本發(fā)明屬于新化合物合成和藥物應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一類新型谷胱甘肽敏感的兩親性聚乙二醇偶聯(lián)的羥基喜樹堿前藥:MPEG-X-COO-HCPT或者HCPT-COO-X-PEG-X-COO-HCPT。

技術(shù)背景

喜樹堿是從我國內(nèi)地特有的珙桐科植物喜樹的皮、果實(shí)中提取得到的一類生物堿。它對(duì)治療多種惡性腫瘤具有顯著療效。研究表明喜樹堿及其衍生物可通過作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I來抑制DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和有絲分裂。

目前喜樹堿類藥物已成為抗腫瘤治療的主力品種之一，被譽(yù)為21世紀(jì)的抗癌藥。但臨床使用中也發(fā)現(xiàn)喜樹堿的毒副作用較大，易出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、骨髓抑制等副作用。因此尋找毒副作用小、抗癌譜廣的喜樹堿類似物的研究倍受人們的關(guān)注。人們以喜樹堿為原料，通過半合成的方法得到許多喜樹堿類似物，并從中篩選出了一系列抗癌活性高、毒副作用低的喜樹堿衍生物，成為世界抗腫瘤藥物市場(chǎng)上的亮點(diǎn)。10-羥基喜樹堿是喜樹堿的一種天然類似物，它抗癌活性明顯高于喜樹堿，但它也有一定的毒性，副作用較多，水溶性較差且體內(nèi)代謝不穩(wěn)定。目前市場(chǎng)上的羥基喜樹堿類藥物都是通過注射進(jìn)入人體發(fā)揮作用的。

納米載體已經(jīng)被廣泛用于抗癌藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)來提高藥物在水中溶解度和腫瘤的靶向性，并大大提高藥物的生物利用度和治療效果。因此，將納米載體引入羥基喜樹堿的衍生化當(dāng)中，可以顯著提高羥基喜樹堿在臨床上的優(yōu)勢(shì)。通常在高分子前藥的制備中，選用的載體有右旋糖酐、血清蛋白、聚乙二醇等，其中聚乙二醇因其中性、低毒等理化性質(zhì)和良好生物相容性，是FDA批準(zhǔn)的可藥用聚合物之一，它經(jīng)常被應(yīng)用于連接抗癌藥物和治療性蛋白，以提高藥物的溶解度、生物利用度。

據(jù)檢索，與本申請(qǐng)相關(guān)的其它專利文獻(xiàn)，具體公開內(nèi)容如下：

CN101199857公開了一種新型的基于兩親性嵌段聚合物的喜樹堿前體藥物：甲氧基聚乙二醇乳酸與喜樹堿類藥物的結(jié)合物(MPEG-X-PLA-T)。MPEG是甲氧基聚乙二醇。X是連接基團(tuán)，例如丁二酸等。PLA是聚乳酸。T是藥物分子，例如喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿等喜樹堿類藥物。聚乳酸與喜樹堿類藥物通過酯鍵相連接。

CN1708540提供喜樹堿的水溶性衍生物，它具有優(yōu)異的治療效果，適合于癌癥的化學(xué)治療。也就是說，喜樹堿的水溶性高分子等衍生物，通過聚乙二醇-聚羧聚合物中的羧酸基團(tuán)與酚喜樹堿中的酚羥基之間的酯連接而獲得，具有良好的持續(xù)釋放效果。

本申請(qǐng)發(fā)明人曾申請(qǐng)的一項(xiàng)專利(CN 104788669)主要涉及聚乙二醇與羥基喜樹堿以氨基甲酸酯功能團(tuán)相連接的一系列化合物。本申請(qǐng)?jiān)谠袑＠幕A(chǔ)上提供了一種對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在的高濃度谷胱甘肽敏感的新型羥基喜樹堿衍生物，包括合成、體外活性、體外釋放以及溶液中自聚為納米膠束等內(nèi)容，擴(kuò)大了羥基喜樹堿的用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種谷胱甘肽敏感的兩親性聚乙二醇-羥基喜樹堿偶聯(lián)物，是一種新型靶向腫瘤部位的可自聚成納米膠束的兩親性羥基喜樹堿的聚乙二醇偶聯(lián)物及其潛在的應(yīng)用，提供了體外活性、體外釋放以及膠束粒徑等測(cè)試數(shù)據(jù)。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一種谷胱甘肽敏感的兩親性聚乙二醇-羥基喜樹堿偶聯(lián)物，結(jié)構(gòu)通式如下

MPEG-X-COO-HCPT或者HCPT-COO-X-PEG-X-COO-HCPT

MPEG是聚乙二醇單甲醚，PEG是聚乙二醇；

X是含二硫鍵的鏈接橋，HCPT為羥基喜樹堿類藥物分子。

其中MPEG是聚乙二醇單甲醚，PEG是聚乙二醇；X是連接基團(tuán)；HCPT是羥基喜樹堿類藥物分子。所述聚乙二醇單甲醚和聚乙二醇的分子量范圍為300-50000，所述連接基團(tuán)為鄰巰基苯乙酸與半胱氨酸或與半胱氨以二硫鍵相連的結(jié)構(gòu)。HCPT羥基喜樹堿類藥物分子包括喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、10-羥基喜樹堿等。

新型水溶性聚乙二醇偶聯(lián)的羥基喜樹堿衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

所述腫瘤主要包括人肝癌、人白血病和人結(jié)腸癌。

所述化合物為下列化合物之一，其中n＝6～1100

一種制備谷胱甘肽敏感的兩親性聚乙二醇-羥基喜樹堿偶聯(lián)物的方法，合成路線如下：

一種制備谷胱甘肽敏感的兩親性聚乙二醇-羥基喜樹堿偶聯(lián)物的方法，合成路線如下：

谷胱甘肽敏感的兩親性聚乙二醇-羥基喜樹堿偶聯(lián)物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

所述腫瘤包括人肝癌、人白血病和人結(jié)腸癌等。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

1、本發(fā)明以羥基喜樹堿、聚乙二醇單甲醚或聚乙二醇、叔丁氧羰基保護(hù)的半胱氨酸、半胱胺為原料，經(jīng)過一系列反應(yīng)合成出具有抗腫瘤活性的聚乙二醇偶聯(lián)的羥基喜樹堿前藥。而且該偶聯(lián)物前藥水溶性增強(qiáng)，在水溶液中可自聚為納米粒徑的膠束，可通過EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向到腫瘤部位。

2、本發(fā)明所涉及的目標(biāo)分子可特異性地響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度的谷胱甘肽，釋放原藥分子，因此可減少對(duì)正常組織的毒性。

3、本發(fā)明具有合成路線短、操作簡單、反應(yīng)條件溫和、合成工藝和純化方法簡單等優(yōu)點(diǎn)。

4、本發(fā)明所涉及的化合物具有抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞的作用，可進(jìn)一步用于研究制備治療人肝癌、人白血病和人結(jié)腸癌抗腫瘤藥物。

附圖說明

圖1-1化合物13a-14c體外HCPT釋放性能；

圖1-2化合物13a-14c體外HCPT釋放性能(10mM GSH)；

圖2-1化合物13a的DLS粒徑分布結(jié)果；

圖2-2化合物13c的DLS粒徑分布結(jié)果；

圖2-3化合物13d的DLS粒徑分布結(jié)果；

圖3-1化合物13a在氘代DMSO中的核磁氫譜圖；

圖3-2化合物13a在重水中的核磁氫譜圖；

圖4-1化合物13a的TEM圖；

圖4-2化合物13c的TEM圖；

圖4-3化合物13d的TEM圖。

具體的實(shí)施方式

為了理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所述的新型谷胱甘肽響應(yīng)的水溶性聚乙二醇偶聯(lián)的羥基喜樹堿衍生物的代表性結(jié)構(gòu)如下：其中n＝6～1100。

化合物13a-13d的合成路線如下：

化合物14a-14d的合成路線如下：

下面通過實(shí)施例具體說明合成過程和測(cè)試方法。下面n＝6～1100。

一、化合物的合成步驟如下：

1、化合物16的合成

取苯并噻吩-2硼酸2g(11.2mmol)溶于20ml乙醇，冰浴下滴加3.68ml 30％H2O2。室溫?cái)嚢柽^夜，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，冰浴下滴加飽和亞硫酸鈉淬滅過量H2O2，再用DCM萃取，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，最后減壓旋干得到1.55g(10.03mmol)固體，產(chǎn)率92％，無需進(jìn)一步純化。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.51-7.25(m,4H),4.21(s,2H).

2、鄰巰基苯乙酸(化合物17)的合成

取1.5g(9.98mmol)化合物16溶于40ml THF,冰浴下滴加溶于40ml水的2.5g(59.6mmol)LiOH.H₂O。在氬氣保護(hù)下，60℃反應(yīng)過夜，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，加水和乙酸乙酯，冰浴下用2N HCl調(diào)節(jié)pH至3，取有機(jī)相，再飽和氯化鈉洗有機(jī)相，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，用石油醚：乙酸乙酯＝10：1，200-300目硅膠柱層析純化得到1.35g(8.02mmol)金黃色固體，產(chǎn)率80％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.36(s,1H),7.54-7.10(m,4H),3.37(s,2H).

3、N-叔丁氧羰基胱氨酸(化合物19)的合成

取L-胱氨酸5g(20.81mmol)溶于50ml H₂O，冰浴下加入8.7ml(62.4mmol)三乙胺，再加入13.5g(62.4mmol)二碳酸二叔丁酯。室溫?cái)嚢柽^夜，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，加0.1N HCl，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，最后減壓旋干,加正己烷，超聲，再過濾得到5.96g(13.5mmol)N-叔丁氧羰基胱氨酸，產(chǎn)率65％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.83(s,2H),7.21(d,J＝8.4Hz,2H),4.20-4.14(m,2H),3.12-3.08(m,2H),2.91-2.85(m,2H),1.38(s,18H).

4、N-叔丁氧羰基半胱氨酸(化合物20)的合成

取N-叔丁氧羰基胱氨酸1g(2.27mmol)溶于18ml THF，再加入三苯基膦0.9g(3.43mmol)，再加入2ml水。氬氣保護(hù)下，50℃反應(yīng)過夜，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，冰浴下加入飽和碳酸氫鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至8-9，加入乙酸乙酯萃取，收集水相，冰浴下用1N HCl調(diào)節(jié)水相pH至2-3，加入乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，最后減壓旋干得到1g(4.52mmol)油狀液體，產(chǎn)率99％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.84(s,1H),7.04(d,J＝8.4Hz,1H),4.02-4.06(m,1H),2.81-2.86(m,1H),2.67-2.72(m,1H),1.39(s,9H).

5、化合物21的合成

取1.33g(6mmol)N-Boc-L-半胱氨酸溶于100ml二氯甲烷中，氬氣保護(hù)，-10℃下滴加到3.97g(18mmol)2,2'-二硫二吡啶的15ml二氯甲烷溶液中，滴加完后，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，加水，萃取，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，用石油醚：乙酸乙酯＝3：1，200-300目硅膠柱層析純化得到1.33g白色固體，產(chǎn)率67％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.86(s,1H),8.47(d,J＝4.0Hz,1H),7.82-7.75(m,2H),7.40(d,J＝8.0Hz,1H),7.26(t,J＝5.6Hz,1H),4.19-4.15(m,1H),3.21-3.07(m,2H),1.40(s,9H).

6、化合物22a-22d的合成

取1g(3.03mmol)21溶于40ml無水二氯甲烷，再加入(1.38mmol)聚乙二醇單甲醚或(0.69mmol)聚乙二醇，冰浴下加入0.1g(0.826mmol)4-二甲氨基吡啶，再滴加溶于20ml二氯甲烷的0.79g(4.13mmol)EDCI。40℃反應(yīng)2h后，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后,向反應(yīng)混合物中加入二氯甲烷，先后用0.1N HCl、飽和NaHCO₃溶液、飽和NaCl溶液洗滌，無水NaSO₄干燥，減壓旋干二氯甲烷，乙醚重結(jié)晶，產(chǎn)率22a-22d(85％-96％)。

Compound 22a：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.48(d,J＝4.4Hz,1H),7.84-7.75(m,2H),7.57(d,J＝8.0Hz,1H),7.27(t,J＝5.8Hz,1H),4.29-4.10(m,3H,),3.57-3.42(m,MPEG),3.24(s,3H),3.20-3.09(m,2H),1.40(s,9H).

Compound 22b：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.48(d,J＝4.0Hz,1H),7.83-7.74(m,2H),7.55(d,J＝8.0Hz,1H),7.27(t,J＝4.0Hz,1H),4.29-4.10(m,3H),3.70-3.42(m,MPEG),3.25(s,3H),3.21-3.09(m,2H),1.40(s,9H).

Compound 22c：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.46(d,J＝4.4Hz,1H),7.81-7.72(m,2H),7.54(d,J＝8.0Hz,1H),7.25(t,J＝5.8Hz,1H),4.25-4.08(m,3H),3.68-3.50(m,MPEG),3.23(s,3H),3.19-3.07(m,2H),1.38(s,9H).

Compound 22d：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.48(d,J＝4.0Hz,2H),7.83-7.75(m,4H),7.57(d,J＝8.0Hz,2H),7.27(t,J＝5.8Hz,2H),4.29-4.11(m,6H),3.57-3.48(m,PEG),3.21-3.09(m,4H),1.40(s,18H).

7、化合物23a-23d的合成

取94.5mg(0.56mmol)鄰巰基苯乙酸溶于20ml二氯甲烷，在氬氣保護(hù)下，-10℃下，滴加到溶于5ml二氯甲烷的(0.42mmol)22a-22c或(0.21mmol)22d中，滴加完后，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全，減壓旋干二氯甲烷，再用乙醚重結(jié)晶，產(chǎn)率89％-95％。

Compound 23a：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ):12.46(s,1H),7.72(d,J＝7.6Hz,1H),7.46-7.31(m,4H),4.32-4.01(m,3H),3.87(s,2H),3.51-3.50(m,MPEG),3.25(s,3H),3.06-2.94(m,2H),1.40(s,9H).

Compound 23b：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.44(s,1H),7.71(d,J＝7.2Hz,1H),7.43-7.30(m,4H),4.31-4.11(m,3H),3.78(s,2H),3.70-3.41(m,MPEG),3.24(s,3H),2.05-2.93(m,2H),1.38(s,9H).

Compound 23c：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.45(s,1H),7.70(d,J＝7.2Hz,1H),7.43-7.30(m,4H),4.28-4.18(m,3H),3.77(s,2H),3.68-3.50(m,MPEG),3.23(s,3H),3.03-2.92(m,2H),1.38(s,9H).

Compound 23d：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.56(s,2H),7.77(d,J＝7.2Hz,2H),7.51-7.35(m,8H),4.37-4.12(m,6H),3.84(s,4H),3.65-3.53(m,PEG),3.09-2.99(m,4H),1.40(s,18H).

8、化合物13a-13d的合成

取0.377g(1mmol)10-羥基喜樹堿溶于10ml無水DMF,再加入(0.69mmol)23a-23c或(0.345mmol)23d，冰浴下加入1.68ml吡啶和85mg(0.66mmol)二甲氨基吡啶，再滴入溶于10ml無水二氯甲烷的0.53g(2.76mmol)EDCI，室溫反應(yīng)3小時(shí)后，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后,向反應(yīng)混合物中加入二氯甲烷，先后用0.1N HCl、飽和NaCl溶液洗滌，無水NaSO₄干燥，減壓旋干二氯甲烷，用100％乙酸乙酯、二氯甲烷:甲醇＝25:1，200-300目硅膠柱層析純化，乙醚重結(jié)晶，產(chǎn)率75％-81％。

MPEG₃₅₀-Cys(Boc)-HCPT(13a):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.72(s,1H),8.22(d,J＝9.2Hz,1H),7.94(s,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,1H),7.70-7.67(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),7.52-7.47(m,2H),7.43-7.41(m,2H),7.36(s,1H),6.53(s,1H),5.44(s,2H),5.30(s,2H),4.41-4.34(m,1H),4.30(s,2H),4.23-4.11(m,2H),3.58-3.42(m,MPEG),3.23(s,3H),3.10-3.03(m,2H),1.92-1.85(m,2H),1.41(s,9H),0.90(t,J＝7.2Hz,3H).

MPEG₂₀₀₀-Cys(Boc)-HCPT(13b):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.69(s,1H),8.21(d,J＝9.2Hz,1H),7.93(s,1H),7.78(d,J＝6.8Hz,1H),7.67(d,J＝6.8Hz,1H),7.51-7.47(m,2H),7.40-7.39(m,2H),7.34(s,1H),6.53(s,1H),5.42(s,2H),5.29(s,2H),4.37-4.33(m,1H),4.28(s,2H),4.20-4.09(m,2H),3.67-3.50(m, MPEG),3.23(s,3H),3.11-2.98(m,2H),1.91-1.81(m,2H),1.39(s,9H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H).

MPEG₅₀₀₀-Cys(Boc)-HCPT(13c):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.72(s,1H),8.24(d,J＝9.2Hz,1H),7.95(s,1H),7.80(d,J＝7.6Hz,1H),7.70(d,J＝8.8Hz,1H),7.54-7.45(m,2H),7.43-7.42(m,2H),7.37(s,1H),6.55(s,1H),5.44(s,2H),5.31(s,2H),4.39-4.37(m,1H),4.30(s,2H),4.20-4.14(m,2H),3.69-3.52(m,MPEG),3.25(s,3H),3.13-3.00(m,2H),1.94-1.83(m,2H),1.42(s,9H),0.90(t,J＝7.2Hz,3H).

HCPT-Cys(Boc)-PEG₃₀₀-Cys(Boc)-HCPT(13d):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.68(s,2H),8.20(d,J＝8.4Hz,2H),7.91(s,2H),7.78(d,J＝5.6Hz,2H),7.66(d,J＝7.6Hz,2H),7.51-7.49(m,4H),7.40(s,4H),7.33(s,2H),6.55(s,2H),5.43(s,4H),5.27(s,4H),4.37(s,2H),4.28(s,4H),4.17-4.12(m,2H),3.56-3.44(m,PEG),3.10-2.98(m,4H),1.89-1.85(m,4H),1.40(s,18H),0.88(t,J＝7.0Hz,6H).

9、化合物25的合成

取1g(8.8mmol)半胱胺鹽酸鹽溶于100ml甲醇，氬氣保護(hù)，-10℃，滴加到5.82g(26.4mmol)2,2'-二硫二吡啶的10ml二氯甲烷溶液中，滴加完后，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全，減壓除去溶劑，加入120ml無水乙腈，冰浴下加入1.83ml三乙胺和1.06g(10.6mmol)丁二酸酐，室溫反應(yīng)2h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，加入0.35ml冰醋酸，減壓除去溶劑，直接用二氯甲烷:甲醇＝60：1，200-300目硅膠柱層析純化，再用乙醚重結(jié)晶得到1.25g(4.36mmol)化合物25，產(chǎn)率50％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.06(s,1H),8.46(d,J＝4.4Hz,1H),8.08(t,J＝5.2Hz,1H),7.85-7.81(m,1H),7.71(d,J＝8.0Hz,1H),7.25(t,J＝5.6Hz,1H),3.33(t,J＝6.4Hz,2H),2.89(t,J＝6.8Hz,2H),2.42(t,J＝6.6Hz,2H),2.32(t,J＝6.8Hz,2H).

10、化合物26a-26d的合成

取0.315g(1.1mmol)化合物25溶于15ml無水二氯甲烷，加入(0.5mmol)聚乙二醇單甲醚或(0.25mmol)聚乙二醇，冰浴下加入33.6mg(0.275mmol)二甲氨基吡啶，再滴入溶于6ml無水二氯甲烷的0.287g(1.5mmol)EDCI,40℃反應(yīng)2h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后,向反應(yīng)混合物中加入加入二氯甲烷，先后用0.1N HCl、飽和NaHCO₃溶液、飽和NaCl溶液洗滌，無水NaSO₄干燥，減壓旋干二氯甲烷，乙醚重結(jié)晶，產(chǎn)率89％-95％。

Compound 26a:¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.46(d,J＝4.4Hz,1H),8.11(t,J＝5.2Hz,1H),7.83(t,J＝7.6Hz,1H),7.77(d,J＝7.6Hz,1H),7.25(t,J＝6.0Hz,1H),4.10(t,J＝4.6Hz,2H),3.69-3.41(m,MPEG),3.33(m,2H,overlapped with water peak),3.24(s,3H),2.88(t,J＝6.8Hz,2H),2.35(t,J＝6.8Hz,2H).

Compound 26b:¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.48(d,J＝4.4Hz,1H),8.12(t,J＝5.2Hz,1H),7.85(t,J＝7.6Hz,1H),7.79(d,J＝8.0Hz,1H),7.26(t,J＝6.0Hz,1H),4.11(t,J＝4.8Hz,2H),3.70-3.43(m,MPEG),3.33(m,2H,overlapped with water peak),3.25(s,3H),2.90(t,J＝6.6Hz,2H),2.36(t,J＝6.8Hz,2H).

Compound 26c:¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.47(d,J＝4.4Hz,1H),8.12(t,J＝5.0Hz,1H),7.85(t,J＝7.6Hz,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,1H),7.26(t,J＝6.0Hz,1H),4.11(t,J＝4.6Hz,2H),3.71-3.44(m,MPEG),3.33(m,2H,overlapped with water peak),3.25(s,3H),2.90(t,J＝6.8Hz,2H),2.36(t,J＝6.8Hz,2H).

Compound 26d:¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.45(d,J＝4.4Hz,2H),8.10(t,J＝5.0Hz,2H),7.82(t,J＝7.6Hz,2H),7.76(d,J＝8.0Hz,2H),7.24(t,J＝6.0Hz,2H),4.09(t,J＝4.2Hz,4H),3.57-3.50(m,PEG),3.33(m,4H,overlapped with water peak),2.87(t,J＝6.8Hz,4H),2.35(t,J＝6.8Hz,4H).

11、化合物27a-27d的合成

取72.3mg(0.43mmol)鄰巰基苯乙酸溶于10ml二氯甲烷，在氬氣保護(hù)下，-10℃下，滴加到溶于5ml二氯甲烷的(0.33mmol)26a-26c或(0.165mmol)26d中，滴加完后，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全，減壓旋干二氯甲烷，再用乙醚重結(jié)晶，產(chǎn)率73％-91％.

Compound 27a:¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.50(s,1H),8.13(t,J＝5.2Hz,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H),7.43-7.34(m,3H),4.16(t,J＝4.4Hz,2H),3.83(s,2H),3.66-3.48(m,MPEG),3.33(m,2H,overlapped with water peak),3.30(s,3H),2.82(t,J＝6.8Hz,2H),2.42(t,J＝6.6Hz,2H).

Compound 27b:¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.43(s,1H),8.07(t,J＝5.4Hz,1H),7.73(d,J＝8.0Hz,1H),7.36-7.27(m,3H),4.10(t,J＝4.6Hz,2H),3.76(s,2H),3.69-3.41(m,MPEG),3.33(m,2H,overlapped with water peak),3.24(s,3H),2.76(t,J＝6.6Hz,2H),2.34(t,J＝6.8Hz,2H).

Compound 27c:¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.41(s,1H),8.08(t,J＝5.4Hz,1H),7.75(d,J＝7.6Hz,1H),7.38-7.29(m,3H),4.11(t,J＝4.4Hz,2H),3.78(s,2H), 3.74-3.52(m,MPEG),3.33(m,2H,overlapped with water peak),3.25(s,3H),2.78(t,J＝6.8Hz,2H),2.35(t,J＝6.6Hz,2H).

Compound 27d:¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.54(s,2H),8.06(t,J＝5.4Hz,2H),7.72(d,J＝7.6Hz,2H),7.34-7.27(m,6H),4.09(s,4H),3.76(s,4H),3.57-3.50(m,PEG),3.33(m,4H,overlapped with water peak),2.75(t,J＝6.6Hz,4H),2.33(t,J＝6.8Hz,4H).

12、化合物14a-14d的合成

取0.141g(0.387mmol)10-羥基喜樹堿溶于5ml無水DMF,再加入(0.258mmol)27a-27c或(0.129mmol)27d，冰浴下加入0.62ml吡啶和31.5mg(0.258mmol)二甲氨基吡啶，再滴入溶于7.5ml無水二氯甲烷的0.198g(1.03mmol)EDCI，室溫反應(yīng)3小時(shí)后，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后,向反應(yīng)混合物中加入二氯甲烷，先后用0.1N HCl、飽和NaC l溶液洗滌，無水NaSO₄干燥，減壓旋干二氯甲烷，用100％乙酸乙酯、二氯甲烷:甲醇＝20:1，200-300目硅膠柱層析純化，乙醚重結(jié)晶，產(chǎn)率61％-91％。

MPEG₃₅₀-cysteamine-HCPT(14a):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.71(s,1H),8.23(d,J＝9.2Hz,1H),8.11(t,J＝5.2Hz,1H),7.94(s,1H),7.81(d,J＝7.6Hz,1H),7.67(d,J＝9.2Hz,1H),7.50(d,J＝7.2Hz,1H),7.45-7.35(m,3H),6.53(s,1H),5.43(s,2H),5.30(s,2H),4.28(s,2H),4.09(t,J＝4.4Hz,2H),3.58-3.41(m,MPEG),3.33(m,2H,overlapped with water peak),3.23(s,3H),2.83(t,J＝6.8Hz,2H),2.36(t,J＝6.8Hz,2H),1.92–1.82(m,2H),0.88(t,J＝7.2Hz,3H).

MPEG₂₀₀₀-cysteamine-HCPT(14b):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.70(s,1H),8.21(d,J＝8.8Hz,1H),8.09(s,1H),7.93(s,1H),7.80(d,J＝7.6Hz,1H),7.66(d,J＝9.2Hz,1H),7.48(d,J＝6.8Hz,1H),7.44-7.34(m,3H),6.52(s,1H),5.42(s,2H),5.29(s,2H),4.27(s,2H),4.09(t,J＝4.4Hz,2H),3.66-3.41(m,MPEG),3.33(m,2H,overlapped with water peak),3.22(s,3H),2.81(t,J＝6.4Hz,2H),2.34(t,J＝6.6Hz,2H),1.88–1.84(m,2H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H).

MPEG₅₀₀₀-cysteamine-HCPT(14c):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.72(s,1H),8.23(d,J＝9.2Hz,1H),8.10(t,J＝5.4Hz,1H),7.94(s,1H),7.81(d,J＝7.6Hz,1H),7.68(d,J＝8.8Hz,1H),7.50(d,J＝7.2,1H),7.45-7.35(m,3H),6.53(s,1H),5.43(s,2H),5.30(s,2H),4.28(s,2H),4.10(t,J＝4.4Hz,2H),3.69-3.43(m,MPEG),3.33(m,2H,overlapped with water peak),3.24(s,3H),2.83(t,J＝6.6Hz,2H),2.36(t,J＝6.8Hz,2H),1.91-1.82(m,2H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H).

HCPT-cysteamine-PEG₃₀₀-cysteamine-HCPT(14d):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:8.69(s,2H),8.21(d,J＝9.2Hz,2H),8.11(t,J＝5.0Hz,2H),7.92(s,2H),7.80(d,J＝7.6Hz,2H),7.66(d,J＝8.0,2H),7.49(d,J＝6.8Hz,2H),7.44-7.34(m,6H),6.53(s,2H),5.43(s,4H),5.28(s,4H),4.27(s,4H),4.09(t,J＝4.4Hz,4H),3.56-3.47(m,PEG),3.33(m,4H,overlapped with water peak),2.82(t,J＝6.6Hz,4H),2.35(t,J＝6.6Hz,4H),1.90–1.83(m,4H),0.88(t,J＝7.2Hz,6H).

二、抗細(xì)胞增殖活性測(cè)定

1、溶液的配制：

DMEM low glucose培養(yǎng)液的配制：購買HyClone MEM low glucose培養(yǎng)基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的青鏈霉素溶液，即每瓶培養(yǎng)基加入50mL的胎牛血清和5mL的青鏈霉素，培養(yǎng)基的配置在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，后放置冰箱4℃保存。

DMEM/F-12培養(yǎng)液的配制：購買HyClone MEM/F-12培養(yǎng)基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的青鏈霉素溶液，即每瓶培養(yǎng)基加入50mL的胎牛血清和5mL的青鏈霉素，培養(yǎng)基的配置在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，后放置冰箱4℃保存。

PBS緩沖液的配制：在1000mL錐形瓶中，稱取氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，十二水合磷酸氫二鈉2.9g，磷酸二氫鉀0.2g，加入800mL純凈水充分?jǐn)嚢枞芙夂蠖ㄈ葜?000mL，高壓滅菌后放置冰箱4℃保存。

MTT溶液的配制：稱取MTT干粉0.5g，溶于100mL PBS緩沖液中，用0.22μM濾膜過濾除菌后，放置冰箱-12℃保存。

2、抗腫瘤活性測(cè)定的具體步驟：

本發(fā)明抗腫瘤活性測(cè)定所用1種正常細(xì)胞HUVEC和3種腫瘤細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞(HepG2)、白血病細(xì)胞(K562)和人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)。

利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)活性測(cè)試

HUVEC細(xì)胞使用的培養(yǎng)液為含1％的青霉素-鏈霉素溶液，10％的胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃、含5％CO₂的恒溫培養(yǎng)箱。具體步驟：

(1)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，用DMEM low glucose培養(yǎng)液將其稀釋至5x10⁴個(gè)/mL；

(2)在96孔板的每個(gè)孔里加入100μL細(xì)胞懸液吹打混勻，培養(yǎng)箱37℃溫育24h；

(3)將所要測(cè)試化合物稀釋至5種濃度：2mM，0.2mM，20μM，2μM，0.2μM，按照濃度依次加藥0.5μL/孔，培養(yǎng)箱37℃溫育48h；

(4)加入濃度為5mg/mL的MTT，培養(yǎng)箱37℃溫育4h；

(5)加DMSO將細(xì)胞溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定在490nm和630nm下的OD值；

(6)處理數(shù)據(jù)，根據(jù)OD值計(jì)算IC₅₀值。

利用人肝癌細(xì)胞HepG2活性測(cè)試

HepG2細(xì)胞使用的培養(yǎng)液為含1％的青霉素-鏈霉素溶液，10％的胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃、含5％CO₂的恒溫培養(yǎng)箱。具體步驟：

(1)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，用DMEM low glucose培養(yǎng)液將其稀釋至5x10⁴個(gè)/mL；

(2)在96孔板的每個(gè)孔里加入100μL細(xì)胞懸液吹打混勻，培養(yǎng)箱37℃溫育24h；

(3)將所要測(cè)試化合物稀釋至5種濃度：2mM,0.2mM,20μM,2μM,0.2μM，按照濃度依次加藥0.5μL/孔，培養(yǎng)箱37℃溫育48h；

(4)加入濃度為5mg/mL的MTT，培養(yǎng)箱37℃溫育4h；

(5)加DMSO將細(xì)胞溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定在490nm和630nm下的OD值；

(6)處理數(shù)據(jù)，根據(jù)OD值計(jì)算IC₅₀值。

利用人白血病細(xì)胞K562活性測(cè)試

K562細(xì)胞使用的培養(yǎng)液為含1％的青霉素-鏈霉素溶液，10％的胎牛血清的PRMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃、含5％CO₂的恒溫培養(yǎng)箱。具體步驟：

(1)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，用RPMI培養(yǎng)液將其稀釋至5x10⁴個(gè)/mL；

(2)在96孔板的每個(gè)孔里加入100μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱37℃溫育2h；

(3)將所要測(cè)試化合物稀釋至5種濃度：2mM,0.2mM,20μM,2μM,0.2μM，按照濃度依次加藥0.5μL/孔，培養(yǎng)箱37℃溫育48h；

(4)加入濃度為5mg/mL的MTT，培養(yǎng)箱37℃溫育4小時(shí)；

(5)加異丙醇與鹽酸裂解液，酶標(biāo)儀測(cè)定在570nm和630nm下的OD值；

(6)處理數(shù)據(jù)，根據(jù)OD值計(jì)算IC₅₀值。

利用人白血病細(xì)胞HT-29活性測(cè)試

HT-29細(xì)胞使用的培養(yǎng)液為含1％的青霉素-鏈霉素溶液，10％的胎牛血清的DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃、含5％CO₂的恒溫培養(yǎng)箱。具體步驟：

(1)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，用DMEM/F-12培養(yǎng)液將其稀釋至5x10⁴個(gè)/mL；

(2)在96孔板的每個(gè)孔里加入100μL細(xì)胞懸液吹打混勻，培養(yǎng)箱37℃溫育24h；

(3)將所要測(cè)試化合物稀釋至5種濃度：2mM,0.2mM,20μM,2μM,0.2μM，按照濃度依次加藥0.5μL/孔，培養(yǎng)箱37℃溫育48h；

(4)加入濃度為5mg/mL的MTT，培養(yǎng)箱37℃溫育4h；

(5)加DMSO將細(xì)胞溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定在490nm和630nm下的OD值；

(6)處理數(shù)據(jù)，根據(jù)OD值計(jì)算IC₅₀值。

表1化合物13a-14d在體外的抗細(xì)胞增殖活性測(cè)試

由上表可知，13a-14d顯示出與羥基喜樹堿相當(dāng)或更高的抗腫瘤增殖活性，同時(shí)顯示出低于羥基喜樹堿對(duì)正常細(xì)胞的毒性，尤其是化合物13a對(duì)正常細(xì)胞有明顯的低毒性，為羥基喜樹堿的二十分之一，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性是正常細(xì)胞的130多倍。

三、羥基喜樹堿(HCPT)體外釋放測(cè)試在37℃下，分兩組進(jìn)行，一組各化合物溶解在PBS(pH7.4)中，不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣分析，另一組溶解在10mM GSH的PBS(pH7.4)中，不同時(shí)間進(jìn)行取樣分析。用C18分析柱進(jìn)行HPLC檢測(cè)，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫比例43％-95％，時(shí)間為15min，流速為1.0mL.min-1，檢測(cè)波長為365nm。以化合物13a-14c為例，由釋放結(jié)果可知在高GSH濃度時(shí)偶聯(lián)物可快速釋放HCPT，而在無GSH條件下，HCPT釋放速率則顯著降低，因此預(yù)測(cè)該系列化合物可在腫瘤部位(具有高GSH濃度)快速釋放HCPT，符合預(yù)期設(shè)想?；衔?4d因溶解度限制未測(cè)試體外HCPT釋放情況。

四、納米粒子的制備及動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)量粒徑分布

設(shè)計(jì)合成的聚合物一端是親水的聚乙二醇，另一端是疏水的羥基喜樹堿，因此在水溶液里有自組裝形成納米粒子的特性。具體操作如下：

(1)先用THF溶解化合物，攪拌條件下再滴加到蒸餾水中，減壓除去THF，再凍干成固體粉末；

(2)各取適量固體粉末溶解在PBS里；

(3)用Zetasizer Nano-BI-APD(Brookhaven Instruments,USA)，在532nm激光燈照射下測(cè)量自主裝形成的納米的粒徑及其分布。

以13a、13c、13d為例，13a、13c、13d三個(gè)化合物的DLS圖分別為圖2-1，圖 2-2，圖2-3。

五、以13a為例用核磁氫譜驗(yàn)證化合物自組裝形成納米粒子

取5mg凍干的化合物13a溶于0.8mL重水，分別用氘代DMSO和重水溶解后做核磁氫譜(圖3-1，圖3-2)。

六、透射電鏡(TEM)觀察納米粒子的具體形態(tài)

取2mg各化合物的凍干粉末于5mL蒸餾水中，超聲10分鐘。再將樣品溶液滴于放置在濾紙上的銅網(wǎng)，自然晾干后用透射電鏡觀察納米粒子的形態(tài)。

三個(gè)化合物的TEM圖，其中13a(圖4-1)、13c(圖4-2)、13d(圖4-3)。