本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種β-胡蘿卜素單加氧酶的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

全反式視黃醛，又稱維生素A醛，是維生素A合成的重要前體，在抵抗肌膚衰老方面具有重要生理功能。全反式視黃醛通過生理作用可以轉(zhuǎn)化為活性維生素A，具有雙重抗衰老作用，不僅促進(jìn)細(xì)胞代謝，還能提亮膚色。全反式視黃醛可被氧化為反式視黃酸，在免疫缺陷病及癌癥治療中具有重要作用。此外，全反式視黃醛是傳統(tǒng)的β-胡蘿卜素制備工藝的重要中間體。

全反式視黃醛一般通過視黃醇氧化反應(yīng)獲得，由于視黃醇的分子結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)共軛雙鍵，對(duì)熱、光或氧氣等極不穩(wěn)定，在氧化反應(yīng)過程中容易形成多種氧化產(chǎn)物,同時(shí)氧化劑使用會(huì)產(chǎn)生大量污染物，因此很難適用于工業(yè)化生產(chǎn)（Helv.Chim.Acta 40, 265 (1957)；中國專利200710157075.0；中國專利93118128.3）。通過對(duì)β-紫羅蘭酮和環(huán)檸檬醛側(cè)鏈上進(jìn)行增碳反應(yīng)（Tetrahedron. Lett. 35,7383(1994); Chem. Lett. 1201 (1975)），也可以合成全反式視黃醛，但是由于該方法中β-紫羅蘭酮和環(huán)檸檬醛的價(jià)格昂貴，并且需要多個(gè)反應(yīng)步驟，因此也不適用于工業(yè)生產(chǎn)。

鑒于目，提出一種利用β-胡蘿卜素單加氧酶制備全反式視黃醛方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決前化學(xué)合成方法制備全反式視黃醛的不足的技術(shù)問題，提供了一種β-胡蘿卜素單加氧酶的制備方法及其應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，采用以下技術(shù)方案：

一種β-胡蘿卜素單加氧酶的制備方法，構(gòu)建β-胡蘿卜素單加氧酶基因的原核表達(dá)載體，將原核表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA柱親和層析和分子篩純化后，得到純化的普β-胡蘿卜素單加氧酶。

所述β-胡蘿卜素單加氧酶基因來源于弓形棲熱菌，保藏號(hào)為CGMCC NO.1.6992。

一種β-胡蘿卜素單加氧酶的應(yīng)用，所述β-胡蘿卜素單加氧酶作為催化劑，在反應(yīng)液中催化底物β-胡蘿卜素，反應(yīng)溫度45-55℃，反應(yīng)時(shí)間20-30 h，反式視黃醛的轉(zhuǎn)化率達(dá)89.5%。

所述反應(yīng)液的成分為：50mmol/L NaCl、5 mmol/L FeSO₄·7H₂O、20 mmol/L TCEP、2%（w/v）OTG、1% （w/v）Tween 80、5 mmol/L DTT、50mmol/L pH 8.0的Tricine/KOH緩沖液。

所述催化劑的濃度為4U/mL，底物濃度為1000 mg/L。

本發(fā)明的有益效果在于：

（1）本發(fā)明得到了一種棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的基因序列和氨基酸序列，該酶是在弓形棲熱菌Thermus arciformis中發(fā)現(xiàn)并制備獲得的第一個(gè)β-胡蘿卜素單加氧酶；

（2）本發(fā)明獲得了一種不同于已發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素單加氧酶的新型酶資源，該β-胡蘿卜素單加氧酶具有不同的氨基酸序列和酶學(xué)特性；

（3）本發(fā)明建立了棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶制備全反式視黃醛的方法，并優(yōu)化了反應(yīng)條件，經(jīng)優(yōu)化后全反式視黃醛轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.5%。

附圖說明

圖1為純化后的β-胡蘿卜素單加氧酶SDS-PAGE分析，其中M：蛋白Marker；1、2和3道為純化后棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶；

圖2為β-胡蘿卜素單加氧酶的最適反應(yīng)溫度曲線圖；

圖3為β-胡蘿卜素單加氧酶的最適pH曲線圖；

圖4為β-胡蘿卜素單加氧酶具有轉(zhuǎn)化制備全反式視黃醛HPLC結(jié)果；

圖5為酶濃度對(duì)全反式視黃醛產(chǎn)量的影響；

圖6為底物濃度對(duì)全反式視黃醛產(chǎn)量的影響；

圖7為在最佳反應(yīng)條件下全反式視黃醛產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

1. 一種弓形棲熱菌（Thermus arciformis）β-胡蘿卜素單加氧酶的制備方法，包括菌株、質(zhì)粒、工具酶、培養(yǎng)基，引物設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建，基因的誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白質(zhì)的純化。具體步驟如下：

（1）菌株、質(zhì)粒、酶與培養(yǎng)基：

大腸桿菌Escherichia coli DH5α、限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI、Pyrobest DNA聚合酶、DNA連接酶、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒kit ver.3.0購自TAKARA公司；大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）購自Novagen公司；LB培養(yǎng)基：每升含Tryptone 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g；氨芐青霉素濃度為100 mg/L, 氯霉素濃度為34 mg/L；弓形棲熱菌（Thermus arciformis）保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.1.6992；克隆與表達(dá)質(zhì)粒載體pET22b購自Novagen公司。

（2）弓形棲熱菌T. arciformis菌株培養(yǎng)：

弓形棲熱菌T. arciformis培養(yǎng)基成分(1 L): Tryptone 1 g, Yeast extract 1 g, 安三乙酸0.1 g，CaSO₄ 0.05 g, MgSO₄·7H₂O 0.1 g, NaNO₃ 0.8 g, KNO₃ 0.1 g, K₂HPO₄ 0.2 g,微量元素溶液1 mL。

微量元素溶液成分(1 L):NaCl 8 g, FeCl₃·6H₂O 0.5 g, MnSO₄·H₂O 2.5 g,ZnSO₄·7H₂O 0.5 g, H₃BO₃ 0.5 g, CuSO₄·5H₂O 0.025 g, Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 g, CoCl₂·6H₂O 0.5 g。

以1mol/L NaOH調(diào)pH為7.2,121℃滅菌30min后加入適量無菌的0.5 mol/L Na₂CO₃/NaHCO₃溶液調(diào)pH為9.0。

培養(yǎng)條件：70℃、轉(zhuǎn)速200 r/min震蕩培養(yǎng)24 h至OD_600nm為0.5左右。將菌液轉(zhuǎn)至滅菌的50 mL離心管，4℃下4,000 g離心10 min，棄上清，收集菌體。

（3）PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建：

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取弓形棲熱菌T. arciformis基因組DNA（提取方法見試劑盒說明書）。按照目前已經(jīng)報(bào)道β-胡蘿卜素單加氧酶保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)引物，上游引物如SEQ ID NO：1所示，其中CATATG為NdeI酶切位點(diǎn)；下游引物如SEQ ID NO：2所示。其中GGATCC為BamHI酶切位點(diǎn)。以弓形棲熱菌T. arciformis基因DNA為模板，PCR技術(shù)擴(kuò)增β-胡蘿卜素單加氧酶基因片段,PCR反應(yīng)體系（100μL）如下：模板1 μL（50 ng）, dNTP (25 mmol/L) 2μL，引物（100 μmol/L）各1μL，MgCl₂(25 mmol/L) 2μL，10×緩沖液10μL，Probest^TM DNA 聚合酶 (5U/μL) 1μL，超純水82 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃4 min；95℃30s，56℃30s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)。

將質(zhì)粒pET22b及經(jīng)瓊脂糖凝膠回收β-胡蘿卜素單加氧酶基因片段，使用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI分別進(jìn)行雙酶切，雙酶切液進(jìn)行回收。雙酶切反應(yīng)體系（20 μL）如下：PCR產(chǎn)物/pET22b 16μL（400 ng），NdeI 內(nèi)切酶（15 U/μL）1μL，BamHI內(nèi)切酶（15 U/μL）1μL，10×緩沖液 2 μL。雙酶切反應(yīng)混合液30℃反應(yīng)6h。

進(jìn)一步通過目的基因與載體pET22b的連接，獲得重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切（如圖1所示）及測序驗(yàn)證。經(jīng)測序分析鑒定得到β-胡蘿卜素單加氧酶基因的序列，如SEQ ID NO：3所示；β-胡蘿卜素單加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

（4）基因的誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白質(zhì)的純化：

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中。挑取平板上的單菌落于20 mL含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12-16 h。按2%接種量轉(zhuǎn)接入1 L含氨芐青霉素和氯霉素LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2.5h，使OD₆₀₀nm在0.4-0.6。加入終濃度0.5mmol/L IPTG于30℃繼續(xù)培養(yǎng)8h，4℃4,000 rpm/min離心20 min。收集的菌體懸浮在30 mL破壁buffer（50mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 100mmol/LNaCl）中，超聲波破碎菌體（功率300w，超聲時(shí)間5秒，間隔時(shí)間5秒，超聲次數(shù)150次）。超聲波破碎菌體,12, 000×g離心15min，得到粗酶液。將得到的粗酶液用0.22 μm濾膜過濾，Ni-NTA瓊脂糖親和層析進(jìn)行蛋白純化，步驟如下：分別用3 mL水和5 mLCharge buffer（50 mmol/L NiSO₄）洗 1 ml 瓊脂糖樹脂，然后3 mL Binding buffer（20mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 500 mmol/L NaCl, 5 mmol/L咪唑）平衡柱子。過濾過的蛋白溶液加入柱子中，結(jié)合 Ni-NTA樹脂上。用6 mL Wash buffer （20mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 500 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑）去除非特異結(jié)合的蛋白，然后用6 mLElute buffer（20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 500 mmol/L NaCl, 1 mol/L咪唑）洗脫結(jié)合在樹脂上的蛋白。將過鎳柱后蛋白溶液透析在平衡buffer（50mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 200 mmol/L NaCl）中，然后用AKTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)分子篩柱純化蛋白。分子篩條件為Sephacryl TM S-100 HR column層析柱用50 mmol/L Tris-HCl, 200 mmol/L NaCl 緩沖液(pH 7.5) 平衡，流速為1 ml/min。SDS-PAGE蛋白電泳檢測收集下來的蛋白。

2.棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的酶學(xué)性質(zhì)分析鑒定

檢測棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶酶活性，采用以下反應(yīng)體系：2 mg/mLβ-胡蘿卜素、50mmol/L NaCl、5 mmol/L FeSO₄·7H₂O、20 mmol/L三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（TCEP）、2%（w/v）辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（OTG）、1% （w/v）Tween 80、5 mmol/L DTT、50mmol/LTricine/KOH緩沖液（pH 8.0）和0.5U/mLβ-胡蘿卜素單加氧酶酶液,50℃酶解120 min，加入5%的甲醛終止反應(yīng)。以不含有酶液的上述反應(yīng)體系作為對(duì)照組。酶活力單位定義為：在一定條件下，每分鐘生成1 微摩爾的全反式視黃醛所需要的酶量為一個(gè)活力單位(U)。

高效液相色譜HPLC檢測反應(yīng)產(chǎn)物，所用色譜柱為Alltech PrevailC18柱(美國奧泰公司，25 cm × 4.6 cm)，采用日本島津SPD-M10A二極管陣列檢測器。檢測β-胡蘿卜素，流動(dòng)相為正己烷：甲基叔丁基醚（95:5,v/v），洗脫速度為1.0 mL/min，在波長460 nm檢測；檢測全反式視黃醛，流動(dòng)相為乙腈：水（90:10,v/v），洗脫速度為0.4 mL/min，在波長370 nm檢測。

通過對(duì)棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶進(jìn)行分析鑒定，得到該酶的主要以下酶學(xué)性質(zhì)如下：

（1）得到編碼棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的基因序列，共960堿基，基因序列如SEQ ID NO：1所示。

（2）得到編碼棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的氨基酸序列，共319氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

（3）得到純化的棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶蛋白電泳圖如圖2所示。重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)后，經(jīng)超聲波破壁、50℃ 熱處理、鎳柱親和層析和分子篩Sephacryl TM S-100，得到純化重組β-胡蘿卜素單加氧酶，分子量大小為35KDa，結(jié)果如圖1所示。

（4）棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶最適反應(yīng)溫度和pH分別為50℃和8.0（如圖2和3所示）。

3. 棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素制備全反式視黃醛

HPLC檢測結(jié)果如圖4所示，棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶具有轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素制備全反式視黃醛的活性。在β-胡蘿卜素單加氧酶的酶活性標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，優(yōu)化催化合成全反式視黃醛產(chǎn)量。

酶的濃度：分別在反應(yīng)體系中添加棲熱β-胡蘿卜素單加氧酶0—6 U/mL，檢測全反式視黃醛產(chǎn)量。結(jié)果表明，4U/mL的酶液作用下，全反式視黃醛的產(chǎn)量最高，達(dá)到400mg/mL（如圖5所示）。

底物濃度：分別在反應(yīng)體系中添加不同濃度底物β-胡蘿卜素（0-1000 mg/L），檢測全反式視黃醛產(chǎn)量。結(jié)果表明，在底物β-胡蘿卜素濃度為600 mg/l，β-紫羅蘭酮的相對(duì)產(chǎn)量最高，達(dá)到562.3400 mg/mL（如圖6所示）。

在以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，建立棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素制備全反式視黃醛的最佳反應(yīng)條件，酶濃度4U/mL，β-胡蘿卜素濃度1000mg/L，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)pH 8.0，其它反應(yīng)條件為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系。結(jié)果如圖6所示，反應(yīng)25h后，產(chǎn)生569.3mg/L全反式視黃醛，同時(shí)消耗600mg/Lβ-胡蘿卜素，根據(jù)催化反應(yīng)式，計(jì)算生成全反式視黃醛的轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.5％。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶可以高效催化合成全反式視黃醛，具有較好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

4、棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的應(yīng)用

全反式視黃醛，不僅可以作為維生素A合成的重要前體，在抵抗肌膚衰老、免疫缺陷病及癌癥治療中也具有重要作用。本發(fā)明在弓形棲熱菌T. arciformis中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能夠高效催化裂解β-胡蘿卜素的β-胡蘿卜素單加氧酶。采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建了棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的原核表達(dá)載體，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)Ni-NTA柱親和層析和分子篩純化后，得到純化的普β-胡蘿卜素單加氧酶。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，分子質(zhì)量是35KD。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶的最適溫度50℃，最適pH8.0。經(jīng)優(yōu)化最佳反應(yīng)條件：底物β-胡蘿卜素濃度1000 mg/L，棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶4.0U/mL，反應(yīng)溫度50℃，水解反應(yīng)25 h，50mmol/L NaCl、5 mmol/L FeSO₄·7H₂O、20 mmol/L三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（TCEP）、2%（w/v）辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（OTG）、1% （w/v）Tween 80、5 mmol/L DTT、50mmol/LTricine/KOH緩沖液（pH 8.0）。在此條件下，生成569.3mg/L全反式視黃醛，轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.5%。到目前為止，還未見采用生物酶法制備全反式視黃醛。綜上所述，棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶具有良好的催化活性，可以高效催化降解β-胡蘿卜素，制備高純度的全反式視黃醛，適用于全反式視黃醛生物酶法制備，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。