本申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合以文本文件與本申請(qǐng)一起提交的計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，所述序列表名稱(chēng)為“Ticagrelor_SeqList_ST25.TXT”，創(chuàng)建于2014年10月1日，并且大小為33,900字節(jié)。背景替格瑞洛(Ticagrelor，倍林達(dá)TM(BRILINTATM或BRILIQUETM))是一種口服活性的環(huán)戊基三唑嘧啶，一種選擇性和可逆結(jié)合的二磷酸腺苷(ADP)受體拮抗劑。在急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)患者中，90mg每日兩次的替格瑞洛結(jié)合低劑量阿司匹林被批準(zhǔn)用于減少主要心血管(CV)事件。替格瑞洛通過(guò)介導(dǎo)抗血小板作用(P2Y12)和增強(qiáng)的腺苷反應(yīng)(ENT-1)的雙重途徑起作用(卡塔內(nèi)奧M(CattaneoM)等人，2014，美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)雜志(JAmCollCardiol.)63(23):2503-9)。雖然適應(yīng)癥尚未批準(zhǔn)，正在進(jìn)行的和計(jì)劃的研究正在評(píng)估替格瑞洛用于減少陳舊性心肌梗死、已確定的外周動(dòng)脈疾病、和急性腦卒中患者，以及糖尿病和確定的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的患者的主要心血管事件。替格瑞洛具有兩種主要代謝物：替格瑞洛活性代謝物(TAM)和替格瑞洛無(wú)活性代謝物(TIM)(滕等人，2010，藥物代謝與處置(DrugMetab.andDispos.)38:1514-1521)。TAM，也稱(chēng)為AR-C124910XX，是替格瑞洛的主要循環(huán)代謝物，并且在P2Y12拮抗劑活性中同樣有效。TAM通常在服用倍林達(dá)(BRILINTA/BRILIQUE)的患者中以母體替格瑞洛濃度的約30％-40％存在。替格瑞洛和TAM的循環(huán)半衰期分別為8和12小時(shí)。TIM，也稱(chēng)為AR-C133913XX，對(duì)P2Y12無(wú)活性，構(gòu)成母體替格瑞洛的不足10％，在8小時(shí)后檢測(cè)不到，并且是通過(guò)尿排泄的主要代謝物。不考慮處理策略(藥學(xué)或侵入處理)，與廣泛的ACS患者群體(不穩(wěn)定性心絞痛(UA)、非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI)、ST段抬高心肌梗死(STEMI))中的氯吡格雷相比，血小板抑制和患者結(jié)果(PLATO)試驗(yàn)證實(shí)替格瑞洛的更大功效，不增加總的大出血。(瓦倫汀(Wallentin)等人2009，新英格蘭醫(yī)學(xué)期刊，361(11):1045-1057)。然而，與所有抗血小板劑一樣，在使用替格瑞洛的患者中存在出血的可能性。如果雙重抗血小板治療(DAPT)患者出現(xiàn)嚴(yán)重出血，則存在有限的治療選擇。如果在DAPT患者中發(fā)生出血事件，可以使用血小板輸注或凝血因子給予以試圖增強(qiáng)止血。然而，目前沒(méi)有臨床數(shù)據(jù)可用于評(píng)價(jià)服用替格瑞洛的受試者的大出血事件之后或期間血小板輸注或使用重組因子VIIa的止血有益性(達(dá)倫M(DalénM)等人，2013，心胸與血管麻醉雜志(JCardiothoracVascAnesth.)27(5):e55-7)。因此，解毒劑(例如替格瑞洛特異性中和抗體)的可用性將允許期望的抗血栓形成效應(yīng)與出血控制之間的平衡的更好的臨床管理。因?yàn)樘娓袢鹇迨俏ㄒ坏氖惺鄣目赡娼Y(jié)合血小板抑制劑，所以抗體可以提供血小板抑制的逆轉(zhuǎn)而不需要新鮮的血小板輸注，從而避免與血小板輸注相關(guān)的危險(xiǎn)?？朔c替格瑞洛和TAM相關(guān)的ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制的試劑的可用性將滿(mǎn)足重要的未滿(mǎn)足的臨床需要，例如在經(jīng)歷大出血或需要緊急手術(shù)的患者中。披露概述在一個(gè)方面，本披露涉及一種抗體，該抗體特異性結(jié)合具有化學(xué)式(Ia)的環(huán)戊基三唑嘧啶化合物：其中R1選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：C1-C6烷氧基和C1-C6烷硫基；R2選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、和取代的C3-C6環(huán)烷基；且R3選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和C1-C6烷醇。在一些實(shí)施例中，該抗體結(jié)合至如化學(xué)式(IIa)由括號(hào)標(biāo)記的化合物的部分內(nèi)的表位其中R1、R2、和R3是如上定義的。在其他的實(shí)施例中，該抗體結(jié)合至如化學(xué)式(IIIa)由括號(hào)標(biāo)記的化合物的部分內(nèi)的表位其中R2和R3是如上所定義的，R’1選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：C1-C4烷基。在其他的實(shí)施例中，該抗體結(jié)合至選自下組的化合物，該組由以下各項(xiàng)組成：替格瑞洛；替格瑞洛活性代謝物(TAM)；以及替格瑞洛無(wú)活性代謝物(TIM)。在上述方面和實(shí)施例的其他實(shí)施例中，該抗體或其片段包含重鏈可變區(qū)(VH)序列，所述序列選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：SEQIDNO:2、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:32、SEQIDNO:42、SEQIDNO:52、SEQIDNO:62和SEQIDNO:72；和輕鏈可變區(qū)(VL)序列，所述序列選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：SEQIDNO:7、SEQIDNO:17、SEQIDNO:27、SEQIDNO:37、SEQIDNO:47、SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77。在一些實(shí)施例中，該抗體包含VH和VL序列的組合，該組合選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：SEQIDNO:2和SEQIDNO:7；SEQIDNO:12和SEQIDNO:17；SEQIDNO:22和SEQIDNO:27；SEQIDNO:32和SEQIDNO:37；SEQIDNO:42和SEQIDNO:47；SEQIDNO:52和SEQIDNO:57；SEQIDNO:62和SEQIDNO:67；以及SEQIDNO:72和SEQIDNO:77。在其他實(shí)施例中，該抗體包含VH和VL的組合，該組合選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：SEQIDNO:52和SEQIDNO:57；SEQIDNO:62和SEQIDNO:67；以及SEQIDNO:72和SEQIDNO:77。在上述方面和實(shí)施例的其他的實(shí)施例中，該抗體或其片段包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)(FR)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1、2和3，其中該重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3序列包含SEQIDNO:3(CDR1)、SEQIDNO:4(CDR2)和SEQIDNO:5(CDR3)；SEQIDNO:13(CDR1)、SEQIDNO:14(CDR2)和SEQIDNO:15(CDR3)；SEQIDNO:23(CDR1)、SEQIDNO:24(CDR2)和SEQIDNO:25(CDR3)；SEQIDNO:33(CDR1)、SEQIDNO:34(CDR2)和SEQIDNO:35(CDR3)；SEQIDNO:43(CDR1)、SEQIDNO:44(CDR2)和SEQIDNO:45(CDR3)；SEQIDNO:53(CDR1)、SEQIDNO:54(CDR2)和SEQIDNO:55(CDR3)；SEQIDNO:63(CDR1)、SEQIDNO:64(CDR2)和SEQIDNO:65(CDR3)；或SEQIDNO:73(CDR1)、SEQIDNO:74(CDR2)和SEQIDNO:75(CDR3)；并且其中該輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3序列包含SEQIDNO:8(CDR1)、SEQIDNO:9(CDR2)和SEQIDNO:10(CDR3)；SEQIDNO:18(CDR1)、SEQIDNO:19(CDR2)和SEQIDNO:20(CDR3)；SEQIDNO:28(CDR1)、SEQIDNO:29(CDR2)和SEQIDNO:30(CDR3)；SEQIDNO:38(CDR1)、SEQIDNO:39(CDR2)和SEQIDNO:40(CDR3)；SEQIDNO:48(CDR1)、SEQIDNO:49(CDR2)和SEQIDNO:50(CDR3)；SEQIDNO:58(CDR1)、SEQIDNO:59(CDR2)和SEQIDNO:60(CDR3)；SEQIDNO:68(CDR1)、SEQIDNO:69(CDR2)和SEQIDNO:70(CDR3)；或SEQIDNO:78(CDR1)、SEQIDNO:79(CDR2)和SEQIDNO:80(CDR3)。在其他的實(shí)施例中，該抗體包含CDR區(qū)的組合，該組合選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：SEQIDNO:53(VHCDR1)、SEQIDNO:54(VHCDR2)、SEQIDNO:55(VHCDR3)、SEQIDNO:58(VLCDR1)、SEQIDNO:59(VLCDR2)、和SEQIDNO:60(VLCDR3)；SEQIDNO:63(VHCDR1)、SEQIDNO:64(VHCDR2)、SEQIDNO:65(VHCDR3)、SEQIDNO:68(VLCDR1)、SEQIDNO:69(VLCDR2)和SEQIDNO:70(VLCDR3)；以及SEQIDNO:73(VHCDR1)、SEQIDNO:74(VHCDR2)、SEQIDNO:75(VHCDR3)、SEQIDNO:78(VLCDR1)、SEQIDNO:79(VLCDR2)、和SEQIDNO:80(VLCDR3)。在上述方面和實(shí)施例中，該抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈Fv(scFv)、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fab、F(ab’)2、單鏈雙抗體，抗體模擬物和抗體可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，該抗體包含scFv。在一些實(shí)施例中，該抗體包含F(xiàn)ab。在一些實(shí)施例中，上述抗體結(jié)合替格瑞洛或替格瑞洛活性代謝物(TAM)。在其他的實(shí)施例中，該抗體以約200nM或更低的IC50結(jié)合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。在另外其他的實(shí)施例中，該抗體以約100nM至約1nM的IC50或以約10nM至約1nM的IC50結(jié)合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。在其他的實(shí)施例中，該抗體以約50nM或更低的KD結(jié)合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。在其他的實(shí)施例中，該抗體以約250pM至約1pM的范圍內(nèi)，或約100pM至約1pM的范圍內(nèi)的KD結(jié)合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。在其他的實(shí)施例中，該抗體結(jié)合替格瑞洛或其代謝物或衍生物，并且不結(jié)合選自下組的化合物，該組由以下各項(xiàng)組成：非諾貝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加諾生、環(huán)噻嗪、氟氯氰菊酯、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格雷洛、泮托拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、2-MeS二磷酸腺苷和2-MeS三磷酸腺苷。在實(shí)施例中，該抗體不抑制選自下組的化合物的活性，該組由以下各項(xiàng)組成：非諾貝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加諾生、環(huán)噻嗪、氟氯氰菊酯、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格雷洛、泮托拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、2-MeS二磷酸腺苷和2-MeS三磷酸腺苷。在其他的實(shí)施例中，該抗體顯示對(duì)于選自下組化合物的至少約1000μM的IC50，該組由以下各項(xiàng)組成：非諾貝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加諾生、環(huán)噻嗪、氟氯氰菊酯、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格雷洛、泮托拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、2-MeS二磷酸腺苷和2-MeS三磷酸腺苷。在一些實(shí)施例中，該抗體具有約4-12小時(shí)的體內(nèi)半衰期。在具體實(shí)施例中，該抗體具有約12小時(shí)的體內(nèi)半衰期。在一些實(shí)施例中，該抗體中和替格瑞洛或替格瑞洛的活性代謝物的抗血小板作用。在其他的實(shí)施例中，該抗體在給予約60分鐘內(nèi)中和替格瑞洛或替格瑞洛的活性代謝物的抗血小板作用。在一些實(shí)施例中，該抗體對(duì)替格瑞洛或替格瑞洛的活性代謝物具有如下解離速率，該解離速率允許繼續(xù)開(kāi)始包含替格瑞洛的治療。在其他方面，本披露提供了在需要治療的患者中治療急性出血的方法，該方法包括向該患者給予有效量的在此披露的抗體。在該方法的一些實(shí)施例中，患者已接受或正在接受外科手術(shù)并且已經(jīng)給予了替格瑞洛。在該方法的一些實(shí)施例中，患者需要緊急護(hù)理和/或緊急創(chuàng)傷管理。本披露的其他方面提供了一種組合物，該組合物包含前述方面和實(shí)施例中任一個(gè)的抗體與藥學(xué)上可接受的載體的組合。一些另外的方面提供了核酸分子，該核酸分子包含編碼根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，核酸分子包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:11、SEQIDNO:16、SEQIDNO:21、SEQIDNO:26、SEQIDNO:31、SEQIDNO:36、SEQIDNO:41、SEQIDNO:46、SEQIDNO:51、SEQIDNO:56、SEQIDNO:61、SEQIDNO:66、SEQIDNO:71和SEQIDNO:76。本披露的其他方面提供了可以包含在此披露的至少一種核酸分子的組合物、載體和宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，組合物、載體和宿主細(xì)胞包含編碼在此披露的一種或多種蛋白質(zhì)的第一核酸分子和第二核酸分子。通過(guò)閱讀下面的說(shuō)明和示例的描述，其他方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明出于說(shuō)明本披露的目的，在附圖中描繪了本披露的某些方面。然而，本披露不限于附圖中所描繪的方面的精確安排和手段。圖1描述了基于III期PLATO數(shù)據(jù)的替格瑞洛中和性Fab的PK/PD建模。在180mg負(fù)荷劑量和90mg每日兩次替格瑞洛后，在時(shí)間零時(shí)添加中和性Fab?；颊咴诘?天重新服用替格瑞洛。預(yù)測(cè)Fab快速中和替格瑞洛和TAM，從而在99％的患者中恢復(fù)血小板聚集。在第0天和第1天之間的“峰”代表在1％的替格瑞洛清除更緩慢的患者中來(lái)自其他組織的替格瑞洛的再分布。圖2-半抗原和Fab特異性。(A)提供替格瑞洛、替格瑞洛活性代謝物(TAM)、替格瑞洛無(wú)活性代謝物(TIM)和腺苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。獨(dú)特的R基團(tuán)(二氟苯基-環(huán)丙基和硫丙基取代基)用虛線突出顯示。(B)TICA0072的特異性圖譜。(C)TICA0212(MEDI2452)的特異性圖譜。特異性圖譜包括替格瑞洛、TAM、TIM、腺苷、ADP、ATP和圖4的十二種相關(guān)化合物中的三種(為了清楚起見(jiàn)；在濃度高達(dá)0.1mM時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到十二種化合物任意一種的結(jié)合)。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的平均值和SEM。圖3示出了與生物素化的接頭替格瑞洛結(jié)合的scFv(x軸)與在50倍過(guò)量的未修飾的替格瑞洛中與生物素化的接頭替格瑞洛結(jié)合的scFv(y軸)的相關(guān)性。在過(guò)量未修飾的替格瑞洛的存在下scFv結(jié)合的抑制用0％、50％、80％和90％抑制的線顯示。圖4顯示了與替格瑞洛具有一定程度的2D、3D或靜電相似性的化合物。圖5提供了TICA0049Fab和TICA0072Fab的選擇性研究。a-cTICA0049Fab通過(guò)所列化合物與生物素化替格瑞洛結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)。d-fTICA0072Fab通過(guò)所列化合物與生物素化替格瑞洛結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)。數(shù)據(jù)DMSO標(biāo)準(zhǔn)化。圖6提供了母體TICA0072和優(yōu)化的變體TICA0152Fab、TICA0162Fab和TICA0212Fab在第二代表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中的競(jìng)爭(zhēng)曲線。圖7顯示TICA0162Fab和TICA0212Fab的選擇性研究的結(jié)果。a-cTICA0162Fab通過(guò)所列化合物與生物素化替格瑞洛的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)。d-fTICA0212Fab通過(guò)所列化合物與生物素化替格瑞洛的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)。數(shù)據(jù)DMSO標(biāo)準(zhǔn)化。圖8顯示替格瑞洛的TICA0212/MEDI2452或TICA0072濃度依賴(lài)性逆轉(zhuǎn)的結(jié)果。(A)TICA0212/MEDI24521μM替格瑞洛(▲)或1μMTAM(●)介導(dǎo)的20μMADP誘導(dǎo)的聚集的抑制。(B)TICA0212/MEDI2452顯示在1μM替格瑞洛存在下血漿中游離替格瑞洛濃度的降低。平均值(n＝5)±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。(C)P2Y12信號(hào)傳導(dǎo)的替格瑞洛和TAM抑制的TICA0072逆轉(zhuǎn)。圖9顯示在對(duì)替格瑞洛處理的小鼠給藥后，TICA0212(250mg/kg)離體介導(dǎo)ADP誘導(dǎo)的全血聚集的逆轉(zhuǎn)的結(jié)果。圖10顯示TICA0072(A)和TICA0212/MEDI2452(B)與替格瑞洛的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的部分圖。Fab以帶狀表示，其中來(lái)自替格瑞洛的內(nèi)的氨基酸殘基以棍狀表示。為了清楚省略了一些主鏈原子。輕鏈以米色顯示，重鏈以淺藍(lán)色顯示。來(lái)自?xún)蓷l鏈的CDR3都著綠色。VHCDR3不能在TICA0072結(jié)構(gòu)中建模，并且臨時(shí)位置繪制為虛線。橙色箭頭指示與TICA0072相比在TICA0212/MEDI2452中觀察到的VLCDR3的位移。殘基遵循卡巴特(Kabat)編號(hào)，并且?guī)в蠰或H前綴以指示輕鏈或重鏈。圖11顯示離體ADP誘導(dǎo)的全血聚集的逆轉(zhuǎn)。(A)替格瑞洛輸注停止后每個(gè)治療組的個(gè)體數(shù)據(jù)。載體對(duì)照(■)，替格瑞洛單獨(dú)(●)，替格瑞洛+TICA0212/MEDI2452(○)和替格瑞洛+同種型對(duì)照(Δ)。條形圖(Bar)表示平均數(shù)據(jù)(n＝4)。AU＝聚集單元。在15分鐘時(shí)，僅收集替格瑞洛+TICA0212/MEDI2452組的數(shù)據(jù)。(B)由TICA0212/MEDI2452誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)百分比，為平均數(shù)據(jù)(n＝4)±SEM圖12顯示替格瑞洛誘導(dǎo)的出血的逆轉(zhuǎn)。(A)總失血和(B)總出血時(shí)間的個(gè)體數(shù)據(jù)。載體對(duì)照(■)，替格瑞洛單獨(dú)(●)和替格瑞洛+TICA0212/MEDI2452(○)。條形圖表示平均數(shù)據(jù)(n＝12)。發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明在繼續(xù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本披露之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，本披露并不局限于特定的組合物或方法步驟，因?yàn)檫@些組合物或方法步驟可以改變。必須注意的是，如本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中使用，單數(shù)形式“一個(gè)(a)”、“一種(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文明確地指示其他的情況。除非另外定義，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意義。例如，生物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)簡(jiǎn)明詞典(ConciseDictionaryofBiomedicineandMolecularBiology)，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社；細(xì)胞和分子生物學(xué)詞典(DictionaryofCellandMolecularBiology)，第3版，1999，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)；以及牛津生物化學(xué)和分子生物學(xué)詞典(OxfordDictionaryOfBiochemistryAndMolecularBiology)，修訂版，2000，牛津大學(xué)出版社(OxfordUniversityPress)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語(yǔ)的通用詞典。氨基酸可以在此通過(guò)它們的通常己知的三字母符號(hào)或通過(guò)由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推薦的單字母符號(hào)來(lái)提及。同樣地，核苷酸可以通過(guò)它們的普遍公認(rèn)的單字母代碼而被提及。除非另有說(shuō)明，否則抗體的可變結(jié)構(gòu)域、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及框架區(qū)(FR)中的氨基酸編號(hào)遵循卡巴特定義，該定義如列出于卡巴特等人，具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第5版，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院，公共衛(wèi)生事業(yè)部，馬里蘭州貝塞斯達(dá)市(1991)。使用這個(gè)編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可以含有對(duì)應(yīng)于可變結(jié)構(gòu)域的FR或CDR的縮短或插入該FR或CDR中的較少的或另外的氨基酸。例如，重鏈可變結(jié)構(gòu)域可以包含在H2的殘基52之后的單個(gè)氨基酸插入(根據(jù)卡巴特，殘基52a)以及在重鏈FR殘基82之后的插入殘基(例如，根據(jù)卡巴特，殘基82a、82b、以及82c等)?？梢酝ㄟ^(guò)抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)”卡巴特編號(hào)序列在同源區(qū)的比對(duì)而針對(duì)給定的抗體確定殘基的卡巴特編號(hào)?？蚣軞埢淖畲蟊葘?duì)常常需要在編號(hào)系統(tǒng)中的有待用于Fv區(qū)的“間隔”殘基插入。另外，由于種間或等位基因差異，在任何給定的卡巴特位點(diǎn)編號(hào)處的某些單獨(dú)殘基的身份在抗體鏈之間可以不同。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體(antibody和antibodies)”也被稱(chēng)為免疫球蛋白，涵蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、由至少兩個(gè)不同表位結(jié)合片段形成的多特異抗體(例如，多特異抗體，如PCT公開(kāi)WO2009018386、PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2012/045229，將其通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此)、雙克隆抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝化抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、Fab片段、F(ab')2片段、展現(xiàn)出所希望的生物活性的抗體片段(例如，抗原結(jié)合部分)、二硫鍵連接的Fv(dsFv)，以及抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括，例如，針對(duì)本發(fā)明的抗體的抗Id抗體)、細(xì)胞內(nèi)抗體，以及上述任一者的表位結(jié)合片段。在本文提供的具體實(shí)施例中，該抗體涉及抗體的活性結(jié)合片段，即含有至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，例如scFv和Fab?？贵w還包括與抗體或其部分的肽融合物，例如與Fc結(jié)構(gòu)域融合的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白分子可以具有任何同種型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亞同種型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同種異型(例如，Gm，如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b、或c)，Am，Em，以及Km(1、2或3))?？贵w可以源自任何哺乳動(dòng)物，包括但不限于人、猴、豬、馬、兔、狗、貓、小鼠等等，或其他動(dòng)物，如鳥(niǎo)類(lèi)(例如雞)。如本文所使用的，C1-C6烷基是指具有一至六個(gè)碳原子的直鏈和支鏈烷基，并且包括甲基、乙基、丙基、正丁基、異丁基、戊基、異戊基、新戊基和己基。如本文所使用的，C1-C6烷氧基是指在基團(tuán)中具有氧的如上所述的烷基。在一些實(shí)施例中，氧原子位于將取代基附接到核心結(jié)構(gòu)(即環(huán)結(jié)構(gòu))的位置處。如本文所使用的，C1-C6烷硫基是指在基團(tuán)中具有硫的如上所述的烷基。在一些實(shí)施例中，硫原子位于將取代基附接到核心結(jié)構(gòu)(即環(huán)結(jié)構(gòu))的位置處。如本文所使用的，C1-C6烷醇是指在取代基結(jié)構(gòu)的末端具有羥基的如上所述的烷基。如本文所使用的，C3-C6環(huán)烷基是指環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。如本文所使用的，“取代的”C3-C6環(huán)烷基和C1-C6烷基是指在至少一個(gè)碳原子上被芳基(也被1-3個(gè)鹵素基團(tuán)取代)取代的上述烷基和環(huán)烷基。如本文所使用的，“替格瑞洛”是指可逆的P2Y12抑制劑((1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基]氨基}-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羥基乙氧基)環(huán)戊烷-1,2-二醇)，并且具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)：如本文所使用的，“替格瑞洛活性代謝物”或“TAM”是指替格瑞洛的主要活性代謝物，也稱(chēng)為AR-C124910XX，為一種可逆的P2Y12抑制劑，并且具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)：如本文所使用的，“替格瑞洛無(wú)活性代謝物”或“TIM”是指替格瑞洛的非活性代謝物，也稱(chēng)為AR-C133913XX，并且具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)：抗體在一般意義上，本披露提供結(jié)合具有化學(xué)式(Ia)的環(huán)戊基三唑嘧啶化合物的新穎抗體：其中R1選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：C1-C6烷氧基和C1-C6烷硫基；R2選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、和取代的C3-C6環(huán)烷基；并且R3選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和C1-C6烷醇。在具體的實(shí)施例中，該抗體特異性結(jié)合選自下組的化合物，該組由以下各項(xiàng)組成：替格瑞洛；替格瑞洛活性代謝物(TAM)；以及替格瑞洛無(wú)活性代謝物(TIM)。在具體方面，本披露提供了結(jié)合替格瑞洛和TAM的抗體，該抗體具有以下特征中的任何一個(gè)或多個(gè)，這些特征包括高結(jié)合特異性、高結(jié)合親和力、快速起效時(shí)間和快速停止時(shí)間(例如，允許選擇性繼續(xù)或共給予包含替格瑞洛的治療)。在一些實(shí)施例中，該抗體結(jié)合替格瑞洛并中和替格瑞洛和TAM的抗血小板聚集活性，從而在替格瑞洛和TAM存在下恢復(fù)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。在一些實(shí)施例中，受試者中的抗體半衰期與替格瑞洛和TAM的半衰期大約相同。在一些實(shí)施例中，該抗體半衰期為約4-24小時(shí)(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時(shí))。在一些實(shí)施例中，該抗體半衰期為約4-12小時(shí)(例如，4、5、6、7、8、9、10、11或12小時(shí))。在一些實(shí)施例中，該抗體提供活性的快速起效。例如，在實(shí)施例中，該抗體起效時(shí)間或中和替格瑞洛和TAM介導(dǎo)的血小板抑制的時(shí)間為約15-120分鐘，或約15-60分鐘。在一些實(shí)施例中，起效時(shí)間小于60分鐘。在一些實(shí)施例中，該抗體具有提供活性的快速停止的PK/PD圖譜，使得例如已給予該抗體的受試者可以重新開(kāi)始規(guī)定的替格瑞洛治療。在一些實(shí)施例中，已經(jīng)接受本文披露的抗體(例如通過(guò)靜脈內(nèi)輸注)的受試者可以在給予抗體后二十四小時(shí)內(nèi)接受或重新開(kāi)始替格瑞洛治療。如本文的某些實(shí)施例中所討論和舉例說(shuō)明的，該抗體結(jié)合替格瑞洛或其代謝物，并且不結(jié)合其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物或可以與替格瑞洛作為聯(lián)合治療給予的化合物。例如，合適地，該抗體不抑制選自下組的化合物的活性，該組由以下各項(xiàng)組成：非諾貝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加諾生、環(huán)噻嗪、氟氯氰菊酯、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格雷洛、泮托拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、2-MeS二磷酸腺苷和2-MeS三磷酸腺苷。本文所述的抗體可以包括僅含有抗體分子例如Fab、F(ab')2、Fab’、scFv、di-scFv、sdAb片段的選擇部分的抗原結(jié)合片段，并且可以用作診斷或治療劑。另外，可以改變可變結(jié)構(gòu)域中的特定殘基以改進(jìn)抗體和抗體片段的結(jié)合特異性和/或穩(wěn)定性。已經(jīng)替換了不直接參與抗原結(jié)合的其他殘基，以便“人源化”非人抗體的區(qū)域并降低抗體的免疫原性。在某些方面，該抗體是Fab片段，例如抗體的Fab片段或重組產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段，其包含可變輕鏈(VL)、恒定輕鏈(CL)、可變重鏈(VH)和恒定重鏈部分(CH1)。任選地，F(xiàn)ab的輕鏈和重鏈可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫鍵互連，例如通過(guò)合適的抗體鉸鏈區(qū)。如本文所述，F(xiàn)ab結(jié)合口服活性劑的環(huán)戊基三唑嘧啶類(lèi)化合物的表位。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)ab結(jié)合替格瑞洛或其代謝物。在某些方面，F(xiàn)ab可以衍生自或基于抗體的序列，例如常規(guī)的鼠類(lèi)、人源化或人抗體。在某些方面，F(xiàn)ab可以衍生自或基于一種或多種scFv，例如篩選和衍生自文庫(kù)的scFv。在這樣的實(shí)施例中，衍生自或基于常規(guī)抗體或scFv的序列的Fab保留常規(guī)抗體的一種或多種功能活性(例如保留至少80％或更多(80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)的功能活性)。例如，在某些方面，該Fab保留對(duì)抗原(例如替格瑞洛)的親和力、抑制活性和/或抗體或scFv的選擇性中的一種或多種。雖然該Fab片段可以包含結(jié)合環(huán)戊基三唑嘧啶的表位的序列，但是在某些實(shí)施例中，該Fab結(jié)合替格瑞洛。在一些方面，該Fab結(jié)合替格瑞洛的活性代謝物。在某些方面，該Fab可以結(jié)合替格瑞洛和替格瑞洛的活性代謝物兩者。在一些實(shí)施例中，該Fab可以包含來(lái)自結(jié)合替格瑞洛或其活性代謝物的不同抗體的CDR區(qū)的組合。在某些方面，該Fab包含輕鏈部分(VL)，該輕鏈部分包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:17、SEQIDNO:27、SEQIDNO:37、SEQIDNO:47、SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77中任一個(gè)列出的氨基酸序列。在另外的實(shí)施例中，該Fab包含輕鏈部分，該輕鏈部分包含SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77中任一個(gè)列出的氨基酸序列。在某些方面，該Fab包含重鏈部分(VH)，該重鏈部分包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:32、SEQIDNO:42、SEQIDNO:52、SEQIDNO:62和SEQIDNO:72中任一個(gè)列出的氨基酸序列。在其他的實(shí)施例中，該Fab重鏈部分，該重鏈部分包含何SEQIDNO:52、SEQIDNO:62和SEQIDNO:72中任一個(gè)列出的氨基酸序列。在某些方面，該Fab由編碼輕鏈部分(VL)的核苷酸序列和編碼重鏈部分(VH)的核苷酸序列編碼，例如核苷酸序列包含SEQIDNO:11、SEQIDNO:21、SEQIDNO:31、SEQIDNO:41、SEQIDNO:51、SEQIDNO:61或SEQIDNO:71中任一個(gè)列出的核酸序列；和核苷酸序列包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:16、SEQIDNO:16、SEQIDNO:16、SEQIDNO:16、SEQIDNO:16、SEQIDNO:16或SEQIDNO:76中任一個(gè)列出的核酸序列。在某些方面，該抗體可以是scFv。應(yīng)當(dāng)理解，該scFv包括多肽鏈，該多肽鏈包含通過(guò)柔性多肽接頭與可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VL)連接的可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)。在一些方面，VH和VL之間的多肽接頭包含蛋白酶切割位點(diǎn)。scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域可以來(lái)自相同或不同的抗體。在一些方面，該scFv的VH或VL可包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)合致感興趣的靶標(biāo)的CDR，而VH或VL結(jié)構(gòu)域的其余部分衍生自不同的抗體或是合成的。在一些方面，該scFv包含抗體的至少一個(gè)CDR，例如對(duì)替格瑞洛或其代謝物具有結(jié)合活性的抗體。在一些方面，該scFv包含給定抗體的至少兩個(gè)CDR。在一些方面，該scFv包含給定抗體的至少三個(gè)CDR。在一些方面，該scFv包含給定抗體的至少四個(gè)CDR。在一些方面，該scFv包含給定抗體的至少五個(gè)CDR。在一些方面，該scFv包含給定抗體的至少六個(gè)CDR。可以單獨(dú)或組合使用幾種方法以改進(jìn)該scFv分子的穩(wěn)定性。可單獨(dú)使用或與一種或多種其他方法組合使用的一種方法是設(shè)計(jì)連接scFv結(jié)構(gòu)域的接頭的長(zhǎng)度和/或組成以穩(wěn)定scFv部分。可以單獨(dú)使用或與本文所述的一種或多種其他方法組合使用的另一種可能的方法是通過(guò)將至少兩個(gè)氨基酸取代(也稱(chēng)為修飾或突變)引入scFv的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)二硫鍵形成(參見(jiàn)例如布林克曼(Brinkmann)等人，1993，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(PNAS)，90:7538-42；朱(Zhu)等人，1997，蛋白質(zhì)科學(xué)(Prot.Sci.)6:781-8；賴(lài)特爾(Reiter)等人，1994，生物化學(xué)(Biochem.)33:5451-9；賴(lài)特爾等人，1996，自然(Nature)14:1239-45；羅(Luo)等人，1995，生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)118:825-31；楊(Young)等人，1995，歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBSLet.)377:135-9；格勒諾布爾等人，1990，生物化學(xué)29:1362-7)。在某些方面，將一個(gè)突變引入scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)中，以在scFv表達(dá)時(shí)促進(jìn)VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的鏈間二硫鍵形成。在另一方面，將兩個(gè)突變引入鏈的相同結(jié)構(gòu)域中。在某些方面，將兩個(gè)突變被引入不同的鏈。在某些方面，引入這兩個(gè)突變的多對(duì)以促進(jìn)多個(gè)二硫鍵的形成。在某些方面，引入半胱氨酸以促進(jìn)二硫鍵形成?？梢酝蛔?yōu)榘腚装彼岬氖纠园被岚╒H2的氨基酸43、44、45、46、47、103、104、105和106，以及VL2的氨基酸42、43、44、45、46、98、99、100和101。上述編號(hào)是基于卡巴特編號(hào)，其鑒定僅相對(duì)于scFv的VH2和VL2的位置(而不是相對(duì)于抗體全長(zhǎng)序列中氨基酸的位置)。可以突變?yōu)榘腚装彼釟埢陌被嵛恢玫氖纠越M合包括：VH44-VL100、VH105-VL43、VH105-VL42、VH44-VL101、VH106-VL43、VH104-VL43、VH44-VL99、VH45-VL98、VH46-VL98、VH103-VL43、VH103-VL44和VH103-VL45。在一些方面，VH的氨基酸44和VL的氨基酸100突變?yōu)榘腚装彼?。可單?dú)使用或與本文所述的一種或多種其他方法組合使用的另一種潛在方法是選擇scFv的結(jié)構(gòu)域的順序。在某些方面，相對(duì)于VL結(jié)構(gòu)域的VH結(jié)構(gòu)域的取向被優(yōu)化以達(dá)到穩(wěn)定性。在某些方面，該scFv處于VH-接頭-VL取向。在某些方面，該scFv處于VL-接頭-VH取向?？梢詥为?dú)使用或與本文所述的一種或多種方法組合使用的另外的方法是通過(guò)突變scFv的一個(gè)或多個(gè)表面殘基引入一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定性突變。在一些方面，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或多于六個(gè)殘基在scFv的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的一者或兩者中突變。在某些方面，僅在scFv的VH結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行改變。在某些方面，僅在scFv的VL結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行改變。在某些方面，在scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行改變?？梢栽诿總€(gè)結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行相同數(shù)量的改變，或者可以在每個(gè)結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行不同數(shù)量的改變。在某些方面，一個(gè)或多個(gè)變化是來(lái)自未修飾的母體scFv中存在的殘基的保守氨基酸取代。在其他方面，一個(gè)或多個(gè)變化是來(lái)自未修飾的母體scFv中存在的殘基的非保守氨基酸取代。當(dāng)進(jìn)行了多個(gè)取代時(shí)，在scFv的VH或VL結(jié)構(gòu)域的一者或兩者中，每個(gè)取代獨(dú)立地是保守取代或非保守取代。在某些方面，所有取代是保守取代。在某些方面，所有取代是非保守的。在某些方面，至少一個(gè)取代是保守的。在某些方面，至少一個(gè)取代是非保守的?？蓡为?dú)使用或與本文所述的一種或多種額外方法組合使用的另一種方法是通過(guò)將存在于scFv的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)殘基突變以導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)取代，從而匹配已知的、經(jīng)篩選的和/或經(jīng)鑒定的抗體的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的共有序列的所述特定位置處的最常見(jiàn)的殘基。在某些方面，在scFv的VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的一者或兩者中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或多于六個(gè)位置處引入取代?？梢栽诿總€(gè)結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行相同數(shù)量的改變，或者可以在每個(gè)結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行不同數(shù)量的改變。在某些方面，與給定共有序列匹配的序列中的一個(gè)或多個(gè)變化是來(lái)自未修飾的VH和/或VL序列中存在的殘基的保守氨基酸取代。在其他方面，一個(gè)或多個(gè)變化表示來(lái)自未修飾的VH和/或VL序列中存在的殘基的非保守氨基酸取代。當(dāng)進(jìn)行了多個(gè)取代時(shí)，在scFv的VH或VL結(jié)構(gòu)域的一者或兩者中，每個(gè)取代獨(dú)立地是保守取代或非保守取代。在某些方面，所有取代是保守取代。在某些方面，所有取代是非保守取代。在某些方面，至少一個(gè)取代是保守的。在某些方面，至少一個(gè)取代是非保守的。應(yīng)當(dāng)注意，描述為可用于修飾或穩(wěn)定scFv部分的任何修飾可用于修飾Fab部分。例如，可以修飾Fab的可變結(jié)構(gòu)域以改進(jìn)穩(wěn)定性，抗原結(jié)合等。此外，可以修飾Fab或scFv部分以降低免疫原性。在某些方面，抗體可以是包含可變輕鏈部分(VL)的scFv，該可輕鏈部分包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:17、SEQIDNO:27、SEQIDNO:37、SEQIDNO:47、SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77中任一個(gè)列出的氨基酸序列。在其他的實(shí)施例中，該scFv包含輕鏈部分，該輕鏈部分包含SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77中任一個(gè)列出的氨基酸序列。在某些方面，該scFv包含重鏈部分(VH)，該重鏈部分包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:32、SEQIDNO:42、SEQIDNO:52、SEQIDNO:62和SEQIDNO:72中任一個(gè)列出的氨基酸序列。在其他的實(shí)施例中，該scFv包含重鏈部分，該重鏈部分包含SEQIDNO:52、SEQIDNO:62和SEQIDNO:72中任一個(gè)列出的氨基酸序列。本文披露的抗體還可以包含一個(gè)或多個(gè)接頭多肽。接頭可以將重鏈結(jié)構(gòu)域和輕鏈結(jié)構(gòu)域(scFv)互連或?qū)⒖贵w或其抗原結(jié)合片段與另一種試劑(例如標(biāo)記物、Fc結(jié)構(gòu)域等)連接。接頭可以在長(zhǎng)度和序列上變化，并且是本領(lǐng)域通常已知的?？梢酝ㄟ^(guò)增加Fc區(qū)對(duì)FcRn的結(jié)合親和力來(lái)增加包含F(xiàn)c區(qū)的抗體的血清半衰期。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體半衰期”意指一種抗體的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，它是抗體分子在它們的給予之后的平均存活時(shí)間的量度?？贵w半衰期可以表示為從患者(或其他哺乳動(dòng)物)的身體或其特定區(qū)室(例如，如在血清中測(cè)量的，即循環(huán)半衰期)，或在其他組織中消除50％已知量的免疫球蛋白所需要的時(shí)間。從一種免疫球蛋白或免疫球蛋白類(lèi)別到另一種免疫球蛋白或免疫球蛋白類(lèi)別，半衰期可以不同。通常，抗體半衰期的增加導(dǎo)致循環(huán)中所給予抗體的平均停留時(shí)間(MRT)的增加。半衰期的增加可以允許供給患者的劑量的減少以及給予頻率的減少。為了增加抗體的血清半衰期，可以例如將補(bǔ)救受體結(jié)合表位并入到抗體(尤其是抗體片段)中，如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,739,277中所描述的。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指引起IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的增加的IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)的Fc區(qū)的表位?？商娲?，具有延長(zhǎng)的半衰期的本披露的抗體可以通過(guò)對(duì)鑒別為參與Fc與FcRn受體之間的相互作用的氨基酸殘基進(jìn)行修飾而產(chǎn)生(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,821,505和7,083,784；以及WO09/058492)。另外，可利用本領(lǐng)域中廣泛使用的技術(shù)通過(guò)與PEG或白蛋白軛合來(lái)使本披露抗體的半衰期增加。落入本披露范圍內(nèi)的抗體可以通過(guò)本文鑒定的任何結(jié)構(gòu)和/或功能特征來(lái)鑒定。例如，可以使用本文所示的任何技術(shù)或本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)篩選抗體的特定結(jié)合特征(例如，K分離(Koff)、KD、IC50，對(duì)替格瑞洛和替格瑞洛代謝物的特異性/選擇性)。標(biāo)記物、軛合物和部分為了診斷和其他測(cè)定的目的，本披露的抗體可以軛合至標(biāo)記物，在這些測(cè)定中可以檢測(cè)抗體和/或其一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)。標(biāo)記物包括但不限于發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、熒光蛋白、磷光性染料、疊層染料(tandemdye)、顆粒、半抗原、酶以及放射性同位素。在某些實(shí)施例中，該抗體軛合至熒光團(tuán)。附接至抗體上的熒光團(tuán)的選擇將確定被軛合的抗體的吸收和熒光發(fā)射特性。可以用于抗體和抗體結(jié)合配體的熒光團(tuán)標(biāo)記物的物理特性包括但不限于：光譜特征(吸收、發(fā)射和斯托克斯位移)、熒光強(qiáng)度、壽命、極化以及光致漂白率、或其組合。所有這些物理特性可以用于將一個(gè)熒光團(tuán)與另一個(gè)熒光團(tuán)區(qū)分開(kāi)，并且從而允許多元分析。熒光標(biāo)記物的其他所希望的特性可以包括細(xì)胞滲透性和低毒性，例如，如果將在細(xì)胞或模型生物體(例如，活體動(dòng)物)中執(zhí)行抗體的標(biāo)記。在某些方面，酶是標(biāo)記物并且軛合至抗體。因?yàn)榭梢垣@得可檢測(cè)的信號(hào)的放大，從而得到提高的測(cè)定靈敏度，所以酶是合乎需要的標(biāo)記物。酶自身不產(chǎn)生可檢測(cè)的響應(yīng)，但是當(dāng)它被適當(dāng)?shù)牡孜锝佑|時(shí)，起到分解底物的作用，這樣使得被轉(zhuǎn)化的底物產(chǎn)生熒光、比色或發(fā)光信號(hào)。因?yàn)闃?biāo)記試劑上的一種酶可以導(dǎo)致多個(gè)底物被轉(zhuǎn)化成可檢測(cè)的信號(hào)，所以酶將可檢測(cè)的信號(hào)放大。選擇酶底物以產(chǎn)生優(yōu)選的可測(cè)量的產(chǎn)物，例如，比色、熒光或化學(xué)發(fā)光。這種底物廣泛用于本領(lǐng)域并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括例如氧化還原酶如辣根過(guò)氧化物酶和底物如3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)；磷酸酶，例如酸性磷酸酶、堿性磷酸酶以及底物例如5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)；糖苷酶，例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-葡糖苷酶以及底物如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)；另外的酶包括水解酶如膽堿酯酶和肽酶、氧化酶如葡萄糖氧化酶和細(xì)胞色素氧化酶、以及還原酶，對(duì)于這些酶適合的底物是已知的。酶以及其產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的適當(dāng)?shù)孜镞m合于一些測(cè)定。這些包括但不限于天然和重組形式的熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。磷酸酶、糖苷酶和氧化酶的產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的底物，如含有穩(wěn)定的二氧雜環(huán)丁烷、魯米諾、異氨基苯二酰肼以及吖啶酯的那些也是有用的。在另一方面，也利用如生物素的半抗原作為標(biāo)記物。生物素是有用的，這是因?yàn)樗梢栽诿赶到y(tǒng)中起作用以進(jìn)一步放大可檢測(cè)的信號(hào)并且它可以充當(dāng)一個(gè)有待在親和色譜中使用用于分離目的標(biāo)簽。出于檢測(cè)目的，使用對(duì)于生物素具有親和力的酶軛合物，如抗生物素蛋白-HRP。隨后添加一種過(guò)氧化物酶底物以產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。半抗原還包括激素、天然存在和合成的藥物、污染物、過(guò)敏原、影響分子、生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化學(xué)中間體、核苷酸及相似物。在某些方面，熒光蛋白可以軛合至抗體作為標(biāo)記物。熒光蛋白的實(shí)例包括綠色熒光蛋白(GFP)和藻膽蛋白以及其衍生物。熒光蛋白，特別是藻膽蛋白，對(duì)于產(chǎn)生疊層染料標(biāo)記的標(biāo)記物試劑尤其有用。出于獲得較大的斯托克斯位移的目的，這些疊層染料包含熒光蛋白和熒光團(tuán)，其中發(fā)射光譜從熒光蛋白的吸收光譜的波長(zhǎng)發(fā)生更遠(yuǎn)的位移。在某些方面，標(biāo)記物是放射性同位素。適合的放射性材料的實(shí)例包括但不限于：碘(121I、123I、125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(111In、112In、113mIn、115mIn)、锝(99Tc、99mTc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(135Xe)、氟(18F)、153SM、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh以及97Ru。在一些方面，藥物可以軛合至抗體。例如，包含scFv的抗體可以軛合至藥物，用于治療心血管疾病和/或急性冠狀動(dòng)脈綜合征。在某些特征中，藥物和其他分子可以通過(guò)位點(diǎn)特異性軛合靶向抗體。例如，抗體可以包含工程化半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(包括至結(jié)合單位和/或Fc結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸)，這導(dǎo)致用于軛合反應(yīng)的游離巰基。在某些方面，將抗體工程化以摻入特異性軛合位點(diǎn)。編碼抗體的核酸分子本披露提供了編碼抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸分子。本披露的一個(gè)方面提供編碼本文具體描述的任何抗體的核酸分子。核酸分子可以編碼抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)。在一些方面，該抗體是Fab或scFv，其中編碼Fab或scFv的核酸部分包含編碼VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列和編碼VH的核苷酸序列，并且其中編碼VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列任選地通過(guò)編碼柔性多肽接頭的核苷酸序列與編碼VH結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列連接。另一方面提供了用本文所述的任何核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在本披露的另一方面，提供了包含載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含如本文所述的核酸分子。在一個(gè)方面，宿主細(xì)胞可以包含多于一種的載體。本披露涵蓋編碼本披露的任何抗體的核酸分子，以及抗體的輕鏈或重鏈。例如，本披露涵蓋核酸分子，該核酸分子包括編碼以下各項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)的核苷酸序列：SEQIDNO:2、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:32、SEQIDNO:42、SEQIDNO:52、SEQIDNO:62、SEQIDNO:72、SEQIDNO:7、SEQIDNO:17、SEQIDNO:27、SEQIDNO:37、SEQIDNO:47、SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77。本披露進(jìn)一步涵蓋編碼本披露的任何抗體的核酸分子，該核酸分子進(jìn)一步包含另外的區(qū)域(例如，F(xiàn)c或修飾的Fc)。在一些實(shí)施例中，核酸分子可以選自以下各項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)：SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:11、SEQIDNO:16、SEQIDNO:21、SEQIDNO:26、SEQIDNO:31、SEQIDNO:36、SEQIDNO:41、SEQIDNO:46、SEQIDNO:51、SEQIDNO:56、SEQIDNO:61、SEQIDNO:66、SEQIDNO:71或SEQIDNO:76。在其他的實(shí)施例中，本披露提供一種載體，該載體包括選自以下各項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)的核酸分子：SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:11、SEQIDNO:16、SEQIDNO:21、SEQIDNO:26、SEQIDNO:31、SEQIDNO:36、SEQIDNO:41、SEQIDNO:46、SEQIDNO:51、SEQIDNO:56、SEQIDNO:61、SEQIDNO:66、SEQIDNO:71或SEQIDNO:76。用于產(chǎn)生抗體、Fab和scFv的方法本披露提供了用于產(chǎn)生本文所述的抗體及其片段的方法。在一些方面，識(shí)別替格瑞洛的抗體的抗原結(jié)合片段和在此披露的替格瑞洛和/或TAM的特異性表位可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)產(chǎn)生。例如，F(xiàn)ab和F(ab’)2片段可由抗體通過(guò)使用酶諸如木瓜蛋白酶(用于產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(用于產(chǎn)生F(ab’)2片段)的免疫球蛋白分子的蛋白水解裂解來(lái)產(chǎn)生。另外，如本文所述的包括scFv和Fab的抗體可以使用本領(lǐng)域已知的多種噬菌體展示方法產(chǎn)生。通常，在噬菌體展示方法中，將功能抗體域展示在噬菌體顆粒表面上，這些顆粒攜帶對(duì)其進(jìn)行編碼的多核苷酸序列。具體地說(shuō)，編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列是從動(dòng)物cDNA文庫(kù)(例如，淋巴組織的人或鼠類(lèi)cDNA文庫(kù))來(lái)擴(kuò)增。通過(guò)PCR將編碼這些VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA與scFv接頭重組在一起，并且克隆至噬粒載體中。將該載體以電穿孔轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，并且用輔助噬菌體對(duì)該大腸桿菌進(jìn)行感染。在這些方法中所使用的噬菌體可以是包括fd和M13的絲狀噬菌體，并且這些VH和VL結(jié)構(gòu)域可以與噬菌體基因III或基因VIII重組融合。表達(dá)結(jié)合替格列洛和/或TAM的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體可以用抗原來(lái)選擇或鑒別，例如，使用標(biāo)記的抗原或結(jié)合或捕獲于固體表面或珠粒上的抗原。類(lèi)似地，除了替格列洛和/或TAM之外，結(jié)合抗原/半抗原的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以被鑒定用于去選擇?？捎糜谥谱鞅景l(fā)明的抗體的噬菌體展示方法的實(shí)例包括在以下文獻(xiàn)中披露的那些：布林克曼(Brinkman)等人，1995，免疫學(xué)方法雜志182:41-50；艾姆斯(Ames)等人，1995，免疫學(xué)方法雜志184:177-186；科托博洛(Kettleborough)等人，1994，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)24:952-958；帕斯克(Persic)等人，1997，基因(Gene)187:9-18；伯頓(Burton)等人，1994，免疫學(xué)進(jìn)展(AdvancesinImmunology)57:191-280；PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB91/O1134；PCT公開(kāi)號(hào)WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和WO97/13844；以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743以及5,969,108；這些文獻(xiàn)各自通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。如上文參考文獻(xiàn)中所述，在噬菌體選擇之后，來(lái)自噬菌體的抗體編碼區(qū)可以被分離并且用于產(chǎn)生包括人類(lèi)抗體的完整抗體或任何其他所希望的抗原結(jié)合片段(scFvs和Fab)，并且表達(dá)在任何所希望的宿主之中，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母以及細(xì)菌，例如如下文詳細(xì)描述的。重組產(chǎn)生Fab、Fab’以及F(ab')2片段的技術(shù)還可以使用在本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)加以利用，如在以下文獻(xiàn)中披露的那些方法：PCT公開(kāi)號(hào)WO92/22324；馬利納克斯(Mullinax)等人，1992，生物技術(shù)12(6):864-869；澤井(Sawai)等人，1995，美國(guó)生殖免疫雜志34:26-34；以及貝特爾(Better)等人，1988，科學(xué)(Science)240:1041-1043(所述參考文獻(xiàn)通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此)。在某些方面，可以將本文披露的核酸可操作地連接至表達(dá)構(gòu)建體中的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控核苷酸序列。編碼抗體輕鏈和重鏈的核酸序列能以任何方向(例如，輕鏈在重鏈前面，或反之亦然)克隆在相同的表達(dá)載體中，或者可以克隆在兩種不同的載體中。如果使用一種載體進(jìn)行表達(dá)，則兩種編碼基因可以具有它們自己的遺傳元件(例如，啟動(dòng)子、RBS、前導(dǎo)序列、終止、polyA等)，或者它們可以用一組遺傳元件克隆，但與順?lè)醋釉噙B。調(diào)控核苷酸序列通常適合用于表達(dá)的宿主細(xì)胞。用于多種主宿主胞的許多類(lèi)型的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體和適合的調(diào)控序列是本領(lǐng)域已知的。典型地，所述一個(gè)或多個(gè)調(diào)控核苷酸序列可以包括但不限于啟動(dòng)子序列、前導(dǎo)序列或信號(hào)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始序列和終止序列、翻譯起始和終止序列、以及增強(qiáng)子或激活序列。本披露期望如本領(lǐng)域已知的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是天然存在的啟動(dòng)子或組合一個(gè)以上啟動(dòng)子組分的雜合啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體可以存在于細(xì)胞中的附加體(例如質(zhì)粒)上，或表達(dá)構(gòu)建體可以插入染色體中。在某些方面，表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記基因以允許轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇。選擇標(biāo)記基因在本領(lǐng)域是熟知的并且將隨著使用的宿主細(xì)胞而變化。在某些方面，本披露涉及包含核苷酸序列的表達(dá)載體，所述核苷酸序列編碼多肽并且可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)控序列。調(diào)控序列是本領(lǐng)域公認(rèn)的并且被選擇為指導(dǎo)編碼的多肽的表達(dá)。因此，術(shù)語(yǔ)調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件。示例性的非限制性調(diào)控序列描述于哥德?tīng)?Goeddel)，基因表達(dá)技術(shù)：酶學(xué)中的方法(GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology)，學(xué)術(shù)出版社，加利福尼亞州圣地亞哥市(1990)中。應(yīng)當(dāng)理解的是，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以取決于這樣的因素，如將要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇和/或希望表達(dá)的蛋白質(zhì)的類(lèi)型。而且，還應(yīng)當(dāng)考慮載體的拷貝數(shù)、控制拷貝數(shù)的能力和由所述載體編碼的任何其他蛋白質(zhì)(例如抗生素標(biāo)記)的表達(dá)。用于產(chǎn)生本披露的抗體的方法可以包括例如用一種或多于一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體編碼抗體(例如，編碼重鏈和輕鏈或其可變區(qū)的單一載體；或兩個(gè)載體，一個(gè)編碼重鏈，一個(gè)編碼輕鏈或其可變區(qū))，所述宿主細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)以允許抗體的表達(dá)發(fā)生。可以從含有該抗體的細(xì)胞和培養(yǎng)基的混合物中分泌和分離抗體?？商娲?，抗體可以保留在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜部分中并且收獲、裂解細(xì)胞并分離蛋白質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)物包括宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基和其他副產(chǎn)物。適合的用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域熟知的。可以使用本領(lǐng)域已知的用于純化蛋白質(zhì)、抗體及其抗原結(jié)合抗體片段的技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞或二者中分離抗體，所述技術(shù)包括離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、超濾、電泳和免疫親和純化。在某些方面，將抗體制備為包含重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗體的抗原結(jié)合片段，其可以增加溶解度和促進(jìn)純化?？梢酝ㄟ^(guò)將克隆基因或其部分連接至載體來(lái)產(chǎn)生重組核酸，所述載體適合在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞(酵母、鳥(niǎo)類(lèi)、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物)或兩者中表達(dá)。用于產(chǎn)生重組多肽的表達(dá)載體包括質(zhì)粒和其他載體。例如，適合的載體包括以下類(lèi)型的質(zhì)粒：用于在原核細(xì)胞，例如大腸桿菌中表達(dá)的pBR322-衍生的質(zhì)粒、pEMBL-衍生的質(zhì)粒、pEX-衍生的質(zhì)粒、pBTac-衍生的質(zhì)粒以及pUC-衍生的質(zhì)粒。在某些方面，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有促進(jìn)載體在細(xì)菌中增殖的原核序列、以及在真核細(xì)胞中表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)真核轉(zhuǎn)錄單位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的載體為適合用于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例。這些載體中的一些用來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒(例如pBR322)的序列修飾，以促進(jìn)在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的復(fù)制和抗藥性選擇?？商娲兀梢允褂貌《镜难苌镉糜谠谡婧思?xì)胞中暫時(shí)表達(dá)蛋白質(zhì)，這些病毒如牛乳頭狀瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205)。在這些質(zhì)粒的制備和宿主生物的轉(zhuǎn)化中使用的多種方法是本領(lǐng)域熟知的。對(duì)于用于原核和真核細(xì)胞兩者的其他適合的表達(dá)系統(tǒng)、以及通用重組程序，參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(MolecularCloningALaboratoryManual)，第二版，薩姆布魯克(Sambrook)，弗里奇(Fritsch)和馬尼亞蒂斯(Maniatis)編，(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，1989)第16和17章。在一些情況下，通過(guò)使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組多肽可能是所希望的。這樣的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括PVL衍生的載體(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的載體(例如pAcUWl)和pBlueBac衍生的載體(例如含有β-gal的pBlueBacIII)。制備融合基因的技術(shù)是熟知的。本質(zhì)上，根據(jù)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行對(duì)編碼不同多肽/抗體序列的各種核酸片段的接合，采用用于連接、限制性?xún)?nèi)切酶消化的平端或交錯(cuò)端以提供適當(dāng)?shù)哪┒耍们榧尤胝承阅┒?，堿性磷酸酶處理以避免不希望的接合和酶連接。在其他方面，可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)，包括DNA自動(dòng)合成儀來(lái)合成融合基因。可替代地，可以使用錨定引物對(duì)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這產(chǎn)生兩個(gè)連續(xù)核酸片段之間的互補(bǔ)突出(complementaryoverhang)，所述連續(xù)基因片段可隨后進(jìn)行退火以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見(jiàn)，例如，現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，奧蘇伯爾(Ausubel)等人編，約翰威利父子出版公司(JohnWiley&Sons)：1992)。在一些方面，表達(dá)本文所述的任何核酸的表達(dá)載體可用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體。例如，可以在細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如，使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)抗體。其他適合的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一旦通過(guò)常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，然后就通過(guò)常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以便產(chǎn)生抗體。因此，本披露包括含有編碼抗體或其片段的多核苷酸的宿主細(xì)胞，該多核苷酸與異源啟動(dòng)子可操作地連接。在某些方面，重鏈和輕鏈兩者和/或重鏈和輕鏈可變區(qū)可以在宿主細(xì)胞中共表達(dá)(來(lái)自相同或不同的載體)以表達(dá)整個(gè)抗體。在某些方面，抗體的重鏈和輕鏈兩者均由單個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)。在某些方面，抗體的重鏈和輕鏈由多個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)。在某些方面，抗體的重鏈和輕鏈在單個(gè)載體上編碼。在某些方面，抗體的重鏈和輕鏈在多個(gè)載體上編碼。作為用于表達(dá)重組抗體的宿主可獲得的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是在本領(lǐng)域中已知的，并且包括許多可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的永生化細(xì)胞系，包括但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、海拉細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，HepG2)、人上皮腎293細(xì)胞、以及多種其他細(xì)胞系。不同的宿主細(xì)胞具有針對(duì)蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾的特征性和特異性機(jī)制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以便確保所表達(dá)的抗體或其部分的正確修飾和加工。為此，可以使用具有用于初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的適當(dāng)加工、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)器(cellularmachinery)的真核宿主細(xì)胞。這類(lèi)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不內(nèi)源性地產(chǎn)生任何功能性免疫球蛋白鏈的鼠骨髓瘤細(xì)胞系)、SP20、CRL7O3O以及HsS78Bst細(xì)胞。在一方面，通過(guò)使人淋巴細(xì)胞永生化而產(chǎn)生的人細(xì)胞系可以用來(lái)重組產(chǎn)生單克隆抗體。在一方面，可以使用人細(xì)胞系PER.C6.(庫(kù)賽爾公司(Crucell)，荷蘭)以重組方式產(chǎn)生單克隆抗體?？梢杂米鞅磉_(dá)重組抗體的宿主的另外的細(xì)胞系包括但不限于昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如Sf21/Sf9，粉紋夜蛾(Trichoplusiani)Bti-Tn5b1-4)或酵母細(xì)胞(例如啤酒酵母(S.cerevisiae)、畢赤酵母屬(Pichia)、US7326681；等)、植物細(xì)胞(US20080066200)；以及雞細(xì)胞(WO2008142124)。在某些方面，本披露的抗體在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。穩(wěn)定表達(dá)可用于長(zhǎng)期、高產(chǎn)量地生產(chǎn)重組蛋白、抗體及其抗原結(jié)合片段。例如，可以產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系?？梢杂冒磉_(dá)控制元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等)和選擇性標(biāo)志基因的適當(dāng)工程化的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在引入外源DNA后，可以允許細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，并且然后切換至選擇性培養(yǎng)基。在重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記賦予對(duì)選擇的抗性，并且允許將質(zhì)粒穩(wěn)定整合進(jìn)其染色體中的細(xì)胞生長(zhǎng)并且形成病灶，進(jìn)而可以將其克隆并且擴(kuò)增成細(xì)胞系。用于以高產(chǎn)量產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的方法是在本領(lǐng)域中熟知的，并且試劑通常是可商購(gòu)的。在某些方面，本披露的抗體在細(xì)胞系中瞬時(shí)表達(dá)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是這樣一種方法：在該方法中引入細(xì)胞的核酸不會(huì)整合至該細(xì)胞的基因組或染色體DNA中。事實(shí)上該核酸被維持作為細(xì)胞中的染色體外元件，例如，作為附加體。附加體的核酸的轉(zhuǎn)錄過(guò)程不受影響，并且產(chǎn)生由附加體的核酸編碼的蛋白質(zhì)。穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系被維持在本領(lǐng)域中熟知的產(chǎn)生單克隆抗體的表達(dá)和產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)基和條件中。在某些方面，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是基于可商購(gòu)的培養(yǎng)基配制品，包括例如DMEM或漢姆氏(Ham's)F12。在其他方面，將細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行改良以便支持細(xì)胞生長(zhǎng)和生物蛋白表達(dá)兩者的增長(zhǎng)。如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)基”、以及“培養(yǎng)基配制品”是指在一個(gè)多細(xì)胞有機(jī)體或組織以外的一個(gè)人工體外環(huán)境中用于細(xì)胞的維持、生長(zhǎng)、繁殖、或擴(kuò)增的營(yíng)養(yǎng)液?？梢詫⒓?xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)化以用于特定的細(xì)胞培養(yǎng)用途，包括例如，被配制來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)培養(yǎng)基，或者被配制來(lái)促進(jìn)重組蛋白產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)培養(yǎng)基。術(shù)語(yǔ)營(yíng)養(yǎng)素、成分、以及組分(component)在此可互換地使用，是指組成細(xì)胞培養(yǎng)基的組分(constituent)。一旦分子已經(jīng)產(chǎn)生，就可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的用于免疫球蛋白分子及其片段的純化的任何方法將其純化，例如，通過(guò)色譜法(例如，離子交換、親和力(特別是通過(guò)對(duì)于特定抗原的親和力、蛋白A或蛋白G)，以及尺寸分級(jí)柱色譜)、離心、差別溶解度，或者通過(guò)用于蛋白質(zhì)、抗體、和/或抗體片段的純化的任何其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。此外，本披露的分子或其片段可以融合至本文所描述的或者本領(lǐng)域中另外已知的異源多肽序列(在此稱(chēng)為“標(biāo)簽”，如組氨酸標(biāo)簽)，以便促進(jìn)純化。在使用重組技術(shù)時(shí)，分子可以細(xì)胞內(nèi)、在周質(zhì)間隙中產(chǎn)生，或直接分泌至培養(yǎng)基之中。如果分子是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，那么作為第一步，(例如)通過(guò)離心或超濾去除宿主細(xì)胞或溶解片段的顆粒碎片?？ㄌ?Carter)等人，生物/技術(shù)(Bio/Technology)，10:163-167(1992)描述了一種用于分離分泌到大腸桿菌的周質(zhì)空間中的抗體的程序。在分子分泌到培養(yǎng)基中的情況下，通常首先使用可商購(gòu)的蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元)對(duì)來(lái)自這類(lèi)表達(dá)系統(tǒng)的上清液進(jìn)行濃縮。蛋白酶抑制劑如PMSF可以被包括在任何前述步驟中以便抑制蛋白水解，并且抗生素可以被包括來(lái)防止外來(lái)污染物的生長(zhǎng)。從細(xì)胞制備的組合物可以單獨(dú)使用例如羥基磷灰石色譜、疏水相互作用色譜、離子交換色譜、凝膠電泳、滲析和/或親和色譜或與其他純化步驟組合來(lái)純化。蛋白A作為親和配體的適合性取決于分子中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類(lèi)和同種型并且將由本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解。附接有親和配體的基質(zhì)最常為瓊脂糖，但其他基質(zhì)也是可用的。在機(jī)械上穩(wěn)定的基質(zhì)如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允許比用瓊脂糖可以實(shí)現(xiàn)的更快的流速和更短的處理時(shí)間。取決于待回收的分子也可用其他蛋白質(zhì)純化技術(shù)，如離子交換柱上分級(jí)分離、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上色譜、肝素上色譜、陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(如聚天冬氨酸柱)上SEPHAROSE色譜、色譜聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸銨沉淀。在任何一個(gè)或多個(gè)初步純化步驟之后，包含感興趣的分子和污染物的混合物可以經(jīng)受低pH疏水性相互作用色譜，該色譜使用pH介于約2.5與4.5之間的一種洗脫緩沖液并且在低鹽濃度(例如，從約0至0.25M鹽)下進(jìn)行?？梢允褂美缟衔暮?或?qū)嵗兴龅娜魏我环N或組合的技術(shù)制備和純化抗體。不管抗體如何被純化，為了證實(shí)本披露的抗體的功能性結(jié)合，可以進(jìn)行結(jié)合測(cè)定(在純化之前和/或之后)。例如，可以使用雙重ELISA測(cè)定。在一些方面，將第一抗原(例如替格瑞洛或其競(jìng)爭(zhēng)劑)包被在孔上，并且與該抗原的結(jié)合固定抗體，準(zhǔn)備用于檢測(cè)。藥用配制品在某些方面，本披露提供藥物組合物。這類(lèi)藥物組合物可以是包含編碼抗體的核酸分子的組合物。這類(lèi)藥物組合物還可以是包含抗體、或抗體的組合、以及藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。在某些方面，本披露的藥物組合物用作藥劑。在某些方面，抗體或抗體的組合(或編碼一種抗體或抗體組合的核酸分子)可以與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑一起配制成藥物組合物。在某些方面，這類(lèi)藥物組合物適于使用本領(lǐng)域中已知的方法經(jīng)由任何一個(gè)或多個(gè)給予途徑來(lái)給予人或非人動(dòng)物。如熟練的業(yè)內(nèi)人士將理解，給予途經(jīng)和/或方式將隨所希望的結(jié)果而變化。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指不干擾活性成分的生物活性的有效性的一種或多種無(wú)毒材料。此類(lèi)制劑常規(guī)地可以含有鹽、緩沖劑、防腐劑、相容的載體以及任選地其他治療劑。這類(lèi)藥學(xué)上可接受的制劑還可以含有適合于給予人的相容的固體或液體填料、稀釋劑或包封物質(zhì)?？梢杂糜谠诖怂枋龅呐渲破分械钠渌O(shè)想的載體、賦形劑、和/或添加劑包括：例如，調(diào)味劑、抗微生物劑、增甜劑、抗氧化劑、抗靜電劑、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)賦形劑(如血清白蛋白、明膠、酪蛋白)、成鹽平衡離子(如鈉)等等。適合用于在此所描述的配制品中的這些和另外已知的藥物載體、賦形劑和/或添加劑是本領(lǐng)域中已知的，例如，如“雷明頓藥物科學(xué)與實(shí)踐(Remington:TheScience&PracticeofPharmacy)”，第21版，利平科特威廉斯與威爾金斯出版公司(LippincottWilliams&Wilkins)(2005)以及“醫(yī)師案頭參考(Physician’sDeskReference)”，第60版，醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)出版社(MedicalEconomics)，蒙特維爾(Montvale)，新澤西(2005)中所列出?？梢赃x擇對(duì)于所希望或所要求的給予方式、溶解度和/或穩(wěn)定性來(lái)說(shuō)合適的藥學(xué)上可接受的載體。在此所述的配制品包含處于產(chǎn)生適用于所希望的劑量的w/v的濃度的活性劑(例如抗體或抗體片段，例如Fab或scFv)。在某些方面，活性劑在配制品中以約1mg/ml至約200mg/ml、約1mg/ml至約100mg/ml、約1mg/ml至約50mg/ml、或1mg/ml與約25mg/ml的濃度存在。在某些方面，活性劑以約25mg/ml的濃度存在。在某些方面，配制品中活性劑的濃度可以從約0.1重量％至約100重量％變化。在某些方面，活性劑的濃度的范圍是0.003至1.0摩爾濃度。在一方面，本披露的配制品是基本上不含內(nèi)毒素和/或相關(guān)熱原物質(zhì)的無(wú)熱原配制品。內(nèi)毒素包括限制在微生物體內(nèi)并且僅當(dāng)微生物破壞或死亡時(shí)才釋放出來(lái)的毒素。熱原物質(zhì)還包括來(lái)自細(xì)菌和其他微生物外膜的誘導(dǎo)發(fā)熱的熱穩(wěn)定的物質(zhì)(糖蛋白類(lèi))。如果向人類(lèi)給予這兩種物質(zhì)，會(huì)引起發(fā)熱、低血壓和休克。由于潛在的有害影響，即使低量的內(nèi)毒素也必須從靜脈內(nèi)給予的藥物溶液中去除。食品與藥物管理局(“FDA”)已經(jīng)針對(duì)靜脈內(nèi)藥物給予，設(shè)置了在單個(gè)一小時(shí)內(nèi)每公斤體重每劑量的5個(gè)內(nèi)毒素單位(EU)的上限(TheUnitedStatesPharmacopeialConvention，PharmacopeialForum(美國(guó)藥典委員會(huì)，藥典論壇)26(1):223(2000))。在某些具體方面，組合物中的內(nèi)毒性和熱原水平是小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。當(dāng)用于體內(nèi)給予時(shí)，本披露的配制品應(yīng)是無(wú)菌的。本披露的配制品可以通過(guò)各種滅菌方法來(lái)滅菌，這些滅菌方法包括無(wú)菌過(guò)濾、輻射等等。在一個(gè)方面，配制品用一個(gè)預(yù)先滅菌的0.22-微米的濾器來(lái)過(guò)濾滅菌。用于注射的無(wú)菌組合物可以根據(jù)“雷明頓藥物科學(xué)與實(shí)踐”，第21版，利平科特威廉斯威爾金斯出版公司(2005)中描述的常規(guī)藥學(xué)實(shí)踐來(lái)配制。本披露的治療組合物可以配制用于特定的給予途經(jīng)，如口服、經(jīng)鼻、經(jīng)肺、局部(包括經(jīng)頰和舌下)、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道和/或腸胃外給予。如在此使用的措辭“腸胃外給予(parenteraladministration)”和“腸胃外地給予(administeredparenterally)”是指除了腸道和局部給予以外的給予方式，通常通過(guò)注射，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬腦膜外以及胸骨內(nèi)注射和輸注。本披露的適合于局部或經(jīng)皮給予的配制品包括粉劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳劑、洗劑、凝膠劑、溶液、貼劑以及吸入劑?？贵w可以在無(wú)菌條件下與藥學(xué)上可接受的載體混合、并且與可能要求的任何防腐劑、緩沖劑、或推進(jìn)劑混合(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,378,110；7,258,873；7,135,180；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)2004-0042972；以及2004-0042971)。這些配制品可以合宜地呈現(xiàn)為單位劑型，并且可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)制備。本披露的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可以變化以便于獲得有效實(shí)現(xiàn)對(duì)于具體的患者、組合物、以及給予方式來(lái)說(shuō)希望的治療應(yīng)答而對(duì)患者無(wú)毒的量(例如，“治療有效量的”)的活性成分。選擇的劑量水平將取決于各種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所采用的具體組合物的活性、給予途徑、給予時(shí)間、所采用的具體化合物的排泄率、治療持續(xù)時(shí)間，與所采用的具體組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料，所治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康和先前病史、以及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的類(lèi)似因素。合適劑量的范圍可以是從約0.0001至約100mg/kg體重或更大，例如約0.1、1、10、或50mg/kg體重，其中約1至約10mg/kg體重是合適的。應(yīng)注意，本披露類(lèi)似地涵蓋：還可以制備適于診斷和研究使用的配制品。這類(lèi)配制品中的活性劑的濃度以及賦形劑和/或熱原的存在或缺乏可以基于具體應(yīng)用和預(yù)期用途來(lái)選擇。用途本文披露的抗體可用于治療方法，包括聯(lián)合治療，用于中和血小板活化、聚集和脫顆粒的抑制劑，血小板分解促進(jìn)劑和抗血栓形成劑的活性。因此，本文所述的抗體可用于與替格瑞洛的給予(包括伴隨方法)相關(guān)的許多應(yīng)用中，并且適合用于中和替格瑞洛和/或替格瑞洛的一種或多種代謝物的作用。在這樣的方法中，該抗體可以任選地可逆地減少、中和、消除或否則抑制替格瑞洛的活性，并治療或預(yù)防與替格瑞洛給予相關(guān)的和/或由包含替格瑞洛的治療產(chǎn)生的許多效應(yīng)、病癥和/或癥狀?？贵w可以給予至正在接受治療的患者，或者需要治療或預(yù)防可治療的適應(yīng)癥和/或具有適于替格瑞洛(倍林達(dá))的適應(yīng)癥的患者，適應(yīng)癥包括例如不穩(wěn)定心絞痛、動(dòng)脈粥樣硬化的原發(fā)性動(dòng)脈血栓并發(fā)癥如血栓形成性或栓塞性中風(fēng)、短暫性缺血發(fā)作、外周血管疾病、伴有或不伴有溶栓的心肌梗死、由于動(dòng)脈粥樣硬化疾病的動(dòng)脈并發(fā)癥(例如血管成形術(shù)，包括冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PTCA)、內(nèi)膜切除術(shù)、支架置入、冠狀動(dòng)脈和其他血管移植手術(shù))、手術(shù)或機(jī)械損傷的血栓性并發(fā)癥(例如意外或手術(shù)創(chuàng)傷后的組織補(bǔ)救、包括皮膚和肌肉瓣的重建手術(shù))、具有彌散性血栓形成/血小板消耗組分的病癥(例如彌散性血管內(nèi)凝血、血栓性血小板減少性紫癜、溶血性尿毒癥綜合征、敗血癥的血栓形成并發(fā)癥、成人呼吸窘迫綜合征、抗磷脂綜合征、肝素誘發(fā)的血小板減少癥和先兆子癇/子癇)、或靜脈血栓形成(如深靜脈血栓形成)、靜脈閉塞性疾病、血液病癥(如骨髓增生性疾病，包括血小板增多癥、鐮狀細(xì)胞疾病)；或預(yù)防體內(nèi)機(jī)械誘導(dǎo)的血小板活化，例如心肺旁路和體外膜氧合(預(yù)防微血栓栓塞)，體外機(jī)械誘導(dǎo)的血小板活化，例如用于保存血液制品如血小板濃縮物、或分流阻塞例如腎透析和血漿置換、繼發(fā)于血管損傷/炎癥的血栓形成如血管炎、動(dòng)脈炎、腎小球腎炎、炎性腸病和器官移植排斥、病癥(如偏頭痛)。在一些實(shí)施例中，本文披露的抗體可以給予至正接受或已經(jīng)接受包含替格瑞洛的治療的患者，以及需要治療或即將需要治療的患者，用于與冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)、心胸外科手術(shù)、縱隔再探查、術(shù)后中風(fēng)、機(jī)械通氣、在重癥監(jiān)護(hù)室長(zhǎng)期停留、緊急非心臟手術(shù)(例如神經(jīng)或眼科手術(shù)、脊柱手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)，眼眶外科手術(shù)、整形外科手術(shù)、腎切除術(shù)、半結(jié)腸切除術(shù)等)相關(guān)的出血或潛在出血。因此，本文提供的方法可以包括將抗體作為與替格瑞洛的共治療劑(同時(shí))給予，或在替格瑞洛給予(例如，分鐘，小時(shí)或天)后的一段時(shí)間內(nèi)給予。例如，在一些實(shí)施例中，該方法可包括在替格瑞洛給予的10-120分鐘內(nèi)向已經(jīng)給予替格瑞洛的患者給予抗體。在一些實(shí)施例中，該方法可包括在替格瑞洛給予的1-48小時(shí)內(nèi)向已經(jīng)給予替格瑞洛的患者給予抗體。在一些實(shí)施例中，將抗體給予至已經(jīng)在不允許從受試者中代謝和消除替格瑞洛和/或其代謝物的時(shí)間量?jī)?nèi)給予替格瑞洛的受試者。在一些實(shí)施例中，本披露提供了抑制替格瑞洛或其活性代謝物對(duì)患者中的(P2Y12)受體的作用的方法。在一些實(shí)施例中，本披露提供了抑制替格瑞洛或其活性代謝物與患者體內(nèi)的P2Y12受體結(jié)合的方法。在一些實(shí)施例中，本披露提供了在已經(jīng)給予替格瑞洛的患者中激活A(yù)DP誘導(dǎo)的血小板聚集的方法。本披露的抗體，例如實(shí)例中舉例說(shuō)明的那些，也可用于診斷目的。例如，可在受試者的組織或細(xì)胞中檢測(cè)一種或多種靶向因子(替格瑞洛或其代謝物)，以確定或篩選受試者中替格瑞洛的循環(huán)量。診斷試劑盒可以包含一種或多種抗體，以及用于指示抗體與替格瑞洛或其代謝物(如果存在的話)的反應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)。因此，本披露涵蓋抗體的許多用途，包括治療、診斷和研究用途。診斷和研究用途可以是體內(nèi)的或離體的。試劑盒本披露的另一方面是試劑盒。在一個(gè)方面，試劑盒包含上述核酸、抗體、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞的任何組合物或藥物組合物，以及指導(dǎo)適當(dāng)使用或給予的說(shuō)明書(shū)或標(biāo)簽。任選地，試劑盒還可以包括一個(gè)或多個(gè)容器和/或注射器或其他裝置以便于遞送或使用。本披露考慮用于進(jìn)行研究測(cè)定、診斷測(cè)定和/或用于給予治療有效量的組分的全部或任何子集可以封裝在試劑盒中。類(lèi)似地，試劑盒可以包括通過(guò)例如在合適的條件下培養(yǎng)表達(dá)編碼本披露的抗體的核酸的宿主細(xì)胞來(lái)制備抗體的說(shuō)明書(shū)。作為另外的實(shí)例，本披露的抗體的治療性給予的試劑盒可以包含含有抗體的藥物配制品的溶液或抗體的凍干制劑，以及用于將該組合物給予至向?qū)ζ溆行枰幕颊叩恼f(shuō)明書(shū)，和/或用于重構(gòu)凍干產(chǎn)物的說(shuō)明書(shū)。在某些實(shí)施例中，試劑盒還包含以適于給予至受試者的處于配制品中的替格瑞洛(例如，倍林達(dá)TM(BRILINTATM，BRILIQUETM))。在這樣的實(shí)施例中，試劑盒還可以包括向需要用抗體、替格瑞洛或抗體和替格瑞洛兩者治療的患者給予抗體和替格瑞洛配制品的說(shuō)明書(shū)。本披露還涵蓋完成包裝的并且?guī)?biāo)簽的藥物產(chǎn)品。這種制造物品包括在適當(dāng)器皿或容器(例如，玻璃小瓶或其他密封容器)中的適當(dāng)?shù)膯挝粍┬?。在適于腸胃外給予的劑型的情況下，活性成分，例如上述抗體和/或替格瑞洛配制品是無(wú)菌的，并且適于作為無(wú)顆粒溶液給予。在某些方面，所述配制品適合于可注射的給予途徑。在一些實(shí)施例中，該給予是皮下給予。在一些實(shí)施例中，該給予是靜脈內(nèi)給予。因此，考慮包括注射或輸注給人或動(dòng)物的給予途徑。在特定的方面，將本披露的配制品配制為在單劑量小瓶中的無(wú)菌液體。示例性的容器包括但不限于小瓶、瓶子、預(yù)填充注射器、IV包、泡罩包裝(包含一個(gè)或多個(gè)藥丸)。任選地，與這樣一個(gè)或多個(gè)容器相關(guān)的可以是由管理藥物或生物制品的制造、使用或銷(xiāo)售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式的公告，所述公告反映針對(duì)人類(lèi)診斷和/或給予的政府機(jī)構(gòu)對(duì)制造、使用或銷(xiāo)售的許可。與任何藥物產(chǎn)品一樣，包裝材料和容器被設(shè)計(jì)為在儲(chǔ)存和裝運(yùn)期間保護(hù)產(chǎn)品的穩(wěn)定性。此外，本披露的產(chǎn)品包括建議醫(yī)師、技術(shù)員或患者關(guān)于如何適當(dāng)預(yù)防或治療所討論的疾病或病癥的使用說(shuō)明書(shū)或其他信息材料。換句話說(shuō)，制造物品包括指示或建議給藥方案(包括但不限于實(shí)際劑量、監(jiān)測(cè)程序、等)，以及其他監(jiān)測(cè)信息的說(shuō)明書(shū)工具。用于診斷測(cè)定的試劑盒可以包含本披露的含有抗體的溶液或抗體的凍干制劑，以及用于檢測(cè)這樣的抗體的試劑，其中該抗體特異性結(jié)合替格瑞洛和/或其代謝物?？贵w可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法標(biāo)記，包括但不限于例如小分子熒光標(biāo)簽、蛋白質(zhì)例如生物素、GFP或其他熒光蛋白，或表位序列例如his或myc的標(biāo)記物。類(lèi)似地，用于檢測(cè)抗體的一抗可以包括在試劑盒中。一抗可以針對(duì)抗體上的序列或針對(duì)標(biāo)記的抗體的標(biāo)記物、標(biāo)簽或表位。一抗可以進(jìn)而被標(biāo)記用于檢測(cè)，或者如果需要進(jìn)一步擴(kuò)增信號(hào)，則一抗可以通過(guò)二抗檢測(cè)，二抗也可以包括在試劑盒中。也考慮用于研究用途的試劑盒。這樣的試劑盒可以例如類(lèi)似于旨在用于診斷或治療用途的試劑盒，但還包括指定試劑盒及其使用僅限于研究目的的標(biāo)簽。實(shí)例縮寫(xiě)列表縮寫(xiě)說(shuō)明ACN乙腈br寬峰BSA牛血清白蛋白CV柱體積d二重峰dd雙二重峰DCM二氯甲烷DMFN,N-二甲基甲酰胺DMSO二甲基亞砜DPBS杜爾貝科氏磷酸鹽緩沖鹽水EDC1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EtOAc乙酸乙酯FA甲酸HOAc乙酸HPLC高效液相色譜HRMS高分辨率質(zhì)譜HTS高通量篩選均相時(shí)間分辨熒光助濾劑，煅燒的助熔劑，用碳酸鈉處理Hz赫茲J偶聯(lián)常數(shù)LC液相層析法m多重峰MS質(zhì)譜NMR核磁共振OAc乙酸鹽Pd/C鈀炭pM皮摩爾PK/PD藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)KF氟化鉀q四重峰r.t.室溫s單峰sat.飽和的scFv單鏈片段變量t三重峰TFA三氟乙酸TEA三乙基胺TBME叔丁基甲醚THF四氫呋喃TIM替格瑞洛無(wú)活性代謝物TLC薄層色譜術(shù)TR-FRET時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)例1：半抗原的制備和表征本實(shí)例描述了用于產(chǎn)生如本文所述的示例性抗體的幾種半抗原的合成、優(yōu)化、分離和表征的方法。該半抗原包括替格瑞洛、替格瑞洛代謝物(TAM和TIM)、生物素化替格瑞洛和生物素化的腺苷(參見(jiàn)例如圖2的非生物素化形式的半抗原化學(xué)結(jié)構(gòu))。如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO2000/034283(蓋爾(Guile)等人，2000)中所述合成替格瑞洛，且如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO1999/005143(蓋爾(Guile)等人，1999)中所述合成TAM，將其各自通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。使用Biotage硅膠40S、40M、12i或Merck硅膠60(0.063-0.200mm)進(jìn)行直相色譜法。使用標(biāo)準(zhǔn)玻璃柱或塑料柱或在BiotageHorizon系統(tǒng)上進(jìn)行快速色譜法。用溶劑作為內(nèi)標(biāo)，以ppm給出化學(xué)位移。僅在NMR中檢測(cè)時(shí)報(bào)告雜原子如NH和OH質(zhì)子上的質(zhì)子，因此該質(zhì)子可能缺失。實(shí)例1.1：生物素化替格瑞洛N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,3-二羥基環(huán)戊基)氧基)乙基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(1.1)(i)2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環(huán)戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)氧基)乙基甲烷磺酸鹽(1.a)的制備將甲磺酰氯(0.086mL，1.10mmol)在0℃下逐滴添加至2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環(huán)戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)氧基)乙醇(參見(jiàn)斯普朗索普(Springthorpe)，B.等人，生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)快報(bào)(Bioorg.Med.Chem.Lett.)，2007,17,6013-6018)(0.563g，1.0mmol)和TEA(0.209mL，1.50mmol)在DCM(5mL)的溶液中。將混合物從0℃至5℃經(jīng)3h攪拌。將該反應(yīng)混合物用DCM(30mL)稀釋?zhuān)⑶矣盟?5mL)洗滌。將混合物通過(guò)穿過(guò)相分離器干燥。蒸發(fā)溶劑并從甲苯共蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物(1.a)(714mg，111％)，為黃色粘稠油狀物，其未經(jīng)進(jìn)一步純化而直接以粗制品使用。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.02-1.47(m,1H),1.55-1.72(d,2H),2.20-2.71(m,1H),2.97(dd,2H),3-3.19(m),3.57-3.68(m,1H),3.69-3.79(m,1H),4.02-4.24(m,1H),4.78(s,3H),5.13(s,3H),5.57(d,2H),6.50(d,2H),7.03(s,1H),7.07(s,1H)。19FNMR(376MHz,CDCl3)δ-141.37(J＝21.3),-138.10(J＝21.3)。(ii)3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-疊氮乙氧基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環(huán)戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.b)的制備將2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環(huán)戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)氧基)乙基甲烷磺酸鹽(1.a)(0.641g，1mmol)和疊氮化鈉(0.070mL，2.00mmol)在DMF(7mL)中的混合物加熱至60℃，并在氮?dú)猸h(huán)境下保持15.5h。形成白色沉淀。添加水(20mL)，產(chǎn)物用TBME(100+40mL)萃取兩次。將有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥。將有機(jī)相過(guò)濾且在減壓下除去溶劑。殘余物通過(guò)快速色譜法在2×8cm硅膠柱上純化，使用庚烷/EtOAc1/1作為洗脫劑(TLC使用庚烷/EtOAc1/1(Rf產(chǎn)物＝0.5))。收集相關(guān)餾分并蒸發(fā)溶劑，得到透明稠油狀的標(biāo)題化合物(1.b)(514mg，87％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.00-1.46(m,2H),1.42(q,1H),1.59-1.73(m,1H),2.17(dd,2H),2.68(t,2H),2.96(s,3H),3.19-3.33(m,4H),3.52-3.63(m,1H),3.72(s,3H),4.03(s,1H),4.79(d,1H),5.13(s,1H),5.54(d,2H),6.43(s,1H),6.96(d,2H)。(iii)中間體3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-氨基乙氧基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環(huán)戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.c)的制備將在EtOH(99.5％)(2mL)中的3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-疊氮乙氧基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環(huán)戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.b)(62.0mg，0.11mmol)添加至Pd/C(5％Pd，50wt％Pd/C，22.46mg，5.28μmol)并且混合物在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下氫化2h。將反應(yīng)混合物通過(guò)過(guò)濾，并用EtOH(99.5％)進(jìn)一步?jīng)_洗塞子。在減壓下除去溶劑，將殘余物再溶解于DCM(2×2mL)中，并在減壓下除去溶劑。殘余物通過(guò)快速色譜法在2×8cm硅膠柱上純化，使用在MeOH95/5中的DCM/NH3(飽和的)作為洗脫劑。收集相關(guān)餾分，得到標(biāo)題化合物(1.c)(41mg，69％)。1HNMR(400MHz；CDCl3):δ0.98(d,3H),1.28(d,3H),1.54(t,3H),1.621.81(m,1H),2.15(s,3H),2.48(dt,1H),2.81(d,1H),3.07(d,1H),3.34(dd,1H),3.53(d,1H),3.99(dd,1H),4.79(dd,1H),5.12(dd,1H),5.52(d,1H),7.02(t,1H),7.09-7.67(m,2H),7.23(s,1H)。19FNMR(376MHz,CDCl3)δ-141.43(J＝21.3),-138.13(J＝21.3)。(iv)中間體(1S,2S,3S,5R)-3-(2-氨基乙氧基)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)環(huán)戊烷-1,2-二醇(1.d)的制備將已預(yù)冷的、冰/水浴溫度的TFA(8mL，103.84mmol)和水(0.88mL，48.85mmol)的混合物添加至已預(yù)冷的盛有3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-氨基乙氧基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環(huán)戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.c)(340mg，0.61mmol)的燒瓶中。在0℃-5℃下將該反應(yīng)混合物攪拌1h。在減壓下除去溶劑，并且將殘余物溶于DCM(100mL)中，用NaHCO3(飽和的，10mL)進(jìn)行洗滌。將鹽水(5mL)添加至水相中，并用EtOAc(30mL)萃取。將合并的有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥。過(guò)濾，然后蒸發(fā)溶劑，得到粗產(chǎn)物，為灰白色固體。將該化合物通過(guò)制備型HPLC在XBridgeC18柱(10μm250x50IDmm)上使用梯度為于H2O/ACN/MeCN/AcOH95/5/0.2緩沖液中的35％-75％ACN，經(jīng)20分鐘以100mL/min的流速進(jìn)行純化。將這些化合物通過(guò)UV在298nm處檢測(cè)。將峰餾分在減壓下蒸發(fā)至干。將殘余物溶于DCM中，并且通過(guò)相分離器過(guò)濾。在減壓下除去溶劑，得到標(biāo)題化合物(1.d)(213mg，67.5％)。LC/MS:m/z522.3[M+H]+。(v)化合物N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,3-二羥基環(huán)戊基)氧基)乙基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺的制備。(1.1)將2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酸鹽(21.77mg，0.04mmol)添加至(1S,2S,3S,5R)-3-(2-氨基乙氧基)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)環(huán)戊烷-1,2-二醇(20mg，0.04mmol)在干DMF(1.0mL)的溶液中，并將混合物置于氮?dú)猸h(huán)境下并且室在溫下攪拌6h。將溶劑在減壓下在40℃下去除。將該化合物通過(guò)制備型HPLC在KromasilC18柱(10μm250x20IDmm)上使用梯度為于H2O/ACN/FA95/5/0.2緩沖液中的20％-60％ACN，經(jīng)20分鐘以19mL/min的流速進(jìn)行純化。將這些化合物通過(guò)UV在298nm處檢測(cè)。收集峰餾分，濃縮，并冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(1.1)(21.4mg，57.3％)。1HNMR(600MHz,DMSO)：存在兩種旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體(比例5:1)，來(lái)源于主要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的信號(hào)為δ0.81(t,3H),1.15-1.64(m,20H),2.03(ddd,7H)ddd,1H),2.57(d,1H),2.59-2.67(m,1H),2.77-2.89(m,2H),2.93(dd,1H),2.96-3.01(m,4H),3.05-3.12(m,1H),3.15(td,1H),3.18-3.25(m,2H),3.39-3.46(m,1H)1H),4.08-4.14(m,1H),4.30(dd,1H),4.54(dd,1H),4.95(q,1H),5.06(s,1H),5.13,1H),6.42(s,1H),7.07(d,1H),7.31(ddt,2H),7.71(dt,2H),7.82(t,1H),9.36(d,1H)。所選擇的、來(lái)自次要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的信號(hào)為δ0.98(CH3),8.95(ArNH)。HRMS計(jì)算為[[C45H65F2N11O7S2]+974.4556；發(fā)現(xiàn)值：974.4585(M+H)+實(shí)例1.2：生物素化的腺苷N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(1.2)(i)N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃[3,4-d][1,3]二氧-4-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(1.e)的制備在室溫下，將DMF(2mL)添加至2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酸鹽(55.6mg，0.10mmol)和9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(氨基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃[3,4-d][1,3]二氧-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(30mg，0.10mmol)中(參見(jiàn)奧斯汀(Austin)、D.J.和劉(Liu)、F.四面體快報(bào)(Tetrahedr.Lett.)2001,3153-3154)，并且將反應(yīng)混合物置于氮?dú)猸h(huán)境下，攪拌1小時(shí)45分鐘，得到(1.e)。隨后將溶劑在減壓下除去。以粗制品使用，無(wú)需進(jìn)一步純化。LC/MS:m/z＝759[M-H]-,757[M+H]+。(ii)最終化合物N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(1.2)的制備將TFA(1.8ml，23.36mmol)和水(0.2mL，11.10mmol)的混合物添加至粗的N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃[3,4-d][1,3]二氧-4-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(1.e)(76mg，0.1mmol)并且將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌1小時(shí)25分鐘。在減壓下除去溶劑并且將殘余物溶解于DMSO中。將該化合物通過(guò)制備型HPLC在XBridgeC18柱(10μm250x19IDmm)上使用梯度為于H2O/ACN/NH395/5/0.2緩沖液中的5％-45％ACN，經(jīng)20分鐘以19mL/min的流速進(jìn)行純化。將這些化合物通過(guò)UV在259nm處檢測(cè)。將峰餾分濃縮并冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(1.2)(50mg，69.6％)，為白色蓬松固體。1HNMR(600MHz,DMSO,40℃)δ1.17-1.26(m,4H),1.27-1.4(m,6H),1.43-1.54(m,7H),1.62(ddt,1H),1.99-2.06(m,4H),2.12(t,2H),2.58(d,1H),2.82(dt,1H),2.96-3.05(m,4H),3.05-3.14(m,1H),3.36(dt,1H),3.44(dt,1H),3.96(dd,1H),4.04(dd,1H),4.11-4.15(m,1H),4.29-4.33(m,1H),4.67(dd,1H),5.16(d,1H),5.38(d,1H),5.84(d,1H),6.29(s,1H),6.33(d,1H),7.25(s,2H),7.64(dt,2H),8.11(t,1H),8.16(s,1H),8.31(s,1H)。HRMS計(jì)算值為[[C32H50N10O7S]+719.3657；發(fā)現(xiàn)值：719.3667(M+H)+實(shí)例2：抗替格瑞洛/TAM抗體的分離和鑒定該實(shí)例說(shuō)明了可用于生產(chǎn)替格瑞洛及其代謝物的抗體的策略和技術(shù)，所述化合物與ATP具有結(jié)構(gòu)相似性并且含有腺苷樣核心(斯普朗索普(Springthorpe)等人，2007，生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)快報(bào)(Bioorg.Med.Chem.Lett.)17:6013-6018))。替格瑞洛/替格瑞洛活性代謝物(TAM)和替格瑞洛無(wú)活性代謝物(TIM)的化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖2中。如上討論的，本文披露和產(chǎn)生的抗體可以結(jié)合并中和替格瑞洛和TAM，并且可以結(jié)合TIM，但不結(jié)合或顯著抑制其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物例如腺苷。雖然對(duì)TIM的結(jié)合活性是在此披露的抗體的任選特征，但是預(yù)期顯示對(duì)TIM的結(jié)合活性的抗體不影響所需的抗體/解毒劑的劑量，因?yàn)門(mén)IM通常代表替格瑞洛代謝物的小的或不顯著的餾分。靶向共同的表位，即替格瑞洛和TAM的獨(dú)特的R基團(tuán)(二氟苯基-環(huán)丙基和硫丙基取代基)，以賦予這些化合物抗體結(jié)合特異性和選擇性。感興趣的表位由圖2中的虛線包圍。使用實(shí)例1中描述的半抗原將抗體表位指向二氟苯基-環(huán)丙基和硫丙基取代基。如實(shí)例1所述，生物素化半抗原(生物素化替格瑞洛和生物素化的腺苷)的接頭位于二醇基團(tuán)上。該策略允許產(chǎn)生對(duì)未修飾的二氟苯基-環(huán)丙基和硫丙基具有結(jié)合特異性的抗體，用于生物素化替格瑞洛/TAM，并且還能夠篩選和去選擇結(jié)合腺苷的抗體文庫(kù)。使用已知技術(shù)，使用人scFv噬菌體展示文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生scFv抗體，并且在對(duì)生物素化替格瑞洛的一系列重復(fù)選擇循環(huán)中以及對(duì)生物素化腺苷的一系列重復(fù)去選擇循環(huán)中從文庫(kù)中分離特異性scFv，基本上如下所述：勞埃德(Lloyd)等人，2009，蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)和選擇(PEDS)22:159-168，將其通過(guò)引用并入本文。選擇來(lái)自第2輪和第3輪選擇輸出的許多個(gè)體克隆，scFv在細(xì)菌周質(zhì)中表達(dá)并在三個(gè)平行生物化學(xué)測(cè)定中篩選特異性。針對(duì)以下各項(xiàng)篩選測(cè)試：i)結(jié)合生物素化替格瑞洛(測(cè)定1)，ii)結(jié)合生物素化的腺苷(測(cè)定2)和iii)在50倍過(guò)量的未修飾的替格瑞洛存在下結(jié)合生物素化替格瑞洛(測(cè)定3)，以確定替格瑞洛而不是生物素化接頭的特異性。使用相同的一般技術(shù)和策略進(jìn)行測(cè)定1、2和3。簡(jiǎn)言之，用于結(jié)合生物素化替格瑞洛或生物素化腺苷的粗周質(zhì)scFv樣品的HTS使用測(cè)定技術(shù)進(jìn)行。(均相時(shí)間分辨熒光)基于TR-FRET(時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的原理。簡(jiǎn)言之，TR-FRET利用能量從供體熒光團(tuán)(在這種情況下是銪的穴狀化合物)轉(zhuǎn)移到受體熒光團(tuán)(在這種情況下是XL665)。如果供體和受體熒光團(tuán)足夠接近(約<10m)，則銪的穴狀化合物供體的激發(fā)(337nm)導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移至XL665受體，接著在665nm發(fā)射熒光信號(hào)。該技術(shù)可以用于敏感地測(cè)量生物分子相互作用，其通過(guò)在特定相互作用中將供體和受體熒光團(tuán)(直接或間接)附接到每個(gè)結(jié)合配偶體。用于scFv與生物素化替格瑞洛結(jié)合的HTS格式(測(cè)定1)如下所示，并且依賴(lài)于生物素化替格瑞洛和his標(biāo)簽標(biāo)記的周質(zhì)scFv兩者上的化學(xué)標(biāo)簽的存在：銪螯合物鏈霉親和素：生物素化替格瑞洛：scFv-His：抗His-XL665在包含DPBSPh7.4(Gibco14190-086)、KF(VWR103444T)(0.4M)和Tween20(SigmaP9416)(0.05％)的緩沖液中進(jìn)行該測(cè)定，測(cè)定容量為10μl，使用黑色淺孔384孔測(cè)定板(Corning/Costar3676)。通過(guò)添加5μl生物素化替格瑞洛(60nM，終濃度為30nM)、2μl周質(zhì)scFv樣品(終濃度為20％)和3μl含有銪的穴狀化合物標(biāo)記的鏈霉親和素(CisBio610SAKLB)(4.2nM，終濃度為1.26nM)和XL665標(biāo)記的抗His抗體(CisBio61HISXLB)(40nM，終濃度為12nM)兩者的溶液設(shè)置測(cè)定。設(shè)置陰性結(jié)合對(duì)照孔，其含有上述所有測(cè)定組分，除了添加2μl測(cè)定緩沖液代替周質(zhì)scFv。將測(cè)定板在室溫下孵育4小時(shí)，然后使用標(biāo)準(zhǔn)HTRF讀取方案在Envision板讀數(shù)器上讀數(shù)，其中樣品在337nm處激發(fā)，并且在620nm和665nM處測(cè)量時(shí)間分辨熒光發(fā)射。原始665nm和620nm計(jì)數(shù)首先轉(zhuǎn)換成665nm/620nm比值，并且隨后結(jié)果表示為ΔF(％)值。根據(jù)以下等式計(jì)算ΔF：ΔF(％)＝{((樣品665/620比)-(陰性665/620比))/(陰性665/620比)}×100(陰性比獲得自陰性結(jié)合對(duì)照孔)。提供大于100％的ΔF值的scFv被定義為在該測(cè)定中的命中。使用與上述相同的方案進(jìn)行粗周質(zhì)scFv樣品的HTS以結(jié)合生物素化腺苷(最終測(cè)定濃度30nM)。測(cè)定2的格式可以描述如下：銪螯合物鏈霉親和素：生物素化腺苷：scFv-His：抗His-XL665測(cè)定3使用與上述相同的方案進(jìn)行HTS，其鑒定出在過(guò)量游離未修飾的替格瑞洛存在下顯示減少的與生物素化替格瑞洛的結(jié)合的粗周質(zhì)scFv樣品。該方案修改自測(cè)定1，因?yàn)闇y(cè)定3在50倍摩爾過(guò)量的游離的未修飾的替格瑞洛(1500nM)的存在下進(jìn)行。命中被定義為與生物素化替格瑞洛的結(jié)合(測(cè)定1中的ΔF>100％)、不結(jié)合生物素化的腺苷(測(cè)定2中ΔF<25％)和在過(guò)量游離的未修飾的替格瑞洛存在下與生物素化替格瑞洛的結(jié)合減少>50％。來(lái)自測(cè)定1和3的數(shù)據(jù)的示例性相關(guān)性顯示在圖3中。許多scFv在過(guò)量游離未修飾的替格瑞洛的存在下顯示有限的抑制，這意味著它們與替格瑞洛的一些組分和接頭具有結(jié)合相互作用。鑒定了scFv的一個(gè)子集，其中在過(guò)量游離未修飾的替格瑞洛的存在下抑制與生物素化替格瑞洛的結(jié)合(>50％)。scFv的分級(jí)基于在測(cè)定3與測(cè)定1中觀察到的結(jié)合的％抑制(50％-80％、80％-90％、>90％)進(jìn)行，其中給出>90％抑制的scFv(包括TICA0072)在進(jìn)一步表征中優(yōu)先。將序列獨(dú)特的scFv命中轉(zhuǎn)化為Fab，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在CHO細(xì)胞中表達(dá)。Fab表達(dá)和純化分離的HC和LC表達(dá)質(zhì)粒用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，基于波西卡(Persic)等人于1997年描述的表達(dá)載體。將載體修飾成含有EBV復(fù)制起點(diǎn)(OriP)。Fab(HC)載體僅含有恒定區(qū)1(CH1)和鉸鏈區(qū)，去除CH2和CH3。根據(jù)制造商的建議將HC和LCDNA添加至150mMNaCl和25-kDa線性PEI(歐洲聚合物科學(xué)(PolysciencesEurope)，德國(guó)，23966)中。然后將DNA-PEI復(fù)合物添加至來(lái)自適于懸浮培養(yǎng)的來(lái)源于CHOK1細(xì)胞系(ECACCNo：85051005)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢野生型(CHOwt)細(xì)胞(達(dá)瑞莫O(DaramolaO)等人，2014)。7天后，通過(guò)離心并過(guò)濾上清液收獲細(xì)胞。使用純化器(GE醫(yī)療集團(tuán))將含有Fab蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清液以5mL/min的流速直接加載到填充有5mlCaptureSelectIgG-CH1(美國(guó)卡爾斯巴德市生命技術(shù)公司)的色譜柱上。將柱平衡并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH7.2洗滌，并根據(jù)樹(shù)脂制造商的說(shuō)明書(shū)用20mM檸檬酸鈉、150mM氯化鈉，pH3.5(CaptureSelectIgG-CH1)洗脫。將洗脫的Fab調(diào)節(jié)至pH5.5，并在分析前過(guò)濾(0.22μmSteriflip，美國(guó)密理博EMD公司(MilliporeEMD))。使用DU520UV/vis分光光度計(jì)(美國(guó)布雷亞貝克曼庫(kù)爾特有限公司)，通過(guò)280nm處的吸光度測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。使用以1.0ml/min運(yùn)行的TSKgelG3000SWx1柱(日本東京東曹生命科學(xué)事業(yè)部(TosohBioscience))和1100HPLC系統(tǒng)(美國(guó)圣克拉拉市安捷倫科技有限公司)測(cè)定樣品純度。實(shí)例3：抗替格瑞洛/TAMFab查詢(xún)含有市售藥物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(“DrugsDB”，歐普拉(OpreaTI)等人，2011，分子發(fā)明(Mol.Inv.)30(2-3),100-111，通過(guò)引用并入本文)，以鑒定與替格瑞洛具有一定結(jié)構(gòu)相似性的分子。一旦鑒定，這些結(jié)構(gòu)相似的分子可用于測(cè)試Fab超過(guò)腺苷及其磷酸化形式(例如，ADP和ATP)的結(jié)合特異性?；谔娓袢鹇鍃射線和NMR結(jié)構(gòu)，查詢(xún)數(shù)據(jù)庫(kù)中與替格瑞洛具有2D指紋相似性、3D形狀和靜電相似性的分子。從該計(jì)算機(jī)分析中，選擇一組12種化合物，其包括六種潛在的聯(lián)合藥物。這些化合物的結(jié)構(gòu)顯示于圖4中。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定格式中研究特異性，其中測(cè)試每種測(cè)試化合物競(jìng)爭(zhēng)性抑制生物素化替格瑞洛與相關(guān)Fab的相互作用的能力。使用如下所述競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定格式，其中目標(biāo)是通過(guò)一組測(cè)試化合物測(cè)量與每個(gè)His-Fab結(jié)合的生物素化替格瑞洛的競(jìng)爭(zhēng)：銪螯合物抗His抗體：測(cè)試His-Fab：生物素化替格瑞洛：XL665標(biāo)記的鏈霉親和素。這種基本測(cè)定格式用于評(píng)價(jià)來(lái)自先導(dǎo)分離和先導(dǎo)優(yōu)化階段二者結(jié)束的前導(dǎo)Fab的選擇性圖譜，并且出于這些研究的目的，使用His-Fab表達(dá)載體產(chǎn)生Fab。在包含DPBSpH7.4(Gibco14190-086)、KF(VWR103444T)(0.4M)和BSA(PAAK05-013)(0.1％)的緩沖液中以20μl的測(cè)定體積在黑色淺孔384孔測(cè)定板(Corning/Costar3676)上進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定設(shè)置包括添加5μl生物素化替格瑞洛，5μl每種測(cè)試選擇性化合物的滴定，5μl相關(guān)His-Fab和5μl含有銪的穴狀化合物標(biāo)記的抗His抗體(CisBio61HISKLB)(5.33nM，終濃度為1.33nM)和XL665標(biāo)記的鏈霉親和素(CisBio611SAXLB)(40nM，終濃度為10nM)兩者的組合溶液。設(shè)置總結(jié)合對(duì)照孔，其含有上述所有測(cè)定組分，除了添加5μl測(cè)定緩沖液代替測(cè)試選擇性化合物的添加。設(shè)置陰性結(jié)合對(duì)照孔，其含有包含在總結(jié)合對(duì)照孔中的所有測(cè)定組分，除了添加5μl測(cè)定緩沖液代替His-Fab的添加。測(cè)試化合物連續(xù)滴定為1/2或1/3，取決于具體實(shí)驗(yàn)，并且基于化合物特異性?xún)?yōu)化頂部最終測(cè)定化合物濃度。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中基于Fab特異性來(lái)優(yōu)化生物素化替格瑞洛和His-Fab的濃度。對(duì)于在先導(dǎo)分離階段結(jié)束時(shí)研究的四種Fab(TICA0010、TICA0049、TICA0053和TICA0072)，所用的最終測(cè)定試劑濃度列于下表1中：表1抗體ID[抗體](nM)[生物素化替格瑞洛](nM)TICA003916.0139.9TICA004916.037.9TICA005316.070.7TICA00728.017.6對(duì)于在先導(dǎo)優(yōu)化階段結(jié)束時(shí)研究的兩種Fab(TICA0162和TICA0212)，在兩種情況下使用的最終測(cè)定試劑濃度為5nM生物素化替格瑞洛和1nMHisFab。將在這些實(shí)驗(yàn)中使用的幾種測(cè)試選擇性化合物溶解于100％DMSO中，并且測(cè)定信號(hào)中與載體相關(guān)的下降可以在高于約1％DMSO的濃度下開(kāi)始發(fā)生。為了使隨后的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化以校正任何這樣的載體相關(guān)效應(yīng)，單獨(dú)的DMSO的平行滴定包括在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，其中最終測(cè)定DMSO濃度相反測(cè)試化合物系列稀釋物。在設(shè)置程序結(jié)束時(shí)，將測(cè)定在室溫下孵育3小時(shí)，然后使用標(biāo)準(zhǔn)讀取方案在Envision讀板器上讀數(shù)。對(duì)于隨后的數(shù)據(jù)分析，首先將原始665nm和620nM計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換成665nm/620nm比值，然后根據(jù)測(cè)定1中所述的等式用上述比值計(jì)算％ΔF值。在計(jì)算％ΔF中使用的陰性比值來(lái)自陰性結(jié)合對(duì)照孔。然后使用％ΔF值根據(jù)以下等式計(jì)算％特異性結(jié)合值：特異性結(jié)合(％)＝{(樣品ΔF-陰性結(jié)合ΔF)/(總結(jié)合ΔF-陰性結(jié)合ΔF)}×100對(duì)于％特異性結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，總結(jié)合ΔF從總結(jié)合對(duì)照孔中獲得，對(duì)照孔包含該測(cè)定的所有上述組分但不包括任何競(jìng)爭(zhēng)測(cè)試化合物。在應(yīng)用DMSO標(biāo)準(zhǔn)化的那些實(shí)驗(yàn)中，基本上根據(jù)上述等式計(jì)算DMSO標(biāo)準(zhǔn)化的％特異性結(jié)合，除了在這種情況下從含有總結(jié)合對(duì)照孔中的所有組分的孔中獲得總結(jié)合ΔF，以及從相關(guān)樣品孔中獲得濃度相當(dāng)?shù)腄MSO。這種類(lèi)型的初始實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)在表2中。在所研究的四種初始Fab中的三種(TICA0010，TICA0049和TICA0053)中，化合物坎格雷洛顯示Fab與生物素化替格瑞洛的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。在TICA0049的情況下，泮托拉唑和利奈唑胺顯示部分競(jìng)爭(zhēng)性抑制。如表2所示，TICA0072Fab對(duì)十二種化合物中的十一種未表現(xiàn)出抑制，其中對(duì)泮托拉唑顯示弱的部分抑制。針對(duì)該第一系列實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的所有四種Fab都觀察到了未修飾的替格瑞洛和TAM的抑制，IC50值落在0.1μM至0.5μM的范圍內(nèi)。四種Fab中的兩種(TICA0049和TICA0072)對(duì)TIM檢測(cè)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制，然而，IC50值>50μM，表明相對(duì)于未修飾的替格瑞洛和TAM，TIM的親和力大大降低?；诒?中的結(jié)果，TICA0072被鑒定為具有最有利的選擇性圖譜?；谠揊ab在剩余的三種Fab中顯示最少結(jié)合坎格雷洛的標(biāo)準(zhǔn)，TICA0049被鑒定為潛在的備用物。表2.12種測(cè)試化合物中每一種(圖4)以及未修飾的替格瑞洛、TAM和TIM對(duì)生物素化替格瑞洛與每種測(cè)試Fab的結(jié)合的抑制的相對(duì)IC50值。NI表示沒(méi)有抑制。在第二系列實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于TICA0049和TICA0072Fab產(chǎn)生進(jìn)一步的選擇性數(shù)據(jù)，其中圖4中列出的12種化合物中的4種的子集與替格瑞洛、TAM和TIM以及幾種腺苷相關(guān)化合物一起重新測(cè)試。在這里，在表2中的早期研究的細(xì)化中，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以便能夠標(biāo)準(zhǔn)化百分比特異性結(jié)合值以校正由于DMSO引起的任何非特異性載體相關(guān)效應(yīng)。來(lái)自該第二系列實(shí)驗(yàn)的示例性繪圖數(shù)據(jù)以及表3中制成表的IC50值顯示在圖5中。表3.圖4中列出的十二種化合物中四種的子集、替格瑞洛、TAM、TIM和幾種腺苷家族化合物在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合選擇性研究中(DMSO標(biāo)準(zhǔn)化)的實(shí)例IC50結(jié)果化合物TICA0049TICA0072腺苷NINIADPNINI2MeSADPNINIATPNINI2MeSATPNINI布拉地新864.9NI利奈唑胺902.0NI坎格雷洛188.4NI泮托拉唑243.51546.0替格瑞洛0.3680.356TAM0.3660.483TIM74.8119.5與早期實(shí)驗(yàn)一樣，TICA0072顯示了最有利的選擇性圖譜，其中只有泮托拉唑在所測(cè)試的四種化合物內(nèi)顯示弱的部分抑制(IC50>1500μM)。在TICA0049的情況下，觀察到坎格雷洛和泮托拉唑的顯著抑制，觀察到利奈唑胺和布拉地新的弱抑制。應(yīng)當(dāng)注意，對(duì)于某些測(cè)試化合物，第一和第二系列實(shí)驗(yàn)之間的絕對(duì)IC50值的微小差異不會(huì)從根本上改變總體結(jié)論。這樣的差異可能源于這樣的事實(shí)，即DMSO標(biāo)準(zhǔn)化被結(jié)合到第二系列實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合在如下事實(shí)，即在一些情況中，我們?cè)噲D測(cè)量非常弱的抑制。對(duì)于TICA0049和TICA0072兩者，替格瑞洛和TAM的測(cè)量的IC50值在0.3μM至0.5μM的范圍內(nèi)，TIM的IC50值在74.8μM和119.5μM處分別是2log值更高的。對(duì)于TICA0049和TICA0072Fab兩者，觀察到腺苷、ADP、ATP和后兩種化合物的甲基-硫代衍生物的痕量抑制，然而這僅在測(cè)試的最高化合物濃度下檢測(cè)到，并且不被認(rèn)為是顯著的。得出結(jié)論，TICA0072是被認(rèn)為是具有替格瑞洛和TAM特異性的唯一Fab。實(shí)例4：抗替格瑞洛/TAMFab的親和力測(cè)量使用OctetRed384上的Biolayer干涉測(cè)定法測(cè)定上文產(chǎn)生的抗替格雷洛Fab的親和力。對(duì)于親和力測(cè)量，將抗替格瑞洛Fab抗體稀釋至測(cè)定緩沖液(PBS，Tween200.05％，BSA0.02％)的最終測(cè)定濃度的2倍的濃度，如200nM。在Greiner聚丙烯96孔板中制備替格瑞洛的10點(diǎn)2倍系列稀釋物。然后將等體積(例如70μL加70μL)的稀釋抗體和游離替格瑞洛轉(zhuǎn)移到第二Greiner聚丙烯板。通過(guò)吸移混合樣品，用板密封件覆蓋，并使其在室溫下平衡3-5天。平衡后，將60μL抗體/替格瑞洛滴定一式兩份轉(zhuǎn)移到384孔黑色傾斜底聚丙烯板中。將生物素化替格瑞洛在測(cè)定緩沖液中稀釋至250nM，并添加至384孔測(cè)定板的前2列的備選孔中，其余孔僅包含測(cè)定緩沖液。將鏈霉親和素生物傳感器在測(cè)定緩沖液中預(yù)浸泡至少10分鐘。然后將樣品板和生物傳感器加載到OctetRed384的載物臺(tái)上。所有測(cè)定在室溫下進(jìn)行。在測(cè)定緩沖液中基線平衡60秒后，將生物素化替格瑞洛加載到鏈霉親和素生物傳感器上300秒，然后添加測(cè)定緩沖液600秒以建立新的基線。然后使抗體/替格瑞洛混合物與生物素化替格瑞洛傳感器表面締合30-600秒，這取決于所用抗體的濃度。使用OctetRed數(shù)據(jù)分析軟件分析所得締合相數(shù)據(jù)。將信號(hào)與基線比對(duì)，并減去每個(gè)樣品的參考傳感器信號(hào)(無(wú)抗體對(duì)照)，然后使用KinExAn-曲線分析軟件將數(shù)據(jù)輸出以用于分析。使用常數(shù)匹配分析(ConstantPartneranalysis)，確定抗替格瑞洛Fab抗體的平衡KD。數(shù)據(jù)顯示FabTICA0072和TICA0049分別對(duì)替格瑞洛具有7.4nM和11.6nM的親和力(表4)。表4.抗替格瑞洛Fab的平衡親和力分析抗體ID半抗原平衡KD95％置信區(qū)間TICA0072替格瑞洛7.43nM1.75-21.46nMTICA0049替格瑞洛11.6nM1.7-66.5nM實(shí)例5：抗替格瑞洛/TAM抗體TICA0072的優(yōu)化使用基于親和力的噬菌體選擇優(yōu)化抗體TICA0072。通過(guò)使用如所述的標(biāo)準(zhǔn)分子量生物技術(shù)(克拉克森(Clackson)和洛曼(Lowman)，2004，實(shí)用方法系列(PracticalApproachSeries)266)，可變重鏈(VH)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1、2或3或可變輕鏈(VL)CDR1、2或3的寡核苷酸定向誘變，產(chǎn)生源自前導(dǎo)scFv序列的大scFv文庫(kù)。文庫(kù)經(jīng)受基于親和力的噬菌體展示選擇以便選擇具有針對(duì)替格瑞洛和TAM的更高親和力的變體。簡(jiǎn)言之，基本上如先前所述(湯普森(Thompson)等人，1996，分子生物學(xué)雜志(JMolBiol.)256(1):77-88)，將scFv-噬菌體顆粒在具有還原性濃度的生物素化替格瑞洛的溶液(典型實(shí)例是20nM至20pM，經(jīng)過(guò)四輪選擇)中孵育。從來(lái)自CDR-靶向選擇輸出的代表性數(shù)目的單個(gè)scFv制備含粗scFv的周質(zhì)提取物，并在表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定格式中篩選，設(shè)計(jì)用于篩選相對(duì)于TICA072親和力改進(jìn)的測(cè)定格式。簡(jiǎn)言之，為了篩選具有改進(jìn)的親和力的scFv和Fab變體，通過(guò)測(cè)試scFv變體，表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定基于母體TICA0072IgG和生物素化替格瑞洛之間的相互作用的競(jìng)爭(zhēng)完成。將該測(cè)定法用作初級(jí)單點(diǎn)HTS以篩選粗周質(zhì)提取物scFv樣品，并且用作多點(diǎn)二級(jí)圖譜分析測(cè)定法，以測(cè)量純化的scFv和Fab變體兩者相對(duì)于母體TICA0072的IC50值的改進(jìn)。雖然表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法(例如本文所述的測(cè)定法)通常不用于測(cè)定絕對(duì)親和力值，但此測(cè)定法可用作基于HTS的親和力的基礎(chǔ)。此外，純化的scFv/Fab變體(相對(duì)于母體scFv/Fab)的IC50的倍數(shù)改進(jìn)可以提供親和力的總體倍數(shù)增加的良好指示，并且可以表示在先導(dǎo)優(yōu)化運(yùn)動(dòng)中對(duì)scFv/Fab變體親和性分級(jí)的有效方式。本文所述的基于表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的TICA0072母體IgG的格式如下：銪標(biāo)記的鏈霉親和素：生物素化替格瑞洛：TICA0072IgG：XL665標(biāo)記的抗人Fc抗體在包括DPBSpH7.4(Gibco14190-086)、KF(VWR103444T)(0.4M)和Tween20(SigmaP9416)(0.05％)的緩沖液中，在黑色淺孔384孔測(cè)定板(Corning/Corning3676)中進(jìn)行該測(cè)定。對(duì)于粗周質(zhì)scFv變體的單點(diǎn)測(cè)試，使用10μl的測(cè)定體積，然而當(dāng)在多點(diǎn)次級(jí)IC50圖譜分析測(cè)定中測(cè)試純化的scFv和Fab時(shí)，使用20μl測(cè)定體積。對(duì)于單點(diǎn)HTS，通過(guò)添加3ulTICA0072IgG(53.3nM，終濃度為16nM)、2ul粗周質(zhì)提取物scFv樣品、2.5ul生物素化替格瑞洛(8nM，終濃度為2nM)和2.5ul包含銪標(biāo)記的鏈霉親和素(CisBio610SAKLB)(3nM，對(duì)于0.75nM最終測(cè)定濃度)和XL665標(biāo)記的抗人Fc抗體(CisBio61HFCXLB)(30nM，最終測(cè)定濃度為7.5nM)的組合溶液來(lái)設(shè)置測(cè)定。將母體TICA0072粗周質(zhì)scFv用作基準(zhǔn)，并且將HTS配置為鑒定相對(duì)于母體提供改進(jìn)的抑制的變體?？偨Y(jié)合對(duì)照孔含有所有測(cè)定組分，除了添加2μl測(cè)定緩沖液代替scFv樣品。陰性結(jié)合對(duì)照孔包含總結(jié)合對(duì)照孔的所有組分，除了添加3ul測(cè)定緩沖液代替TICA0072IgG。對(duì)于純化的scFv/Fab變體的多點(diǎn)IC50測(cè)試，通過(guò)添加5μl的TICA0072IgG(53.3nM，終濃度為16nM)、5μl的1/3滴定的純化的測(cè)試scFv或Fab變體、5μl生物素化替格瑞洛(8nM，終濃度為2nM(scFv圖譜分析)；4nM，最終測(cè)定濃度為1nM(Fab圖譜分析))和5ul的含有銪標(biāo)記的鏈霉親和素(CisBio610SAKLB)(3nM，對(duì)于0.75nM最終測(cè)定濃度)和XL665標(biāo)記的抗人Fc抗體(CisBio61HFCXLB)(30nM，最終測(cè)定濃度為7.5nM)的組合溶液來(lái)設(shè)置測(cè)定。在所有實(shí)驗(yàn)中使用純化的母體TICA0072(scFv或Fab)作為基準(zhǔn)，使得用優(yōu)化變體(scFv或Fab)測(cè)量的IC50的改進(jìn)可表達(dá)為相對(duì)于母體TICA0072的倍數(shù)改進(jìn)?？偨Y(jié)合對(duì)照孔含有所有測(cè)定組分，除了添加5μl測(cè)定緩沖液代替純化的scFv或Fab樣品。陰性結(jié)合對(duì)照孔包含總結(jié)合對(duì)照孔的所有組分，除了添加5μl測(cè)定緩沖液代替TICA0072IgG。在測(cè)定的單點(diǎn)HTS和多點(diǎn)IC50圖譜分析版本中，將板在室溫下孵育3小時(shí)，然后使用標(biāo)準(zhǔn)HTRF讀取方案在Envision板讀數(shù)器上讀數(shù)，其中樣品在337nm處激發(fā)，并且在620nm和665nM處測(cè)量時(shí)間分辨熒光發(fā)射。根據(jù)早先分別在測(cè)定1和4中描述的等式，使用原始665nm和620nm計(jì)數(shù)來(lái)計(jì)算ΔF(％)和％特異性結(jié)合。對(duì)于多點(diǎn)二次圖譜分析實(shí)驗(yàn)，使用GraphpadPrism軟件使用S形劑量響應(yīng)(可變斜率)曲線擬合(4參數(shù)對(duì)數(shù)等式)確定IC50值。對(duì)篩選中鑒定的命中，即與母體TICA0072scFv相比顯示出顯著改進(jìn)的抑制效果的scFv變體進(jìn)行DNA測(cè)序，并且將來(lái)自可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3和可變輕鏈文庫(kù)CDR1、CDR2或CDR3輸出的獨(dú)特變體作為純化的scFv產(chǎn)生，并在相同的測(cè)定中重新測(cè)試以確定濃度響應(yīng)IC50曲線。然后產(chǎn)生顯示最大改進(jìn)的IC50值的scFv變體作為Fab，并在下文所述的第二代表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中測(cè)試。用于篩選/分級(jí)最高親和力Fab的第二代表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定為了在先導(dǎo)優(yōu)化活動(dòng)結(jié)束時(shí)有效區(qū)分非常高親和力純化的Fab，進(jìn)行進(jìn)一步的表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，然而在這種情況下，該測(cè)定基于與母體TICA0072IgG相反的中間親和力優(yōu)化的TICA0072譜系IgG(TICA0159)與生物素化替格瑞洛的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。該測(cè)定法僅用于多點(diǎn)IC50圖譜分析格式(與HTS格式相反)，并且基本上與在測(cè)定5(上文)中給出的方法相同地進(jìn)行，用于基于表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的母體TICA0072IgG中純化的Fab變體的多點(diǎn)IC50圖譜分析。唯一的區(qū)別是在測(cè)定設(shè)置中的適當(dāng)點(diǎn)處使用TICA0159IgG代替TICA0072IgG，但是最終測(cè)定濃度相同，為16nM。在所有其他方面，該測(cè)定完全如上文針對(duì)純化的Fab的多點(diǎn)二級(jí)圖譜分析版本所述進(jìn)行。第二代測(cè)定用部分優(yōu)化的抗體TICA0159代替TICA0072，以能夠比基于表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的TICA0072中可能的更高效的區(qū)分和分級(jí)最高親和力的Fab。最大改進(jìn)的VH被鑒定為CDR3變體TICA0162。最大改進(jìn)的VL被鑒定為CDR3變體TICA0152。為了產(chǎn)生進(jìn)一步的親和力改進(jìn)，使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)將來(lái)自改進(jìn)的抗體的不同的CDR重組為新的Fab。從這種重組工作可知，TICA0162和TICA0152的組合產(chǎn)生具有進(jìn)一步改進(jìn)的表位競(jìng)爭(zhēng)圖譜的新的FabTICA0212。第二代表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中TICA0072、TICA0152、TICA0162和TICA0212Fab的繪圖競(jìng)爭(zhēng)曲線顯示于圖6中，其中測(cè)量的IC50值顯示在表5中。TICA0212顯示相對(duì)于母體TICA0072Fab的IC50提高約2log。表5：在第二代表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中列出的優(yōu)化的抗替格雷洛Fab的IC50數(shù)據(jù)。FabIC50(nM)倍數(shù)改進(jìn)TICA00721714.00TICA015273.523.3TICA016216.3105.2TICA021212.0142.8實(shí)例6：優(yōu)化的抗替格瑞洛/TAMFab的親和力測(cè)量使用KinExA3200測(cè)定實(shí)例5中產(chǎn)生的抗替格瑞洛/TAMFab的親和力。對(duì)于KinExA親和力測(cè)量，首先通過(guò)使它們與1mg鏈霉親和素在50mMNaHCO3中反應(yīng)過(guò)夜來(lái)制備小丸(600mg二氫唑酮小丸)。在用2種變化的Tris緩沖液(1MTrispH8.7，10mg/mLBSA)封閉后，將鏈霉親和素包被的小丸重懸于8mL的總體積中。用PBS完全洗滌小丸(1.33mL，相當(dāng)于100mg初始干燥的二氫唑酮小丸)，然后允許在1mLPBS中結(jié)合約2.5μg生物素-替格瑞洛，持續(xù)10分鐘，偶爾攪拌。將所得的生物素-替格瑞洛包被的小丸用PBS洗滌，然后重懸于含有0.1％BSA和0.02％NaN3的50mLPBS中，并在室溫下儲(chǔ)存，直至轉(zhuǎn)移至KinExA小丸小瓶。基本上如先前方法中所述進(jìn)行抗體/替格瑞洛樣品制備。將抗替格瑞洛Fab抗體稀釋至測(cè)定緩沖液(PBS，Tween200.05％，BSA0.02％，0.02％NaN3)的最終測(cè)定濃度的2倍的濃度，如200nM。在Falcon50mL聚丙烯管中制備替格瑞洛的10點(diǎn)2倍系列稀釋物。然后將等體積，例如5mL加5mL的稀釋抗體和游離替格瑞洛轉(zhuǎn)移到第二個(gè)Falcon聚丙烯管中。通過(guò)吸移混合樣品，用板密封件覆蓋，并使其在室溫下平衡3-5天。平衡后，將樣品管轉(zhuǎn)移至KinExA3200用于分析。所有測(cè)定在室溫下進(jìn)行。取樣抗體/替格瑞洛混合物，并使其與生物替格瑞洛小丸混合，同時(shí)洗去未結(jié)合的游離替格瑞洛。然后使用DyLight649標(biāo)記的小鼠抗人重鏈和輕鏈抗體檢測(cè)結(jié)合的抗體。樣品體積(300-1300μL)和注射時(shí)間(90-120s)隨濃度變化，并且每個(gè)樣品有2-3個(gè)讀數(shù)改變。使用KinExAn-曲線分析軟件分析數(shù)據(jù)。使用常數(shù)匹配分析，確定抗替格瑞洛Fab抗體的平衡KD。如在先前實(shí)例中，使Fab在室溫下在20倍過(guò)量濃度的未修飾的替格瑞洛或TAM存在下平衡。將生物素化替格瑞洛加載到鏈霉親和素包被的小丸的表面上。平衡后，使剩余的游離抗體與生物素化替格瑞洛結(jié)合。然后使用DyLight649標(biāo)記的小鼠抗人重鏈和輕鏈檢測(cè)抗體檢測(cè)結(jié)合的抗體。用至少三種不同的固定濃度的抗體進(jìn)行游離替格瑞洛或TAM的滴定，以產(chǎn)生具有至少10倍表觀KD位移的獨(dú)立滴定圖譜。使用KinExAPron-曲線分析軟件分析數(shù)據(jù)以確定游離替格瑞洛或TAM的平衡KD。FabTICA0212對(duì)未修飾的替格瑞洛和TAM的親和力為約20pM(表6)。從平衡數(shù)據(jù)TICA0212證明了與替格瑞洛和TAM結(jié)合的等同的高親和力(約20pM)。表6：抗替格瑞洛/TAMFab的平衡親和力分析自母體TICA0072的序列殘基的變化被加粗，并且在TICA0072中鑒定某些殘基的卡巴特編號(hào)。實(shí)例7：抗替格瑞洛/TAMFabTICA0162和TICA0212的特異性如實(shí)例3中那樣測(cè)試Fab、TICA0162和TICA0212的特異性，并針對(duì)DMSO標(biāo)準(zhǔn)化。TICA0162和TICA0212的所有可用選擇性數(shù)據(jù)的匯總表包括在表7中。另外，實(shí)例繪出的數(shù)據(jù)來(lái)自下述實(shí)驗(yàn)，其中圖4中列出的十二種化合物中的五種與替格瑞洛、TAM、TIM和圖7中所示的幾種腺苷家族化合物一起進(jìn)行測(cè)試。表7：除了替格瑞洛、TAM、TIM和腺苷家族化合物之外，12種結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物對(duì)生物素化替格瑞洛與TICA0162和TICA0212Fab結(jié)合的抑制的相對(duì)IC50值。NI表示沒(méi)有抑制。如數(shù)據(jù)所示，TICA0212(MEDI2452)對(duì)替格瑞洛和TAM具有基本上相等的結(jié)合特異性，并且對(duì)TIM的結(jié)合較弱。此外，MEDI2452/TICA0212未顯示與任何其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的藥物或腺苷相關(guān)化合物的顯著結(jié)合。實(shí)例8：蛋白質(zhì)晶體學(xué)將具有C-末端his-標(biāo)簽的TICA0072在PBS中濃縮至9mg/ml。通過(guò)添加溶解在DMSO中的1mM替格瑞洛實(shí)現(xiàn)復(fù)合物形成。將該復(fù)合物在室溫下孵育2小時(shí)，然后使用沉滴蒸氣擴(kuò)散法設(shè)置結(jié)晶試驗(yàn)。使用3個(gè)商業(yè)篩選進(jìn)行廣泛篩選，并獲得幾個(gè)命中。從(英國(guó)分子尺寸公司(MolecularDimensions))命中的網(wǎng)格優(yōu)化獲得最佳衍射晶體。在20℃下，通過(guò)混合等體積的TICA0072-替格瑞洛復(fù)合物和12.8％PEG3350、12.8％PEG1000、12.8％MPD、1.7％1,6-己二醇、1.7％1-丁醇、1.7％1,2-丙二醇、1.7％2-丙醇、1.7％1,4-丁二醇、1.7％1,3-丙二醇、25mM咪唑、25mM二甲胂酸鈉、25mMMES和25mMBis-TrispH6.5的儲(chǔ)備溶液，來(lái)生長(zhǎng)用于結(jié)構(gòu)測(cè)定的晶體。將晶體在液氮中快速冷凍，而不添加任何冷凍保護(hù)劑。將濃度為約15mg/ml的PBS中的TICA0212/MEDI2452與替格瑞洛混合至1mM的濃度，并在進(jìn)行廣泛篩選之前在室溫下孵育2小時(shí)。沒(méi)有獲得自發(fā)命中。來(lái)自TICA0072-替格瑞洛晶體的晶種通過(guò)在30ul孔溶液中粉碎幾種晶體制備，并用于MMS(微量基質(zhì)篩選)至廣泛的商業(yè)篩選中。獲得了幾個(gè)命中，但是用于結(jié)構(gòu)測(cè)定的晶體在20℃下在20％甘油、20％PEG4000、10％2-丙醇、0.1MNaCl和0.5M乙酸鈉pH4.6的條件下生長(zhǎng)。用0.2μl蛋白、0.18μl孔溶液和0.02μl種子原液設(shè)置滴劑。將晶體在液氮中快速冷凍，而不添加任何冷凍保護(hù)劑。在歐洲同步輻射工廠(法國(guó)格勒諾布爾)的光束線ID23-1處收集數(shù)據(jù)。使用AutoProc工作流程處理、縮放并進(jìn)一步減化數(shù)據(jù)[翁赫C(Vonrhein，C.)等人，ActaCryst.，2011；D67:293-302]，統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表8。對(duì)于TICA0072，通過(guò)使用高分辨率Fab結(jié)構(gòu)的分子替換進(jìn)行初始定相(PDBidcode1aqk，[法伯爾C(FaberC.)等人，免疫技術(shù)(Immunotechnology)，1998；3:253-70])作為起始模型。對(duì)于TICA0212/MEDI2452，使用TICA0072的結(jié)構(gòu)作為起始模型。使用Coot進(jìn)行模型重建[布里科涅C(BricogneG.)等人，(2011)，BUSTER版本2.11.4，英國(guó)劍橋：環(huán)球菲茲公司(GlobalPhasingLtd)]，并且使用autobuster進(jìn)行細(xì)化[埃姆斯利P(Emsley，P)等人，晶體學(xué)D節(jié)：生物晶體學(xué)(ActaCrystallogr.,Sect.D:Biol.Crystallogr.)2004，D60,2126-2132]。最終模型的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表8。TICA0072與替格瑞洛的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)確定為分辨率(圖10)。CDR形成高度凹入的表面，并且替格瑞洛深深插入VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的界面。這種類(lèi)型的結(jié)合通常在小的半抗原中觀察到。除VLCDR2外的所有CDR直接有助于替格瑞洛結(jié)合，并且大部分VHCDR3是無(wú)序的。替格瑞洛的二氟苯基基團(tuán)位于包含游標(biāo)殘基(vernierresidue)VHTrp47、VLPhe98和VHCDR3殘基Leu100L的、排列有疏水性殘基的腔中。與替格瑞洛相互作用的關(guān)鍵殘基是VLTrp91，其涉及針對(duì)腺苷樣核心的π-堆積和鍵合至環(huán)戊基部分的核糖羥基之一的氫。與腺苷樣核心的另外的相互作用由VHCDR1His35和VHCDR3Tyr99提供。硫丙基取代基與VHCDR2環(huán)的主鏈疊加。環(huán)戊基部分上的羥乙基取代基突出到溶劑中，并且不與Fab發(fā)生任何相互作用。在親和力改進(jìn)的Fab，TICA0212/MEDI2452的結(jié)構(gòu)中，替格瑞洛結(jié)合與TICA0072的結(jié)構(gòu)類(lèi)似，其中保留了上述所有相互作用，但具有一些重要差異(圖10B)。VLCDR3突變Asp92Leu和Ser94Asp的組合打破VLCDR3環(huán)內(nèi)的氫鍵以產(chǎn)生更“松弛”的結(jié)構(gòu)。新構(gòu)象與嘧啶環(huán)的15°傾斜(關(guān)于環(huán)丙基-二氟苯基取代基的附接)相關(guān)。嘧啶環(huán)的新位置使其與Fab72相比更接近TICA0212/MEDI2452中的VHCDR3Tyr99約此外，VLIle93Tyr引入氫鍵供體，其使得與VHCDR3環(huán)相互作用，從而進(jìn)一步限定結(jié)合位點(diǎn)。TICA0212/MEDI2452的晶體結(jié)構(gòu)顯示在VH和VL界面之間的深縫隙中結(jié)合的替格瑞洛。用生物素通過(guò)三酰胺接頭將替格瑞洛標(biāo)記到羥乙基基團(tuán)的設(shè)計(jì)策略得到證實(shí)，因?yàn)榫w結(jié)構(gòu)證明羥乙基基團(tuán)不參與與TICA0212/MEDI2452的任何相互作用。這進(jìn)一步得到如下事實(shí)的支持，即Fab也以相同的親和力結(jié)合缺乏羥乙基基團(tuán)的TAM。TICA0212/MEDI2452顯示對(duì)TIM的弱結(jié)合，TIM缺乏環(huán)丙基-二氟苯基基團(tuán)。在TICA0212/MEDI2452-替格瑞洛復(fù)合物中，環(huán)丙基-二氟苯基基團(tuán)被掩埋在疏水口袋的底部，并且必須在使替格瑞洛腺苷樣核心與VLCDR3殘基TrpL91比對(duì)中起關(guān)鍵結(jié)構(gòu)作用。由于替格瑞洛的化學(xué)起點(diǎn)是ATP，并且它保留了腺苷樣核心，解毒劑特異性的關(guān)鍵屬性是證明沒(méi)有腺苷的結(jié)合。先導(dǎo)分離策略涉及高通量和詳細(xì)的特異性分析，并且通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性或直接結(jié)合分析未檢測(cè)到腺苷的結(jié)合。從結(jié)構(gòu)分析，預(yù)期腺苷的嘌呤環(huán)和核糖基團(tuán)可以模擬替格瑞洛的腺苷樣核心的相互作用。然而，缺乏結(jié)合可以通過(guò)缺少兩個(gè)疏水R基團(tuán)(環(huán)丙基-二氟苯基和硫丙基)來(lái)解釋?zhuān)滹@著降低結(jié)合相互作用的相對(duì)形狀互補(bǔ)性和疏水性。對(duì)母體TICA0072和TICA0212/MEDI2452的結(jié)構(gòu)的分析顯示了在親和力成熟期間引入的一些改變的顯著性。VLCDR3中的突變似乎具有特別高的影響，導(dǎo)致TICA0212/MEDI2452中不同的環(huán)構(gòu)象和額外的氫鍵，以限定結(jié)合腔。相反，VHCDR3中的突變的貢獻(xiàn)在結(jié)構(gòu)上不太明顯。來(lái)自結(jié)構(gòu)的這些觀察結(jié)果部分地由僅含有VLCDR3(TICA0152)或VHCDR3(TICA0162)中的修飾的修飾抗體的數(shù)據(jù)證實(shí)，這些修飾分別導(dǎo)致比TICA0072高200倍和50倍的改進(jìn)。然而，盡管VLCDR3變化似乎具有更大的效果，但兩組突變都顯著改進(jìn)。應(yīng)當(dāng)注意，晶體結(jié)構(gòu)是復(fù)合物的靜態(tài)圖片，并且不能捕獲結(jié)合中涉及的任何蛋白質(zhì)和配體動(dòng)力學(xué)。實(shí)例9：在替格瑞洛或TAM存在下，TICA0212/MEDI2452在體外濃度依賴(lài)性地恢復(fù)血小板聚集使用光透射聚集測(cè)定法在人富血小板血漿(PRP)中測(cè)定TICA0212/MEDI2452逆轉(zhuǎn)替格瑞洛或TAM介導(dǎo)的對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制的程度和效力。對(duì)于體外人PRP測(cè)定，通過(guò)頭靜脈的靜脈穿刺從禁食的健康志愿者收集血液。棄去前2mL血液，然后收集等分試樣到含有0.109M檸檬酸鈉、1+9(檸檬酸鹽+血液)的管中至最終濃度為10.9mM。將抗凝血的人血在240×g離心15分鐘。小心地移除PRP并轉(zhuǎn)移至干凈的小瓶中。通過(guò)PRP在2000×g離心15分鐘制備貧血小板血漿(PPP)。通過(guò)血小板聚集分析儀(美國(guó)賓夕法尼亞州生物/數(shù)據(jù)公司(Bio/DataCorporation)PAP-8E)在PRP中評(píng)價(jià)光透射聚集度(LTA)。將零％聚集定義為PRP的光透射率，將100％聚集定義為PPP的光透射率。PRP與1μM替格瑞洛或TAM一起預(yù)孵育1小時(shí)，然后與不同濃度的TICA0212或同種型對(duì)照Fab共孵育30分鐘。通過(guò)添加20μMADP引發(fā)血小板聚集，并連續(xù)記錄6分鐘。分析6分鐘時(shí)最終聚集(FA)程度的數(shù)據(jù)。計(jì)算給出半最大值逆轉(zhuǎn)的TICA0212/MEDI2452的濃度(IC50)。TICA0212/MEDI2452產(chǎn)生1μM替格瑞洛的濃度依賴(lài)性逆轉(zhuǎn)和1μMTAM介導(dǎo)的對(duì)20μMADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制，分別計(jì)算平均(n＝5)IC50值為0.64和0.78μM(圖8)。當(dāng)在1:1條件(1μMTICA0212/MEDI2452：1μM替格瑞洛或TAM)下評(píng)價(jià)時(shí)，平均逆轉(zhuǎn)程度分別為78％和62％。同種型對(duì)照Fab不引起替格瑞洛和TAMADP誘導(dǎo)的血小板聚集的顯著逆轉(zhuǎn)。例如，在30分鐘孵育后，同種型對(duì)照Fab分別導(dǎo)致替格瑞洛和TAM的-3％和2％逆轉(zhuǎn)。由此，數(shù)據(jù)顯示TICA0212/MEDI2452能以濃度依賴(lài)性方式在體外逆轉(zhuǎn)替格瑞洛和TAM介導(dǎo)的對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制。當(dāng)在1:1實(shí)驗(yàn)設(shè)置中評(píng)估時(shí)獲得最大和接近完全的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，當(dāng)TICA0212/MEDI2452以1:1化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合替格瑞洛或TAM時(shí)將可預(yù)測(cè)所述效應(yīng)。實(shí)例10：在替格瑞洛或TAM存在下，TICA0212/MEDI2452在體外有效且快速地恢復(fù)血小板聚集使用如實(shí)例8中的光透射聚集測(cè)定法在人富血小板血漿(PRP)中測(cè)定TICA0212/MEDI2452逆轉(zhuǎn)替格瑞洛或TAM的起始時(shí)間。PRP與1μM替格瑞洛或TAM預(yù)孵育1小時(shí)，然后添加1μMTICA0212/MEDI2452并共孵育5、10、15、30和60分鐘，或添加同種型對(duì)照Fab持續(xù)30分鐘。通過(guò)添加20μMADP引發(fā)血小板聚集，并連續(xù)記錄6分鐘。分析6分鐘時(shí)最終聚集(FA)程度的數(shù)據(jù)。TICA0212/MEDI2452產(chǎn)生替格瑞洛介導(dǎo)的抑制逆轉(zhuǎn)的類(lèi)似程度，而不管共孵育時(shí)間如何，因?yàn)槠骄?n＝3)逆轉(zhuǎn)程度在5、10、15、30和60分鐘后分別為85％、69％、74％、80％和81％。類(lèi)似地，在5、10、15、30和60分鐘后，由TICA0212/MEDI2452誘導(dǎo)的TAM逆轉(zhuǎn)的平均(n＝3)程度分別為53％、56％、58％、69％、74％。TICA0212/MEDI2452快速且有效地逆轉(zhuǎn)替格瑞洛和介導(dǎo)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制。在與同種型對(duì)照Fab共孵育30分鐘后，沒(méi)有逆轉(zhuǎn)，平均值(n＝3)-2％。從該數(shù)據(jù)可知，當(dāng)在1:1實(shí)驗(yàn)設(shè)置中評(píng)估時(shí)，顯示TICA0212/MEDI2452快速且有效地逆轉(zhuǎn)替格瑞洛和TAM介導(dǎo)的對(duì)ADP誘導(dǎo)的聚集的抑制。實(shí)例11：TICA0212/MEDI2452在體內(nèi)給藥經(jīng)替格瑞洛處理的小鼠后有效且快速恢復(fù)血小板聚集在小鼠靜脈內(nèi)(i.v.)給藥替格瑞洛后，離體測(cè)定TICA0212/MEDI2452介導(dǎo)的、對(duì)替格瑞洛介導(dǎo)的ADP誘導(dǎo)的全血血小板聚集抑制的逆轉(zhuǎn)(阻抗聚集測(cè)定)的起始速度和程度。給小鼠靜脈注射替格瑞洛，經(jīng)5分鐘作1200μg/kg的推注，然后15分鐘連續(xù)輸注30μg/kg/min。在替格瑞洛輸注終止后，當(dāng)測(cè)量替格瑞洛血漿暴露為平均1.4μM時(shí)，給小鼠靜脈內(nèi)推注250mg/kg的TICA0212/MEDI2452。在TICA0212/MEDI2452給予后5、30和60分鐘，處死小鼠，收集血液樣品。在該研究中，測(cè)量ADP誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)6分鐘，并且將數(shù)據(jù)表示為隨時(shí)間記錄的聚集單位(AU)的曲線下的平均面積(AU*min)。在進(jìn)行阻抗聚集測(cè)定中，處死小鼠并將血液樣品收集到7μM水蛭素中。將血液(175μL)添加到多板微型測(cè)試單元中的預(yù)熱的NaCl2(37℃，175μL)中，混合3分鐘，然后添加12μLADP，至終濃度為6.5μM。一次性多板微型測(cè)試單元包含攪拌棒并且具有浸入血液樣品中的兩組單獨(dú)的電極對(duì)。當(dāng)添加激動(dòng)劑(ADP)并通過(guò)攪拌誘導(dǎo)剪切時(shí)，血小板將開(kāi)始粘附并聚集在電極上。這導(dǎo)致電極上的增加的阻抗，其通過(guò)多層阻抗儀(德國(guó)慕尼黑黛娜貝茨(DynaByte))隨時(shí)間連續(xù)記錄所述阻抗。替格瑞洛治療誘導(dǎo)幾乎完全抑制ADP誘導(dǎo)的聚集，因?yàn)樵谔娓袢鹇遢斪⒑蚉BS推注5、30和60分鐘后，平均(n＝4)聚集反應(yīng)分別從432降低至2，從474降至6和從494降至14AU*min(圖9)。TICA0212/MEDI2452介導(dǎo)體內(nèi)替格瑞洛介導(dǎo)的抑制的逆轉(zhuǎn)，因?yàn)樵谔娓袢鹇遢斪⒑蚑ICA0212推注5、30和60分鐘后，平均(n＝4)聚集反應(yīng)分別從2增加到147，從6增加到448和從14增加到413AU*min(圖9)。在給予同種型對(duì)照30分鐘后沒(méi)有逆轉(zhuǎn)，因?yàn)槠骄?n＝4)聚集反應(yīng)保持從6至4AU*min不變。該數(shù)據(jù)表明，當(dāng)靜脈內(nèi)給予濃度為1.4μM的替格瑞洛血漿時(shí)，(其提供對(duì)ADP誘導(dǎo)的聚集的完全抑制)，TICA0212/MEDI2452可以快速且有效地恢復(fù)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。實(shí)例12：替格瑞洛處理的小鼠中的小鼠出血由于TICA0212/MEDI2452的預(yù)期適應(yīng)癥之一是作為需要緊急手術(shù)的替格瑞洛患者的解毒劑，在小鼠出血實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)TICA0212/MEDI2452，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為模擬臨床設(shè)置，在手術(shù)開(kāi)始之前應(yīng)當(dāng)實(shí)現(xiàn)完全逆轉(zhuǎn)。將小鼠用連續(xù)輸注的替格瑞洛(300μg/kg/min)或載體預(yù)處理20分鐘。停止輸注后，t＝0，經(jīng)45秒施用推注劑量的TICA0212/MEDI2452(600mg/kg)或載體(組氨酸蔗糖緩沖液)，并且在t＝30分鐘時(shí)，通過(guò)從尾部尖端切割5mm誘導(dǎo)出血。尾部尖端用水(2mL/min)沖洗，并將血液和水混合物收集在小室中，在該室中攪拌器混合液體以增強(qiáng)溶血并且產(chǎn)生勻質(zhì)溶液。當(dāng)從腹主動(dòng)脈收集終末血樣用于血小板聚集時(shí)，在525nm處記錄光透射30分鐘。將光透射率轉(zhuǎn)化為吸光度，并用于通過(guò)繪制隨時(shí)間的吸光度來(lái)計(jì)算為吸光度曲線下面積(AUC，吸光度*s)的失血量和總出血時(shí)間(BT，s)。將所有低于95％的透射率定義為出血。在替格瑞洛輸注結(jié)束時(shí)(t＝0)和尾部切割時(shí)(t＝30分鐘)針對(duì)血小板聚集以及總的和游離的血漿暴露收集樣品。研究由瑞典哥德堡大學(xué)動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。用異氟烷氣體(瑞典阿伯特斯堪的納維亞AB公司(AbbotScandinaviaAB)的)麻醉小鼠。將導(dǎo)管插入左頸靜脈中，用于給予載體或藥物。通過(guò)外部加熱將體溫維持在38℃。為了將TICA0212/MEDI2452對(duì)血小板聚集的作用轉(zhuǎn)化為對(duì)出血的潛在作用，進(jìn)行了預(yù)防性小鼠尾部出血研究。將替格瑞洛輸注到平均總替格瑞洛和TAM血漿濃度分別為7.6和0.3μM，以提供顯著的藥物依賴(lài)性出血窗口。在停止替格瑞洛輸注后立即將TICA0212/MEDI2452經(jīng)30秒以600mg/kg的單次推注給藥。30分鐘后，ADP誘導(dǎo)的聚集完全標(biāo)準(zhǔn)化，替格瑞洛的平均游離血漿濃度從4.7nM降低至低于0.03nM(定量下限)。通過(guò)尾部切割開(kāi)始出血并監(jiān)測(cè)30分鐘。在載體處理的小鼠中，尾部切割時(shí)的平均總替格瑞洛和TAM血漿濃度為2.4和0.6μM。經(jīng)30分鐘的總失血量和出血時(shí)間通過(guò)替格瑞洛顯著(p<0.05)增強(qiáng)，分別為約3.8倍和1.6倍。相對(duì)于單獨(dú)的替格瑞洛，TICA0212/MEDI2452顯著(p<0.05)逆轉(zhuǎn)失血量和出血時(shí)間至回到與未用替格瑞洛處理的小鼠沒(méi)有顯著差異的水平(圖12)。在該預(yù)防性設(shè)置中，TICA0212/MEDI2452標(biāo)準(zhǔn)化替格瑞洛依賴(lài)性出血。從離體模型翻譯為該體內(nèi)模型的30分鐘的起始時(shí)間證明TICA0212/MEDI2452可以將失血量和出血時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)化為未用替格瑞洛處理的小鼠的失血量和出血時(shí)間。實(shí)例13：替格瑞洛和TAM的總血漿濃度將血樣收集在具有EDTA抗凝劑的管中，并在室溫下以10000×g離心5分鐘以制備血漿。通過(guò)蛋白質(zhì)沉淀和串聯(lián)質(zhì)譜法的液相色譜(LC-MS/MS)測(cè)定替格瑞洛和TAM的血漿濃度，如公開(kāi)的方法[席侖H(SillénH.)等人，分析技術(shù)測(cè)定生物生命科學(xué)JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci)，2010；878:2299-306]中描述的，具有以下偏差。血漿，50μL，用在乙腈中的180μl內(nèi)標(biāo)(D7-ZD6140)進(jìn)行蛋白沉淀。液相色譜系統(tǒng)和質(zhì)譜儀是Acquity超高性能LC，聯(lián)合沃特斯公司的XevoTQ-S質(zhì)譜儀。在AquityBEHC18柱上進(jìn)行色譜分離(2.1×50mm，粒徑1.7μm)。使用負(fù)電噴射電離。洗脫液A是具有10mmol/L乙酸銨、pH5的水，洗脫液B是具有10mmol/L乙酸銨的乙腈。注射體積為1至5μL，分析梯度從4％B開(kāi)始，在1.5分鐘內(nèi)增加至95％，保持至2.3分鐘，然后在2.4分鐘內(nèi)恢復(fù)至初始條件，隨后0.3分鐘再平衡。在分析中沒(méi)有使用質(zhì)量控制樣品。定量下限(LLOQ)為0.005μmol/L，校準(zhǔn)范圍為0.005至15.0μM。通過(guò)添加1％甲酸(FA：樣品，1:5)，然后進(jìn)行如上所述的蛋白質(zhì)沉淀和LC-MS/MS來(lái)測(cè)定TICA0212/MEDI2452存在下替格瑞洛和TAM的總血漿濃度。將甲酸添加至樣品中以促進(jìn)替格瑞洛和TICA0212/MEDI2452的解離。實(shí)例14：替格瑞洛游離血漿濃度基于先前公開(kāi)的方法[席侖H(SillénH.)等人，分析技術(shù)測(cè)定生物生命科學(xué)(JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci)，2011年8月1日；879(23):2315-22]優(yōu)化該方法。將允許質(zhì)量低于6至8kDa的分子通過(guò)的透析膜(仕必純實(shí)驗(yàn)用品公司(SpectrumLaboratories，Inc))在ELGA水中浸泡10至15分鐘，并放置在透析板(室內(nèi)制備)之間。將血漿(130μL)添加至透析板的一側(cè)，并將130μL磷酸鹽緩沖液(pH7.0)添加到另一側(cè)。將兩側(cè)的孔用蓋子密封，并將鋁板放在該板的每一側(cè)的頂部以避免泄漏。然后將板垂直放置于37℃下100rpm/min的軌道振蕩器上24小時(shí)。通過(guò)將來(lái)自血漿側(cè)的50μL保留物和來(lái)自緩沖液側(cè)的75μL透析液轉(zhuǎn)移到乙腈中的蛋白質(zhì)LoBindPCR清潔96深孔板中來(lái)終止透析，所述96深孔板各自含有150μL、75μL內(nèi)標(biāo)物(D7-ZD6140)。將板混合1分鐘，然后在4℃下1500×g離心20分鐘。離心后，轉(zhuǎn)移來(lái)自沉淀保留物的50μL上清液，并在LC-MS/MS(沃特斯公司Acquity超性能LC聯(lián)合XevoTQ-S質(zhì)譜儀)分析之前用50μLELGAH2O稀釋。在分析中沒(méi)有使用質(zhì)量控制樣品。保留物的校準(zhǔn)范圍為0.4至1000nmol/L，透析液的校準(zhǔn)范圍為0.003至50nmol/L。透析液中替格瑞洛的LLOQ為0.03nmol/L。下表9提供了在上述實(shí)例中描述的示例性抗體的概述，并且用于說(shuō)明在此披露的技術(shù)的某些實(shí)施例。表9抗體/scFv/Fab序列的概述參考文獻(xiàn)和通過(guò)引用并入1.范吉森JJ(VanGiezenJJ)、尼爾森L(NilssonL)、本特森P(BerntssonP)等人，替格瑞洛獨(dú)立于ADP與人P2Y(12)結(jié)合，但拮抗ADP誘導(dǎo)的受體信號(hào)傳導(dǎo)和血小板聚集，中華血液學(xué)雜志(JThrombHaemost)2009；7(9)：1556-15652.瓦倫汀(WallentinL)、貝克爾RC(BeckerRc)、布達(dá)A(BudajA)等人，在急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者中使用替格瑞洛與氯吡格雷，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(NEnglJMed.)2009；361：1045-1057。3.阿姆斯特丹EA(AmsterdamEA)、威戈NK(WengerNK)、布林迪斯RG(BrindisRG)等人，2014ACC/AHA非ST段抬高型急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者管理指南：美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)工作組實(shí)踐指南的報(bào)告，循環(huán)(Circulation.)2014；000：000-0004.斯托雷R(shí)F(StoreyRF)、安吉洛DJ(AngiolilloDJ)、帕蒂爾SB(PatilSB)等人，與氯吡格雷相比，替格瑞洛對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者血小板功能的抑制作用：PLATO(血小板抑制和患者結(jié)局)血小板研究，美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)雜志(JAmCollCardiol)2010；56(18)：1456-1462。5.泰勒G(TaylorG)、奧辛斯基D(OsinskiD)、戴維南A(TheveninA)等人，血小板輸注是否有效恢復(fù)在緊急手術(shù)之前對(duì)阿司匹林和/或氯吡格雷有反應(yīng)的患者的血小板反應(yīng)性？外傷急性護(hù)理雜志(JTraumaAcuteCareSurg.)2013；74：1367-1369。6.普魯勒爾F(PrüllerF)、德雷克斯勒C(DrexlerC)、阿占S(ArchanS)、馬修S(MacherS)、瑞嘉姆RB(RaggamRB)、馬哈爾E(MahlaE)，通過(guò)輸入儲(chǔ)存的血小板來(lái)恢復(fù)低血小板反應(yīng)性：健康志愿者體內(nèi)研究，中華血液學(xué)雜志(JThrombHaemost)2011；9(8)：1670-1673。7.漢松EC(HanssonEC)、夏姆斯哈基米C(ShamsHakimiC)、阿斯特朗奧森K(K)等人，離體血小板補(bǔ)充對(duì)來(lái)自用乙酰水楊酸，氯吡格雷或替格瑞洛治療的患者的血液樣品中的血小板聚集性的影響，英國(guó)麻醉學(xué)雜志(BrJAnaesth)2014；112(3)：570-575。8.蒂勒T(ThieleT)、薩尼A(SümnigA)、赫龍G(HronG)，用于逆轉(zhuǎn)需要緊急手術(shù)的患者中的雙重抗血小板治療的血小板輸注：一項(xiàng)試驗(yàn)研究，中華血液學(xué)雜志(JThrombHaemost)2012；10：968-971。9.佩爾松S(PehrssonS)、漢松K(HanssonK)、尼蘭德S(NylanderS.)替格瑞洛誘導(dǎo)小鼠出血可被FVIIa和FII逆轉(zhuǎn)，美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)雜志(JAmCollCardiol)，2013；61(10S)：E212。10.道津E(DolginE)解毒劑邊緣更接近新血液稀釋劑的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，天然藥物(NatMed)2013：193，251。11.克洛澤MA(CrowtherMA)、安吉諾W(AgenoW)、加西亞D(GarciaD)等人，口服維生素K與安慰劑相比，在接受華法林的患者中校正過(guò)度抗凝：一項(xiàng)隨機(jī)試驗(yàn)，內(nèi)科學(xué)年鑒(AnnInternMed)2009；150：293-300。12.席勒F(SchieleF)、范賴(lài)恩J(vanRynJ)、卡納達(dá)K(CanadaK)等人，達(dá)比加群的特定解毒劑：功能性和結(jié)構(gòu)性特征。血液(Blood)2013；121：3554-3562。13.魯G(LuG)、迪古士曼FR(DeGuzmanFR)、霍倫巴赫SJ(HollenbachSJ)等人，用于通過(guò)凝血因子X(jué)a的直接和間接抑制劑逆轉(zhuǎn)抗凝的特異性解毒劑，天然藥物(NatMed)2013；19：446-451。14.斯托雷R(shí)F(StoreyRF)、赫斯特德S(HustedS)、哈林頓RA(HarringtonRA)等人，與急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者的氯吡格雷相比，AZD6140(一種可逆的口服P2Y12受體拮抗劑)抑制血小板聚集，美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)雜志(JAmCollCardiol)2007；50：1852-1856。15.赫斯特德SE(HustedSE)、斯托雷R(shí)F(StoreyRF)、布萊登K(BlidenK)等人，穩(wěn)定型冠狀動(dòng)脈疾病患者的替格瑞洛的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)：來(lái)自O(shè)NSET-OFFSET和RESPOND研究的結(jié)果，臨床藥代動(dòng)力學(xué)(ClinPharmacokinet.)2012；51(6)：397-409。16.滕R(TengR)、奧利弗S(OliverS)、海耶斯MA(HayesMA)、巴特勒K(ButlerK)，健康受試者中替格瑞洛的吸收、分布、代謝和排泄，藥物代謝和處置(DrugMetabDispos.)2010；38(9)：1514-1521。17.達(dá)拉莫拉O(DaramolaO)、史蒂文森J(StevensonJ)、迪恩G(DeanG)等人，高產(chǎn)CHO瞬時(shí)系統(tǒng)：編碼EBNA-1和GS的基因的共表達(dá)增強(qiáng)瞬時(shí)蛋白表達(dá)，生物技術(shù)進(jìn)展(BiotechnolProg)2014；30(1)：132-141。18.奧普雷亞TI(OpreaTI)、尼耳森SK(NielsenSK)、烏阿蘇O(UrsuO)等人，將藥物、靶點(diǎn)和臨床結(jié)果關(guān)聯(lián)到綜合網(wǎng)絡(luò)中提供計(jì)算機(jī)輔助藥物再利用的新平臺(tái)，分子信息(MolInform)2011；30：100-111)。19.斯普朗索普.B(Springthorpe.B)、貝莉A(BaileyA)、巴頓P(BartonP)等人，從ATP到AZD6140：發(fā)現(xiàn)用于預(yù)防血栓形成的口服活性可逆P2Y12受體拮抗劑，生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)快報(bào)(BioorgMedChemLett)2007；17：6013-6018。20.范寧SW1(FanningSW1)、霍恩JR(HornJR)，抗半抗原駱駝抗體顯示具有來(lái)自非高可變環(huán)的顯著能量貢獻(xiàn)的隱藏結(jié)合位點(diǎn)，蛋白質(zhì)科學(xué)(ProteinSci.)2011；20：1196-1207。21.張K(ZhangK)、張J(ZhangJ)、高ZG(GaoZG)等人，與抗血栓形成藥物復(fù)合的人P2Y12受體的結(jié)構(gòu)，自然Nature.，2014；509：115-118。22.卡塔內(nèi)奧M(CattaneoM)、舒爾茨R(SchulzR)、尼蘭德S(NylanderS)，腺苷介導(dǎo)的替格瑞洛的效果：證據(jù)和潛在臨床相關(guān)性，美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)雜志(JAmCollCardiol)2014；63：2503-2509。23.席侖H(SillénH.)、庫(kù)克M(CookM)、戴維斯P(DavisP)，通過(guò)平衡透析和LC-MS/MS測(cè)定人血漿中游離替格瑞洛及其活性代謝物(AR-C124910XX)，分析技術(shù)測(cè)定生物生命科學(xué)(JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci)2011；879(23)：2315-2322。在此提及的所有公開(kāi)物和專(zhuān)利特此以其全文通過(guò)引用而結(jié)合，如同每個(gè)單獨(dú)的公開(kāi)物或?qū)＠幻鞔_且單獨(dú)地表明通過(guò)引用而結(jié)合。雖然已經(jīng)討論了本披露的特定方面，但上述說(shuō)明是說(shuō)明性而非限制性的。通過(guò)回顧此說(shuō)明書(shū)和以下權(quán)利要求，本披露的多種變體對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將變得明顯。應(yīng)通過(guò)參考權(quán)利要求、連同它們的等效物的全部范圍、以及說(shuō)明書(shū)、連同這類(lèi)變體，確定本披露的全部范圍。<110><120>替格瑞洛的抗體及其使用方法<130>TICA-100WO1<160>80<170>專(zhuān)利版本3.5<210>1<211>363<212>DNA<213>智人<400>1gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactac180gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcaacagagtac300gacctgcaacggcctttcgggtttgacttctggggcaaggggacaatggtcaccgtctcg360agt363<210>2<211>121<212>PRT<213>智人<400>2GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrGluTyrAspLeuGlnArgProPheGlyPheAspPheTrpGly100105110LysGlyThrMetValThrValSerSer115120<210>3<211>5<212>PRT<213>智人<400>3SerTyrAlaMetSer15<210>4<211>17<212>PRT<213>智人<400>4AlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>5<211>12<212>PRT<213>智人<400>5GluTyrAspLeuGlnArgProPheGlyPheAspPhe1510<210>6<211>333<212>DNA<213>智人<400>6tcctatgtgctgactcagccaccctcagcgtctggggcccccgggcagagggctaccatc60tcctgctctggaagcagctccaacatcggaagtaatcttgtgaactggtaccaacaattc120ccaggagaggcccccaagctcctcatctttagtgacaatcaacgaccctcaggggtccct180gaccgattctctggctccaggtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccag240tccgaggatgaggctgattattactgtgcaacgtgggatgacagactggatggttatgtg300gtattcggcggagggaccaagctgaccgtccta333<210>7<211>111<212>PRT<213>智人<400>7Ser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