本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新型構(gòu)建hcv病毒感染可視化報告系統(tǒng)的細(xì)胞修飾方法。

背景技術(shù)：

1989年人類首次發(fā)現(xiàn)并克隆了丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus，hcv)(chooetal,science,1989)，經(jīng)過20多年的研究，人們逐漸在其分子生物學(xué)特性、致病機(jī)理及與宿主的關(guān)系上取得較大進(jìn)展。同時hcv帶來的危害也逐漸被人們所認(rèn)知，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球hcv感染率為3％，并且多數(shù)患者會轉(zhuǎn)為持續(xù)感染，繼而誘發(fā)肝硬化、肝纖維化和肝癌，已成為威脅人類健康的主要病原之一。

hcv屬于黃病毒科肝炎病毒屬。hcv經(jīng)血液傳播，主要通過輸血和血制品傳播，也可以通過破損的皮膚與粘膜傳播。目前hcv最常用的治療手段為干擾素(peg-ifn)和利巴韋林(ribavirin)，但是該方法不僅治療費(fèi)用昂貴，而且副作用強(qiáng)，易導(dǎo)致肌痛、關(guān)節(jié)痛、頭痛等，同時50％的患者無法根除病毒。雖然有高效的直接抗病毒藥物上市，但是極高的價格無法惠及眾多患者。而且hcv的基因組差異較大，已發(fā)現(xiàn)7種基因型及多個亞型，同時由于hcv復(fù)制酶(ns5b)保真性差而導(dǎo)致其基因組變異率高，因此給hcv的治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。hcv對直接抗病毒藥物的逃逸也逐漸被發(fā)現(xiàn)和報道(xiaof,etal.plospathog,2014)。

相比原型株，本發(fā)明人對hcv患者體內(nèi)的準(zhǔn)種(quasispecies)更感興趣，它不僅代表了hcv基因的多態(tài)性，而且能真實(shí)地反映出這種差異在臨床上的表現(xiàn)。但是目前還沒有相關(guān)方法來有效篩選患者體內(nèi)病毒粒子。本發(fā)明人希望通過建立一種新型的hcv檢測方法，一方面能有效地從hcv患者血清中分離出hcv病毒粒子，分析其基因組的差異性與臨床表現(xiàn)，并最終獲得多株hcv感染性克隆用于進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究。另一方面針對hcv患者治病費(fèi)用高昂的情況，本發(fā)明人希望能利用一種hcv報告系統(tǒng)幫助患者做藥物治療前檢測，測試治療藥物對該病人的有效性；同時為篩選廣譜特異性的抗hcv藥物提供技術(shù)平臺。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的病毒感染的報告系統(tǒng)，來檢測病毒的感染。

本發(fā)明的另一目的是提供一種新型構(gòu)建hcv病毒感染可視化報告系統(tǒng)的細(xì)胞修飾方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組蛋白，所述重組蛋白包括相互獨(dú)立的第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下式i所示：

nls-pn-in，(i)；

所述第二融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下式ii所示：

ic-pc-nls-ips，(ii)；

其中，

nls為核定位信號；

ips為線粒體定位信號；

in為內(nèi)含肽n端片段，ic為內(nèi)含肽c端片段；

pn為報告蛋白n端片段，pc為報告蛋白c端片段；

并且，當(dāng)?shù)谝蝗诤系鞍缀偷诙诤系鞍卓臻g接觸時，所述in和ic結(jié)合時形成具有活性的內(nèi)含肽，所述內(nèi)含肽剪接pn和pc，從而使pn和pc結(jié)合形成具有報告蛋白特性的多肽?！?”表示肽鍵或肽段(如肽接頭)。

在另一優(yōu)選例中，所述第二融合蛋白中包括切割位點(diǎn)，所述切割位點(diǎn)位于ips內(nèi)部和/或所述nls和所述ips之間。

在另一優(yōu)選例中，所述切割位點(diǎn)為病毒蛋白的切割位點(diǎn)。

在另一優(yōu)選例中，所述切割位點(diǎn)為hcv的ns3/4a蛋白的切割位點(diǎn)、hav的3abc蛋白切割位點(diǎn)、ev71的2a蛋白切割位點(diǎn)、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述切割位點(diǎn)為hcv的ns3/4a蛋白的切割位點(diǎn)。

在另一優(yōu)選例中，所述nls具有如下多肽序列：

dpkkkrkv，seqidno.:1。

在另一優(yōu)選例中，所述ips具有如下多肽序列：

segtfgihvaenpsiqllegnpgppadpdggprpqadrkfqerevpchrpspgalwlqvavtgvlvvtllvvlyrrrlh，seqidno.:2。

在另一優(yōu)選例中，所述in和ic多肽序列分別如下：

in:claadtevltveygpiaigklveenircqvyccnpdgyiysqpigqwhqrgeqevieyelsdgriiratadhrfmteegemlsldeiferslelkqiptpllaiaqpsplata，seqidno.:3

ic:vkivrrrslgvqpvydlgvatvhnfvlanglvasncfn，seqidno.:4。

在另一優(yōu)選例中，所述報告蛋白選自下組：

綠色熒光蛋白(gfp)、和紅色熒光蛋白(mcherry)。

在另一優(yōu)選例中，所述pn和pc選自下組：

gfp-pn:vskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkq，seqidno.:5

gfp-pc:kngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk，seqidno.:6；和

mcherry-pn:vskgeednmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermyped，seqidno.:7

mcherry-pc:galkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelyk，seqidno.:8。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸包括編碼所述第一融合蛋白的多核苷酸和/或編碼所述第二融合蛋白的多核苷酸。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)載體，或者在基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞包含編碼所述第一融合蛋白的第一載體和/或編碼所述第二融合蛋白的第二載體。

在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞基因組中整合有編碼所述第一融合蛋白的第一多核苷酸，和/或編碼所述第二融合蛋白的第二多核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞核定位有所述第一融合蛋白，所述宿主細(xì)胞的線粒體定位有所述第二融合蛋白。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括：

(1)本發(fā)明第一方面所述的重組蛋白；

(2)編碼所述第一融合蛋白的第一多核苷酸和/或編碼所述第二融合蛋白的第二多核苷酸；

(3)包含編碼所述第一融合蛋白的多核苷酸的第一載體和/或包含編碼所述第二融合蛋白的多核苷酸的第二載體；和/或

(4)本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明的第六方面，提供了一種構(gòu)建基因工程細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟：

(1)提供一宿主細(xì)胞，將外源的表達(dá)第一融合蛋白的多核苷酸導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞，從而使所述宿主細(xì)胞表達(dá)所述第一融合蛋白；

(2)將外源的表達(dá)第二融合蛋白的多核苷酸導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞，從而使所述宿主細(xì)胞表達(dá)所述第二融合蛋白；

其中，所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白分別如上所述。

在另一優(yōu)選例中，所述第一融合蛋白定位于所述基因工程細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。

在另一優(yōu)選例中，所述第二融合蛋白定位于所述基因工程細(xì)胞的線粒體。

在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為對hcv易感的肝癌細(xì)胞系。

本發(fā)明的第七方面，提供了一種用于本發(fā)明第六方面所述的方法的融合蛋白，所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下式i所示：

nls-pn-in，(i)；或者

所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下式ii所示：

ic-pc-nls-ips，(ii)；

其中，

nls為核定位信號；

ips為線粒體定位信號；

in為內(nèi)含肽n端片段，ic為內(nèi)含肽c端片段；

pn為報告蛋白n端片段，pc為報告蛋白c端片段。

本發(fā)明的第八方面，提供了一種構(gòu)建hcv病毒感染報告系統(tǒng)的方法，所述方法包括步驟：

(1)提供一宿主細(xì)胞，將外源的表達(dá)第一融合蛋白的多核苷酸導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞，從而使所述宿主細(xì)胞表達(dá)所述第一融合蛋白；

(2)將外源的表達(dá)第二融合蛋白的多核苷酸導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞，從而使所述宿主細(xì)胞表達(dá)所述第二融合蛋白；

其中，所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白分別如上所述；

當(dāng)所述宿主細(xì)胞被hcv感染時，hcv非結(jié)構(gòu)蛋白ns3/4a蛋白切割所述第二融合蛋白中的切割位點(diǎn)，從而使所述第二融合蛋白片段游離并在所述nls的驅(qū)動下移至核內(nèi)，與所述第一融合蛋白接觸，在內(nèi)含肽的作用下剪接形成完整的報告蛋白，從而在所述宿主細(xì)胞上顯示報告蛋白特性。

本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的重組蛋白，本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)載體、本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞、本發(fā)明第五方面所述的試劑盒的用途，用于篩選抗病毒的藥物。

本發(fā)明的第十方面，提供了一種篩選抗病毒藥物的方法，所述方法包括：

(1)根據(jù)本發(fā)明第六方面所述的方法構(gòu)建基因工程細(xì)胞；

(2)向步驟(1)中構(gòu)建的基因工程細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入病毒和待篩選物質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)組；

(3)檢測實(shí)驗(yàn)組中宿主細(xì)胞中的報告蛋白特性；

如果實(shí)驗(yàn)組中報告蛋白的特性降低，則說明該物質(zhì)能夠抑制該病毒復(fù)制。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了visi-gfp細(xì)胞系驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果。

圖2顯示了visi-gfp與huh7.5.1在hcv病毒復(fù)制和病毒產(chǎn)量上的比較。

圖3顯示了hcv病毒感染實(shí)驗(yàn)。

圖4顯示了藥物抑制實(shí)驗(yàn)。

圖5顯示了visi-mcherry的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，構(gòu)建了病毒感染可視化報告系統(tǒng)，在宿主細(xì)胞中將報告蛋白分開表達(dá)，使報告蛋白的兩個片段分別定位在細(xì)胞核和線粒體上，當(dāng)細(xì)胞感染病毒后，病毒蛋白將定位在線粒體上的報告蛋白片段切割下來，并游離到細(xì)胞核內(nèi)，與定位在細(xì)胞核內(nèi)的蛋白接觸，在內(nèi)含肽的作用下發(fā)生剪接形成完整的報告蛋白，從而在宿主細(xì)胞上觀察到報告蛋白特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述報告系統(tǒng)能夠方便、靈敏、高效的顯示宿主細(xì)胞是否感染病毒。本發(fā)明還提供了所述報告系統(tǒng)在藥物篩選中的用途。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。

在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@類方法和條件可以變動。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。

除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時，術(shù)語“約”意指該值可以從列舉的值變動不多于1％。例如，如本文所用，表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。

具體地，本發(fā)明提供了一種新型的hcv病毒感染可視化報告系統(tǒng)的細(xì)胞修飾方法，隨后在肝細(xì)胞系huh7.5.1細(xì)胞中運(yùn)用該修飾方法建立起一種簡單靈敏的hcv感染報告系統(tǒng)，清晰準(zhǔn)確的顯示被感染細(xì)胞，本方法可應(yīng)用于hcv感染活細(xì)胞分選及抗hcv藥物的高通量篩選及抗毒活性高效評估。

病毒

病毒(virus)是由一個核酸分子(dna或rna)與蛋白質(zhì)構(gòu)成的非細(xì)胞形態(tài)的靠寄生生活的生命體。病毒無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，需要依靠宿主細(xì)胞完成自身的繁殖。病毒感染細(xì)胞后，依靠宿主表達(dá)出病毒蛋白，用于組裝新的病毒。其中部分病毒蛋白具有切割功能。本發(fā)明中所述“切割功能”是指某些病毒蛋白具有酶活性，能特異切割宿主蛋白以干擾宿主的抗病毒過程。實(shí)例性的病毒包括：hcv(丙型肝炎病毒)、hav(甲型肝炎病毒)、ev71(腸道病毒71型)等。這些病毒中具有切割動能的蛋白如：hcv中的ns3/4a蛋白、hav中的3abc蛋白、ev71中的2a蛋白。在(lixd,etal.pnas,2005；yangy,etal.pnas,2007；wangb,etal.plospathog,2013)文獻(xiàn)中有關(guān)于這些蛋白的詳細(xì)報道。以下以hcv為例，詳細(xì)介紹。

hcv屬于黃病毒科肝炎病毒屬，為單股正連rna病毒，基因組全長9.6kb，編碼一個多聚蛋白，經(jīng)胞內(nèi)激酶和自身非結(jié)構(gòu)蛋白的切割形成3個結(jié)構(gòu)蛋白(core、e1、e2)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)。核心蛋白core是其核衣殼的主要組成部分，用來包裹hcv基因組；e1、e2為囊膜蛋白，可形成二聚體包裹于核衣殼外；p7為疏水性的離子通道蛋白；ns2既能切割多聚蛋白同時也能參與病毒的組裝；ns3n端180個氨基酸具有絲氨酸蛋白酶活性，能與輔酶ns4b一起切割多聚蛋白多個節(jié)點(diǎn)，而其c端具有atp水解酶和解旋酶活性，是hcv基因組復(fù)制所必需的；ns5a為磷酸化蛋白，可調(diào)節(jié)hcvrna的復(fù)制與組裝，而且能與宿主多個因子結(jié)合；ns5b是hcv的復(fù)制酶。復(fù)制而得hcvrna與結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞內(nèi)脂類的共同作用下形成新的病毒粒子并釋放到胞外，再通過識別細(xì)胞表面受體后再進(jìn)入細(xì)胞并完成下一次循環(huán)。

利用本發(fā)明的技術(shù)方案，可以構(gòu)建一種新型的hcv感染的報告系統(tǒng)，來檢測hcv的感染。也可以利用本發(fā)明的技術(shù)方案，構(gòu)建其它病毒(優(yōu)選為能夠表達(dá)切割蛋白的病毒)感染的報告系統(tǒng)，用來檢測病毒感染。

nls(核定位信號)

nls(nuclearlocalizationsignal)是蛋白質(zhì)的一個結(jié)構(gòu)域，通常為一短的氨基酸序列，它能與入核載體相互作用，使蛋白能被運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核。

在優(yōu)選地實(shí)施方式中，本發(fā)明中的nls序列為：

dpkkkrkv(seqidno.:1)。

ips(線粒體定位信號)

ips(ifn-betapromoterstimulator)是ifn-β啟動子刺激因子。

在優(yōu)選地實(shí)施方式中，本發(fā)明中的ips序列如下：

segtfgihvaenpsiqllegnpgppadpdggprpqadrkfqerevpchrpspgalwlqvavtgvlvvtllvvlyrrrlh(seqidno.:2)。

內(nèi)含肽

內(nèi)含肽(intein)，是位于宿主蛋白質(zhì)中的一段插入序列。與內(nèi)含肽相對應(yīng)的另一專用術(shù)語是外顯肽。內(nèi)含肽基因不是一個獨(dú)立的，必須插人于外顯肽基因才能復(fù)制轉(zhuǎn)錄，可從前體蛋白中切除并將兩側(cè)外顯肽連接起來成為成熟蛋白質(zhì)。其對應(yīng)的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白對應(yīng)的核酸序列之中，與宿主蛋白基因存在于同一開放閱讀框架(openreadingframe，orf)內(nèi)，并與宿主蛋白質(zhì)基因進(jìn)行同步轉(zhuǎn)錄和翻譯，當(dāng)翻譯形成蛋白質(zhì)前體后，內(nèi)含肽從宿主蛋白質(zhì)中切除，從而形成成熟的具有活性的蛋白。

在優(yōu)選地實(shí)施方式中，本發(fā)明中的內(nèi)含肽為分離性內(nèi)含肽(splictintein)。分離性內(nèi)含肽的兩個剪接區(qū)域分裂成兩份，存在于不同的多肽片段上，所以稱為分離內(nèi)含肽。分離內(nèi)含肽的兩個多肽片段可以分開表達(dá)，當(dāng)兩個多肽片段接觸時，結(jié)合成為具有剪接功能的完整內(nèi)含肽。

優(yōu)選地本發(fā)明中的內(nèi)含肽為聚球藻屬synechococcuselongates(sel)的分離性內(nèi)含肽,genbank:cp000100.1，其分開的兩段分別為：

in:claadtevltveygpiaigklveenircqvyccnpdgyiysqpigqwhqrgeqevieyelsdgriiratadhrfmteegemlsldeiferslelkqiptpllaiaqpsplata(seqidno.:3)

ic:vkivrrrslgvqpvydlgvatvhnfvlanglvasncfn(seqidno.:4)

報告蛋白

如本文所用，報告蛋白(reporterprotein)是一種可被檢測的蛋白質(zhì)或酶，也就是說，是一個非常容易被鑒定的蛋白。常用的報告蛋白包括：抗生素抗性蛋白、β半乳糖苷酶、熒光素酶、熒光蛋白。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用熒光蛋白，如綠色熒光蛋白(gfp)和紅色熒光蛋白(mcherry)。

綠色熒光蛋白(gfp,238aa,參考genbank:u55762.1)等報告基因的蛋白序列在特定的區(qū)域可分裂成兩個片段:gfpn(1-157aa)和gfpc(158-237aa)，二者均不產(chǎn)生熒光，但借助內(nèi)含肽(intein)的剪接功能將分開的片段重新拼接成完整的gfp后又會發(fā)出熒光。

gfpn(1-157aa)的氨基酸序列如下：

gfp-pn:vskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkq(seqidno.:5)

gfpc(158-237aa)的氨基酸序列如下：

gfp-pc:kngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seqidno.:6)。

紅色熒光蛋白mcherry-pn(1-158aa)的氨基酸序列如下：

mcherry-pn:vskgeednmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermyped(seqidno.:7)

mcherry-pc(159-235aa)的氨基酸序列如下：

mcherry-pc:galkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelyk(seqidno.:8)。

hcv感染可視化報告系統(tǒng)

本發(fā)明提供的hcv感染可視化報告系統(tǒng)中包括一種重組蛋白，所述重組蛋白包括相互獨(dú)立的第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下式i所示：

nls-pn-in，(i)；

所述第二融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下式ii所示：

ic-pc-nls-ips，(ii)；

其中，

nls為核定位信號；

ips為線粒體定位信號；

in為內(nèi)含肽n端片段，ic為內(nèi)含肽c端片段；

pn為報告蛋白n端片段，pc為報告蛋白c端片段；

并且，當(dāng)?shù)谝蝗诤系鞍缀偷诙诤系鞍卓臻g接觸時，所述in和ic結(jié)合時形成具有活性的內(nèi)含肽，所述內(nèi)含肽剪接pn和pc，從而使pn和pc結(jié)合形成具有報告蛋白特性的多肽。

在一個優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述第二融合蛋白中包括切割位點(diǎn)，所述切割位點(diǎn)位于ips內(nèi)部和/或所述nls和所述ips之間；優(yōu)選地，所述切割位點(diǎn)為hcv非結(jié)構(gòu)蛋白ns3/4a蛋白的切割位點(diǎn)。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的一種hcv感染可視化報告系統(tǒng)(viralinfectionactivatedsplit-inteinbasedreportersystem,visi)中，選用了synechococcuselongates(sel)，一種來自藍(lán)藻的分離性內(nèi)含肽(splictintein,genbank:cp000100.1)，蛋白序列可分為dnaen(ncbireferencesequence:wp_011378362.1,758-870aa)和dnaec(ncbireferencesequence:wp_011243264.1,1-38aa)。之后將gfp分裂片段(gfpn/gfpc)與內(nèi)含肽分裂片段(dnaen/dnaec)相互組合形成融合蛋白(dnaen+gfpn/dnaec+gfpc),利用核定位信號(nls,dpkkkrkv)將內(nèi)含肽一端(nls-gfpn-dnaen)穩(wěn)定表達(dá)并定位于huh7.5.1細(xì)胞核內(nèi)，而另一端(dnaec-gfpc-nls-ips)則利用線粒體定位信號(ips,462-540aa,genbank:ab232371.1,)穩(wěn)定表達(dá)并定位于huh7.5.1細(xì)胞線粒體上，該細(xì)胞系本發(fā)明人稱之為visi-gfp，定位不同造成二者空間位置不同，內(nèi)含肽無法發(fā)揮剪接功能，從而使得visi-gfp細(xì)胞無熒光信號出現(xiàn)。

上述線粒體定位信號(ips)自身蛋白序列上存在hcv病毒復(fù)制必需蛋白ns3/4a的切割位點(diǎn)，所以當(dāng)hcv感染后，翻譯出的復(fù)制所需蛋白ns3/4a將切割ips,造成定位于線粒體一端融合蛋白(dnaec-gfpc-nls-ips)發(fā)生游離，在該序列中核定位信號(nls)的驅(qū)動下移至核內(nèi)，因此在空間上接近了定位于核內(nèi)的一端融合蛋白(nls-gfpn-dnaen)，二者在內(nèi)含肽的作用下，發(fā)生剪接形成完整的gfp蛋白，從而使得visi-gfp細(xì)胞出現(xiàn)可見的核內(nèi)綠色熒光。

在本發(fā)明中，“重組蛋白”指具有式i或ii所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白，也指一種重組蛋白的組合，在該重組蛋白的組合中包括式i和ii所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白。此外，應(yīng)理解，所述術(shù)語還包括融合蛋白的活性片段和衍生物。

本發(fā)明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。dna可以是單鏈的或是雙鏈的。dna可以是編碼鏈或非編碼鏈。

本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。

如本文所用，術(shù)語“引物”指的是在與模板配對，在dna聚合酶的作用下能以其為起點(diǎn)進(jìn)行合成與模板互補(bǔ)的dna鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的rna、dna，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如lna或zna等。引物“大致上”(或“基本上”)與模板上一條鏈上的一個特殊的序列互補(bǔ)。引物必須與模板上的一條鏈充分互補(bǔ)才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補(bǔ)。比如，在一個3'端與模板互補(bǔ)的引物的5'端加上一段與模板不互補(bǔ)的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補(bǔ)。只要有足夠長的引物能與模板充分的結(jié)合，非完全互補(bǔ)的引物也可以與模板形成引物-模板復(fù)合物，從而進(jìn)行擴(kuò)增。

本發(fā)明融合蛋白的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂胮cr擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于pcr擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cdna庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次pcr擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。

此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。

應(yīng)用pcr技術(shù)擴(kuò)增dna/rna的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于pcr的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的dna/rna片段。

本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或融合蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的方法。

通過常規(guī)的重組dna技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組蛋白。一般來說有以下步驟：

(1)用本發(fā)明的編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；

(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；

(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明蛋白的編碼dna序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的dna序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mrna合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。

此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性等，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。

包含上述的適當(dāng)dna序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。

宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅s2或sf9的昆蟲細(xì)胞；cho、ns0、cos7、或293細(xì)胞的動物細(xì)胞等。

用重組dna轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收dna的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用cacl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用mgcl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的dna轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。

獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。

在上面的方法中的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(hplc)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。

如本文所用，術(shù)語“融合蛋白”還包括第一融合蛋白或第二融合蛋白的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：1-3個(通常為1-2個，更佳地1個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一個或數(shù)個(通常為3個以內(nèi)，較佳地為2個以內(nèi)，更佳地為1個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。此外，所述術(shù)語還包括單體和多聚體形式的本發(fā)明多肽。該術(shù)語還包括線性以及非線性的多肽(如環(huán)肽)。

本發(fā)明還包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明融合蛋白的功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或幾個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)抗原肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導(dǎo)序列、分泌序列或6his等標(biāo)簽序列融合而形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。

一類優(yōu)選的活性衍生物指與式ia或式ib的氨基酸序列相比，有至多3個，較佳地至多2個，更佳地至多1個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表a進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。

表a

本發(fā)明還提供本發(fā)明融合蛋白的類似物。這些類似物與第一融合蛋白或第二融合蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。類似物還包括具有不同于天然l-氨基酸的殘基(如d-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。

修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)：目前的hcv感染可視化都是建立在對病毒基因組的遺傳改造上的；比如在病毒基因組中插入熒光蛋白基因。但是這種遺傳改造通常會信號弱并影響病毒的生物學(xué)特性。本發(fā)明通過對hcv宿主細(xì)胞系進(jìn)行改造，避免了對野生型病毒的影響。野生型hcv感染后通過病毒蛋白酶ns3/4a切割，核轉(zhuǎn)運(yùn)，內(nèi)含肽的高效剪接，在細(xì)胞核內(nèi)重新拼接并恢復(fù)熒光蛋白的結(jié)構(gòu)和熒光。

(2)病毒感染該hcv感染可視化宿主細(xì)胞系統(tǒng)前，細(xì)胞中的熒光蛋白基因被分段表達(dá)并分別定位于線粒體和細(xì)胞核內(nèi)，所以該系統(tǒng)具有極低的熒光背景和hcv感染后優(yōu)秀的信噪比。該系統(tǒng)構(gòu)建的細(xì)胞模型與現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞模型相比具有更高的靈敏度，更好的特異性等優(yōu)點(diǎn)。

(3)依照本方法構(gòu)建的細(xì)胞培養(yǎng)報告系統(tǒng)是一種實(shí)時監(jiān)測hcv感染的細(xì)胞系統(tǒng)，感染細(xì)胞的熒光信號強(qiáng)弱可以指示hcv感染復(fù)制的水平，存在“開關(guān)”效應(yīng)。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如美國sambrook.j等著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(黃培堂等譯，北京：科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。

材料

1、質(zhì)粒：含綠色熒光蛋白(greenfluorescenceprotein，gfp,plasmid#60360))、紅色熒光蛋白(mcherry,plasmid#36084)及ips((plasmid#52135)基因序列的質(zhì)粒購自addgene，內(nèi)含肽(intein)基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、細(xì)胞：huh7.5.1(參考文獻(xiàn)zhongj,等.pnas,2005；us8506969；us8143022；可以獲自中國科學(xué)院上海巴斯德研究所)。

3、病毒：hcvjc1(參考文獻(xiàn)lindenbachb.d,等.science,2005；us7439227；可以獲自中國科學(xué)院上海巴斯德研究所),jcr2a(poenischm,等.plospathog,2015；可以獲自中國科學(xué)院上海巴斯德研究所)通過人工改造，刪除其結(jié)構(gòu)蛋白e1e2(2051bp-3647bp)序列而成jcr2a-deltae1e2毒株(可以獲自中國科學(xué)院上海巴斯德研究所)。

通用方法

分子克隆、免疫熒光、病毒生長曲線測定等實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)(dacosta,etal.jvirol,2012),核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)(dum,etal.jimmunol,2015)。

分子克?。和ㄟ^合成引物再用pcr方法擴(kuò)增所需基因，隨后利用酶切位點(diǎn)將該片段連接到質(zhì)粒載體上。

免疫熒光：將貼壁細(xì)胞用多聚甲醛固定在玻璃片上，再用0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)在細(xì)胞上打孔以方便抗體的進(jìn)入，隨后用5％的血清封閉，而后孵育一抗，1小時后洗滌并孵育熒光二抗，經(jīng)幾次洗滌后將玻璃片置于封片劑中以防止熒光淬滅，隨后用激光共聚焦顯微鏡拍照。

hcvrna的制備與電轉(zhuǎn)化：含有hcv基因組的質(zhì)粒通過體外轉(zhuǎn)錄獲得hcv全長的rna，隨后用電轉(zhuǎn)儀(975μf,270v,+∞ω,4mm)將hcvrna轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)并繼續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞.

病毒生長曲線測定：將病毒基因組rna電轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，隨后繼續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞，在不同的時間點(diǎn)(0h、12h、24h、48h、72h、96h)收取細(xì)胞上清，病毒上清收齊后再通過半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(tcid50)實(shí)驗(yàn)檢測其在各個點(diǎn)的感染性。

核質(zhì)分離：收集一定數(shù)量的細(xì)胞后，離心獲得沉淀，加入hypotonicbuffer(10mmhepes,ph7.6；1.5mmmgcl2；10mmkcl；1mmedta；proteinaseinhibitors)，冰上孵育10分鐘后離心后轉(zhuǎn)移上清即為細(xì)胞質(zhì)懸液，洗滌數(shù)次后再加入highsaltbuffer(20mmhepes,ph7.6；0.5mnacl；1.5mmmgcl2；1mmedta；proteinaseinhibitors)，冰上孵育20分鐘，離心后獲得上清即為細(xì)胞核懸液。

本發(fā)明人通過上述方法，成功構(gòu)建了visi-gfp細(xì)胞系和visi-mcherry細(xì)胞系。

實(shí)施例1visi-gfp驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

visi-gfp細(xì)胞系構(gòu)建完成后，隨即驗(yàn)證了該策略的可行性。本發(fā)明人在visi-gfp細(xì)胞系內(nèi)過表達(dá)hcvns3/4a蛋白，表達(dá)ns3/4a后可見核內(nèi)出現(xiàn)明顯熒光，而陰性對照組(mock)未出現(xiàn)任何熒光，而且背景信號低(圖1a)。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)同樣顯示存在ns3/4a蛋白時，核內(nèi)出現(xiàn)大量完整gfp蛋白(39kd)(圖1b)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該策略可行，相比charlesmrice等(jonesct,etal.natbiotechnol,2010)建立的實(shí)時監(jiān)測hcv感染的細(xì)胞模型，visi細(xì)胞具有極低的背景，更加清晰的視野，能夠快速準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)感染細(xì)胞。

實(shí)施例2visi-gfp細(xì)胞系與huh7.5.1的病毒學(xué)比較

huh7.5.1是培養(yǎng)hcv常用的細(xì)胞系之一，本發(fā)明人以huh7.5.1為靶細(xì)胞構(gòu)建visi-gfp細(xì)胞系并對huh7.5.1和visi-gfp細(xì)胞系在病毒復(fù)制及病毒產(chǎn)量上進(jìn)行了比較。首先在兩種細(xì)胞系中分別電轉(zhuǎn)包含renillaluciferase報告基因的hcvjcr2a-deltae1e2rna,在不同時間點(diǎn)(0h-96h)收集樣品測renillaluciferase值從而檢測hcv在該細(xì)胞的復(fù)制情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)visi-gfp與huh7.5.1相比，二者在病毒復(fù)制水平上無明顯差異(圖2)。其次在兩種細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染hcv基因組jc1后于不同時間點(diǎn)收集病毒上清，并檢測其感染能力，圖2顯示二者在病毒產(chǎn)量上并無差別，綜上所述：visi-gfp細(xì)胞系的建立并未影響細(xì)胞本身在病毒復(fù)制和病毒產(chǎn)生方面的能力。

實(shí)施例3hcv病毒感染實(shí)驗(yàn)

為檢測hcv病毒感染能否引起驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中同樣的核熒光，本發(fā)明人用huh7.5.1細(xì)胞培養(yǎng)收獲的hcvjc1病毒感染visi-gfp細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒感染細(xì)胞后翻譯產(chǎn)生的ns3/4a同樣會產(chǎn)生核內(nèi)可見熒光(圖3)。同時用hcvjc1病毒感染huh7.5.1及visi-gfp后，分別收集不同時間點(diǎn)的細(xì)胞，圖3顯示隨著病毒蛋白的合成，visi-gfp細(xì)胞內(nèi)gfp蛋白也隨之產(chǎn)生，48h即可出現(xiàn)大量熒光蛋白。與liangjt等(huz,etal.antimicrobagentschemother，2013)建立的hcv檢測方法相比.本系統(tǒng)無需對hcv病毒本身進(jìn)行修改，不改變病毒本身特性，病毒復(fù)制即可產(chǎn)生可見熒光。綜上所述：visi-gfp細(xì)胞系可應(yīng)用于靈敏特異地可視化檢測野生型hcv感染。

實(shí)施例4藥物抑制實(shí)驗(yàn)

通常hcv在體內(nèi)會建立起持續(xù)感染，能長時間存在于肝臟內(nèi)而無法清除。dornerm等(marcusdorner,etal.methods,2013)將hcv-cre/loxp系統(tǒng)運(yùn)用到其建立的hcv感染的小鼠模型中，將hcv-crerna注射到小鼠體內(nèi)可見明顯的報告基因信號，但是該系統(tǒng)存在一定的局限性：一方面該系統(tǒng)對病毒自身序列進(jìn)行改造(cre插入到hcv基因中)，會直接影響病毒自身特性；另一方面該系統(tǒng)一旦信號開啟就無法關(guān)閉，限制其在抗病毒藥物篩選上的應(yīng)用。前面實(shí)驗(yàn)證明visi系統(tǒng)不需要改造病毒自身序列，所以如果要將visi系統(tǒng)運(yùn)用到小鼠模型內(nèi)，本發(fā)明人必須在模擬其體內(nèi)持續(xù)感染機(jī)制的同時驗(yàn)證其是否存在“開關(guān)”效應(yīng)。本發(fā)明人首先用hcvjc1病毒感染visi-gfp細(xì)胞系，大部分細(xì)胞出現(xiàn)可見的核熒光后再加入抗病毒藥物(ifn購自上海索萊寶生物科技有限公司、simeprevir購自medchemexpress公司)，分別于不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞并進(jìn)行免疫染色，觀察熒光，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不管是ifn治療組還是simeprevir治療組，均出現(xiàn)可見核熒光會隨時間的增加而降低，存在明顯的“開關(guān)”效應(yīng)，直接反映出藥物的抗病毒能力(圖4)，同理該系統(tǒng)也能用于中和抗體的評估。

實(shí)施例5visi熒光蛋白的替換

上述實(shí)驗(yàn)中本發(fā)明人選用綠色熒光蛋白(gfp)構(gòu)建visi檢測系統(tǒng)，為滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求，后期又將紅色熒光蛋白(mcherry,235aa,參考genbank:kp238582.1)蛋白序列在第158位分離成的n端(1-158aa)、c端(159-235aa)兩部分，分別替換visi-gfp系統(tǒng)中g(shù)fp的n端和c端，從而構(gòu)建了紅色熒光蛋白(mcherry)的visi系統(tǒng)(visi-mcherry)。感染實(shí)驗(yàn)證明：在hcvns3/4a蛋白存在時，細(xì)胞呈現(xiàn)核紅色(如圖5),顯示出visi-gfp相同的結(jié)果；說明此種hcv感染報告系統(tǒng)修飾方法可以實(shí)現(xiàn)多色可視化。

總結(jié)

體外實(shí)驗(yàn)證明hcv病毒感染即可在細(xì)胞培養(yǎng)報告系統(tǒng)中產(chǎn)生可見熒光,間接免疫熒光(ifa)實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)出現(xiàn)熒光的細(xì)胞存在hcv復(fù)制所需的ns3/4a蛋白。hcv藥物處理后可見明顯的熒光減弱，證明該系統(tǒng)應(yīng)用于抗病毒藥物篩選的適用性。

本發(fā)明人建立了一種新型構(gòu)建hcv感染多色可視化報告系統(tǒng)的細(xì)胞修飾方法，利用該方法構(gòu)建的hcv感染活細(xì)胞報告系統(tǒng)，能靈敏高效地顯示hcv感染的陽性細(xì)胞；其次，藥物抑制實(shí)驗(yàn)證明該方法可用于抗病毒藥物的活性評估和篩選。

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在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。