5所述方法制得)及配體L(按本發(fā)明實施例1所述方法制得)對多種人類腫瘤株進行體外抑制活性實驗
1、細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)
本實驗選用人胃癌細(xì)胞MGC-803、人肝癌細(xì)胞株Hep G2、人膀胱癌細(xì)胞T-24、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460以及人正常細(xì)胞HL-7702共5種細(xì)胞株。
所有腫瘤細(xì)胞株均培養(yǎng)在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)，置37℃含體積濃度5％CO2孵箱中培養(yǎng)；人正常細(xì)胞株則培養(yǎng)在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)。
2、待測化合物的配制
將各待測化合物的DMSO儲液(濃度為0.002mol/L)通過RMPI1640培養(yǎng)基依次稀釋成五個濃度梯度，分別為20、10、5、2.5、1.25μmol/L，其中助溶劑DMSO終濃度≤1％。首先測試20μmol/L的各待測化合物對于腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率，視為初篩結(jié)果；再分別測試不同梯度濃度下各待測化合物對各種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制程度，用以擬合計算半數(shù)抑制濃度，即IC50值。
3、細(xì)胞生長抑制實驗(MTT法)
(1)取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培養(yǎng)液配制成濃度為5000個/mL的細(xì)胞懸液，以每孔190μL接種于96孔培養(yǎng)板中，使待測細(xì)胞密度至1000～10000個/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)；
(2)5％CO2，37℃孵育24h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，每孔加入一定濃度梯度的藥物10μL，每個濃度梯度設(shè)4個復(fù)孔；
(3)5％CO2，37℃孵育48小時，倒置顯微鏡下觀察；
(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h；
(5)終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO充分溶解甲瓚沉淀，振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀用波長為570nm，參比波長為450nm測定各孔的光密度值；
(6)同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO)。
(7)根據(jù)測得的光密度值(OD值)，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強。
計算化合物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。對于在初篩濃度下抑制率超過50％的細(xì)胞株，進一步通過SPSS軟件對五個濃度梯度的抑制率數(shù)據(jù)進行擬合，求出化合物對不同腫瘤株的半數(shù)抑制濃度(IC50值，單位μmol/L)，化合物對于不同細(xì)胞株的IC50值如表1所示。
表1：本發(fā)明所述化合物對5種細(xì)胞株的IC50值(μmol/L)
從體外抗腫瘤活性測試結(jié)果來看，本發(fā)明所述配合物具有較強的抗腫瘤活性，其活性明顯優(yōu)于順鉑，有望開發(fā)成抗腫瘤藥物。