本發(fā)明涉及莽草酸的分離提純技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從銀杏落葉中分離提純莽草酸的方法。

背景技術(shù)：

莽草酸（shikimic acid），化學(xué)名為3,4,5-三羥基-1環(huán)己烷基-1-羧酸，熔點(diǎn)為185-187℃，易溶于水，難溶于氯仿、苯和石油醚，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血栓及腦缺血、抗腫瘤的作用。目前世界衛(wèi)生組織確認(rèn)的唯一對(duì)H5N1禽流感病毒有效的治療藥物達(dá)菲就是以莽草酸為原料合成的，北京中醫(yī)藥大學(xué)藥理研究室前期研究首次發(fā)現(xiàn)莽草酸有明顯的抗血栓形成作用，可抑制動(dòng)、靜脈血栓及腦血栓形成。

1960年Simonart 和Wiaux曾報(bào)道了用陰離子交換樹脂處理莽草酸發(fā)酵液的方法，但他們并沒有將莽草酸與去氫莽草酸等副產(chǎn)物進(jìn)行很好的分離。后來有報(bào)道從八角果實(shí)八角茴香中提取莽草酸。八角茴香屬于藥食同源，即可以用于家庭食用，也用在中醫(yī)配方中，在民間的用量很大，而目前世界上幾乎全部的莽草酸都是從八角茴香中提取得到的，雖然提取方法已經(jīng)很成熟，但是八角茴香的資源有限，根本不能滿足目前整個(gè)世界對(duì)于莽草酸的需求，因此又有研究從八角葉和八角葉精油提取后廢渣中提取莽草酸。但到目前未見從銀杏落葉中分離提純莽草酸的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種從銀杏落葉中分離提純莽草酸的方法，為莽草酸的提取提供了一條新的途徑。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種從銀杏落葉中分離提純莽草酸的方法，包括以下步驟：

（1）將銀杏落葉干燥粉碎，然后用70%乙醇回流提取2-3次，每次1-2h，合并提取液，減壓濃縮至浸膏狀；其中每次提取過程中銀杏落葉與70%乙醇的質(zhì)量體積比值為0.25-0.4g/mL；

（2）將步驟（1）所得浸膏在去離子水中超聲溶解，然后再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，每種溶液萃取3次，合并萃取后的水溶液并將其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干，得到水相浸膏；

（3）將步驟（2）所得水相浸膏溶于甲醇中，然后再與100-200目的硅膠混合，攪拌均勻后在40℃條件下烘干并冷卻至室溫；其中步驟（1）所得浸膏與硅膠的重量比為1:1.5-2；

（4）將步驟（3）所得干燥物質(zhì)裝于層析柱上端10-20cm厚度，然后用乙酸乙酯和甲醇體積比為8-1:1的混合液對(duì)層析柱上端的物質(zhì)進(jìn)行洗脫，洗脫液為500mL時(shí)，收集洗脫液，并將洗脫液濃縮至干，得莽草酸粗品；

（5）向莽草酸粗品中加入2-3倍莽草酸粗品重量的甲醇，溶解，冷藏結(jié)晶，過濾得莽草酸結(jié)晶。

進(jìn)一步地，步驟（1）中提取過程中銀杏落葉與70%乙醇的質(zhì)量體積比值為0.4g/mL。

進(jìn)一步地，步驟（3）中水相浸膏與硅膠的重量比為1:1.75。

進(jìn)一步地，步驟（4）中乙酸乙酯和甲醇體積比為8:1。

本發(fā)明提供的從銀杏落葉中分離提純莽草酸的方法，具有以下有益效果：

（1）雖然八角是現(xiàn)今生產(chǎn)莽草酸的主要原料，但八角主要生長在云貴川地區(qū)，主要用作香料，且很難生長，滿足不了市場(chǎng)的需求，生產(chǎn)成本也高；本發(fā)明以銀杏落葉作為原料，來分離提純莽草酸，該原料廉價(jià)易得，通過簡單易操作的分離方法即可得莽草酸，可以緩解市場(chǎng)對(duì)莽草酸的需求壓力，同時(shí)還將我們每年大量廢棄的銀杏落葉變廢為寶，得以循環(huán)利用。

（2）本發(fā)明將銀杏落葉用70%乙醇浸提后得到的浸膏，經(jīng)過簡單的萃取得到水相浸膏，然后再通過硅膠柱層析就可以收獲大量白色晶體物質(zhì)，該提取方法簡單可行，所得莽草酸產(chǎn)率高、純度高。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種從銀杏落葉中分離提純莽草酸的方法，包括以下步驟：

（1）將銀杏落葉干燥粉碎，然后用70%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，減壓濃縮至浸膏狀；其中每次提取過程中銀杏落葉與70%乙醇的質(zhì)量體積比值為0.25g/mL；

（2）將步驟（1）所得浸膏在去離子水中超聲溶解，然后再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，每種溶液萃取3次，合并萃取后的水溶液并將其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干，得到水相浸膏；

（3）將步驟（2）所得水相浸膏溶于甲醇中，然后再與100-200目的硅膠混合，攪拌均勻后在40℃條件下烘干并冷卻至室溫；其中步驟（1）所得浸膏與硅膠的重量比為1:1.5；

（4）取一根洗凈的直徑約7cm，長115cm的色譜柱，垂直固定，以500mL錐形瓶作為洗脫液的接收器，取適量脫脂棉放于干凈的色譜柱底部，輕輕塞緊。取100-200目的硅膠1080g，用乙酸乙酯潤濕后調(diào)成糊狀，再徐徐倒入柱中，用橡膠塞輕輕敲打柱身由下至上，確保柱子裝實(shí)，同時(shí)打開活塞，當(dāng)柱內(nèi)硅膠不再下沉，液體表面剛好接觸到硅膠時(shí)立即關(guān)閉活塞，并根據(jù)接出來的乙酸乙酯體積來計(jì)算柱體積為2700mL；將步驟（3）所得干燥物質(zhì)沿管壁環(huán)繞均勻加載硅膠柱的液面，用橡膠塞輕輕敲打柱身由下至上，確保裝實(shí)，待樣品與硅膠柱吸附完全后，用乙酸乙酯和甲醇體積比為1:1的混合液對(duì)層析柱上端的物質(zhì)進(jìn)行淋洗，洗脫液為500mL時(shí)，收集洗脫液，并將洗脫液濃縮至干，得莽草酸粗品；

（5）向莽草酸粗品中加入2-3倍莽草酸粗品重量的甲醇，溶解，冷藏結(jié)晶，過濾得莽草酸結(jié)晶，收率為80.1%，純度為98.2%。

實(shí)施例2

一種從銀杏落葉中分離提純莽草酸的方法，包括以下步驟：

（1）將銀杏落葉干燥粉碎，然后用70%乙醇回流提取2次，每次1.5h，合并提取液，減壓濃縮至浸膏狀；其中每次提取過程中銀杏落葉與70%乙醇的質(zhì)量體積比值為0.3g/mL；

（2）將步驟（1）所得浸膏在去離子水中超聲溶解，然后再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，每種溶液萃取3次，合并萃取后的水溶液并將其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干后合并，得到水相浸膏；

（3）將步驟（2）所得水相浸膏溶于甲醇中，然后再與100-200目的硅膠混合，攪拌均勻后在40℃條件下烘干并冷卻至室溫；其中步驟（1）所得浸膏與硅膠的重量比為1:1.6；

（4）取一根洗凈的直徑約7cm，長115cm的色譜柱，垂直固定，以500mL錐形瓶作為洗脫液的接收器，取適量脫脂棉放于干凈的色譜柱底部，輕輕塞緊。取100-200目的硅膠1080g，用乙酸乙酯潤濕后調(diào)成糊狀，再徐徐倒入柱中，用橡膠塞輕輕敲打柱身由下至上，確保柱子裝實(shí)，同時(shí)打開活塞，當(dāng)柱內(nèi)硅膠不再下沉，液體表面剛好接觸到硅膠時(shí)立即關(guān)閉活塞，并根據(jù)接出來的乙酸乙酯體積來計(jì)算柱體積為2700mL；將步驟（3）所得干燥物質(zhì)沿管壁環(huán)繞均勻加載硅膠柱的液面，用橡膠塞輕輕敲打柱身由下至上，確保裝實(shí)，待樣品與硅膠柱吸附完全后，用乙酸乙酯和甲醇體積比為2:1的混合液對(duì)層析柱上端的物質(zhì)進(jìn)行洗脫，洗脫液為500mL時(shí)，收集洗脫液，并將洗脫液濃縮至干，得莽草酸粗品；

（5）向莽草酸粗品中加入2-3倍莽草酸粗品重量的甲醇，溶解，冷藏結(jié)晶，過濾得莽草酸結(jié)晶，收率為80.6%，純度為98.7%。

實(shí)施例3

一種從銀杏落葉中分離提純莽草酸的方法，包括以下步驟：

（1）將銀杏落葉干燥粉碎，然后用70%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮至浸膏狀；其中每次提取過程中銀杏落葉與70%乙醇的質(zhì)量體積比值為0.35g/mL；

（2）將步驟（1）所得浸膏在去離子水中超聲溶解，然后再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，每種溶液萃取3次，合并萃取后的水溶液并將其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干，得到水相浸膏；

（3）將步驟（2）所得水相浸膏溶于甲醇中，然后再與100-200目的硅膠混合，攪拌均勻后在40℃條件下烘干并冷卻至室溫；其中步驟（1）所得浸膏與硅膠的重量比為1:1.7；

（4）取一根洗凈的直徑約7cm，長115cm的色譜柱，垂直固定，以500mL錐形瓶作為洗脫液的接收器，取適量脫脂棉放于干凈的色譜柱底部，輕輕塞緊。取100-200目的硅膠1080g，用乙酸乙酯潤濕后調(diào)成糊狀，再徐徐倒入柱中，用橡膠塞輕輕敲打柱身由下至上，確保柱子裝實(shí)，同時(shí)打開活塞，當(dāng)柱內(nèi)硅膠不再下沉，液體表面剛好接觸到硅膠時(shí)立即關(guān)閉活塞，并根據(jù)接出來的乙酸乙酯體積來計(jì)算柱體積為2700mL；將步驟（3）所得干燥物質(zhì)沿管壁環(huán)繞均勻加載硅膠柱的液面，用橡膠塞輕輕敲打柱身由下至上，確保裝實(shí)，待樣品與硅膠柱吸附完全后，用乙酸乙酯和甲醇體積比為3:1的混合液對(duì)層析柱上端的物質(zhì)進(jìn)行洗脫，洗脫液為500mL時(shí)，收集洗脫液，并將洗脫液濃縮至干，得莽草酸粗品；

（5）向莽草酸粗品中加入2-3倍莽草酸粗品重量的甲醇，溶解，冷藏結(jié)晶，過濾得莽草酸結(jié)晶，收率為81.3%，純度為99.0%。

實(shí)施例4

一種從銀杏落葉中分離提純莽草酸的方法，包括以下步驟：

（1）將銀杏落葉干燥粉碎，然后用70%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮至浸膏狀；其中每次提取過程中銀杏落葉與70%乙醇的質(zhì)量體積比值為0.4g/mL；

（2）將步驟（1）所得浸膏在去離子水中超聲溶解，然后再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，每種溶液萃取3次，合并萃取后的水溶液并將其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干，得到水相浸膏；

（3）將步驟（2）所得水相浸膏溶于甲醇中，然后再與100-200目的硅膠混合，攪拌均勻后在40℃條件下烘干并冷卻至室溫；其中步驟（1）所得浸膏與硅膠的重量比為1:1.8；

（4）取一根洗凈的直徑約7cm，長115cm的色譜柱，垂直固定，以500mL錐形瓶作為洗脫液的接收器，取適量脫脂棉放于干凈的色譜柱底部，輕輕塞緊。取100-200目的硅膠1080g，用乙酸乙酯潤濕后調(diào)成糊狀，再徐徐倒入柱中，用橡膠塞輕輕敲打柱身由下至上，確保柱子裝實(shí)，同時(shí)打開活塞，當(dāng)柱內(nèi)硅膠不再下沉，液體表面剛好接觸到硅膠時(shí)立即關(guān)閉活塞，并根據(jù)接出來的乙酸乙酯體積來計(jì)算柱體積為2700mL；將步驟（3）所得干燥物質(zhì)沿管壁環(huán)繞均勻加載硅膠柱的液面，用橡膠塞輕輕敲打柱身由下至上，確保裝實(shí)，待樣品與硅膠柱吸附完全后，用乙酸乙酯和甲醇體積比為5:1的混合液對(duì)層析柱上端的物質(zhì)進(jìn)行洗脫，洗脫液為500mL時(shí)，收集洗脫液，并將洗脫液濃縮至干，得莽草酸粗品；

（5）向莽草酸粗品中加入2-3倍莽草酸粗品重量的甲醇，溶解，冷藏結(jié)晶，過濾得莽草酸結(jié)晶，收率為81.5%，純度為99.2%。

實(shí)施例5

一種從銀杏落葉中分離提純莽草酸的方法，包括以下步驟：

（1）將銀杏落葉干燥粉碎，然后用70%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮至浸膏狀；其中每次提取過程中銀杏落葉與70%乙醇的質(zhì)量體積比值為0.4g/mL；

（2）將步驟（1）所得浸膏在去離子水中超聲溶解，然后再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，每種溶液萃取3次，合并萃取后的水溶液并將其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干，得到水相浸膏；

（3）將步驟（2）所得水相浸膏溶于甲醇中，然后再與100-200目的硅膠混合，攪拌均勻后在40℃條件下烘干并冷卻至室溫；其中步驟（1）所得浸膏與硅膠的重量比為1:1.75；

（4）取一根洗凈的直徑約7cm，長115cm的色譜柱，垂直固定，以500mL錐形瓶作為洗脫液的接收器，取適量脫脂棉放于干凈的色譜柱底部，輕輕塞緊。取100-200目的硅膠1080g，用乙酸乙酯潤濕后調(diào)成糊狀，再徐徐倒入柱中，用橡膠塞輕輕敲打柱身由下至上，確保柱子裝實(shí)，同時(shí)打開活塞，當(dāng)柱內(nèi)硅膠不再下沉，液體表面剛好接觸到硅膠時(shí)立即關(guān)閉活塞，并根據(jù)接出來的乙酸乙酯體積來計(jì)算柱體積為2700mL；將步驟（3）所得干燥物質(zhì)沿管壁環(huán)繞均勻加載硅膠柱的液面，用橡膠塞輕輕敲打柱身由下至上，確保裝實(shí)，待樣品與硅膠柱吸附完全后，用乙酸乙酯和甲醇體積比為8:1的混合液對(duì)層析柱上端的物質(zhì)進(jìn)行洗脫，洗脫液為500mL時(shí)，收集洗脫液，并將洗脫液濃縮至干，得莽草酸粗品；

（5）向莽草酸粗品中加入2-3倍莽草酸粗品重量的甲醇，溶解，冷藏結(jié)晶，過濾得莽草酸結(jié)晶，收率為83.5%，純度為99.35%。