本發(fā)明涉及使用來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilis,zm-shc)的角鯊烯-藿烯(squalene-hopene)環(huán)化酶或與zm-shc具有至少80％序列同一性的環(huán)化酶來環(huán)化香葉基芳樟醇(geranyllinalool)的新方法，以及在該方法中獲得的環(huán)化產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)闡明了在相應(yīng)的生產(chǎn)生物體中大量單萜的生物合成。通常，線性前體分子被高度特異性的生物催化劑環(huán)化。這些前體通常是直鏈萜醇和二磷酸(diphosphoricacid)的酯。這樣的前體的典型實(shí)例是焦磷酸香葉酯。焦磷酸鹽基團(tuán)從分子中被酶促消除，隨后水解得到兩個(gè)磷酸根離子。另一方面，這產(chǎn)生了碳陽離子，其現(xiàn)在能夠進(jìn)行進(jìn)一步的分子內(nèi)反應(yīng)并重組以產(chǎn)生環(huán)狀單萜，例如消除質(zhì)子(curr.opin.chem.biol.2009,13:180-188)。
眾所周知，非激活三萜烯如角鯊烯或氧鯊烯(oxidosqualene)在體內(nèi)通過角鯊烯-藿烯環(huán)化酶(shc)反應(yīng)，得到相應(yīng)的環(huán)狀化合物(siedenburg,g.和jendrossek,d.,應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)(appliedandenvironmentalmicrobiology),2011,77,(12),3905)。
某些角鯊烯-藿烯環(huán)化酶(shc)的活性并不限于三萜烯。將其公開內(nèi)容完整引入本文的國(guó)際申請(qǐng)pct/ep2011/070304(wo2012066059a2)，描述了角鯊烯-藿烯環(huán)化酶突變體，其催化香茅醛異構(gòu)體環(huán)化成異蒲勒醇異構(gòu)體。
將其公開內(nèi)容完整引入本文的國(guó)際申請(qǐng)pct/ep2010/057696(wo2010139719a2)，提出了角鯊烯-藿烯環(huán)化酶作為用于將homofarnesol環(huán)化成ambroxan的生物催化劑。
來自細(xì)菌運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zm-shc)的角鯊烯-藿烯環(huán)化酶的基因和蛋白質(zhì)序列是已知的(genpeptaccessionnoaav901722004和natbiotechnol2005,23:63-68,參見seqidno.1和2)。
本發(fā)明的目的是提供一種使香葉基芳樟醇環(huán)化的方法。
發(fā)明概述
通過式(i)化合物的生物催化環(huán)化的方法解決了上述問題，
在具有如seqidno.2所示的氨基酸序列或具有與seqidno.2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的環(huán)化酶存在下進(jìn)行。
優(yōu)選地，式(i)化合物在本發(fā)明的方法中反應(yīng)，得到至少一種式(ii)化合物。
本發(fā)明還涉及式(ii)的化合物。
發(fā)明詳述
a.一般定義
為了本發(fā)明的目的，“環(huán)化酶”通常是酶或酶突變體，其具體顯示香葉基芳樟醇環(huán)化酶的活性。香葉基芳樟醇環(huán)化酶的活性是指香葉基芳樟醇(i)的異構(gòu)化的酶活性，其形成至少一個(gè)5或6元環(huán)，具體地講是類似色烯，特別是類似苯并色烯的環(huán)化結(jié)構(gòu)。具有香葉基芳樟醇環(huán)化酶活性的合適的酶是來自異構(gòu)酶亞類的分子內(nèi)轉(zhuǎn)移酶；也就是ec編號(hào)為ec5.4的蛋白質(zhì)(根據(jù)eur.j.biochem.1999,264,610-650的酶代碼)。具體地講，它們采取ec5.4.99.17代表的形式。具體地講，具有香葉基芳樟醇環(huán)化酶活性的合適的酶是還引起homofarnesol環(huán)化成ambroxan，香茅醛異構(gòu)體環(huán)化成異蒲勒醇異構(gòu)體，或角鯊烯環(huán)化成藿烯的那些酶(因此有時(shí)也稱為“shc”角鯊烯-藿烯環(huán)化酶)，并且在國(guó)際申請(qǐng)pct/ep2010/057696和pct/ep2011/070304中有詳細(xì)描述，在此明確地引用這一點(diǎn)。
由于酶反應(yīng)的可逆性，本發(fā)明涉及兩個(gè)反應(yīng)方向的本文所述的酶反應(yīng)。
“環(huán)化酶”的“功能突變體”包括這些酶的“功能等同物”，其在下文中定義。
術(shù)語“生物催化方法”涉及任何“式(i)化合物的生物催化環(huán)化方法”，即在粗制、純化、溶解、分散或固定化酶存在下的方法，或在顯示或表達(dá)香葉基芳樟醇環(huán)化酶活性的微生物的顯示環(huán)化酶細(xì)胞的存在下。因此，生物催化過程包括酶和微生物過程以及發(fā)酵過程。
術(shù)語“立體專一性”是指具有至少一個(gè)不對(duì)稱中心的化合物的幾種可能的立體異構(gòu)體之一，該化合物根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生，是通過本發(fā)明酶的作用在高“對(duì)映體過量”或高“對(duì)映體純度”中產(chǎn)生，例如至少90％ee，具體地講是至少95％ee或至少98％ee或至少99％ee。ee％值由以下公式計(jì)算：
ee％＝[xa-xb]/[xa+xb]*100,
其中xa和xb分別代表對(duì)映異構(gòu)體a和b的摩爾分?jǐn)?shù)。
“第一球體殘基”和“第二球體殘基”是氨基酸殘基，其基于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析被指定與環(huán)化酶的反應(yīng)中心特別接近。第一球體的標(biāo)準(zhǔn)是與已發(fā)表的x射線結(jié)構(gòu)(pdb:1ump)中指定的配位體2-azasqualene的距離。使用計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)確定這些殘基(http://ligin.weizmann.ac.il/cgi-bin/lpccsu/lpccsu.cgi；sobolevv,sorokinea,priluskyj,abolaee,edelmanm.,蛋白質(zhì)中原子間接觸的自動(dòng)分析(automatedanalysisofinteratomiccontactsinproteins)。生物信息學(xué)(automatedanalysisofinteratomiccontactsinproteins.bioinformatics)1999；15(4):327-332.)。當(dāng)它們的原子之間的距離對(duì)應(yīng)于它們的范德華半徑
在標(biāo)準(zhǔn)條件下用式(i)的香葉基芳樟醇，具體地講是e,e-香葉基芳樟醇作為參考底物測(cè)定的“環(huán)化酶活性”是描述環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)物形成的酶活性。
“標(biāo)準(zhǔn)條件”是，例如，底物濃度為10mm至0.2m，具體地講是15至100mm，例如約20至25mm；ph4至8；并且溫度為，例如15至45或20至25℃。它們可以使用重組環(huán)化酶表達(dá)細(xì)胞，破碎的環(huán)化酶表達(dá)細(xì)胞，這些的部分或富集或純化的環(huán)化酶確定。參考基質(zhì)，具體地講是式(i)的香葉基芳樟醇；具體地講是濃度為15至100mm或約20至25mm，在20至25℃和ph6-7，例如6.5的e,e-香葉基芳樟醇；如也在實(shí)施例中更詳細(xì)描述的。
通常還根據(jù)本發(fā)明包括的是本文所述化合物的所有異構(gòu)體形式，例如構(gòu)成異構(gòu)體，具體地講是立體異構(gòu)體和這些的混合物，例如旋光異構(gòu)體或幾何異構(gòu)體，例如e-和z-異構(gòu)體，以及這些的組合。如果分子中存在幾個(gè)不對(duì)稱中心，則本發(fā)明包括這些不對(duì)稱中心的不同構(gòu)象的所有組合，例如對(duì)映異構(gòu)體對(duì)或立體異構(gòu)形式的任何混合物。
b.本發(fā)明的具體發(fā)展
具體地講本發(fā)明涉及以下具體實(shí)施方案：
1.式(ii)的化合物
以純的立體異構(gòu)體形式和作為包含該化合物的至少一種可能的立體異構(gòu)體的混合物。
2.根據(jù)實(shí)施方案1的混合物形式的化合物，其包含式(ii)化合物的多種立體異構(gòu)體。
3.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的化合物，其以立體異構(gòu)體的形式存在。
4.式(i)化合物的生物催化環(huán)化的方法
在環(huán)化酶存在下，其具有如seqidno.2所示的氨基酸序列或具有與seqidno.2至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中至少一種式(i)化合物將在液體中與環(huán)化酶接觸，具體地講是在單相水相或兩相水-有機(jī)反應(yīng)介質(zhì)中，具體地講是在不會(huì)對(duì)所需反應(yīng)產(chǎn)生不利影響的條件下，并且特別是在有利于所需反應(yīng)的條件下。合適的反應(yīng)條件(例如，底物的最佳濃度、酶、ph、任選使用的緩沖液的性質(zhì)、反應(yīng)的溫度和持續(xù)時(shí)間、有機(jī)溶劑)可以在較少的初步測(cè)試的基礎(chǔ)上由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
5.根據(jù)實(shí)施方案4的方法，其中式(i)化合物以兩種對(duì)映異構(gòu)體的混合物的形式使用。
6.根據(jù)實(shí)施方案5的方法，其中混合物是外消旋混合物。
7.根據(jù)實(shí)施方案5的方法，其中混合物中的兩種對(duì)映異構(gòu)體之一以過量存在。
8.根據(jù)實(shí)施方案4至7中任一項(xiàng)的方法，其中使式(i)化合物反應(yīng)得到式(ii)化合物。
9.根據(jù)實(shí)施方案4至8中任一項(xiàng)的方法，其中環(huán)化酶以粗制、純化、溶解、分散或固定化形式存在，或在微生物的環(huán)化酶顯示細(xì)胞的存在下。
10.根據(jù)實(shí)施方案4至9中任一項(xiàng)的方法，其中環(huán)化酶以選自以下的形式存在：
a)游離、任選純化或部分純化的環(huán)化酶；
b)固定化環(huán)化酶；
c)根據(jù)a)或b)從細(xì)胞分離的環(huán)化酶；
d)完整的、任選重組體、細(xì)胞、任選的靜止或破碎的含環(huán)化酶的細(xì)胞；
e)細(xì)胞裂解物或d)所述細(xì)胞的細(xì)胞勻漿。
11.根據(jù)實(shí)施方案4至10中任一項(xiàng)的方法，在重組微生物的存在下，其包含編碼環(huán)化酶的核苷酸序列。
12.根據(jù)實(shí)施方案11的方法，其中核苷酸序列是表達(dá)盒的一部分，并且其中處于至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的控制之下。
13.根據(jù)實(shí)施方案12的方法，其中表達(dá)盒是表達(dá)載體的一部分。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中表達(dá)載體選自質(zhì)粒。
15.根據(jù)實(shí)施方案4至14中任一項(xiàng)的方法，其中微生物選自細(xì)菌、真菌和酵母。
16.根據(jù)實(shí)施方案4至15中任一項(xiàng)的方法，其中微生物選自物種大腸桿菌(escherichiacoli)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、水稻細(xì)菌性谷枯病菌(burkholderiaglumae)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)、鉛青紫鏈霉菌(streptomyceslividans)、天藍(lán)色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilis)。
17.根據(jù)實(shí)施方案4至16中任一項(xiàng)的方法，其中微生物是大腸桿菌(e.coli)。
18.根據(jù)實(shí)施方案4至17中任一項(xiàng)的方法，其中生物催化環(huán)化在單相水相體系中或在兩相體系中進(jìn)行；或在無水體系中，例如在離子流體或深共晶溶劑中。
19.根據(jù)實(shí)施方案4至18中任一項(xiàng)的方法，其中生物催化環(huán)化在20至45℃的溫度和/或4至8的ph范圍內(nèi)進(jìn)行。
c.本發(fā)明的進(jìn)一步發(fā)展
1.本發(fā)明的方法中使用的環(huán)狀酶
本發(fā)明不限于使用本文具體公開的環(huán)化酶的方法，而是還涉及使用具體描述的環(huán)化酶的功能等同物進(jìn)行的方法。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，具體公開的酶和酶突變體(衍生自seqidno.2)的“功能等同物”或類似物是與它們不同的多肽，并且還保留所需的環(huán)化酶活性。
因此，例如，“功能等同物”包括酶和突變體，在用于本發(fā)明目的的“環(huán)化酶活性”的使用試驗(yàn)中(即在標(biāo)準(zhǔn)條件下具有參考底物)，顯示酶的活性至少為1％，具體地講是至少約5％至10％，例如至少10％或至少20％，例如至少50％或75％或90％以上或以下，包括本文具體定義的來自seqidno.2的氨基酸序列。
在本文中功能等同物的活性數(shù)據(jù)除非另有規(guī)定，涉及通過參考底物進(jìn)行的活性測(cè)定，例如在本文定義的“標(biāo)準(zhǔn)條件”下進(jìn)行的活性測(cè)定。
用于本發(fā)明目的的“環(huán)化酶活性”可以借助于使用參考底物，例如香葉基芳樟醇的試驗(yàn)，在如上所述并在實(shí)驗(yàn)部分中說明的標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定。
此外，功能等同物是穩(wěn)定的，例如在ph4至11之間，并且有利地具有在ph5至10范圍內(nèi)的最佳ph，例如具體地講是6.5至9.5或7至8或約7.5，以及具有在15℃至80℃或20℃至70℃范圍內(nèi)的最佳溫度，例如30至60℃或約35至45℃，例如40℃。
上述意義上的“功能等同物”也是所述多肽的“前體”和多肽的“功能衍生物”和“鹽”。
“功能等同物”包括可通過一個(gè)或多個(gè)，例如1至50、2至30、2至15、4至12或5至10個(gè)“突變”獲得的突變體，例如氨基酸添加、取代、缺失和/或反轉(zhuǎn)，其中上述修飾可以發(fā)生在任何序列位置，只要它們導(dǎo)致具有本發(fā)明的性質(zhì)特征的突變體。在質(zhì)量方面，即，例如當(dāng)相同的底物以不同的速率反應(yīng)時(shí)，突變體和未修飾的多肽之間的反應(yīng)性特征一致，功能等同性也尤其顯著。
合適的氨基酸取代的非限制性實(shí)例在下表中匯總：
在本文中“前體”是具有或不具有所需生物活性多肽的天然或合成前體。
術(shù)語“鹽”被理解為不僅意指羧基的鹽，而且意味著環(huán)化酶的氨基的酸加成鹽。羧基的鹽可以以本身已知的方式產(chǎn)生，并且包含無機(jī)鹽，例如鈉、鈣、銨、鐵和鋅鹽，以及與有機(jī)堿的鹽，例如胺類，例如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶等。酸加成鹽也是本發(fā)明的主題，例如與無機(jī)酸的鹽，如鹽酸或硫酸，以及與有機(jī)酸的鹽，如乙酸和草酸。
環(huán)化酶的“功能衍生物”同樣可以借助已知技術(shù)產(chǎn)生，無論是在功能氨基酸側(cè)基上，還是在其n-末端或c-末端。此類衍生物包括例如羧酸基團(tuán)的脂族酯、羧酸基團(tuán)的酰胺，可通過與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)獲得；通過與?；磻?yīng)制備的游離氨基的n-酰基衍生物；或通過與酰基反應(yīng)制備的游離羥基的o-?；苌?。
“功能等同物”自然也包括可從其他生物體獲得的多肽，以及天然存在的變體。例如，可以通過序列比較建立同源序列區(qū)的區(qū)域，并且可以基于本發(fā)明的具體信息來確定的等同的酶。
“功能等同物”同樣包含環(huán)化酶的片段，優(yōu)選單個(gè)結(jié)構(gòu)域或序列基序，其具有例如所需的生物學(xué)功能。
此外，“功能等同物”還具有上述多肽序列或其功能等同物之一的融合蛋白，以及功能性n-或c-末端連接中至少一個(gè)功能上不同的異源序列(即沒有融合蛋白基團(tuán)的相互實(shí)質(zhì)功能障礙)。這種異源序列的非限制性實(shí)例是，例如信號(hào)肽、組氨酸錨或酶。
如果蛋白質(zhì)糖基化是可能的，則環(huán)化酶包含去糖基化或糖基化形式和修飾形式的“功能等同物”，其可通過改變糖基化模式獲得。
可通過誘變產(chǎn)生環(huán)化酶同源物，例如通過點(diǎn)突變、延長(zhǎng)或截短蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的同系物可以通過篩選突變體的組合文庫，例如截短的突變體來鑒定。例如，蛋白質(zhì)變體的多樣化文庫可以通過在核酸水平上的組合誘變產(chǎn)生，例如通過酶連接合成寡核苷酸的混合物。存在可用于從簡(jiǎn)并寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在同系物文庫的多種方法。簡(jiǎn)并基因序列的化學(xué)合成可以在自動(dòng)dna合成儀中進(jìn)行，然后將合成基因連接到合適的表達(dá)載體中。使用簡(jiǎn)并基因的集合使得可以在混合物中提供編碼所需潛在蛋白質(zhì)序列集合的所有序列。合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如narang,s.a.(1983)tetrahedron39:3；itakura等人(1984)annu.rev.biochem.53:323；itakura等人(1984)science198:1056；ike等人(1983)nucleicacidsres.11:477)。
用于篩選由點(diǎn)突變或截短產(chǎn)生的組合文庫的基因產(chǎn)物，以及用于篩選具有選定性質(zhì)的基因產(chǎn)物的cdna文庫的多種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。這些技術(shù)可以適應(yīng)于基因文庫的快速篩選，其通過本發(fā)明的同系物的組合誘變產(chǎn)生。作為高通量分析的基礎(chǔ)，用于篩選大基因文庫的最常用的技術(shù)包括將基因文庫克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用所得的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，并在檢測(cè)條件下表達(dá)組合基因，其中所需活性的檢測(cè)促進(jìn)了編碼已被檢測(cè)的產(chǎn)物基因的載體分離。遞歸綜合誘變(rem)，一種增加文庫中功能突變體頻率的技術(shù)，可以與鑒定同系物的篩選試驗(yàn)結(jié)合使用(arkin和yourvan(1992)pnas89:7811-7815；delgrave等人(1993)，蛋白工程(proteinengineering)6(3):327-331)。
根據(jù)本發(fā)明還包含的“功能等同物”是特定公開蛋白質(zhì)的同系物。它們與特定公開的氨基酸序列之一具有至少60％，優(yōu)選至少75％，具體地講是至少85％，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的同源性(或同一性)，通過pearson和lipman的算法計(jì)算，proc.natl.acad,sci.(usa)85(8),1988,2444-2448。基于本文具體描述的氨基酸序列的總長(zhǎng)度，本發(fā)明的同源多肽以百分比表示的同源性或同一性，具體地講是指氨基酸殘基以百分比表示的同一性。
以百分比表示的同一性數(shù)據(jù)也可以借助于blast比對(duì)、blastp(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)blast)算法或通過應(yīng)用以下指定的clustal設(shè)置來確定。
2.核酸和構(gòu)建體
2.1核酸
本發(fā)明的方法可以在包含編碼環(huán)化酶的核苷酸序列，也就是核酸分子的微生物的存在下進(jìn)行。
本文提及的所有核酸分子(單鏈和雙鏈dna和rna序列，例如cdna和mrna)可以以本身已知的方式從核苷酸構(gòu)建單元通過化學(xué)合成制備，例如，通過雙螺旋的單個(gè)重疊互補(bǔ)核酸構(gòu)建單元的片段縮合。寡核苷酸的化學(xué)合成可以，例如以已知方式通過磷亞酰胺(phosphoamidite)方法進(jìn)行(voet,voet,第二版,wileypressnewyork,第896-897頁)。在sambrook等人(1989),分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress)中，描述了借助于dna聚合酶的klenow片段和連接反應(yīng)以及一般的克隆方法，合成寡核苷酸的附加原件和間隙的填充。
一種區(qū)分編碼環(huán)化酶或其生物活性片段的分離的核酸分子和核苷酸片段，其可用于，例如用作于鑒定或擴(kuò)增編碼環(huán)化酶的核酸的雜交探針或引物。
核酸分子還可以包含編碼基因區(qū)的3'-和/或5'-末端的非翻譯序列。
存在與具體描述的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子或其片段。
核苷酸序列使得可以產(chǎn)生探針和引物，其可用于鑒定和/或克隆在其他類型的細(xì)胞和生物體中的同源序列。這樣的探針或引物通常包含核苷酸序列區(qū)，其在“嚴(yán)格”條件(見下文)下與核酸序列的有義鏈或相應(yīng)的反義鏈的至少約12個(gè)連續(xù)核苷酸雜交，優(yōu)選與至少約25個(gè)連續(xù)核苷酸雜交，例如與約40、50或75個(gè)連續(xù)核苷酸雜交。
從存在于核酸的天然來源的其他核酸分子中分離出“分離的”核酸分子，并且此外如果通過重組技術(shù)制備，或者如果化學(xué)合成中不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)，則“分離的”核酸分子可以基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基。
可以通過分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和提供的序列信息分離核酸分子。例如，可以通過使用具體公開的完整序列之一或其片段作為雜交探針和標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，從合適的cdna文庫中分離(如在sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)。第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港(molecularcloning:alaboratorymanual.2nded.,coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor),ny,1989中所述)。此外，可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來分離包含所公開的序列之一或其片段的核酸分子，其中使用基于該序列產(chǎn)生的寡核苷酸引物。因此擴(kuò)增的核酸可以克隆到合適的載體中，并通過dna序列分析進(jìn)行表征。此外可以通過標(biāo)準(zhǔn)合成方法制備寡核苷酸，例如使用自動(dòng)dna合成儀。
核酸序列或其衍生物，這些序列的同系物或部分可以從其他細(xì)菌中分離，例如使用常規(guī)雜交方法或pcr技術(shù)，例如通過基因組文庫或cdna文庫。這些dna序列在標(biāo)準(zhǔn)條件下與本發(fā)明的序列雜交。
“雜交”被理解為意指聚或寡核苷酸在標(biāo)準(zhǔn)條件下與幾乎互補(bǔ)的序列結(jié)合的能力，而在這些條件下不發(fā)生非互補(bǔ)配偶體之間的非特異性結(jié)合。為此，序列可以為90-100％互補(bǔ)。利用能夠彼此特異性結(jié)合的互補(bǔ)序列的性質(zhì)，例如在northern或southern印跡技術(shù)中，或在pcr或rt-pcr的引物結(jié)合中。
對(duì)于雜交，使用保守區(qū)域的短寡核苷酸是有利的。然而，本發(fā)明的核酸的較長(zhǎng)片段或完整序列也可用于雜交。根據(jù)所使用的核酸(寡核苷酸、更長(zhǎng)的片段或完整序列)，或根據(jù)其核酸的類型、dna或rna用于雜交，這些標(biāo)準(zhǔn)條件是不同的。因此，例如dna:dna雜交體的解鏈溫度比相同長(zhǎng)度的dna:rna雜交體低約10℃。
根據(jù)核酸，標(biāo)準(zhǔn)條件被理解為，例如在溫度為42至58℃，濃度為0.1至5×ssc(1×ssc＝0.15mnacl,15mm檸檬酸鈉，ph7.2)的含水緩沖溶液中，或另外在50％甲酰胺存在下，例如在42℃、5×ssc、50％甲酰胺中。有利地，dna:dna雜交體的雜交條件為0.1×ssc，并且溫度為約20℃至45℃之間，優(yōu)選為約30℃至45℃之間。對(duì)于dna:rna雜交體，有利地雜交條件為0.1×ssc，并且溫度為約30℃至55℃之間，優(yōu)選為約45℃至55℃之間。雜交的這些規(guī)定的溫度是在不存在甲酰胺的情況下，以長(zhǎng)度為約100個(gè)核苷酸且g+c含量為50％的核酸計(jì)算的解鏈溫度值的實(shí)例。在遺傳學(xué)的相關(guān)教科書中描述了關(guān)于dna雜交的實(shí)驗(yàn)條件，例如sambrook等人，“分子克隆”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室("molecularcloning",coldspringharborlaboratory),1989，并且可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的公式計(jì)算，例如作為核酸的長(zhǎng)度、雜交的類型或g+c含量的函數(shù)。關(guān)于雜交的進(jìn)一步信息可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員從以下教科書中獲得：ausubel等人(編著),1985,當(dāng)代分子生物學(xué)方法(currentprotocolsinmolecularbiology),johnwiley&sons,newyork；hames和higgins(編著),1985,核酸雜交：實(shí)用方法(nucleicacidshybridization：apracticalapproach),irlpressatoxforduniversitypress,oxford；brown(編著),1991,基礎(chǔ)分子生物學(xué)：實(shí)踐方法(essentialmolecularbiology：apracticalapproach),irl牛津大學(xué)出版社出版,牛津。
具體地講“雜交”可能在嚴(yán)格條件下發(fā)生。這樣的雜交條件，例如描述于sambrook,j.,fritsch,e.f.,maniatis,t.,分子克隆(實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,第9.31-9.57頁中或在當(dāng)代分子生物學(xué)方法(currentprotocolsinmolecularbiology),johnwiley&sons,n.y.(1989),6.3.1-6.3.6中。
具體地講是將“嚴(yán)格”雜交條件表示為：42℃下，在由50％甲酰胺、5×ssc(750mmnacl,75mm檸檬酸三鈉)、50mm磷酸鈉(ph7.6)、5×denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性剪切的鮭魚精子dna組成的溶液中孵育過夜，隨后的步驟在65℃用0.1×ssc洗滌濾器。
核苷酸序列可以與啟動(dòng)子融合。排列在指定核苷酸序列上游的啟動(dòng)子可以通過至少一個(gè)核苷酸取代、至少一個(gè)插入、倒位和/或缺失而改變，但不會(huì)對(duì)啟動(dòng)子的功能/活性產(chǎn)生不利影響。此外，可通過修飾其序列來增強(qiáng)啟動(dòng)子的功效，或者可以完全交換啟動(dòng)子用于更有效的啟動(dòng)子，也可以來自外來生物體。
兩個(gè)核酸之間的“同一性”理解為意指在每種情況下核酸的整個(gè)長(zhǎng)度的核苷酸同一性，具體地講是通過與來自informax(usa)的vectorntisuite7.1軟件的幫助進(jìn)行比較，使用clustal方法計(jì)算的同一性(higginsdg,sharppm.微計(jì)算機(jī)上快速靈敏的多序列比對(duì)(fastandsensitiveandsequencemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer).computapplbiosci.1989年4月；5(2):151-1)，設(shè)置以下參數(shù)：
多重比對(duì)參數(shù)：
成對(duì)比對(duì)參數(shù)：
作為替代，同一性也可以根據(jù)chenna,ramu,sugawara,hideaki,koike,tadashi,lopez,rodrigo,gibson,tobyj,higgins,desmondg,thompson,julied。與clustal系列程序的多重序列比對(duì)(multiplesequencealignmentwiththeclustalseriesofprograms).(2003)nucleicacidsres31(13):3497-500，根據(jù)網(wǎng)址http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw/index.html#并使用以下參數(shù)：
2.2功能突變體的產(chǎn)生
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉產(chǎn)生功能突變體的方法，也就是說編碼與seqidno.2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的環(huán)化酶的核苷酸序列。
根據(jù)所使用的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將完全隨機(jī)的突變或更為定向的突變引入到基因或其他非編碼核酸區(qū)(其例如對(duì)于調(diào)節(jié)表達(dá)是重要的)中，并隨后產(chǎn)生遺傳文庫。為此目的所需的分子生物學(xué)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如在sambrook和russell,分子克隆。第3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(molecularcloning.3rdedition,coldspringharborlaboratorypress)2001中所述。
用于修飾基因并因此修飾它們編碼的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員長(zhǎng)期已知的，例如
-位點(diǎn)特異性誘變，其中基因的單個(gè)或幾個(gè)核苷酸以定向的方式被替換(trowermk(ed.)1996；體外誘變方案(invitromutagenesisprotocols).humanapress,newjersey)，
-飽和誘變，其中任何氨基酸的密碼子可以在基因的任何點(diǎn)交換或添加(kegler-ebodm,docktorcm,dimaiod(1994)nucleicacidsres22:1593；barettinod,feigenbutzm,valcárelr,stunnenberghg(1994)nucleicacidsres22:541；bariks(1995)molbiotechnol3:1)，
-易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)，其中核苷酸序列由易錯(cuò)dna聚合酶突變(eckertka,kunkelta(1990)nucleicacidsres18:3739)；
-sesam方法(序列飽和方法)，其中優(yōu)選的交換被聚合酶阻止。schenk等人,biospektrum,第3卷,2006,277-279
-突變株中基因的傳代，其中例如由于dna修復(fù)機(jī)制缺陷，核苷酸序列的突變率增加(greenera,callahanm,jerpsethb(1996)使用大腸桿菌變異體菌株的有效隨機(jī)誘變技術(shù)(anefficientrandommutagenesistechniqueusingae.colimutatorstrain)。在trowermk(ed.)體外誘變方案(invitromutagenesisprotocols).humanapress,newjersey)中，或
-dna改組，其中形成和消化了密切相關(guān)的基因庫，并且將該片段用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板，其中通過重復(fù)的鏈分離和重新連接，最終產(chǎn)生全長(zhǎng)嵌合基因(stemmerwpc(1994)nature370:389；stemmerwpc(1994)procnatlacadsciusa91:10747)。
使用所謂的定向進(jìn)化(特別是在reetzmt和jaegerk-e(1999),topicscurrchem200:31；zhaoh,moorejc,volkovaa,arnoldfh(1999),通過定向進(jìn)化優(yōu)化工業(yè)酶的方法(methodsforoptimizationindustrialenzymesbydirectedevolution)描述中，在demainal,daviesje(ed.)工業(yè)微生物學(xué)和生物技術(shù)手冊(cè)。美國(guó)微生物學(xué)會(huì)(manualofindustrialmicrobiologyandbiotechnology.americansocietyformicrobiology))中，技術(shù)人員可以以定向性的方式大規(guī)模生產(chǎn)功能性突變體。為此，在第一步中，首先制備各蛋白質(zhì)的基因文庫，例如使用上述給出的方法。基因文庫以合適的方式表達(dá)，例如細(xì)菌或噬菌體展示系統(tǒng)。
表達(dá)功能突變體的宿主生物體的相關(guān)基因，具有與所需性質(zhì)大致相符的性質(zhì)，可以進(jìn)行另一個(gè)突變周期?？梢缘刂貜?fù)突變和選擇或篩選的步驟，直到本發(fā)明的功能突變體具有足夠的所需性質(zhì)。使用這種迭代程序，可以分階段進(jìn)行有限數(shù)量的突變，例如1、2、3、4或5個(gè)突變，并對(duì)所討論的其對(duì)酶性質(zhì)的影響進(jìn)行評(píng)估和選擇。然后可以以相同的方式將選定的突變體進(jìn)行進(jìn)一步的突變步驟。以這種方式，可以顯著降低待研究的各個(gè)突變體的數(shù)量。
本發(fā)明的結(jié)果還提供了與相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)和序列相關(guān)的重要信息，其是以目標(biāo)方式產(chǎn)生具有所需修飾特性的其他酶所必需的。具體地講，可以定義所謂的“熱點(diǎn)”，即潛在地適用于通過引入靶向突變來修飾酶性質(zhì)的序列片段。
關(guān)于氨基酸序列位置的信息，也可以在應(yīng)該對(duì)酶活性幾乎沒有影響的可以實(shí)現(xiàn)突變的區(qū)域中推導(dǎo)出，并且可以被指定為潛在的“沉默突變”。
2.3構(gòu)建體
在本發(fā)明的方法中，核苷酸序列可以是表達(dá)盒的一部分。同義使用術(shù)語表達(dá)盒和表達(dá)構(gòu)建體。優(yōu)選重組表達(dá)構(gòu)建體含有編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列，并且其在調(diào)控核酸序列的遺傳控制下。
在本發(fā)明的方法中，表達(dá)盒可以是表達(dá)載體的一部分，具體地講是重組表達(dá)載體的一部分。
“表達(dá)單位”被理解為根據(jù)本發(fā)明具有表達(dá)活性的核酸，其包含如本文所定義的啟動(dòng)子，并且在與待表達(dá)的核酸或基因功能連接之后調(diào)節(jié)表達(dá)，即調(diào)節(jié)所述核酸或所述基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。因此在這方面也被稱為“調(diào)節(jié)性核酸序列”。除了啟動(dòng)子之外，還可以存在其他調(diào)節(jié)元件，例如增強(qiáng)子。
根據(jù)本發(fā)明，“表達(dá)盒”或“表達(dá)構(gòu)建體”被理解為與待表達(dá)的核酸或待表達(dá)的基因功能性連接的表達(dá)單元。因此與表達(dá)單位相比，表達(dá)盒不僅包含調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的核酸序列，還包含作為轉(zhuǎn)錄和翻譯結(jié)果表達(dá)為蛋白質(zhì)的核酸序列。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“表達(dá)”或“過表達(dá)”描述了在微生物中，由相應(yīng)dna編碼的一種或多種酶的細(xì)胞內(nèi)活性的產(chǎn)生或增加。為此，例如可以將基因引入到生物體中，用另一個(gè)基因替換現(xiàn)有基因，增加基因的拷貝數(shù)，使用強(qiáng)啟動(dòng)子或使用編碼具有相應(yīng)高活性酶的基因；可選地，可以組合這些措施。
優(yōu)選地，本發(fā)明的這種構(gòu)建體包含在每種情況下與編碼序列有效連接的，相應(yīng)編碼序列5’-上游的啟動(dòng)子，3’-下游的終止子序列和任選的其他通常的調(diào)節(jié)元件。
根據(jù)本發(fā)明，“啟動(dòng)子”，“具有啟動(dòng)子活性的核酸”或“啟動(dòng)子序列”被理解為，當(dāng)與要轉(zhuǎn)錄的核酸功能性連接時(shí)調(diào)節(jié)所述核酸的轉(zhuǎn)錄。
在此上下文中，“功能”或“有效”連接被理解為，例如具有啟動(dòng)子活性的核酸之一與要轉(zhuǎn)錄的核酸序列和任何其他調(diào)節(jié)元件，例如確保核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列，例如終止子的順序排列，以這樣的方式每個(gè)調(diào)控元件可以在核酸序列轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)揮其功能。這不一定需要在化學(xué)意義上的直接連接。遺傳控制序列，例如增強(qiáng)子序列，甚至可以從更遠(yuǎn)的位置，或甚至從其他dna分子發(fā)揮其在靶序列上的功能。優(yōu)選的排列是其中待轉(zhuǎn)錄的核酸序列位于啟動(dòng)子序列之后(即在啟動(dòng)子序列的3'端)，使得兩個(gè)序列共價(jià)連接在一起。啟動(dòng)子序列與重組表達(dá)的核酸序列之間的距離可以小于200個(gè)堿基對(duì)，或小于100個(gè)堿基對(duì)或小于50個(gè)堿基對(duì)。
除了啟動(dòng)子和終止子之外，可以提及以下作為其他調(diào)控元件的實(shí)例：靶向序列、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、選擇性標(biāo)記、擴(kuò)增信號(hào)、復(fù)制起點(diǎn)等等。合適的調(diào)節(jié)序列描述于，例如goeddel,基因表達(dá)技術(shù)：酶學(xué)方法185(geneexpressiontechnology：methodsinenzymology185),academicpress,sandiego,ca(1990)中。
具體地講，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體包含編碼環(huán)化酶的序列，例如衍生自seqidno.1的核酸序列，或編碼根據(jù)seqidno.2的環(huán)化酶或其衍生物和同系物的核酸序列，以及可以從這些序列衍生的核酸序列，并且其已經(jīng)與一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)信號(hào)有效地或功能性連接，有利地用于控制，例如增加基因表達(dá)。
除了這些調(diào)節(jié)序列之外，這些序列的天然調(diào)節(jié)可能仍然存在于實(shí)際的結(jié)構(gòu)基因之前，并且任選地可以被遺傳修飾，使得自然調(diào)節(jié)已被關(guān)閉并且基因的表達(dá)已被增強(qiáng)。然而，核酸構(gòu)建體也可以是更簡(jiǎn)單的構(gòu)建，即在編碼序列和天然啟動(dòng)子之前沒有其他調(diào)節(jié)信號(hào)已被插入，并且其調(diào)控尚未被去除。相反，自然調(diào)節(jié)序列被突變，使得調(diào)節(jié)不再發(fā)生并且基因表達(dá)增加。
優(yōu)選的核酸構(gòu)建體有利地還包含一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)提及的與啟動(dòng)子功能性連接的“增強(qiáng)子”序列，該序列使核酸序列增強(qiáng)的表達(dá)成為可能。還可以在dna序列的3'-末端插入另外的有利序列，例如其他調(diào)控元件或終止子。本發(fā)明的核酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝可以存在于構(gòu)建體中。在構(gòu)建體中，也可任選地存在其他標(biāo)記，例如補(bǔ)體營(yíng)養(yǎng)缺陷型或抗生素抗性的基因，以便選擇構(gòu)建體。
合適的調(diào)節(jié)序列的實(shí)例存在于啟動(dòng)子中，如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laciq、t7、t5、t3、gal、trc、ara、rhap(rhapbad)sp6、λ-pr或λ-pl啟動(dòng)子，并且它們有利地用于革蘭氏陰性細(xì)菌中。其他有利的調(diào)節(jié)序列存在于例如革蘭氏陽性啟動(dòng)子amy和spo2中，酵母或真菌中的啟動(dòng)子adc1、mfalpha、ac、p-60、cyc1、gapdh、tef、rp28、adh中。人造啟動(dòng)子也可用于調(diào)節(jié)。
為了在宿主生物體中表達(dá)，將核酸構(gòu)建體有利地插入載體中，例如質(zhì)粒或噬菌體，這使得宿主中的基因表達(dá)最佳。載體也被理解為除了質(zhì)粒和噬菌體之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有其他載體，也就是說例如病毒如sv40、cmv、桿狀病毒和腺病毒、轉(zhuǎn)座子、is元件、質(zhì)粒、粘粒和線性或環(huán)狀dna。這些載體能夠在宿主生物體中自主復(fù)制或者其他在染色體上復(fù)制。這些載體是本發(fā)明的進(jìn)一步發(fā)展。
合適的質(zhì)粒是，例如在大腸桿菌中的plg338、pacyc184、pbr322、puc18、puc19、pkc30、prep4、phs1、pkk223-3、pdhe19.2、phs2、pplc236、pmbl24、plg200、pur290、pin-iii113-b1、λgt11或pbdci，在鏈霉菌屬(streptomyces)中的pij101、pij364、pij702或pij361中，在芽孢桿菌屬(bacillus)中的pub110、pc194或pbd214，在棒狀桿菌屬(corynebacterium)中的psa77或paj667，在真菌中的pals1、pil2或pbb116，在酵母中的2αm、pag-1、yep6、yep13或pemblye23，或在植物中的plgv23、pghlac+、pbin19、pak2004或pdh51。上述質(zhì)粒是可能的質(zhì)粒的小部分選擇。另外的質(zhì)粒是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如可以在書籍，克隆載體(cloningvectors)(pouwelsp.h.等人編著，elsevier,amsterdam-newyork-oxford,1985,isbn0444904018)中找到。
在載體的進(jìn)一步發(fā)展中，包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的核酸，也可以有利地以線性dna的形式引入到微生物中，并通過異源或同源重組整合到宿主生物體的基因組中。該線性dna可以由線性化的載體組成，諸如質(zhì)?；蚧騼H本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或核酸。
為了在生物體中最佳表達(dá)異源基因，修飾核酸序列以匹配生物體中使用的特定“密碼子選擇”是有利的?！懊艽a子選擇”可以通過對(duì)所討論的生物體的其他已知基因的計(jì)算機(jī)評(píng)估來容易地確定。
通過將合適的啟動(dòng)子融合到合適的編碼核苷酸序列和終止子或聚腺苷酸化信號(hào)，來產(chǎn)生本發(fā)明的表達(dá)盒。常規(guī)重組和克隆技術(shù)用于此目的，如描述于，例如t.maniatis,effritsch和j.sambrook,分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港(molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor),ny(1989)中和在tjsilhavy,m.l.berman和l.w.enquist,基因融合實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港(experimentswithgenefusions,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor),ny(1984)中和在ausubel,f.m.等人,當(dāng)代分子生物學(xué)方法(currentprotocolsinmolecularbiology),greenepublishingassoc.和wileyinterscience(1987)中。
為了在合適的宿主生物體中表達(dá)，有利地將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體插入到宿主特異性載體中，其使宿主中基因的最佳表達(dá)成為可能。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如可以在“克隆載體(cloningvectors)”(pouwelsp.h.等人編著,elsevier,amsterdam-newyork-oxford,1985)中找到。
3.微生物
根據(jù)上下文，術(shù)語“微生物”可以指野生型微生物或遺傳修飾的重組微生物，或這兩者。
借助于本發(fā)明的載體，可以產(chǎn)生重組微生物，其例如用至少一種本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化，并可用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。有利地，將上述本發(fā)明的重組構(gòu)建體引入到合適的宿主系統(tǒng)中并在其中表達(dá)。在本文中，優(yōu)選使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)克隆和轉(zhuǎn)染方法，例如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等，以便將上述核酸在所討論的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。合適的系統(tǒng)描述于，例如當(dāng)代分子生物學(xué)方法(currentprotocolsinmolecularbiology),f.ausubel等人編著,wileyinterscience,newyork1997或sambrook等人。分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港(molecularcloning:alaboratorymanual.coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor),ny,1989。
原則上，本發(fā)明的核酸或核酸構(gòu)建體的合適的重組宿主生物體是所有原核生物或真核生物。微生物如細(xì)菌、真菌或酵母有利地用作宿主生物體。有利地，使用革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌，優(yōu)選來自腸桿菌科(enterobacteriaceae)、假單胞菌科(pseudomonadaceae)、根瘤菌科(rhizobiaceae)、鏈霉菌科(streptomycetaceae)或諾卡氏菌科(nocardiaceae)的細(xì)菌，特別優(yōu)選來自埃希氏菌屬(escherichia)、假單胞菌屬(pseudomonas)、鏈霉菌屬(streptomyces)、諾卡氏菌屬(nocardia)、伯克霍爾德氏菌屬(burkholderia)、沙門氏菌屬(salmonella)、農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)、梭菌屬(clostridium)或紅球菌屬(rhodococcus)。非常特別優(yōu)選的屬和物種是大腸桿菌。另外可以在α-變形細(xì)菌綱(alpha-proteobacteria)、β-變形細(xì)菌綱(beta-proteobacteria)或γ-變形桿菌綱(gamma-proteobacteria)中發(fā)現(xiàn)更有利的細(xì)菌。
在本文中，本發(fā)明的宿主生物體優(yōu)選含有本發(fā)明中描述的核酸序列、核酸構(gòu)建體或載體中的至少一種，其編碼具有如上文所定義的苯乙醇脫氫酶活性的酶。
根據(jù)宿主生物體，本發(fā)明的方法使用的生物體以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方式生長(zhǎng)或培養(yǎng)。通常，微生物在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，該液體培養(yǎng)基包含通常為糖形式的碳源，通常為有機(jī)氮源形式的氮源，例如酵母提取物或諸如硫酸銨的鹽，微量元素如鐵鹽、錳鹽、鎂鹽和任選的維生素，在0℃至100℃之間的溫度下，優(yōu)選在10℃至60℃之間，同時(shí)送入氧氣。液體培養(yǎng)基的ph可以保持在固定值，也就是可以或不在培養(yǎng)期間調(diào)節(jié)。培養(yǎng)可以分批、半分批或連續(xù)進(jìn)行?？梢栽诎l(fā)酵開始時(shí)提供營(yíng)養(yǎng)物，或以半連續(xù)或連續(xù)方式補(bǔ)料。
4.本發(fā)明酶的重組生產(chǎn)
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的酶或其功能性生物活性片段的重組生產(chǎn)方法，其中培養(yǎng)產(chǎn)酶微生物，任選地誘導(dǎo)多肽的表達(dá)，并從培養(yǎng)物中分離多肽。如果需要，也可以用這種方式在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)多肽。
因此產(chǎn)生的微生物可以通過分批法或補(bǔ)料分批法或重復(fù)補(bǔ)料分批法連續(xù)或不連續(xù)地培養(yǎng)。已知培養(yǎng)方法的概述可以在chmiel的教科書(bioprozeβtechnik1.einführungindiebioverfahrenstechnik[生物處理技術(shù)1。生物處理技術(shù)導(dǎo)論(bioprocesstechnology1.introductiontobioprocesstechnology)](gustavfischerverlag,stuttgart,1991))或在storhas的教科書(bioreaktorenundperiphereeinrichtungen[生物反應(yīng)器和外圍設(shè)備(bioreactorsandperipheralequipment)](viewegverlag,braunschweig/wiesbaden,1994))中找到。
要使用的培養(yǎng)基必須適當(dāng)?shù)貪M足各菌株的要求。美國(guó)細(xì)菌學(xué)會(huì)(americansocietyforbacteriology)在手冊(cè)“一般細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)(manualofmethodsforgeneralbacteriology)”(washingtond.c.,usa,1981)中給出了各種微生物培養(yǎng)基的描述。
根據(jù)本發(fā)明可以使用的這些培養(yǎng)基通常包含一種或多種碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素和/或微量元素。
優(yōu)選的碳源是糖，例如單糖、二糖或多糖。非常好的碳源是，例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。還可以通過復(fù)合化合物，例如糖蜜或糖精煉的其他副產(chǎn)物將糖加入到培養(yǎng)基中。添加不同碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子脂肪，脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸或亞油酸，醇例如甘油、甲醇或乙醇，和有機(jī)酸例如乙酸或乳酸。
氮源通常是有機(jī)或無機(jī)氮化合物或包含這些化合物的材料。氮源的實(shí)例包括氨氣或銨鹽，例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨、硝酸鹽、尿素、氨基酸或復(fù)合氮源，例如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等。氮源可以單獨(dú)使用或作為混合物使用。
可存在于培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、磷酸鹽或硫酸鹽。
可以使用無機(jī)含硫化合物，例如硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、連四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物以及有機(jī)硫化合物，如硫醇作為硫源。
可以使用磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的含鈉鹽作為磷源。
為了將金屬離子保持在溶液中，螯合劑可以加入到培養(yǎng)基中。特別合適的螯合劑包括二羥基苯酚，如鄰苯二酚或原兒茶酸，或有機(jī)酸，如檸檬酸。
根據(jù)本發(fā)明使用的發(fā)酵培養(yǎng)基通常還包含其他生長(zhǎng)因子如維生素或生長(zhǎng)促進(jìn)劑，其包含例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸鹽(panthothenate)和吡哆醇。生長(zhǎng)因子和鹽通常來自復(fù)合培養(yǎng)基的組分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等。此外，可以將合適的前體加入到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中化合物的確切組成在很大程度上取決于相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，并且分別針對(duì)每個(gè)具體情況而定。關(guān)于培養(yǎng)基優(yōu)化的信息可以在教科書“應(yīng)用微生物。生理學(xué)，實(shí)踐方法(appliedmicrobiol.physiology,apracticalapproach)”(p.m.rodes編著,p.f.standbury,irlpress(1997)，第53-73頁,isbn0199635773)中找到。還可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得生長(zhǎng)培養(yǎng)基，例如標(biāo)準(zhǔn)1(merck)或bhi(腦心臟浸液，difco)等。
所有培養(yǎng)基組分均通過加熱(1.5巴和121℃20分鐘)滅菌或通過過濾滅菌。如果需要，組分可以一起滅菌或分開滅菌。所有培養(yǎng)基組分可以在培養(yǎng)開始時(shí)存在，或者可以連續(xù)加入或分批加入。
培養(yǎng)溫度通常在15℃至45℃之間，優(yōu)選25℃至40℃，并且可以在實(shí)驗(yàn)期間變化或保持恒定。培養(yǎng)基的ph應(yīng)在5至8.5的范圍內(nèi)，優(yōu)選約7.0。通過添加堿性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，可以在生長(zhǎng)過程中控制生長(zhǎng)的ph。消泡劑，例如脂肪酸聚乙二醇酯，可用于控制發(fā)泡。為了保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以向培養(yǎng)基中加入合適的選擇性作用物質(zhì)，例如抗生素。為了維持好氧條件，將氧或含氧氣體混合物，例如環(huán)境空氣送入到培養(yǎng)物中。培養(yǎng)物的溫度通常在20℃至45℃的范圍內(nèi)。繼續(xù)培養(yǎng)直到形成所需產(chǎn)物的最大值。該目標(biāo)通常在10小時(shí)至160小時(shí)內(nèi)達(dá)到。
隨后進(jìn)一步處理發(fā)酵液。根據(jù)要求，通過分離技術(shù)，例如離心、過濾、傾析或這些方法的組合，生物質(zhì)可以完全或部分地從發(fā)酵液中除去，或者可以完全留在發(fā)酵液中。
如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，也可以裂解細(xì)胞，并且可以通過已知的蛋白質(zhì)分離方法從裂解物獲得產(chǎn)物。細(xì)胞可以任選地通過高頻超聲、高壓(例如在費(fèi)氏壓碎器中)、通過滲透、通過洗滌劑、溶解酶或有機(jī)溶劑的作用，通過均化器或通過上述幾種方法的組合破碎。
多肽可以通過已知的層析技術(shù)純化，例如分子篩層析(凝膠過濾)，例如q-瓊脂糖層析、離子交換層析和疏水層析，以及其他常規(guī)技術(shù)如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析和天然凝膠電泳。合適的方法描述于，例如cooper,t.g.,biochemischearbeitsmethoden[生化方法(biochemicalprocesses)],verlagwalterdegruyter,berlin,newyork中，或在scopes,r.,蛋白質(zhì)純化(proteinpurification),springerverlag,newyork,heidelberg,berlin中。
為了分離重組蛋白，使用載體系統(tǒng)或寡核苷酸可能是有利的，其通過限定的核苷酸序列延伸cdna并因此編碼修飾的多肽或融合蛋白，其例如用于更容易的純化。這種類型的合適修飾是，例如用作錨的所謂“標(biāo)簽”，例如稱為六組氨酸錨的修飾，或可被認(rèn)為是抗體抗原的表位(例如，描述于harlow,e.andlane,d.,1988,抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。冷泉港(紐約)出版社。(antibodies:alaboratorymanual.coldspringharbor(n.y.)press)中)。這些錨可以用于將蛋白質(zhì)連接到固體載體上，例如聚合物基質(zhì)，其可以例如在層析柱中用作填充物，或可以用于微量滴定板或其他載體上。
同時(shí)，這些錨也可以用于蛋白質(zhì)的識(shí)別。為了識(shí)別蛋白質(zhì)，還可以使用通常的標(biāo)記物，例如熒光染料、酶標(biāo)記物，其在與底物反應(yīng)之后形成可檢測(cè)的反應(yīng)產(chǎn)物，或放射性標(biāo)記物，單獨(dú)的或與錨組合使用用于衍生化蛋白質(zhì)。
類似地，這種表達(dá)環(huán)化酶的微生物也可用于式ii化合物的發(fā)酵生產(chǎn)，其中式i化合物另外加入到培養(yǎng)基中作為底物，并且培養(yǎng)微生物，并且將有價(jià)值的產(chǎn)物任選地與發(fā)酵液分離。此外，式(i)化合物也可以由微生物自主產(chǎn)生，因?yàn)樵撐⑸锞哂杏糜趶暮?jiǎn)單前體合成(i)的相應(yīng)的生物化學(xué)裝備。
6.酶固定化
根據(jù)本發(fā)明使用的酶可以在本文所述的方法中以游離或固定形式使用。固定化酶是固定在惰性載體上的酶。合適的載體材料和固定在其上的酶從ep-a-1149849、ep-a-1069183和de-os-100193773以及其中引用的參考文獻(xiàn)中已知。在這方面，這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。合適的載體材料包括例如粘土、粘土礦物如高嶺土、硅藻土、珍珠巖、二氧化硅、氧化鋁、碳酸鈉、碳酸鈣、纖維素粉末、陰離子交換材料，合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸樹脂、苯酚/甲醛樹脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烴，如聚乙烯和聚丙烯。為了制備支持的酶，載體材料通常使用細(xì)碎的顆粒形式，優(yōu)選多孔形式。載體材料的粒徑通常不大于5mm，具體地講是不超過2mm(粒徑分布曲線)。類似地，當(dāng)使用脫氫酶作為全細(xì)胞催化劑時(shí)，可以選擇游離或固定的形式。載體材料是例如藻酸鈣和角叉菜膠。酶和細(xì)胞也可以直接與戊二醛交聯(lián)(與clea交聯(lián))。相應(yīng)的和其他的固定化技術(shù)描述于，例如在j.lalonde和a.mololin“酶的固定化(immobilizationofenzymes)”中，在k.drauzandh.waldmann,在有機(jī)合成中的酶催化(enzymecatalysisinorganicsynthesis)2002,第iii卷,991-1032,wiley-vch,weinheim中。關(guān)于用于實(shí)施本發(fā)明的方法的生物轉(zhuǎn)化和生物反應(yīng)器的進(jìn)一步信息也可以在，例如rehm等人(編著)生物技術(shù)(biotechology),第二版，第3卷,第17章,vch,weinheim中給出。
6.香葉基芳樟醇的酶環(huán)化
本發(fā)明的環(huán)化方法具體地講是在酶的存在下進(jìn)行，其中酶由根據(jù)seqidno.1的核酸序列或其功能等同物編碼，其中核酸序列是基因構(gòu)建體或載體的成分。這些基因構(gòu)建體或載體在國(guó)際申請(qǐng)pct/ep2010/057696第16至20頁中有詳細(xì)描述，在此明確引用。
宿主細(xì)胞含有基因構(gòu)建體或載體，其中存在編碼具有所需活性的酶的核酸序列，該宿主細(xì)胞也被稱為轉(zhuǎn)基因生物體。原則上已知這種轉(zhuǎn)基因生物的產(chǎn)生，例如在國(guó)際申請(qǐng)pct/ep2010/57696第20頁中進(jìn)行了討論，在此也明確引用。
選自包含細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、真菌和酵母的細(xì)胞優(yōu)選作為轉(zhuǎn)基因生物體。細(xì)胞優(yōu)選選自畢赤酵母屬的真菌或埃希氏桿菌屬、棒狀桿菌屬、拉氏菌屬(ralstonia)、梭菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、發(fā)酵單胞菌屬(zymomonas)、紅細(xì)菌屬(rhodobacter)、鏈霉菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、乳桿菌屬(lactobacillus)或乳球菌屬(lactococcus)的細(xì)菌。細(xì)胞特別優(yōu)選選自大腸桿菌、惡臭假單胞菌、水稻細(xì)菌性谷枯病菌、鉛青紫鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的細(xì)菌。
優(yōu)選本發(fā)明的方法，其特征在于具有環(huán)化酶活性的酶由從選自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的微生物中分離的基因編碼。
此外還優(yōu)選本發(fā)明的方法，其特征在于具有環(huán)化酶活性的酶是由過量產(chǎn)生酶的微生物產(chǎn)生的，并且該微生物選自包含埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、拉氏菌屬、梭菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、紅細(xì)菌屬、鏈霉菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、乳桿菌屬和乳球菌屬的微生物。
具體提及本發(fā)明的方法，其特征在于具有環(huán)化酶活性的酶已經(jīng)由大腸桿菌、惡臭假單胞菌、水稻細(xì)菌性谷枯病菌、谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母、鉛青紫鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、枯草芽孢桿菌或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的轉(zhuǎn)基因微生物產(chǎn)生，其過度產(chǎn)生具有環(huán)化酶活性的酶。
本發(fā)明的方法的特征在于酶以下列形式中的至少一種存在：
a)游離、任選純化或部分純化的多肽；
b)固定化多肽；
c)按照a)或b)，從細(xì)胞分離的多肽；
d)完整細(xì)胞，任選包含至少一種此類多肽的靜止或生長(zhǎng)細(xì)胞；
e)在d)下描述的細(xì)胞的裂解物或勻漿。
本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案的特征在于細(xì)胞是微生物，優(yōu)選細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因微生物，其表達(dá)至少一種編碼具有環(huán)化酶活性的多肽的異源核酸分子。
本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案至少包括以下步驟a)、b)和d)：
a)分離或產(chǎn)生重組微生物，其從天然來源生產(chǎn)具有環(huán)化酶活性的酶，
b)使該微生物繁殖，
c)任選地從微生物中分離具有環(huán)化酶活性的酶或制備包含該酶的蛋白質(zhì)組分，并且
d)將步驟b)的微生物或步驟c)的酶轉(zhuǎn)移到包含通式(i)的底物的培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明的方法中，使底物與介質(zhì)中的環(huán)化酶接觸和/或溫育，使得底物在酶的存在下反應(yīng)。介質(zhì)優(yōu)選為水性反應(yīng)介質(zhì)。
進(jìn)行本發(fā)明的方法的水性反應(yīng)介質(zhì)的ph優(yōu)選有利地保持在ph4和12之間，優(yōu)選在ph4.5和9之間，特別優(yōu)選在ph5和8之間。
水性反應(yīng)介質(zhì)優(yōu)選為緩沖溶液，其通常具有優(yōu)選5至8的ph?？梢允褂玫木彌_液可以是檸檬酸鹽、磷酸鹽、tris(三(羥甲基)氨基甲烷)或mes緩沖液(2-(n-嗎啉代)乙磺酸)。反應(yīng)介質(zhì)還可以包含另外的添加劑，例如洗滌劑(例如?；敲撗跄懰猁})。
底物優(yōu)選以2-200mm，特別優(yōu)選5-25mm的濃度引入到酶環(huán)境中，并且可以連續(xù)或分批地重新供給。
通常，酶的環(huán)化發(fā)生在低于所用酶的失活溫度和高于-10℃的反應(yīng)溫度下。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法在0℃至95℃之間的溫度下進(jìn)行，特別優(yōu)選在15℃至60℃之間的溫度下進(jìn)行，具體地講是20至45℃的溫度下進(jìn)行，例如在約25至30℃的溫度下進(jìn)行。
特別優(yōu)選的是本發(fā)明的方法，其中反應(yīng)在20至40℃的溫度范圍內(nèi)和/或4至8的ph范圍內(nèi)進(jìn)行。
除了這些單相水系統(tǒng)之外，在本發(fā)明的另一變型中，也使用兩相系統(tǒng)。這里，和水相一樣，使用有機(jī)非水溶性反應(yīng)介質(zhì)作為第二相。結(jié)果，反應(yīng)產(chǎn)物在有機(jī)相中積聚。反應(yīng)后，有機(jī)相中的產(chǎn)物可以容易地從包含生物催化劑的水相中分離出來。
反應(yīng)產(chǎn)物可以使用有機(jī)溶劑萃取和任選地蒸餾純化。
合適的有機(jī)溶劑的實(shí)例是優(yōu)選具有5-8個(gè)碳原子的脂肪烴，例如戊烷、環(huán)戊烷、己烷、環(huán)己烷、庚烷、辛烷或環(huán)辛烷，優(yōu)選具有一個(gè)或兩個(gè)碳原子的鹵代脂肪烴，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷，芳香烴如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯，優(yōu)選具有4-8個(gè)碳原子的脂肪族無環(huán)和環(huán)醚或醇，如乙醇、異丙醇、乙醚、甲基叔丁醚、乙基叔丁醚、二丙醚、二異丙醚、二丁醚、四氫呋喃，或酯如乙酸乙酯或乙酸正丁酯，或酮如甲基異丁基酮或二噁烷，或它們的混合物。特別優(yōu)選使用上述庚烷、甲基叔丁基醚、二異丙基醚、四氫呋喃、乙酸乙酯。
根據(jù)本發(fā)明使用的環(huán)化物可以按照本發(fā)明的方法用作游離或固定化酶，如上所述。
對(duì)于本發(fā)明的方法，可以使用包含編碼環(huán)化酶的核酸、核酸構(gòu)建體或載體的靜止或生長(zhǎng)、游離或固定的細(xì)胞。還可以使用破碎的細(xì)胞，例如細(xì)胞裂解物或細(xì)胞勻漿。破裂的細(xì)胞被理解為這樣的意思，例如，已經(jīng)通過例如用溶劑處理透化的細(xì)胞，或已經(jīng)通過酶處理，通過機(jī)械處理(例如費(fèi)氏壓碎器或超聲波)或通過其他方法破裂的細(xì)胞。由此獲得的粗提取物有利地適用于本發(fā)明的方法。純化或部分純化的酶也可用于該方法。
如果本發(fā)明的方法使用游離生物體或酶，則它們?cè)谳腿≈坝欣胤蛛x，例如通過過濾或離心。
本發(fā)明的方法可以分批、半分批或連續(xù)操作。
在該方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有環(huán)化酶活性的酶選自包含seqidno.2所示的氨基酸序列或由其衍生的序列的酶，其中高達(dá)25％，優(yōu)選高達(dá)20％，特別優(yōu)選高達(dá)15％，具體地講是高達(dá)10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸殘基已通過刪除、取代、插入或刪除、取代和插入的組合被修飾。在這里，關(guān)于seqidno.2修飾的這些多肽序列仍然可以保留seqidno.2的酶活性的至少50％，優(yōu)選65％，特別優(yōu)選80％，具體地講是大于90％。在本文中，seqidno.2的酶活性被理解為通式(i)化合物的生物催化環(huán)化，得到相應(yīng)的式(ii)化合物的能力。
實(shí)驗(yàn)部分
除非在以下實(shí)施例中給出了具體信息，以下的一般信息將適用。
a.一般信息
所用的所有材料和微生物都是可商購(gòu)的產(chǎn)品。
除非另有說明，重組蛋白質(zhì)通過標(biāo)準(zhǔn)方法克隆并表達(dá)，例如，如sambrook,j.,fritsch,e.f和maniatis,t.,分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港(molecularcloning:alaboratorymanual,2ndedition,coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor),ny,1989所述。
a)細(xì)菌菌株，質(zhì)粒和生長(zhǎng)條件
從合適的2-ml預(yù)培養(yǎng)物接種，將大腸桿菌lu15568在100-ml錐形瓶(擋板)中生長(zhǎng)于20mllythbroth-amp/spec/cm(100μg/l氨芐青霉素；100μg/l壯觀霉素；20μg/l氯霉素)中，在37℃0.1mmiptg，0.5g/l鼠李糖下存在16小時(shí)，并以5000*g離心10分鐘。
b)用香葉基芳樟醇進(jìn)行環(huán)化測(cè)定(標(biāo)準(zhǔn)條件)
將重組大腸桿菌細(xì)胞懸浮于20mmtris-hclph8.0(每g濕細(xì)胞3ml)中。環(huán)化混合物包含250μl細(xì)胞懸浮液，50μl1m檸檬酸鹽緩沖液(ph4.5)，20mm(終濃度)底物和水至500μl。當(dāng)角鯊烯環(huán)化時(shí)，加入1％(v/v)triton-x100。對(duì)于環(huán)化反應(yīng)，將大腸桿菌細(xì)胞(6g潮濕細(xì)胞)懸浮于溶解緩沖液(50mm磷酸鹽,10mmmgcl2(ph6.5；總體積:25ml))中，使用manton-gaulin均化器在1500巴下破碎細(xì)胞。通過離心除去不溶性細(xì)胞碎片(4℃并且7150×g下15分鐘)。
對(duì)于香葉基芳樟醇的反應(yīng)，將1.2mlkpi緩沖液(50mm磷酸鉀,ph6.5；10mmmgcl2)與1ml粗酶提取物(50mmkpi緩沖液中的蛋白質(zhì)含量為39.3mg/ml)和22μl香葉基芳樟醇(來自sigma-aldrich-fluka；訂貨號(hào)48809)，并在裝有磁力攪拌器的10ml螺旋罐中在37℃和300轉(zhuǎn)/分鐘下孵育3或20小時(shí)。
在孵育結(jié)束時(shí)，用5ml正庚烷/1-丙醇(3:2)提取樣品，并通過gc分析。用含有空載體的大腸桿菌細(xì)胞和熱滅活的表達(dá)shc的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照。
c)氣相色譜
儀器：agilent6890系列
柱：optima-1tgid:0.32mm,長(zhǎng)度:10m
(macherey-nagel,düren,德國(guó))
流速：5.1psi(和80℃)下1.0/min
分流：1:50，分流量：50ml/min，
載體：氮
注射器：分流/不分流襯套(restecgmbh,badhomburg,德國(guó)；
siltec失活,4*6.3*78.5mm,玻璃棉)注射器溫度280℃
注射體積：1μl
檢測(cè)器：具有300ml/min空氣,30ml/min氫氣和
30ml/min氮?dú)獾膄id
檢測(cè)器溫度：320℃
溫度程序：
開始：100℃
保持時(shí)間1：0分鐘
t斜坡1：5℃/min
t端1：200℃
保持時(shí)間2：5分鐘
t斜坡2：30℃/min
t端2：320℃
保持時(shí)間3：20分鐘
總時(shí)間：49.0分鐘
數(shù)據(jù)分析：empower-3軟件服務(wù)版本1(watersgmbh,eschborn,德國(guó))
香葉基芳樟醇保留時(shí)間：14.4分鐘
b.實(shí)施例
實(shí)施例1：通過zmo-shc(seqidno.2)使香葉基芳樟醇的環(huán)化
a)程序：
如所述通過生長(zhǎng)和破壞lu15568(參見pct/ep2010/057696(wo2010139719a2))產(chǎn)生重組體zmo-shc。為了檢查該酶制劑，使用homofarnesol作為參考底物重新確定活性。所獲得的活性(用39mg總蛋白3小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化率為63％)在這些條件下迄今獲得的結(jié)果范圍內(nèi)。
香葉基芳樟醇的反應(yīng)如上所述在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行。
在孵育期結(jié)束時(shí)，用5ml正庚烷/1丙醇(3:2)萃取樣品，并通過gc分析。
反應(yīng)方程式：
b)結(jié)果
20小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)酶依賴性峰(保留時(shí)間分別為13.3和13.7分鐘)?；谒玫南闳~基芳樟醇的轉(zhuǎn)化率約為11％。通過gc-ms分析和解釋質(zhì)譜，將苯并色烯衍生物2的兩個(gè)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體歸入兩個(gè)峰。
分別在13.3和13.7分鐘的兩個(gè)峰之間的差異不能被ms闡明。例如，它們可能是化合物2的立體異構(gòu)體。
在沒有添加酶的情況下孵育的陰性對(duì)照中無法檢測(cè)到這些峰。
該結(jié)果表明zmo-shc還能夠環(huán)化香葉基芳樟醇(1)。然而，反應(yīng)中似乎出現(xiàn)至少兩種異構(gòu)體。
c)總結(jié)：
第一次可以通過來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的重組角鯊烯-藿烯環(huán)化酶證明香葉基芳樟醇環(huán)化為三環(huán)乙烯基苯并色烯衍生物。
序列：
seqidno.1：zmo-shc的核酸序列
seqidno.2：zmo-shc的氨基酸序列
明確引用本文中引用的出版物的公開內(nèi)容。