本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及頭孢哌酮的新用途，具體涉及頭孢哌酮的藥物組合物及其在治療牙周炎中的應用。
背景技術：
頭孢哌酮用于敏感產(chǎn)酶菌引起的各種感染的治療，如呼吸系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)、膽道、胃腸道、胸腹腔、皮膚軟組織感染的治療，及對流感桿菌、腦膜炎球菌引起的腦內(nèi)感染也有較好的療效。
迄今為止，尚未見頭孢哌酮及其藥物組合物與治療牙周炎的相關性報道。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種頭孢哌酮的藥物組合物，該藥物組合物中含有頭孢哌酮和一種天然產(chǎn)物，頭孢哌酮和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療牙周炎。
本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現(xiàn)的：
一種頭孢哌酮的藥物組合物，包括頭孢哌酮、具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(Ⅰ)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型；
作為優(yōu)選，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
作為優(yōu)選，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
作為優(yōu)選，所述化合物(Ⅰ)由以下步驟制備而得：(a)將小葉蓮粉碎，用80～90％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用30％乙醇洗脫6個柱體積，再用85％乙醇洗脫12個柱體積，收集85％洗脫液，減壓濃縮得85％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中85％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88％的甲醇水溶液等度洗脫，收集13～16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)。
作為優(yōu)選，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
本發(fā)明的優(yōu)點：
本發(fā)明提供的頭孢哌酮的藥物組合物中含有頭孢哌酮和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，頭孢哌酮、化合物(Ⅰ)單獨作用時，對牙周炎具有治療作用；頭孢哌酮和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療牙周炎的藥物。
附圖說明
圖1為化合物(Ⅰ)結(jié)構(gòu)式。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和范圍。
實施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
分離方法：(a)將小葉蓮(2kg)粉碎，用85％乙醇熱回流提取(15L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水飽和的正丁醇(3L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用30％乙醇洗脫6個柱體積，再用85％乙醇洗脫12個柱體積，收集85％洗脫液，減壓濃縮得85％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中85％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1(12個柱體積)、50:1(10個柱體積)、25:1(8個柱體積)和12:1(8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1(6個柱體積)、12:1(8個柱體積)和2:1(6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d) 中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88％的甲醇水溶液等度洗脫，收集13～16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)(HPLC歸一化純度大于98％)。
結(jié)構(gòu)確證：HR-ESIMS顯示[M+H]+為m/z 340.2196，結(jié)合核磁特征可得分子式為C22H28O2，不飽和度為9。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δH(ppm，CDCl3，500MHz)：H-2a(1.36，m)，H-2b(1.46，m)，H-3a(1.73，m)，H-3b(2.04，m)，H-5(2.46，d，J＝10.9Hz)，H-6(5.26，dt，J＝10.2，3.1Hz)，H-7(5.38，br，t，J＝6.5Hz)，H-9a(2.11，dd，J＝13.2，2.7Hz)，H-9b(2.22，br，t，J＝12.3Hz)，H-10a(1.37，m)，H-10b(1.67，m)，H-11(1.76，s)，H-13(1.91，s)，H-14(1.93，s)，H-15(1.02，s)，H-2’,6’(7.94，d，J＝8.6Hz)，H-3’,5’(7.57，d，J＝8.6Hz)，H-4’(7.64，d，J＝8.6Hz)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δC(ppm，CDCl3，125MHz)：43.2(C，1-C)，38.3(CH2，2-C)，29.2(CH2，3-C)，153.2(C，4-C)，53.2(CH，5-C)，75.2(CH，6-C)，121.1(CH，7-C)，136.1(C，8-C)，31.1(CH2，9-C)，41.7(CH2，10-C)，25.7(CH3，11-C)，114.2(C，12-C)，19.4(CH3，13-C)，22.1(CH3，14-C)，18.4(CH3，15-C)，167.6(C，C＝O)，133.5(C，1’-C)，123.3(CH，2’,6’-C)，125.1(CH，3’,5’-C)，133.3(CH，4’-C)。IR光譜表明該化合物含有酯羰基(1678cm-1)?；衔锏臍渥V顯示該化合物具有一個單取代的苯環(huán)質(zhì)子信號[δH7.94(2H，d，J＝8.6Hz，H-2’,6’)，7.57(2H，d，J＝8.6Hz，H-3’,5’)和7.64(1H，d，J＝8.6Hz，H-4’)]，一個烯屬次甲基質(zhì)子信號[δH5.38(1H，br，t，J＝6.5Hz，H-7)]，一個連氧次甲基質(zhì)子信號[δH5.26(1H，dt，J＝10.2，3.1Hz，H-6)]，以及四個甲基質(zhì)子信號[δH1.76(3H，s，H-11)，1.91(3H，s，H-13)，1.93(3H，s，H-14)，1.02(3H，s，H-15)]。該化合物的碳譜顯示該化合物有22個碳信號，包括四個甲基，四個亞甲基，八個次甲基(六個烯烴碳，一個連氧碳)以及六個季碳(一個酯羰基碳，四個烯烴季碳)。初步的HSQC以及HMBC譜解析發(fā)現(xiàn)，H-6’/C-CO、H-6’/C-2’、H-4’/C-2’、H-5’/C-3’以及H-6’/C-5’的相關性可以連接出一個單取代的苯甲酰基信號。除去苯甲酰基的7個碳，化合物還剩下15個碳信號，以此可以推斷出該化合物為一個倍半萜類衍生物。查閱相關文獻發(fā)現(xiàn)，該化合物和已知化合物elaeochytrin B具有相似的結(jié)構(gòu)。比較兩者的核磁共振數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，新化合物和elaeochytrin B的不同之處在于雙鍵位置和個數(shù)的不同以及苯甲酰基的取代方式不同。首先，H-6/C-CO之間的相關性說明苯甲?；廊皇俏挥贑-6位的，與elaeochytrin B不同的是，新化合物中的苯甲?；菃稳〈摹Ｍ瑫r，H-11/C-7，H-11/C-8，H-6/C-7以及H-6/C-8之間的相關性說明C-7和C-8之間為雙鍵。進一步的HMBC譜解析發(fā)現(xiàn)，H-13/C-12，H-13/C-4，H-14/C-4之間的相關信號說明多出來的另一個雙鍵是位于C-4和C-12位的。NOESY譜中，H3-15與H-6的相關性表明H3-15和H-6為β構(gòu)型，則苯甲?；俏挥讦廖坏?。綜合氫譜、碳 譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
該化合物化學式及碳原子編號如下：
實施例2：藥理作用
本實施例采用劃割剝離大鼠牙齦并喂以白砂糖制備牙周炎大鼠模型，觀察藥物改善動物牙齦紅腫，潰瘍，萎縮等方面的抗牙周炎的作用。
1、材料與方法
1.1動物
選用牙體牙列完整，無齲壞及牙周病的5周齡SD大鼠，雌雄各半，體重200±20g，由湖北省實驗動物研究中心提供。
1.2試劑與樣品
頭孢哌酮購自中國藥品生物制品檢定所。化合物(Ⅰ)自制，制備方法見實施例1。白砂糖，配成10％糖水作為飲用水，常規(guī)飼料，喂時用此糖水浸泡成軟飼料。口泰(復方氯己定含漱液)，深圳南粵藥業(yè)有限公司。
1.3儀器
眼科及手術器材一套；注射器；體視鏡；動物全自動血球計數(shù)儀，特康科技有限公司。
1.4大鼠分組及模型制備
大鼠隨機分為6組，每組13只大鼠(其中1只在造模2周后處死，取病理材料)，分籠飼養(yǎng)在已取得屏障環(huán)境使用許可證的設施中，分別為正常對照組、模型對照組、陽性對照組(口泰組，10mg·kg-1)和頭孢哌酮組(10mg·kg-1)、化合物(Ⅰ)組(10mg·kg-1)、頭孢哌酮與化合物(Ⅰ)組合物組【5mg·kg-1頭孢哌酮+5mg·kg-1化合物(Ⅰ)】。以一把大鑷子開口， 以眼科用彎剪對兩側(cè)牙齒周圍牙齦進行劃割剝離，然后喂以用10％的白砂糖水、并喂白砂糖水浸泡的軟飼料，造模結(jié)束改用正常飲食，每天觀察動物狀況。
造模成功后，每天兩次按照上述劑量口腔內(nèi)滴注給藥，用藥后禁飲食4h。連續(xù)給藥3天。
1.5齦出血指數(shù)(sulus bleeding index，SBI)測定實驗
用探針輕探選用牙的牙周袋或齦溝10s：不出血，游離齦緣無炎癥為0；游離齦緣無紅腫，探診出血為1；游離齦緣發(fā)紅水腫，探診出血為2；自發(fā)性出血，牙齦明顯紅腫，潰瘍?yōu)?。
1.6菌斑指數(shù)(plaque index，PLI)測定實驗
用小棉粒蘸菌斑染色劑(2％堿性品紅)涂于選用牙上30s后，自來水沖洗10s，觀察牙面上紫紅色的面積和深淺情況，近齦緣區(qū)無菌斑為0，近齦緣區(qū)牙面有薄菌斑為1，齦緣或鄰面有菌斑為2，齦溝和/或齦緣及鄰近面有大量菌斑為3。
1.7探診深度(probing depth，PD)測定實驗
用自制帶有刻度(刻度單位3mm)的細探針探選用牙牙周袋，每牙選近中頰、頰側(cè)、遠中頰3個點測量，取均值。
1.8牙齒松動度(Tooth mobility，TM)測定實驗
不松動為0，輕度松動即向頰向松動為1，中度松動即向近遠中向松動為2，重度松動即垂直向松動為3。
1.9牙槽骨吸收值(alveolar bone loss，ABL)測定實驗
大鼠處死后，取下頭顱，沸水煮，去肉存骨，解剖鏡下測量，從釉牙骨質(zhì)界到牙槽骨嵴頂?shù)拈L度，每牙選近中舌、舌側(cè)、遠中舌3個點測量，取均值。
1.10統(tǒng)計學方法
實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示，應用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2、實驗結(jié)果
2.1對牙周炎模型大鼠齦出血指數(shù)(SBI)、菌斑指數(shù)(PLI)、探診深度(PD)的影響
與正常對照組比，模型對照組大鼠齦出血指數(shù)SBI、菌斑指數(shù)PLI、探診深度PD明顯增加(P＜0.01)；與模型對照組比，頭孢哌酮與化合物(Ⅰ)組合物組和口泰組大鼠齦出血指數(shù)SBI、菌斑指數(shù)PLI、探診深度PD明顯降低(P＜0.01)；與模型對照組比，頭孢哌酮組、化合物(Ⅰ)組大鼠齦出血指數(shù)SBI、菌斑指數(shù)PLI、探診深度PD降低(P＜0.05)。
實驗結(jié)果見表1。
2.2對牙周炎模型大鼠牙槽骨吸收值(ABL)和牙齒松動度(TM)的影響
與正常對照組比較，模型對照組大鼠的牙槽骨吸收值和牙齒松動度明顯增加(P＜0.01)。 與模型對照組比較，頭孢哌酮與化合物(Ⅰ)組合物組和口泰組牙槽骨吸收值和牙齒松動度明顯減小(P＜0.01)；與模型對照組比較，頭孢哌酮組、化合物(Ⅰ)組牙槽骨吸收值和牙齒松動度減小(P＜0.05)。結(jié)果見表1。
表1對牙周炎模型大鼠臨床指標的改善和牙槽骨吸收值、牙齒松動度的影響
目前常用局部刺激或全身因素+局部刺激共同作用制備牙周炎。主要的局部刺激因素有高糖飲食、結(jié)扎、手術刺激、口腔接種特異菌等方法，自身因素要應用激素與免疫抑制劑。應用激素或免疫抑制方法造?；蚴侵芷陂L，模型不穩(wěn)定，或是與臨床病理變化不一致，或是操作不方便，易使動物死亡或個體差異大等不足，影響藥物療效的觀察和評價。
本實驗采用局部剝離加高糖飼料和高糖飲水喂養(yǎng)的方法，使實驗動物口腔明顯地出現(xiàn)了菌群失調(diào)及類似人類牙周炎病理改變。牙齦局部剝離為高糖飼料提供固著點，能使厭氧菌快速增殖，高糖飲水為厭氧菌生長提供良好環(huán)境，高糖飼料進一步為厭氧菌生長提供穩(wěn)定的營養(yǎng)和環(huán)境。該方法制備模型方便易行，便于普及，實驗周期短，二至三周即可形成典型牙周炎，并可見牙周袋形成，模型穩(wěn)定，個體差異小。
牙周探診是牙周病最重要的檢查方法，包括探診深度和探診出血陽性率等內(nèi)容。牙齦的炎癥和出血以及牙周袋形成是牙周炎最重要的病理改變。探診深度可反映牙周袋深度的變化，袋深者炎癥較重；探診是否出血是顯示牙齦有無炎癥較客觀的指標，探診不出血的牙位提示牙周組織處于較健康狀態(tài)，而出血陽性部位則提示需要繼續(xù)治療。
結(jié)果表明，頭孢哌酮、化合物(Ⅰ)單獨作用時，對牙周炎具有治療作用；頭孢哌酮和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療牙周炎的藥物。
上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護范圍。 本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和保護范圍。