本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高流速多糖微球的制備方法。

背景技術(shù)：

瓊脂糖是一種天然多糖，系海洋植物石花菜或江蘺等紅藻提取的瓊脂經(jīng)精制加工而成，是由1,3-連接的β-D-吡喃半乳糖和1,4-連接的3,6-脫水-α-L-吡喃半乳糖殘基交替連接而成的直鏈線性多糖。瓊脂糖在溫度較高時(shí)可以溶于水，形成瓊脂糖水溶液，在冷卻過(guò)程中則形成凝膠，其中含有大量能允許大分子擴(kuò)散的孔道。瓊脂糖可用于制備凝膠微球，具有羥基密度大、親水性好、可取代基團(tuán)多、易于活化、優(yōu)良的孔結(jié)構(gòu)、非特異性吸附低以及穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，常用于層析、酶固定化和細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域。以層析介質(zhì)為例，迄今為止，瓊脂糖凝膠過(guò)濾介質(zhì)及在此基礎(chǔ)上得到的各種功能性層析介質(zhì)已廣泛應(yīng)用于生物制藥、食品工業(yè)及化工等領(lǐng)域，可分離蛋白、核酸、肽類及糖等多種物質(zhì)。但是，傳統(tǒng)瓊脂糖層析介質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度低、不耐壓，實(shí)際應(yīng)用中受到流速限制，影響分離效率。制備耐壓性能好、流速快的瓊脂糖微球，在其基礎(chǔ)上制備其他功能性層析介質(zhì)，以能夠滿足快速分離生物大分子的要求。

目前，瓊脂糖微球的制備方法包括制球和交聯(lián)兩步。首先是制備瓊脂糖微球，通常采用攪拌法(Hjertén S.The preparation of agarose spheres for chromatography of molecules and particles.Biochim.Biophys.Acta,1964,79:393-398)、噴射法(Bengtsson S,Philipson L.Chromatography of animal viruses on pearl-condensed agar.Biochim.Biophys.Acta,1964,79:399-406)和膜乳化法(CN 1304101C)完成。其次是對(duì)瓊脂糖微球進(jìn)行交聯(lián)，傳統(tǒng)的交聯(lián)方法采用雙功能團(tuán)交聯(lián)劑或多功能團(tuán)交聯(lián)劑，如環(huán)氧氯丙烷(US Patent 3,507,851)、草酰氯(US Patent 3,860,573)和季戊四醇三縮水甘油醚(US Patent 4,665,164)等，雖然在一定程度上提高了微球的機(jī)械強(qiáng)度，但是，由于交聯(lián)過(guò)程中交聯(lián)劑容易發(fā)生水解及自交聯(lián)等副反應(yīng)，導(dǎo)致交聯(lián)效率大大降低且交聯(lián)程度不可控，制得的瓊脂糖微球耐壓性能差。圖1(a)是這種瓊脂糖微球的結(jié)構(gòu)示意圖，其交聯(lián)位點(diǎn)分布松散且隨機(jī)性大，從而影響微球機(jī)械強(qiáng)度。

為了進(jìn)一步提高瓊脂糖微球的交聯(lián)強(qiáng)度，Lindgren等以溴丙烯作為交聯(lián)劑，交聯(lián)瓊脂糖微球(US Patent 4,973,683)。與上述雙功能團(tuán)或多功能團(tuán)交聯(lián)劑相比，溴丙烯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是一端為活性、另一端為惰性，一開始活性端基與瓊脂糖反應(yīng)，接下來(lái)通過(guò)控制反應(yīng)條件，使另一惰性端基與瓊脂糖反應(yīng)。該反應(yīng)的特點(diǎn)是交聯(lián)程度可控，交聯(lián)效率高。Hans Berg等在制球過(guò)程中引入交聯(lián)劑，即在瓊脂糖溶液中加入溴丙烯，制得瓊脂糖微球上連有雙鍵，再通過(guò)一系列反應(yīng)打開雙鍵，從而得到交聯(lián)瓊脂糖微球(US Patent 6,602,990)。圖1(b)是以溴丙烯為交聯(lián)劑制備的交聯(lián)瓊脂糖微球內(nèi)部凝膠結(jié)構(gòu)示意圖，與傳統(tǒng)的雙功能團(tuán)或多功能團(tuán)交聯(lián)劑相比，溴丙烯交聯(lián)微球內(nèi)部交聯(lián)位點(diǎn)數(shù)目更多且分布更均勻，微球的強(qiáng)度大大提高。趙希等在該方法基礎(chǔ)上，將一部分多糖經(jīng)交聯(lián)劑改性，得到修飾多糖，并與未修飾多糖混合后作為水相，成球后再經(jīng)后期活化交聯(lián)，得到高流速多糖微球(CN 201210413412.9)。

以溴丙烯作為交聯(lián)劑，盡管對(duì)改善瓊脂糖微球的交聯(lián)程度以及提高微球流速起到一定效果，但是，由于天然瓊脂糖具有較大的剛性，分子鏈較長(zhǎng)，分子尺寸較大，溶液粘度大(幾百—幾千CP，甚至更高)，溴丙烯與其反應(yīng)時(shí)存在一定空間位阻效應(yīng)，易造成交聯(lián)不均勻，在很大程度上影響了瓊脂糖微球的最終交聯(lián)效率。

有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種高流速多糖微球及其制備方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種高流速多糖微球及其制備方法。以該方法制備的多糖微球具有機(jī)械強(qiáng)度高、交聯(lián)程度可控的特點(diǎn)。

本發(fā)明的多糖微球的制備方法，包括降解多糖溶液得到多糖降解溶液的步驟。所得多糖降解溶液的粘度為10-1000cP。

進(jìn)一步的，還包括將所述多糖溶液和多糖降解溶液改性的步驟。

進(jìn)一步的，多糖微球的制備方法包括以下步驟：

(1)在60-100℃和堿性條件下，將所述多糖降解溶液與多糖溶液分別與改性劑反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為0.5-8h，得到改性多糖降解溶液和改性多糖溶液，將改性后的兩溶液混合，得到多糖混合溶液；所述多糖降解溶液與多糖溶液中[OH^-]濃度為0.01-5mol/L，優(yōu)選為0.1-2mol/L，且反應(yīng)結(jié)束后用濃冰醋酸溶液調(diào)節(jié)體系pH至中性。

(2)將所述多糖混合溶液在60-100℃和堿性條件下與改性劑反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為0.5-8h，得到改性多糖混合溶液，作為水相；

(3)將所述改性多糖混合溶液加入含乳化劑的油相中乳化、固化，得到改性多糖微球；其中油相可以是液體石蠟、甲苯/CCl4、環(huán)己烷體系等；乳化劑是油溶性乳化劑，如Span系列、PO500等，優(yōu)選為Span85與Span60復(fù)配而成，二者復(fù)配比例為19:1-5:1，優(yōu)選為19:1-9:1，乳化劑含量為油相的0.5-5％(w/v)；成球過(guò)程包括攪拌法、噴射法和膜乳化法。

(4)將改性多糖微球經(jīng)洗滌并與溴水反應(yīng)得到溴化多糖微球，在堿性條件下，所述溴化多糖微球和交聯(lián)劑在有機(jī)溶劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，得到多糖微球。所述有機(jī)溶劑為二甲亞砜和丙酮中一種或組合，其用量為多糖微球的1-30％(v/w)，且有機(jī)溶劑中[OH^-]濃度為0.01-3mol/L，優(yōu)選為0.05-2mol/L；交聯(lián)劑為環(huán)氧氯丙烷或1,4-丁二醇雙縮水甘油醚；根據(jù)需要，交聯(lián)反應(yīng)可以反復(fù)多次進(jìn)行，交聯(lián)過(guò)程中還可補(bǔ)加交聯(lián)劑。

進(jìn)一步的，所述多糖溶液中的多糖為瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖、魔芋多糖和纖維素中的一種。

進(jìn)一步的，所述多糖溶液和多糖降解溶液中多糖的質(zhì)量濃度均為1-15％。

進(jìn)一步的，所述改性劑為一端雙鍵、另一端可以與多糖分子上的羥基反應(yīng)的雙鍵試劑，優(yōu)選雙鍵試劑為溴丙烯或烯丙基縮水甘油醚中的一種或組合。

進(jìn)一步的，所述改性劑在被改性溶液中的體積百分比為0.1-30％，優(yōu)選為1-10％。

進(jìn)一步的，步驟(1)中，多糖降解溶液在多糖溶液中的體積百分比為10-90％，優(yōu)選為20-40％。

進(jìn)一步的，采用化學(xué)降解法(如酸降解法)、生物降解法(如酶降解法)或物理降解法(如超聲降解法)對(duì)所述多糖溶液進(jìn)行降解。

本發(fā)明的另一方面還提供一種多糖微球，該多糖微球具有更高的機(jī)械強(qiáng)度和耐壓性能，操作過(guò)程中可以實(shí)現(xiàn)高流速，在層析等領(lǐng)域具有更加廣泛的應(yīng)用前景。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明通過(guò)對(duì)多糖溶液進(jìn)行降解和改性，將短鏈改性多糖降解溶液和改性多糖溶液混合，再與改性劑反應(yīng)，得到改性多糖混合溶液(水相)，多次改性保證能夠得到更多的惰性官能團(tuán)，改性多糖混合溶液經(jīng)乳化、固化過(guò)程成球后，再經(jīng)堿化交聯(lián)反應(yīng)，最終制得高流速多糖微球。

與現(xiàn)有的多糖微球相比，本發(fā)明制備的高流速多糖微球具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：首先，由于多糖的分子鏈較長(zhǎng)，空間位阻作用導(dǎo)致傳統(tǒng)交聯(lián)方法的交聯(lián)效果有限，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為松散，僅靠增加交聯(lián)劑用量無(wú)法有效解決這一問(wèn)題，反而會(huì)造成局部交聯(lián)過(guò)度，而本發(fā)明首先對(duì)多糖溶液進(jìn)行降解，得到一定粘度范圍的短鏈多糖降解溶液，再對(duì)其進(jìn)行改性，以這種改性短鏈多糖降解溶液與改性多糖溶液分別作為短、長(zhǎng)鏈兩種單體，在一定條件下發(fā)生共聚，形成類似“block polymer”的結(jié)構(gòu)，如圖1(c)，與傳統(tǒng)交聯(lián)方法相比，長(zhǎng)、短鏈單體形成的交聯(lián)結(jié)構(gòu)具有更多的交聯(lián)連接點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為緊密，多糖微球的耐壓性能更高；本發(fā)明中的短鏈多糖降解溶液來(lái)源于對(duì)多糖溶液的降解，較結(jié)構(gòu)單一且不可控的市售多糖而言，本發(fā)明得到的短鏈多糖降解溶液具有一定粘度范圍，且通過(guò)調(diào)節(jié)降解工藝條件可以實(shí)現(xiàn)多糖粘度可控，從而形成更有效的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；其次，傳統(tǒng)交聯(lián)方法的堿化反應(yīng)在水相中進(jìn)行，副反應(yīng)較多，交聯(lián)效率低，需要進(jìn)一步進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)以提高微球的強(qiáng)度，操作步驟繁瑣。為解決該問(wèn)題，本發(fā)明在有機(jī)相中進(jìn)行堿化反應(yīng)，同時(shí)加入雙功能團(tuán)交聯(lián)劑，不僅有效避免了副反應(yīng)的發(fā)生，大大提高了反應(yīng)效率，而且減少了反應(yīng)步驟，縮短了反應(yīng)時(shí)間。與現(xiàn)有的多糖微球相比，本發(fā)明制備的多糖微球具有更高的機(jī)械強(qiáng)度和耐壓性能，操作過(guò)程中可以實(shí)現(xiàn)高流速，在層析等領(lǐng)域具有更加廣泛的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的方法步驟中：(1)降解多糖溶液，采用化學(xué)降解法、物理降解法或生物降解法對(duì)多糖溶液進(jìn)行降解，得到粘度范圍為10-1000cP的短鏈多糖降解溶液，短鏈多糖降解溶液的分子尺寸及其分布極大地影響多糖微球的最終交聯(lián)程度；(2)多糖溶液的改性過(guò)程，采用含烯丙基改性劑分別對(duì)短鏈多糖降解溶液和多糖溶液進(jìn)行改性，得到共聚反應(yīng)的兩種單體；多糖溶液的改性程度是影響多糖微球交聯(lián)程度的重要因素之一；(3)改性短鏈多糖降解溶液和改性多糖溶液以一定比例混合，并進(jìn)一步改性后，以其作為水相，與含有乳化劑的油相發(fā)生乳化反應(yīng)，再固化成球，兩種單體的混合比例極大地影響多糖微球的機(jī)械強(qiáng)度；(4)堿化過(guò)程在有機(jī)相中進(jìn)行，反應(yīng)同時(shí)加入雙功能團(tuán)交聯(lián)劑，有機(jī)溶劑可以是二甲亞砜或丙酮等，從而有效減少副反應(yīng)的發(fā)生，交聯(lián)劑是環(huán)氧氯丙烷或1,4-丁二醇雙縮水甘油醚等，能夠大大提高交聯(lián)效率，根據(jù)需要，交聯(lián)反應(yīng)可以反復(fù)多次進(jìn)行，交聯(lián)過(guò)程中還可補(bǔ)加交聯(lián)劑。

上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。

附圖說(shuō)明

圖1為現(xiàn)有技術(shù)的交聯(lián)方法和本發(fā)明的交聯(lián)方法制備的瓊脂糖微球結(jié)構(gòu)示意圖，其中(a)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)，(b)溴丙烯交聯(lián)，(c)改性長(zhǎng)短鏈單體共聚交聯(lián)；

圖2為本發(fā)明中實(shí)施例1制備的質(zhì)量濃度為6％的高流速瓊脂糖微球的光學(xué)顯微鏡照片(2-1)和粒徑分布圖(2-2)；

圖3為本發(fā)明中實(shí)施例1至7和對(duì)比例1至2與商品介質(zhì)Sepharose 6FF的壓力-流速曲線比較圖；

圖4為本發(fā)明中三種熒光標(biāo)記蛋白分別在由實(shí)施例1制備的6％高流速瓊脂糖微球(a)和商品介質(zhì)Sepharose 6FF(b)中分布情況的激光共聚焦顯微鏡照片，圖中(a)和(b)從左至右依次為核糖核酸酶、牛血清白蛋白和甲狀腺球蛋白；

圖5為本發(fā)明中實(shí)施例1制備的6％瓊脂糖微球的凝膠過(guò)濾色譜圖；

圖6為本發(fā)明中實(shí)施例1、實(shí)施例5、對(duì)比例1及對(duì)比例2的凝膠過(guò)濾色譜實(shí)驗(yàn)各組分K_av值。

圖7為本發(fā)明中實(shí)施例2制備的微球的光學(xué)顯微鏡照片(7-1)和粒徑圖(7-2)；

圖8為本發(fā)明中實(shí)施例3制備的微球的光學(xué)顯微鏡照片(8-1)和粒徑圖(8-2)；

圖9為本發(fā)明中實(shí)施例4制備的微球的光學(xué)顯微鏡照片(9-1)和粒徑圖(9-2)；

圖10為本發(fā)明中實(shí)施例6制備的微球的光學(xué)顯微鏡照片(10-1)和粒徑圖(10-2)；

圖11為本發(fā)明中實(shí)施例7制備的微球的光學(xué)顯微鏡照片(11-1)和粒徑圖(11-2)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：制備質(zhì)量濃度為6％的高流速瓊脂糖微球

(1)瓊脂糖降解溶液的制備

采用酸降解法降解瓊脂糖溶液，在100℃下加熱90mL瓊脂糖溶液(含瓊脂糖6.7g)20min，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)體系pH 3.0，繼續(xù)保持5min，得到短鏈瓊脂糖降解溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)體系至中性。

將瓊脂糖降解溶液加熱至100℃待其溶解后，采用Brookfiled DV-II+Pro粘度計(jì)測(cè)定溶液粘度，測(cè)得短鏈瓊脂糖降解溶液的粘度值為800cP。

(2)改性瓊脂糖降解溶液和改性瓊脂糖溶液的制備

向步驟(1)中的瓊脂糖降解溶液體系加入5mL溴丙烯、5mL20％NaOH溶液，于90℃反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用冰醋酸調(diào)節(jié)體系pH至中性，得到改性瓊脂糖降解溶液(單體A)。

在100℃下加熱90mL瓊脂糖溶液(含瓊脂糖6.7g)30min，加入5mL溴丙烯、5mL 20％NaOH溶液，于90℃反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用冰醋酸調(diào)節(jié)體系pH至中性，得到改性瓊脂糖溶液(單體B)。

(3)改性瓊脂糖混合溶液(水相溶液)的制備

在90℃下將30mL單體A與60mL和單體B混合，加入5mL溴丙烯、5mL 20％NaOH溶液，反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用冰醋酸調(diào)節(jié)體系pH至中性，得到質(zhì)量濃度為6％的改性瓊脂糖混合溶液(水相溶液)。

(4)改性瓊脂糖微球的制備

在60℃下加熱600mL液體石蠟(含1g Span60，9g Span85)30min，得到油相。將100mL上述步驟(3)得到的改性瓊脂糖混合溶液加入油相，于600rpm攪拌30min，冷水浴降溫固化，得到改性瓊脂糖微球。

(5)溴化瓊脂糖微球的制備

按照溴化鉀-溴酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定法測(cè)定改性瓊脂糖微球的烯丙基密度，其中改性瓊脂糖微球的烯丙基密度為200μmol/g抽干濕膠，改性瓊脂糖微球經(jīng)反復(fù)洗滌抽干后，加入過(guò)量飽和溴水，(室溫)20-35℃下反應(yīng)2h，加入甲酸鈉后體系由黃色變無(wú)色，充分洗滌改性瓊脂糖微球，得到溴化瓊脂糖微球。

(6)交聯(lián)過(guò)程

稱取步驟(5)中50g溴化瓊脂糖微球，加入200mL二甲亞砜、10mL環(huán)氧氯丙烷、4mL 40％NaOH溶液，于20-35℃下反應(yīng)4h后，升溫至40℃，繼續(xù)反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后充分洗滌微球，得到高流速瓊脂糖微球。

采用XSZ-H₃型光學(xué)顯微鏡觀察高流速瓊脂糖微球的形貌，所得的高流速瓊脂糖微球形貌規(guī)整；采用Mastersizer 2000E激光粒度分析儀分析瓊脂糖微球的粒徑，光學(xué)顯微鏡照片和粒徑分布圖如圖2中(2-1)和(2-2)所示。

高流速瓊脂糖微球裝柱待床層穩(wěn)定后，層析柱連入PPS 100蛋白層析系統(tǒng)。設(shè)定流速，待壓力穩(wěn)定后記錄此時(shí)壓力值。逐漸增加柱子流速，測(cè)定柱子在不同流速下的壓力值。隨著流速的不斷增大，柱子壓力值相應(yīng)增加。以壓力為橫坐標(biāo)，流速為縱坐標(biāo)，得到微球的壓力-流速曲線。該曲線在一定范圍內(nèi)呈線性，該范圍內(nèi)微球未發(fā)生變形，其最高點(diǎn)對(duì)應(yīng)的流速即為微球的最大線性流速，其值越大，說(shuō)明微球的流通性能越好。測(cè)得高流速瓊脂糖微球的最大線性流速為2751cm/h，如圖3所示，高于傳統(tǒng)環(huán)氧交聯(lián)法和溴丙烯交聯(lián)法制備的微球。

配制1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(核糖核酸酶、牛血清白蛋白和甲狀腺球蛋白)，向其中加入少量熒光染料FITC，4℃、pH 8下振蕩過(guò)夜。次日，離心數(shù)次，洗去未被結(jié)合的熒光染料，得到經(jīng)熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。向其中加入30mg微球，4℃下振蕩過(guò)夜，次日離心洗球。采用激光共聚焦觀察熒光標(biāo)記蛋白在微球孔道中的分布情況。激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用該法制備的高流速瓊脂糖微球?qū)σ幌盗胁煌肿恿繕?biāo)準(zhǔn)蛋白均有很好的滲透性能，蛋白都能進(jìn)入微球孔道，且均勻分布在微球內(nèi)部，如圖4所示。

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(核糖核酸酶(RNA)，M_w 13.7kDa；牛血清白蛋白(BSA)，M_w66.12kDa；甲狀腺球蛋白(Thyrobolulin)，M_w 660kDa)，濃度為2mg/mL。介質(zhì)裝柱采用50mM PB-0.15M NaCl(pH7.0)緩沖液平衡柱子。蛋白依次上柱，繼續(xù)采用50mM PB-0.15M NaCl(pH7.0)緩沖液洗脫蛋白，記錄蛋白保留體積。分別采用Blue Dextran 2000(M_w 2,000kDa)和丙酮測(cè)定柱子的外水相體積和總流動(dòng)相體積。計(jì)算各組分的保留系數(shù)(K_av)。凝膠過(guò)濾色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微球具有良好的凝膠過(guò)濾色譜性能，蛋白按照分子量由大到小的順序先后洗脫，如圖5所示，各組分K_av值如圖6中的表格所示。

實(shí)施例2：制備質(zhì)量濃度為6％的高流速瓊脂糖微球

與實(shí)施例1中的步驟相同，區(qū)別在于：采用酶降解法降解瓊脂糖溶液，在100℃下加熱90mL瓊脂糖溶液(含瓊脂糖6.7g)20min，降溫至42℃，加入100mg瓊脂糖酶，繼續(xù)保持2h，得到短鏈瓊脂糖降解溶液，測(cè)定其粘度值為700cP；依次得到改性瓊脂糖微球和溴化瓊脂糖微球，其中改性瓊脂糖微球的烯丙基密度為180μmol/g抽干濕膠，最終制備得到的高流速瓊脂糖微球最大線性流速為2610cm/h，如圖3所示，光學(xué)顯微鏡照片和粒徑分布圖如圖7中(7-1)和(7-2)所示。

實(shí)施例3：制備質(zhì)量濃度為6％的高流速瓊脂糖微球

與實(shí)施例1中的步驟相同，區(qū)別在于：采用超聲降解法法降解瓊脂糖溶液，在100℃下加熱90mL瓊脂糖水溶液(含瓊脂糖6.7g)20min，降溫至50℃，超聲繼續(xù)保持2h(超聲條件：35kHZ，300W/cm²)得到短鏈瓊脂糖降解溶液，測(cè)定其粘度值為450cP；以烯丙基縮水甘油醚代替溴丙烯作為改性劑，依次得到改性瓊脂糖微球和溴化瓊脂糖微球，其中改性瓊脂糖微球的烯丙基密度為890μmol/g抽干濕膠，光學(xué)顯微鏡照片和粒徑分布圖如圖8中(8-1)和(8-2)所示；最終制備得到的高流速瓊脂糖微球最大線性流速為2680cm/h，如圖3所示。

實(shí)施例4：制備質(zhì)量濃度為4％的高流速瓊脂糖微球

與實(shí)施例1中的步驟相比，增加了補(bǔ)交交聯(lián)劑的步驟，其區(qū)別在于：在100℃下加熱90mL瓊脂糖水溶液(含瓊脂糖4.5g)20min，測(cè)得短鏈瓊脂糖降解溶液粘度值為200cP；100℃下加熱90mL瓊脂糖水溶液(含瓊脂糖4.5g)30min；依次得到改性瓊脂糖微球和溴化瓊脂糖微球，其中改性瓊脂糖微球的烯丙基密度為140μmol/g抽干濕膠，光學(xué)顯微鏡照片和粒徑分布圖如圖9中(9-1)和(9-2)所示；交聯(lián)反應(yīng)中，為進(jìn)一步提高交聯(lián)效果，采取交聯(lián)過(guò)程補(bǔ)加交聯(lián)劑的方法，稱取50g溴化瓊脂糖微球，加入200mL二甲亞砜，10mL環(huán)氧氯丙烷，4mL 40％NaOH溶液，于室溫下反應(yīng)4h后，升溫至40℃，補(bǔ)加10mL環(huán)氧氯丙烷，繼續(xù)反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后充分洗滌微球，得到高流速瓊脂糖微球。最終制備得到的高流速瓊脂糖微球最大線性流速為1560cm/h，如圖3所示。

實(shí)施例5：制備質(zhì)量濃度為6％的高流速瓊脂糖微球

與實(shí)施例1中的步驟相同，區(qū)別在于：采取多次交聯(lián)的方法，即稱取50g實(shí)施例1中制備得到的6％交聯(lián)瓊脂糖微球，加入200mL二甲亞砜，10mL環(huán)氧氯丙烷，4mL 40％NaOH溶液，于室溫下反應(yīng)4h后，升溫至40℃，繼續(xù)反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后充分洗滌瓊脂糖微球，得到高流速瓊脂糖微球，其最大線性流速為3013cm/h，高于傳統(tǒng)環(huán)氧交聯(lián)法和溴丙烯交聯(lián)法制備的微球，如圖3所示；凝膠過(guò)濾色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微球具有良好的凝膠過(guò)濾色譜性能，各組分K_av如圖6中的表格所示。

實(shí)施例6：制備質(zhì)量濃度為6％的高流速瓊脂微球

與實(shí)施例1中的步驟相同，區(qū)別在于：在100℃下加熱90mL瓊脂溶液(含瓊脂6.7g)20min，測(cè)得短鏈瓊脂溶液的粘度值為500cP；在100℃下加熱90mL瓊脂水溶液(含瓊脂6.7g)30min；依次得到改性瓊脂微球和溴化瓊脂微球，其中改性瓊脂微球的烯丙基密度為110μmol/g抽干濕膠，光學(xué)顯微鏡照片和粒徑分布圖如圖10中(10-1)和(10-2)所示；最終制備得到的高流速瓊脂微球最大線性流速為2180cm/h，如圖3所示。

實(shí)施例7：制備質(zhì)量濃度為12％的高流速葡聚糖微球

與實(shí)施例1中的步驟相同，區(qū)別在于：采用超聲降解法降解葡聚糖溶液，在10℃下超聲90mL葡聚糖溶液(含葡聚糖6.7g)30min(超聲條件：35kHZ，500W/cm²)，得到短鏈葡聚糖降解溶液，用濃NaOH溶液調(diào)節(jié)體系至中性。測(cè)定短鏈葡聚糖降解溶液的粘度值為100cP；依次得到改性葡聚糖微球和溴化葡聚糖微球，其中改性葡聚糖微球的烯丙基密度為520μmol/g抽干濕膠光學(xué)顯微鏡照片和粒徑分布圖如圖11中(11-1)和(11-2)所示；最終制備得到的高流速葡聚糖微球最大線性流速為2570cm/h，如圖3所示。

對(duì)比例1：制備質(zhì)量濃度為6％的瓊脂糖微球

采用環(huán)氧試劑交聯(lián)法制備，配制質(zhì)量濃度為6％瓊脂糖溶液，按照實(shí)施例1中步驟(4)、(5)和(6)的方法制備6％瓊脂糖微球。其最大線性流速為992cm/h，低于改性降解多糖參與制備的瓊脂糖微球，如圖3所示。

對(duì)比例2：制備質(zhì)量濃度為6％的瓊脂糖微球

采用溴丙烯交聯(lián)法。在100℃下加熱90mL瓊脂糖水溶液(含瓊脂糖6g)30min，加入5mL溴丙烯、5mL 20％NaOH溶液，于90℃反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用冰醋酸調(diào)節(jié)體系pH至中性，得到6％改性瓊脂糖溶液。按照實(shí)施例1步驟步驟(4)、(5)的方法依次制備改性瓊脂糖微球和溴化瓊脂糖微球，其中改性瓊脂糖微球的烯丙基密度為105μmol/g抽干濕膠。按照實(shí)施例1步驟(6)的方法對(duì)瓊脂糖微球進(jìn)行交聯(lián)，得到的瓊脂糖微球最大線性流速為1152cm/h，低于改性降解多糖參與制備的瓊脂糖微球，如圖3所示。

本發(fā)明中多糖溶液(如瓊脂糖溶液、瓊脂溶液、葡聚糖溶液等)、多糖降解溶液(如瓊脂糖降解溶液、瓊脂降解溶液、葡聚糖降解溶液等)指多糖水溶液(如瓊脂糖水溶液、瓊脂水溶液、葡聚糖水溶液等)、多糖降解水溶液(如瓊脂糖降解水溶液、瓊脂降解水溶液、葡聚糖降解水溶液等)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。