本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種發(fā)酵液中提取純化他克莫司的方法。

背景技術(shù)：

他克莫司(Tacrolimus)又名普樂可復(fù)，為白色或類白色結(jié)晶體，化學(xué)式為C44H69NO12·H2O，分子量為822.05，易溶解于乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯和氯仿，幾乎不溶于水。他克莫司是由日本藤澤制藥公司率先提取得到的一種真菌代謝產(chǎn)物，屬于免疫抑制性大環(huán)內(nèi)酯類藥物。

現(xiàn)代工業(yè)主要采用筑波鏈霉菌(Streptomyces tsukubaensis)、鏈霉菌等進行微生物發(fā)酵，進而進行提取純化獲得他克莫司。由于他克莫司的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，發(fā)酵液中還含有他克莫司類似物，如子囊霉素和二氫他克莫司，因此，難以通過常規(guī)的純化技術(shù)純化得到高純度的他克莫司，通常需要通過硅膠柱層析進行純化。

中國專利申請CN101712686公開了一種發(fā)酵液中他克莫司的分離純化方法，包括過濾收集菌體、有機溶劑浸提菌體、大孔樹脂吸附、萃取濃縮、硅膠柱層析等步驟，使用含乙酸乙酯的正己烷溶液、含乙酸乙酯的環(huán)己烷溶液、含丙酮的正己烷溶液、含丙酮的環(huán)己烷溶液、含乙醇的正己烷溶液或含乙醇的環(huán)己烷溶液作為硅膠柱層析的洗脫液，雖然得到的他克莫司純度高達95.8％，但仍無法達到原料藥的要求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，發(fā)明人通過大量試驗對大孔樹脂柱和硅膠柱的操作條件進行摸索，預(yù)料不到地發(fā)現(xiàn)：通過添加一定量的醋酸，以正己烷、乙酸乙酯和醋酸組成的洗脫組合物進行洗脫，可以實現(xiàn)他克莫司與他克莫司類似物的高效分離，提高了他克莫司的純度?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，從而完成本發(fā)明。

發(fā)明人通過色譜檢測發(fā)現(xiàn)，目標產(chǎn)物他克莫司是一水化合物，易在含水溶媒中形成互變異構(gòu)體。由于大孔樹脂的流動相往往需要使用水作為溶劑，對此，發(fā)明人對大孔樹脂柱的柱溫進行考察，令發(fā)明人驚奇的是：通過降低大孔樹脂柱的柱溫至16～19℃，可以避免他克莫司的互變異構(gòu)體形成，解吸液中檢測不到他克莫司的互變異構(gòu)體，減少了他克莫司的損失，提高了他克莫司的收率和純度。

本發(fā)明提供一種發(fā)酵液中提取純化他克莫司的方法，包括如下步驟：

S1發(fā)酵液的固液分離：向發(fā)酵液中，加入過濾助劑，攪拌，過濾，收集濾渣；

S2丙酮浸提：向所述濾渣中以3～8mL/g濾渣的比例加入丙酮，超聲提取2～3次，過濾并合并濾液，得到浸提液；

S3浸提液濃縮及大孔樹脂處理：將所述浸提液減壓濃縮得到第一濃縮液，經(jīng)大孔樹脂柱床吸附，大孔樹脂柱床與第一濃縮液的體積比為1：4～8，使用4～8倍大孔樹脂柱床體積的體積濃度30～45％的丙酮溶液進行沖洗，柱床溫度為16～19℃，然后使用0.5～2倍大孔樹脂柱床體積的體積濃度65～80％的丙酮溶液進行解吸，收集解吸液；

S4解吸液處理：將所述解吸液減壓濃縮得到第二濃縮液，加入第二濃縮液2～4倍體積的乙酸乙酯萃取2～3次，減壓濃縮得到油狀物，加入油狀物1～3倍體積的正己烷溶解，得到待層析液；

S5硅膠柱層析：將所述待層析液上硅膠柱層析，柱溫18～22℃，使用正己烷、乙酸乙酯和醋酸組成的洗脫組合物進行洗脫，收集層析液；

S6層析液處理：將所述層析液減壓濃縮得到第三濃縮液，加入第三濃縮液2～4倍體積的乙酸乙酯萃取2～3次，加入乙酸乙酯體積4～5％的正己烷，冷卻至1～10℃析晶，收集晶體，真空干燥，得到他克莫司。

優(yōu)選地，所述洗脫包括：正己烷、乙酸乙酯和醋酸以3～5：2～3：0.1～0.4的體積比組成的組合物4～6倍柱體積，正己烷、乙酸乙酯和醋酸以1～2：3～5：0.1～0.4的體積比組成的組合物8～15倍柱體積。

更優(yōu)選地，所述洗脫包括：正己烷、乙酸乙酯和醋酸以4：2：0.2的體積比組成的組合物5倍柱體積，正己烷、乙酸乙酯和醋酸以2：4：0.2的體積比組成的組合物12倍柱體積。

優(yōu)選地，所述超聲的頻率為35～40kHz，時間為20～30min。

優(yōu)選地，所述大孔樹脂為非極性大孔樹脂。具體的如非極性大孔樹脂D4020、非極性大孔樹脂LX1180等。

優(yōu)選地，所述過濾助劑包括：0.5～2％(w/v)的硫酸鋅、0.5～2％(w/v)的無水氯化鈣和1～5％(w/v)的硅藻土，以發(fā)酵液體積計。

優(yōu)選地，所述減壓濃縮的溫度為35～55℃。

優(yōu)選地，所述析晶的溫度為3～6℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種發(fā)酵液中提取純化他克莫司的方法，通過降低大孔樹脂柱的柱溫至16～19℃，可以避免他克莫司的互變異構(gòu)體形成，解吸液中檢測不到他克莫司的互變異構(gòu)體，減少了他克莫司的損失，提高了他克莫司的收率和純度；通過添加一定量的醋酸，以正己烷、乙酸乙酯和醋酸組成的洗脫組合物進行洗脫，可以實現(xiàn)他克莫司與他克莫司類似物的高效分離，提高了他克莫司的純度，最終得到的他克莫司的含量高達98.5％以上，子囊霉素和二氫他克莫司的含量均低于0.2％，可以滿足原料藥的要求。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。

本發(fā)明實施例中，所使用的材料和試劑均為常規(guī)市售產(chǎn)品，或可通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法獲得。

實施例一 濾渣的獲得及浸提

向筑波鏈霉菌的發(fā)酵液中，加入發(fā)酵液體積1％(w/v)的硫酸鋅、1％(w/v)的無水氯化鈣和2％(w/v)的硅藻土，攪拌，過濾，收集濾渣；向所述濾渣中以6mL/g濾渣的比例加入丙酮，超聲提取2次，超聲的頻率為35kHz，時間為25min，過濾并合并濾液，得到浸提液。

實施例二 大孔樹脂處理

將按實施例一方法得到的浸提液減壓濃縮得到第一濃縮液，經(jīng)大孔樹脂LX1180柱床吸附，大孔樹脂柱床與第一濃縮液的體積比為1：6，使用6倍大孔樹脂柱床體積的體積濃度35％的丙酮溶液進行沖洗，柱床溫度為18℃，然后使用1.5倍大孔樹脂柱床體積的體積濃度70％的丙酮溶液進行解吸，收集解吸液。

對比例一 大孔樹脂處理

將按實施例一方法得到的浸提液減壓濃縮得到第一濃縮液，經(jīng)大孔樹脂LX1180柱床吸附，大孔樹脂柱床與第一濃縮液的體積比為1：6，使用6倍大孔樹脂柱床體積的體積濃度35％的丙酮溶液進行沖洗，柱床溫度為25℃，然后使用1.5倍大孔樹脂柱床體積的體積濃度70％的丙酮溶液進行解吸，收集解吸液。對比例一與實施例二的區(qū)別在于柱床溫度由18℃變?yōu)?5℃。

對比例二 大孔樹脂處理

將按實施例一方法得到的浸提液減壓濃縮得到第一濃縮液，經(jīng)大孔樹脂LX1180柱床吸附，大孔樹脂柱床與第一濃縮液的體積比為1：6，使用6倍大孔樹脂柱床體積的體積濃度35％的丙酮溶液進行沖洗，柱床溫度為22℃，然后使用1.5倍大孔樹脂柱床體積的體積濃度70％的丙酮溶液進行解吸，收集解吸液。對比例二與實施例二的區(qū)別在于柱床溫度由18℃變?yōu)?2℃。

實施例三 解吸液的檢測

分別對實施例二、對比例一和對比例二的解吸液進行色譜檢測，并進行圖譜的對比，結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)對比例一和對比例二分別在相對保留時間(RRT)1.1和1.3處有明顯的特征峰，經(jīng)質(zhì)譜檢測為他克莫司的互變異構(gòu)體；而實施例二并未出現(xiàn)該特征峰，未檢出他克莫司的互變異構(gòu)體。

實施例四 硅膠柱層析及后處理

將按實施例二方法得到的解吸液減壓濃縮得到第二濃縮液，加入第二濃縮液3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，減壓濃縮得到油狀物，加入油狀物2倍體積的正己烷溶解，得到待層析液；將所述待層析液上硅膠柱層析，柱溫20℃，使用正己烷、乙酸乙酯和醋酸組成的洗脫組合物進行洗脫，洗脫包括：正己烷、乙酸乙酯和醋酸以4：2：0.2的體積比組成的組合物5倍柱體積，然后正己烷、乙酸乙酯和醋酸以2：4：0.2的體積比組成的組合物12倍柱體積，收集12倍柱體積部分，得到含他克莫司的層析液；將所述層析液減壓濃縮得到第三濃縮液，加入第三濃縮液3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，加入乙酸乙酯體積5％的正己烷，冷卻至4℃析晶，收集晶體，真空干燥，得到他克莫司，以按實施例一方法得到的浸提液中他克莫司含量計，他克莫司的的質(zhì)量收率為84.6％。經(jīng)色譜檢測，他克莫司的含量高達99.2％，子囊霉素的含量為0.08％，二氫他克莫司的含量為0.11％，可以滿足原料藥的要求。

對比例三 硅膠柱層析及后處理

將按實施例二方法得到的解吸液減壓濃縮得到第二濃縮液，加入第二濃縮液3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，減壓濃縮得到油狀物，加入油狀物2倍體積的正己烷溶解，得到待層析液；將所述待層析液上硅膠柱層析，柱溫20℃，使用正己烷和乙酸乙酯組成的洗脫組合物進行洗脫，洗脫包括：正己烷和乙酸乙酯以4：2的體積比組成的組合物5倍柱體積，然后正己烷和乙酸乙酯以2：4的體積比組成的組合物12倍柱體積，收集12倍柱體積部分，得到含他克莫司的層析液；將所述層析液減壓濃縮得到第三濃縮液，加入第三濃縮液3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，加入乙酸乙酯體積5％的正己烷，冷卻至4℃析晶，收集晶體，真空干燥，得到他克莫司，以按實施例一方法得到的浸提液中他克莫司含量計，他克莫司的的質(zhì)量收率為85.1％。經(jīng)色譜檢測，他克莫司的含量達95.2％，子囊霉素的含量為0.23％，二氫他克莫司的含量為0.36％，無法滿足原料藥的要求。

對比例三與實施例四的區(qū)別在于洗脫組合物由正己烷和乙酸乙酯組成，不含醋酸。

對比例四 硅膠柱層析及后處理

將按實施例二方法得到的解吸液減壓濃縮得到第二濃縮液，加入第二濃縮液3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，減壓濃縮得到油狀物，加入油狀物2倍體積的正己烷溶解，得到待層析液；將所述待層析液上硅膠柱層析，柱溫20℃，使用正己烷、乙酸乙酯和磷酸組成的洗脫組合物進行洗脫，洗脫包括：正己烷、乙酸乙酯和磷酸以4：2：0.2的體積比組成的組合物5倍柱體積，然后正己烷、乙酸乙酯和磷酸以2：4：0.2的體積比組成的組合物12倍柱體積，收集12倍柱體積部分，得到含他克莫司的層析液；將所述層析液減壓濃縮得到第三濃縮液，加入第三濃縮液3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，加入乙酸乙酯體積5％的正己烷，冷卻至4℃析晶，收集晶體，真空干燥，得到他克莫司。經(jīng)色譜檢測，他克莫司的含量達95.8％，子囊霉素的含量為0.18％，二氫他克莫司的含量為0.29％，無法滿足原料藥的要求。以按實施例一方法得到的浸提液中他克莫司含量計，他克莫司的的質(zhì)量收率為84.2％。

對比例四與實施例四的區(qū)別在于洗脫組合物由正己烷、乙酸乙酯和磷酸組成，不含醋酸。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。