本申請要求2014年3月3日提交的美國臨時專利申請系列號61/947,051的權(quán)益，該申請通過引用由此并入。

背景

水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)是基因通過除了有性或無性生殖之外的機制由一種生物體至另一種生物體的傳播。許多過程可以導(dǎo)致HGT。例如，在一些情況下，病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒將在細胞之間隨同或取代病毒序列來包裝和轉(zhuǎn)移細胞遺傳物質(zhì)。遺傳物質(zhì)還將通過內(nèi)源性細菌過程在原核生物之間傳遞，所述內(nèi)源性細菌過程包括細菌轉(zhuǎn)化(環(huán)境DNA的攝取與表達)和綴合(彼此接觸的細菌之間的DNA轉(zhuǎn)移)。

HGT是一種關(guān)鍵機制，微生物通過該機制傳播傳達存活或生長優(yōu)勢的基因，如抗生素抗性基因，和毒力因子。例如，在一個種類的細菌中負責(zé)抗生素抗性的基因可以通過上述各種HGT機制轉(zhuǎn)移至其它種類的細菌，導(dǎo)致形成新的抗生素抗性菌株。

當(dāng)傳達存活優(yōu)勢的基因人為設(shè)計到生物體中時，HGT的風(fēng)險是一個問題。具體而言，HGT介導(dǎo)的選擇性標(biāo)記(在特定細胞培養(yǎng)條件下促進細胞存活的基因)由工程化微生物向天然微生物的傳播在許多領(lǐng)域(包括醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和研究)中可能存在問題。例如，選擇性標(biāo)記，包括抗生素抗性基因，通常在微生物學(xué)中用以促進從其它方面(otherwise)類似細胞群中選擇含有所需遺傳物質(zhì)的罕見細胞。不幸的是，在實驗微生物中使用抗生素抗性基因作為選擇性標(biāo)記的研究者要冒基因?qū)⑺睫D(zhuǎn)移到毒力微生物中，賦予該毒力微生物抗生物抗性并更難以醫(yī)學(xué)治療的風(fēng)險。即使當(dāng)受體微生物并非毒力時，抗生素抗性基因的傳播也會使得抗生素效力降低，增加細胞培養(yǎng)污染的風(fēng)險。類似地，HGT可導(dǎo)致基因修飾作物中的除草劑抗性基因轉(zhuǎn)移到入侵植物種類中，使得入侵植物具有除草劑抗性并且更難以控制。

因此，對于降低功能性選擇性標(biāo)記由基因修飾生物體向環(huán)境的水平基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險的新組合物和方法存在顯著的需要。

概述

本文中提供的是用于減少功能蛋白的水平基因轉(zhuǎn)移的方法與組合物。在一些實施方案中，通過在至少兩個空間上不同的核酸序列上分別編碼蛋白質(zhì)(例如顯性選擇性標(biāo)記)的結(jié)構(gòu)域來降低水平基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。設(shè)計分離的結(jié)構(gòu)域使得各個體結(jié)構(gòu)域自身是非功能性的，但是結(jié)構(gòu)域一起的共表達導(dǎo)致它們締合以形成功能蛋白。因為功能蛋白的轉(zhuǎn)移將要求將編碼該蛋白的個體結(jié)構(gòu)域的多個空間上不同的核酸序列的每一個轉(zhuǎn)移到單一細胞中，因此大大降低了功能蛋白水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。

在一些方面，本文中提供的是生成表達功能性選擇性標(biāo)記的細胞的方法，該方法包括向細胞中引入至少兩種編碼顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域的不同的多核苷酸。在一些實施方案中，引入恰好兩種不同的多核苷酸。在一些實施方案中，所述顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域締合以形成功能性顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，沒有個體多核苷酸編碼該功能性顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，該多核苷酸在載體中被引入該細胞。在某些實施方案中，該多核苷酸是質(zhì)粒、質(zhì)粒的片段、或線性化的質(zhì)粒。在一些實施方案中，不同的多核苷酸整合到該細胞的基因組中的不同位置。在一些實施方案中，該多核苷酸被靶向以整合到該細胞的基因組中的不同位置(例如通過同源重組)。在一些實施方案中，該多核苷酸整合到該細胞的基因組中的隨機位置。

在一些方面，本文中提供的是生成表達功能性顯性選擇性標(biāo)記的細胞的方法，該方法包括向表達顯性選擇性標(biāo)記的第一結(jié)構(gòu)域的細胞中引入編碼該顯性選擇性標(biāo)記的第二結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。在一些實施方案中，該第一結(jié)構(gòu)域與第二結(jié)構(gòu)域締合以形成功能性顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，該多核苷酸不編碼該功能性顯性選擇性標(biāo)記；并且該細胞在轉(zhuǎn)染前不表達該功能性顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，該多核苷酸在載體中被引入該細胞。在某些實施方案中，該多核苷酸是質(zhì)粒、質(zhì)粒的片段、或線性化的質(zhì)粒。在一些實施方案中，該多核苷酸整合到該細胞的基因組中。在一些實施方案中，該多核苷酸被靶向以整合到該細胞的基因組中的不同位置(例如通過同源重組)。在一些實施方案中，該多核苷酸整合到該細胞的基因組中的隨機位置。

在某些方面，本文中提供的是包含至少兩個位于該細胞的基因組中不同位置并編碼顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域的核酸序列的細胞。在一些實施方案中，該顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域締合以形成功能性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，沒有個體核酸序列編碼該功能性顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，該細胞包含恰好兩個核酸序列，其各自編碼顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域，其中該多核苷酸編碼的兩個不同結(jié)構(gòu)域在細胞中締合以形成該功能性顯性選擇性標(biāo)記。

在一些方面，本文中提供的是包含至少兩種編碼顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域的不同的多核苷酸的試劑盒。在一些實施方案中，所述顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域能夠締合以形成完整的顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，沒有個體多核苷酸編碼完整的顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，該多核苷酸在載體中。在一些實施方案中，該多核苷酸是質(zhì)粒、質(zhì)粒的片段、或線性化的質(zhì)粒。在一些實施方案中，該試劑盒包含恰好兩種不同的多核苷酸。在一些實施方案中，該試劑盒進一步包含細胞。

在一些實施方案中，所述顯性選擇性標(biāo)記是抗藥性標(biāo)記。在一些實施方案中，抗藥性標(biāo)記賦予對選自以下的藥物的抗性：兩性霉素B、克念菌素、菲律賓菌素、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龜裂殺菌素、聯(lián)苯芐唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、異康唑、酮康唑、盧立康唑、咪康唑、奧莫康唑、奧昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬凈、阿莫羅芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬凈、卡泊芬凈、米卡芬凈、苯甲酸、環(huán)吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黃霉素、鹵普羅近、水蓼二醛、托萘酯、結(jié)晶紫、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龍霉素、壯觀霉素、格爾德霉素、除莠霉素、利福昔明、鏈霉素、氯碳頭孢、厄他培南、多利培南、亞胺培南、美羅培南、頭孢羥氨芐、頭孢唑林、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢丙烯、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢布烯、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢洛林酯(Ceftaroline fosamil)、頭孢比羅、替考拉寧、萬古霉素、替拉凡星、氯潔霉素、林可霉素、達托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥因、利奈唑胺、泊西唑利德、雷得唑來(Radezolid)、特地唑胺(Torezolid)、阿莫西林、氨芐青霉素、阿洛西林、羧芐青霉素、鄰氯青霉素、雙氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦、克拉維酸、桿菌肽、粘菌素、多粘霉素B、環(huán)丙沙星、依諾沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酮酸(Nalidixic acid)、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替馬沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶銀、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺(Sulfanilimide)、柳氮磺吡啶、磺胺異噁唑、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、復(fù)方新諾明、Sulfonamidochrysoidine、地美環(huán)素、強力霉素、米諾環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、氯法齊明、氨苯砜、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福噴汀、鏈霉素、胂凡納明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹羅星、平板霉素(Platensimycin)、奎奴普丁、達福普汀、甲砜霉素、替加環(huán)素、替硝唑、甲氧芐啶、遺傳霉素、諾爾絲菌素、潮霉素、博來霉素和嘌呤霉素。

在一些實施方案中，該顯性選擇性標(biāo)記是營養(yǎng)標(biāo)記。在一些實施方案中，該營養(yǎng)標(biāo)記選自亞磷酸特異性氧化還原酶(Phosphite specific oxidoreductase)、α-酮戊二酸依賴性次磷酸雙加氧酶(Alpha-ketoglutarate-dependent hypophosphite dioxygenase)、堿性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脫氨酶、氰尿酸酰胺水解酶(Cyanurate amidohydrolase)、縮二脲水裂合酶(Biuret hydrolyase)、尿素酰胺裂合酶(Urea amidolyase)、氰尿酰胺氨基水解酶(Ammelide aminohydrolase)、鳥嘌呤脫氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亞磷酸氫化酶(Phosphite hydrogenase)、甘油磷酸二酯酶、對硫磷水裂合酶、亞磷酸脫氫酶(Phosphite dehydrogenase)、二苯并噻吩脫硫酶(Dibenzothiophene desulfurization enzyme)、芳族脫亞磺酸酶(Aromatic desulfinase)、NADH依賴性FMN還原酶、氨基嘌呤轉(zhuǎn)運蛋白、羥胺氧化還原酶、轉(zhuǎn)化酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纖維素酶和支鏈淀粉酶(Pullulonase)。

在一些實施方案中，該細胞是原核細胞，如細菌細胞。在一些實施方案中，該細胞是真核細胞，如哺乳動物細胞、酵母細胞、絲狀真菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、禽細胞、植物細胞或昆蟲細胞。

在一些實施方案中，該顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域經(jīng)由蛋白結(jié)合基序締合。在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是亮氨酸拉鏈基序、Src同源2結(jié)構(gòu)域、Src同源3結(jié)構(gòu)域、磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、LIM結(jié)構(gòu)域、不育α基序結(jié)構(gòu)域(sterile alpha motif domain)、PDZ結(jié)構(gòu)域、FERM結(jié)構(gòu)域、鈣調(diào)理蛋白同源結(jié)構(gòu)域、普列克底物蛋白(plexkstrin)同源結(jié)構(gòu)域、WW結(jié)構(gòu)域或WSxWS基序。

附圖簡述

圖1描述了使用DLP-SVM-接合法的斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)膦酸脫氫酶(phosphonate dehydrogenase)基因ptxD的結(jié)構(gòu)域接頭預(yù)測的結(jié)果。

圖2描述了使用DROP法的斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD的結(jié)構(gòu)域接頭預(yù)測的結(jié)果。

圖3描述了通過用于斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD的兩種不同方法：DLP-SVM-接合法(SVM)和DROP法(DROP)預(yù)測的接頭區(qū)的營養(yǎng)品(aliment)。陰影矩形顯示兩種方法之間的重疊。箭頭顯示用于設(shè)計兩種單獨表達的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)斷裂的點。

圖4是經(jīng)由融合至N-pxtD和C-ptxD結(jié)構(gòu)域的反平行亮氨酸接頭之間的卷曲螺旋相互作用的斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域N-pxtD和C-ptxD的翻譯后組裝的示意圖。

圖5是用于在解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株NS18中表達斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD的ptxD構(gòu)建物的圖譜。載體ptxD在轉(zhuǎn)化前通過PacI/NotI限制酶切消化來線性化。2u ori：釀酒酵母(S. cerevisiae)復(fù)制起點；pMB1 ori：大腸桿菌(E. coli) pMB1復(fù)制起點；AmpR：用作用氨芐青霉素選擇的標(biāo)記的bla基因；PR2：解脂耶氏酵母 GPD1啟動子-931至-1；ptxD：斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD；TER1：終止后的解脂耶氏酵母 CYC1終止子300 bp；Sc URA3：用于在酵母中選擇的釀酒酵母URA3營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。

圖6是用于在解脂耶氏酵母菌株NS18中表達和組裝斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD的N-pxtD和C-ptxD結(jié)構(gòu)域的ptxD斷裂構(gòu)建物的圖譜。載體ptxD-斷裂在轉(zhuǎn)化前通過PacI/NotI/PmeI限制酶切消化來線性化。2u ori：釀酒酵母復(fù)制起點；pMB1 ori：大腸桿菌pMB1復(fù)制起點；AmpR：用作用氨芐青霉素選擇的標(biāo)記的bla基因；PR2：解脂耶氏酵母GPD1啟動子-931至-1；N-ptxD：斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD的N端結(jié)構(gòu)域；N-ZIP：N端蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的亮氨酸拉鏈；TER1：終止后的解脂耶氏酵母 CYC1終止子300 bp；PR22：釀酒酵母TEF1啟動子-412至-1；C-ZIP：用于C端蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的設(shè)計的亮氨酸拉鏈；C-ptxD：斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD的C端結(jié)構(gòu)域；TER2：終止后的釀酒酵母CYC1終止子275 bp；Sc URA3：用于在酵母中選擇的釀酒酵母URA3營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。

圖7提供了斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD的DNA和蛋白質(zhì)序列。

圖8提供了斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD的N端和C端結(jié)構(gòu)域的DNA和蛋白質(zhì)序列。

圖9提供了斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD的N端和C端結(jié)構(gòu)域的亮氨酸拉鏈的DNA和蛋白質(zhì)序列。

詳述

概覽

本文中提供的方法與組合物(例如方法、細胞、核酸、多肽、蛋白質(zhì)和試劑盒)消除或顯著減少編碼功能蛋白的遺傳因子(包括但不限于，編碼功能性顯性選擇性標(biāo)記的遺傳因子)的水平轉(zhuǎn)移。

水平基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致耐藥性在病原體之間擴散。因此，由于細菌和其它生物體產(chǎn)生抗藥性機制，其隨后通過水平基因轉(zhuǎn)移擴散至其它生物體，新發(fā)現(xiàn)的和人工的抗生素可經(jīng)時喪失其效力。

由于抗藥性和營養(yǎng)選擇標(biāo)記通常用于生物體的遺傳工程，標(biāo)記由工程化生物體轉(zhuǎn)移到環(huán)境中顯現(xiàn)醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)風(fēng)險。例如，顯性選擇性標(biāo)記的水平轉(zhuǎn)移提高了病原體獲得抗藥性的可能性，并由此變得更難以治療或預(yù)防人類、家畜和作物中的疾病。此外，標(biāo)記從遺傳工程生物體向天然生物體的無意擴散也降低了設(shè)計成基因修飾生物體的競爭優(yōu)勢，并且，結(jié)果，提高了被不期望的天然生物體污染的風(fēng)險。因此，水平基因轉(zhuǎn)移可以提高生物反應(yīng)器被不合意的抗生素抗性微生物污染的風(fēng)險和作物被除草劑抗性入侵植物種類污染的風(fēng)險。

因此，在一些實施方案中，本文中提供的是通過在至少兩個空間上不同的核酸序列上分別編碼顯性選擇性標(biāo)記的結(jié)構(gòu)域來降低水平基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險的組合物和方法，其中單獨的各個體結(jié)構(gòu)域不能充當(dāng)選擇性標(biāo)記，但是編碼的結(jié)構(gòu)域的共表達導(dǎo)致它們締合以形成功能性選擇性標(biāo)記。由于個體標(biāo)記結(jié)構(gòu)域并非功能性的(除了與其它結(jié)構(gòu)域組裝時)，所以個體結(jié)構(gòu)域通過水平基因轉(zhuǎn)移向其它生物體的轉(zhuǎn)移不會賦予受體生物體選擇優(yōu)勢。因此，非宿主生物體獲得組裝功能性顯性選擇性標(biāo)記所必需的所有結(jié)構(gòu)域的概率顯著低于單一水平基因轉(zhuǎn)移事件的概率。

定義

冠詞“一個(種)”(“a”和“an”)在本文中用于指一個(種)或超過一個(種)(即至少一個(種))該冠詞的語法對象。通過舉例方式，“一個要素”指的是一個要素或多于一個要素。

術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”指的是蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分，其能夠折疊成獨立于該蛋白質(zhì)其余部分的穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)。天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域通常通過結(jié)構(gòu)域接頭來連接。從蛋白質(zhì)的氨基酸序列中識別結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域接頭的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并包括例如Ebina等人在Biopolymers 92:1-8 (2009)中描述的DLP-SVM-接合法(通過引用以其全部由此并入)，和DROP法，其描述在Ebina等人的Bioinformatics 27:487-494 (2001)(通過引用以其全部由此并入)中。

術(shù)語“顯性選擇性標(biāo)記”指的是允許表達該選擇性標(biāo)記的細胞在特定細胞培養(yǎng)條件下生長和/或存活的選擇性標(biāo)記。顯性選擇性標(biāo)記可以與“陰性選擇性標(biāo)記”形成對照，所述陰性選擇性標(biāo)記指的是防止表達該選擇性標(biāo)記的細胞在特定細胞培養(yǎng)條件下生長和/或存活的選擇性標(biāo)記。如果單一選擇性標(biāo)記允許表達該選擇性標(biāo)記的細胞在特定細胞培養(yǎng)條件下生長和/或存活，但是防止表達該選擇性標(biāo)記的細胞在其它細胞培養(yǎng)條件下生長和/或存活的話，則該選擇性標(biāo)記有可能既是顯性選擇性標(biāo)記又是陰性選擇性標(biāo)記。

本文中所用的術(shù)語“營養(yǎng)源”包括可以由細胞用于促進細胞生長和/或存活的任何材料，包括碳源。

本文中所用的術(shù)語“質(zhì)?！敝傅氖桥c生物體的基因組DNA物理分離的環(huán)狀DNA分子。質(zhì)?？梢栽诒灰氲剿拗骷毎熬€性化(在本文中稱為線性化的質(zhì)粒)。線性化的質(zhì)粒不是自我復(fù)制的，但是可整合到生物體的基因組DNA中并用生物體的基因組DNA來復(fù)制。

術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”可互換使用。它們指的是任意長度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物)的聚合形式。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，并可實施任何功能。下面是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段的編碼區(qū)或非編碼區(qū)、由連鎖分析確定的基因座(locus)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在的話，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可在組裝聚合物之前或之后進行(impart)。多核苷酸可經(jīng)進一步修飾，如通過與標(biāo)記組分綴合。在本文中提供的所有核酸序列中，U核苷酸可與T核苷酸互換。

術(shù)語“載體”指的是核酸可以由此在生物體、細胞或細胞組分之間傳播和/或轉(zhuǎn)移的手段。載體包括質(zhì)粒、線性DNA片段、病毒、噬菌體、前病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子和人工染色體等等，其可能或可能不能夠自主復(fù)制或整合到宿主細胞的染色體中。

用于減少功能蛋白的水平基因轉(zhuǎn)移的方法

在一些方面，本文中提供的是生成具有降低的水平轉(zhuǎn)移編碼功能蛋白的核酸序列的可能性的細胞的方法。在一些實施方案中，這通過設(shè)計該細胞使得該蛋白被表達為至少兩個由單獨的表達盒編碼的單獨的結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)。各個表達的結(jié)構(gòu)域在單獨被表達時是非功能性的，但是當(dāng)該結(jié)構(gòu)域一起被表達時，它們締合形成功能蛋白。在一些實施方案中，該蛋白是顯性選擇性標(biāo)記。

在一些實施方案中，該方法包括向細胞中引入至少兩種編碼該蛋白的不同結(jié)構(gòu)域的不同的多核苷酸。在一些實施方案中，將該功能蛋白分為2、3、4、5、6或更多個單獨的結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，恰好引入兩種不同的多核苷酸。在一些實施方案中，各單獨的結(jié)構(gòu)域在引入該細胞的一種單獨的多核苷酸上被編碼。在一些實施方案中，將單獨的多核苷酸同時引入該細胞(例如在單一共轉(zhuǎn)染中)。在一些實施方案中，將單獨的多核苷酸依次引入該細胞(例如在連續(xù)轉(zhuǎn)染中)。由此，在一些實施方案中，將編碼該蛋白的一個結(jié)構(gòu)域的單一多核苷酸引入包含(例如在其基因組中)編碼該蛋白的不同結(jié)構(gòu)域的核酸序列的細胞中。在一些實施方案中，該單獨的結(jié)構(gòu)域由單獨的表達盒編碼。該單獨的表達盒可以在分開的多核苷酸上或在單一多核苷酸上。在一些實施方案中，該多核苷酸是質(zhì)粒、質(zhì)粒的片段、或線性化的質(zhì)粒。

在某些實施方案中，本文中描述的方法可以應(yīng)用于任何細胞類型。在一些實施方案中，該細胞是原核細胞，如細菌細胞。在一些實施方案中，該細胞是真核細胞，如哺乳動物細胞、酵母細胞、絲狀真菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、禽細胞、植物細胞或昆蟲細胞。

在一些實施方案中，該細胞是微生物。在一些實施方案中，該微生物是耶氏酵母屬(Yarrowia)、Arxula屬、酵母菌屬(Saccharomyces)、Ogataea屬、畢赤酵母屬(Pichia)或埃希氏菌屬(Escherichia)的物種。在一些實施方案中，該微生物選自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Ogataea polymorpha、畢赤酵母(Pichia pastoris)、Arxula adeniovorans和大腸桿菌(Escherichia coli)。

在某些實施方案中，該多核苷酸可以使用本領(lǐng)域中已知的任何方法引入該細胞。例如，在一些實施方案中，該多核苷酸在載體中被引入。一種類型的載體是“質(zhì)?！保渲傅氖歉郊覰DA節(jié)段可以連接到其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。在一些實施方案中，該質(zhì)粒在引入該細胞之前線性化。另一種類型的載體是病毒載體，其中附加DNA節(jié)段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入其中的宿主細胞(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和游離型真核載體)中自主復(fù)制。其它載體(例如非游離型真核載體)可以在引入宿主細胞中時整合到該宿主細胞的基因組中，并由此與宿主基因組一起復(fù)制。

某些載體能夠引導(dǎo)它們可操作地連接的基因的表達(表達載體)。本文中提供的表達載體能夠促進宿主細胞中的編碼結(jié)構(gòu)域的表達，這意味著該表達載體包括一個或更多個基于要用于表達的宿主細胞所選擇的調(diào)節(jié)序列(例如啟動子、增強子)，該調(diào)節(jié)序列可操作地連接到要表達的核酸序列。表達載體的設(shè)計可以取決于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達水平等等的因素。

該多核苷酸可以經(jīng)由常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)引入原核或真核宿主細胞中。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染技術(shù)的實例包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔、光學(xué)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、impalefection、流體輸送(hydrodynamic delivery)、使用基因槍、磁轉(zhuǎn)染和粒子轟擊。多核苷酸也可以通過用病毒載體(例如腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)感染該細胞來引入。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的合適方法可見于Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)和其它實驗室手冊。

在一些方面，本文中提供的是可用于實施本文中描述的方法的試劑盒。在一些實施方案中，該試劑盒包括至少兩種編碼顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域的不同的多核苷酸。在一些實施方案中，該顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域能夠締合以形成完整的顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，沒有個體多核苷酸編碼完整的顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，該多核苷酸在載體中。在一些實施方案中，該多核苷酸是質(zhì)粒、質(zhì)粒的片段、或線性化的質(zhì)粒。在一些實施方案中，該試劑盒包含恰好兩種不同的多核苷酸。在一些實施方案中，該試劑盒進一步包含細胞。在一些實施方案中，該細胞是真核細胞，如哺乳動物細胞、酵母細胞、絲狀真菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、禽細胞、植物細胞或昆蟲細胞。在一些實施方案中，該試劑盒進一步包含轉(zhuǎn)染試劑。在一些實施方案中，該試劑盒進一步包含使用說明書。

具有降低的水平基因轉(zhuǎn)移的細胞

在某些方面，本文中提供的是具有降低的水平轉(zhuǎn)移其表達的蛋白(例如顯性選擇性標(biāo)記)的可能性的細胞。在一些實施方案中，該細胞是原核細胞，如細菌細胞。在一些實施方案中，該細胞是真核細胞，如哺乳動物細胞、酵母細胞、絲狀真菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、禽細胞、植物細胞或昆蟲細胞。

在一些實施方案中，該細胞是微生物。在一些實施方案中，該微生物是耶氏酵母屬、酵母菌屬(Saccharomyces)、Ogataea屬、畢赤酵母屬、Arxula屬或埃希氏菌屬的物種。在一些實施方案中，該微生物選自解脂耶氏酵母、釀酒酵母、Ogataea polymorpha、畢赤酵母、Arxula adeniovorans和大腸桿菌。

在一些實施方案中，該細胞含有至少兩種位于該細胞中空間上不同位置處的編碼蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一些實施方案中，該顯性選擇性標(biāo)記的不同結(jié)構(gòu)域締合以形成功能性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，沒有個體核酸序列編碼該功能性顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，使用本文中描述的方法生成該細胞。

在一些實施方案中，所述兩種核酸序列位于該細胞的基因組中的不同位置處。在一些實施方案中，所述兩種核酸序列位于不同的染色體上。在一些實施方案中，所述兩種核酸序列位于該細胞內(nèi)不同的染色體外因子(例如質(zhì)粒)上。在一些實施方案中，一個核酸序列位于該細胞的基因組DNA中，且另一核酸序列位于染色體外因子上。在一些實施方案中，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000個堿基對分隔所述核酸序列。

顯性選擇性標(biāo)記

在一些實施方案中，本文中提供的是作為單獨的結(jié)構(gòu)域表達的顯性選擇性標(biāo)記，所述結(jié)構(gòu)域獨立地為非功能性的，但是能夠締合以形成顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，本文中提供的是編碼此類顯性選擇性標(biāo)記和顯性選擇性標(biāo)記結(jié)構(gòu)域的核酸分子、細胞或生物體。

在一些實施方案中，該顯性選擇性標(biāo)記是抗藥性標(biāo)記?？顾幮詷?biāo)記是在被細胞表達時，允許該細胞在通常將抑制細胞生長和/或存活的藥物存在下生長和/或存活的顯性選擇性標(biāo)記。表達抗藥性標(biāo)記的細胞可以通過在該藥物的存在下生長該細胞來選擇。在一些實施方案中，該抗藥性標(biāo)記是抗生素抗性標(biāo)記。在一些實施方案中，該抗藥性標(biāo)記賦予對選自以下的藥物的抗性：兩性霉素B、克念菌素、菲律賓菌素、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龜裂殺菌素、聯(lián)苯芐唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、異康唑、酮康唑、盧立康唑、咪康唑、奧莫康唑、奧昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬凈、阿莫羅芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬凈、卡泊芬凈、米卡芬凈、苯甲酸、環(huán)吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黃霉素、鹵普羅近、水蓼二醛、托萘酯、結(jié)晶紫、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龍霉素、壯觀霉素、格爾德霉素、除莠霉素、利福昔明、鏈霉素、氯碳頭孢、厄他培南、多利培南、亞胺培南、美羅培南、頭孢羥氨芐、頭孢唑林、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢丙烯、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢布烯、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢洛林酯、頭孢比羅、替考拉寧、萬古霉素、替拉凡星、氯潔霉素、林可霉素、達托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥因、利奈唑胺、泊西唑利德、雷得唑來、特地唑胺、阿莫西林、氨芐青霉素、阿洛西林、羧芐青霉素、鄰氯青霉素、雙氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦、克拉維酸、桿菌肽、粘菌素、多粘霉素B、環(huán)丙沙星、依諾沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酮酸、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替馬沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶銀、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺、柳氮磺吡啶、磺胺異噁唑、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、復(fù)方新諾明、Sulfonamidochrysoidine、地美環(huán)素、強力霉素、米諾環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、氯法齊明、氨苯砜、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福噴汀、鏈霉素、胂凡納明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹羅星、平板霉素、奎奴普丁、達福普汀、甲砜霉素、替加環(huán)素、替硝唑、甲氧芐啶、遺傳霉素、諾爾絲菌素、潮霉素、博來霉素和嘌呤霉素。

在一些實施方案中，該顯性選擇性標(biāo)記是營養(yǎng)標(biāo)記。營養(yǎng)標(biāo)記是在被細胞表達時，允許該細胞使用特定營養(yǎng)源生長和/或存活的顯性選擇性標(biāo)記。表達營養(yǎng)標(biāo)記的細胞可以通過在受限的營養(yǎng)條件下生長該細胞來選擇，在所述條件下表達該營養(yǎng)標(biāo)記的細胞能夠存活和/或生長，但是缺少該營養(yǎng)標(biāo)記的細胞不能存活和/或生長。在一些實施方案中，該營養(yǎng)標(biāo)記選自亞磷酸特異性氧化還原酶、α-酮戊二酸依賴性次磷酸雙加氧酶、堿性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脫氨酶、氰尿酸酰胺水解酶、縮二脲水裂合酶、尿素酰胺裂合酶、氰尿酰胺氨基水解酶、鳥嘌呤脫氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亞磷酸氫化酶、甘油磷酸二酯酶、對硫磷水裂合酶、亞磷酸脫氫酶、二苯并噻吩脫硫酶、芳族脫亞磺酸酶、NADH依賴性FMN還原酶、氨基嘌呤轉(zhuǎn)運蛋白、羥胺氧化還原酶、轉(zhuǎn)化酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纖維素酶和支鏈淀粉酶。

在一些實施方案中，本文中描述的顯性選擇性標(biāo)記作為單獨的結(jié)構(gòu)域表達，所述結(jié)構(gòu)域單獨地為非功能性的，但是能夠與其它結(jié)構(gòu)域締合形成功能性顯性選擇性標(biāo)記。該顯性選擇性標(biāo)記的單獨的結(jié)構(gòu)域可以使用本領(lǐng)域已知的方法來識別。例如，該單獨的結(jié)構(gòu)域可以基于該顯性選擇性標(biāo)記的晶體結(jié)構(gòu)來識別，或基于該顯性選擇性標(biāo)記的氨基酸序列來識別。從蛋白質(zhì)的氨基酸序列中識別結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域接頭的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并包括例如在Ebina等人, Biopolymers 92:1-8 (2009)中描述的DLP-SVM-接合法和在Ebina等人, Bioinformatics 27:487-494 (2001)中描述的DROP法。通常，該顯性選擇性標(biāo)記的結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)域接頭中的位置處的單獨表達來劃分(devided for)。

在一些實施方案中，該顯性選擇性標(biāo)記的結(jié)構(gòu)域固有地能夠締合以形成功能性顯性選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，該顯性選擇性標(biāo)記的結(jié)構(gòu)域設(shè)計成經(jīng)由蛋白結(jié)合基序來締合。在此類情況下，該顯性選擇性標(biāo)記的結(jié)構(gòu)域作為包括顯性選擇性標(biāo)記結(jié)構(gòu)域和蛋白結(jié)合基序兩者的融合蛋白表達。在大多數(shù)情況下，將選擇蛋白結(jié)合基序連接到結(jié)構(gòu)域的位置，使得在結(jié)構(gòu)域締合后形成的復(fù)合物類似于天然蛋白的結(jié)構(gòu)。由此，在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序連接到位于天然蛋白的N端的結(jié)構(gòu)域的C端。在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序連接到位于天然蛋白的C端的結(jié)構(gòu)域的N端。

在一些實施方案中，任何蛋白結(jié)合基序可用于促進顯性選擇性標(biāo)記結(jié)構(gòu)域的締合。蛋白結(jié)合基序的實例包括亮氨酸拉鏈、Src同源2結(jié)構(gòu)域、Src同源3結(jié)構(gòu)域、磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、LIM結(jié)構(gòu)域、不育α基序結(jié)構(gòu)域、PDZ結(jié)構(gòu)域、FERM結(jié)構(gòu)域、鈣調(diào)理蛋白同源結(jié)構(gòu)域、普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域、WW結(jié)構(gòu)域或WSxWS基序。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是亮氨酸拉鏈基序。亮氨酸拉鏈是常見的三維蛋白結(jié)構(gòu)基序，其常充當(dāng)二聚結(jié)構(gòu)域。亮氨酸拉鏈氨基酸序列在本領(lǐng)域中是已知的。例如，在圖9中提供了示例性亮氨酸拉鏈序列，并描述在Ghosh等人,J.Am.Chem.Soc.122:5658 (2000)中。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是Src同源2結(jié)構(gòu)域(SH2結(jié)構(gòu)域)。SH2結(jié)構(gòu)域是大約100個氨基酸的廣泛(broadly)保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其允許含有此類結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合到其它蛋白質(zhì)上的磷酸化酪氨酸殘基。SH2結(jié)構(gòu)域序列在該領(lǐng)域中是已知的并在許多物種中發(fā)現(xiàn)，包括在超過100種人類基因中。許多SH2結(jié)構(gòu)域序列在本領(lǐng)域中是已知的。含有SH2結(jié)構(gòu)域的人蛋白的實例包括ABL1、ABL2、BCAR3、CHN2、DAPP1、HCK、SLA、SOCS1、SOCS2、SOCS3、TEC、TNS、VAV1、YES1和ZAP70。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是Src同源3結(jié)構(gòu)域(SH3結(jié)構(gòu)域)。SH3結(jié)構(gòu)域是在大約300種由人基因組編碼的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的大約60個氨基酸的小的、高度保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。SH3結(jié)構(gòu)域具有特征性β-桶狀折疊(beta-barrel fold)，其由排列成兩個緊密堆積的反平行β折疊(β sheet)的五條或六條β鏈組成。SH3結(jié)構(gòu)域通常結(jié)合到結(jié)合配偶體(binding partner)中的富含脯氨酸的肽。被SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的富含脯氨酸的肽常具有X-P-p-X-P的共有序列，X代表脂族氨基酸，P總是代表脯氨酸，而p有時為脯氨酸。含有SH3結(jié)構(gòu)域的人蛋白的實例包括CDC24、CDC25、PI3激酶、GRB2、SH3D21和STAC3。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PTB結(jié)構(gòu)域)。磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域是結(jié)合到磷酸酪氨酸的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的實例在通過結(jié)合到NPXY基序與β整合蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)相互作用的張力蛋白的C端中發(fā)現(xiàn)。含有PTB結(jié)構(gòu)域的人蛋白的實例包括APBA1、APBA2、EPS8、EPS8L1、TENC1、TNS、DOC1、FRS2、IRS1和TLN1。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是LIM結(jié)構(gòu)域。LIM結(jié)構(gòu)域是由兩個被二-氨基酸殘基疏水性接頭分隔的鄰接鋅指結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(structural domain)。LIM結(jié)構(gòu)域初始在蛋白質(zhì)Lin11、Isl-1和Mec-3中被識別，但是已經(jīng)在真核生物和原核生物兩者中的許多其它蛋白質(zhì)中被識別。LIM結(jié)構(gòu)域的序列特征為[C]-[X]_2-4-[C]-[X]_13-19-[W]-[H]-[X]_2-4-[C]-[F]-[LVI]-[C]-[X]_2-4-[C]-[X]_13-20-C-[X]_2-4-[C]。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是不育α基序結(jié)構(gòu)域(SAM結(jié)構(gòu)域)。SAM結(jié)構(gòu)域是在寬范圍的真核蛋白中發(fā)現(xiàn)的尺寸為大約70個氨基酸的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域。Sam結(jié)構(gòu)域以具有兩個大界面的小的五螺旋束形式排列。SAM結(jié)構(gòu)域常與其它SAM結(jié)構(gòu)域二聚。例如，真菌蛋白Ste50p的SAM結(jié)構(gòu)域與Ste11p的SAM結(jié)構(gòu)域相互作用以促進形成異二聚體復(fù)合物。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是PDZ結(jié)構(gòu)域。PDZ結(jié)構(gòu)域是在寬范圍的生物體(包括細菌、酵母、植物、病毒和動物)中發(fā)現(xiàn)的80-90個氨基酸的常見結(jié)構(gòu)域。PDZ結(jié)構(gòu)域通過β折疊增加(augmentation)結(jié)合到其它蛋白質(zhì)的C端的短區(qū)域。存在大約260種人PDZ結(jié)構(gòu)域，許多蛋白質(zhì)含有多個PDZ結(jié)構(gòu)域。含有PDZ結(jié)構(gòu)域的人蛋白的實例包括Erbin、Htra1、Htra2、Htra3、PSD-95、SAP97、CARD11和PTP-BL。PDZ結(jié)構(gòu)域常與其它蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(包括SH3結(jié)構(gòu)域)締合。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是FERM結(jié)構(gòu)域。FERM結(jié)構(gòu)域是在許多細胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種普遍的蛋白質(zhì)分子。在大多數(shù)情況下，該FERM結(jié)構(gòu)域存在于含有FERM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的N端。含有FERM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的實例包括Band 4.1、埃茲蛋白(Ezrin)、膜突蛋白(Moesin)、根蛋白(Radixin)、踝蛋白(Talin)、Merlin、NBL4和TYK2。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是鈣調(diào)理蛋白同源結(jié)構(gòu)域(CH結(jié)構(gòu)域)。CH結(jié)構(gòu)域是在細胞骨架蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白兩者中發(fā)現(xiàn)的一類肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。含有CH結(jié)構(gòu)域的人蛋白的實例包括ACTN1、CLMN、DIXDC1、FLNA、IQGAP1、LCP1、MACF1、NAV2、PARVA、SMTN和VAV1。在Saraste等人, Nat.Struct.Biol. 4:175-179 (1997)中提供了示例性CH結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域(PH結(jié)構(gòu)域)。PH結(jié)構(gòu)域是在寬范圍的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的大約120個氨基酸的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。示例性PH結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)描述在Riddihough Nat.Struct.Biol. 1:755-757 (1994)中。PH結(jié)構(gòu)域具有由后接C端兩親性螺旋的兩個垂直的反平行β折疊組成的結(jié)構(gòu)。含有PH結(jié)構(gòu)域的人蛋白的實例包括ABR、BMK、BTK、DAB2IP、DOK4、EXOC8、GAB1、IRS1、KALRN、NET1、RASA1、ROCK1、RP1和VEPH1。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是WW結(jié)構(gòu)域(也稱為rsp5-結(jié)構(gòu)域或WWP重復(fù)基序)。該WW結(jié)構(gòu)域是大約40個氨基酸的模塊結(jié)構(gòu)域，其常重復(fù)多達四次并且與特定的脯氨酸基序(包括[AP]-[P]-[P]-[AP]-Y基序)相互作用。含有來自寬范圍的物種基序的WW的大量蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域中是已知的，包括脊椎動物YAP蛋白、NEDD4(小鼠)、RSP5(酵母)、FE65(大鼠)和DB10(煙草)。在Hu等人, Proteomics 4:643-655 (2004)中提供了對WW結(jié)構(gòu)域相互作用的詳細信息。

在一些實施方案中，該蛋白結(jié)合基序是WSxWS基序。該WSxWS基序是在某些蛋白質(zhì)受體(包括I型細胞因子受體)的胞外結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)相互作用基序。在Dagil等人, Structure 20:270-282 (2012)中提供了示例性WSxWS基序的結(jié)構(gòu)。含有WSxWS基序的蛋白質(zhì)的實例包括IL-4受體、生長激素受體、催乳素受體、促紅細胞生成素受體、IL-2受體、IL-13受體和IL-6受體。

范例

實施例1：識別營養(yǎng)標(biāo)記ptxD中的結(jié)構(gòu)域

為了證實標(biāo)記結(jié)構(gòu)域的單獨表達降低了標(biāo)記轉(zhuǎn)移到其它生物體的風(fēng)險，選擇斯氏假單胞菌膦酸脫氫酶基因ptxD(序列基于NCBI參考序列：YP_006457277.1提供在圖7中)作為實例。當(dāng)斯氏假單胞菌ptxD基因在解脂耶氏酵母中被表達時，其促進了由解脂耶氏酵母進行的亞磷酸鹽(phosphite)消耗，并允許其在其中亞磷酸鹽是唯一可用磷源的條件下生長。由于解脂耶氏酵母的野生型菌株不能在其中亞磷酸鹽是唯一磷源的培養(yǎng)基上生長，ptxD在解脂耶氏酵母中充當(dāng)營養(yǎng)標(biāo)記。

為了將ptxD基因斷裂成可以單獨折疊的結(jié)構(gòu)域，使用兩種方法預(yù)測結(jié)構(gòu)域接頭序列：DLP-SVM-接合(Ebina等人, Biopolymers 92:1-8 (2009))和DROP(Ebina等人, Bioinformatics 27:487-494 (2001))。圖1和2分別顯示了由DLP-SVM-接合法和DROP法產(chǎn)生的這些結(jié)構(gòu)域接頭預(yù)測的結(jié)果。如圖3中所示，兩種結(jié)構(gòu)域預(yù)測方法識別了重疊的接頭序列。選擇共有接頭序列中的位置作為將分離ptxD的N端結(jié)構(gòu)域與C端結(jié)構(gòu)域的點，如圖3中的箭頭所示。在圖8中提供了所得N端結(jié)構(gòu)域與C端結(jié)構(gòu)域的序列。

實施例2：產(chǎn)生將ptxD作為單獨的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域表達的細胞

圖1中識別的結(jié)構(gòu)域ptxD融合到亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(序列提供在圖9中)用于如圖4中所示的翻譯后組裝。該ptxD作為單獨的結(jié)構(gòu)域表達或作為單一蛋白質(zhì)表達用于比較。通過以下兩種表達構(gòu)建物之一來轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株NS18(NRRL YB-392)細胞：ptxD(編碼完整的ptxD蛋白，顯示在圖5中)或ptxD-斷裂(編碼單獨的ptxD結(jié)構(gòu)域/亮氨酸拉鏈融合多肽，顯示在圖6中)。構(gòu)建物ptxD在轉(zhuǎn)化之前通過PacI/NotI限制酶切消化來線性化。構(gòu)建物ptxD-斷裂在轉(zhuǎn)化之前通過PacI/NotI/PmeI限制酶切消化來線性化。ptxD-斷裂構(gòu)建物的PacI/NotI/PmeI消化生成兩個單獨的DNA片段，其各自含有一個表達盒：一個編碼N端結(jié)構(gòu)域ptxD/亮氨酸拉鏈融合多肽，而另一個編碼ptxD/亮氨酸拉鏈融合多肽的C端結(jié)構(gòu)域。為了獲得編碼個體標(biāo)記結(jié)構(gòu)域的單獨的表達盒，該ptxD-斷裂構(gòu)建物可以通過PacI/NotI/PmeI核酸內(nèi)切酶來消化，并通過使用標(biāo)準凝膠電泳和凝膠純化技術(shù)分離含有個體表達盒的DNA片段?；蛘撸梢詫txD的各個結(jié)構(gòu)域設(shè)計和構(gòu)建單獨的表達載體。

將來自線性化的ptxD和ptxD-斷裂質(zhì)粒的表達盒整合到NS18菌株細胞的基因組中。對于線性化的ptxD-斷裂，兩種表達盒必須同時整合到酵母基因組中以使ptxD為功能性的。作為對照試驗，各個ptxD結(jié)構(gòu)域在解脂耶氏酵母細胞中單獨表達以證明各結(jié)構(gòu)域并非獨立地為功能性的。

實施例3：在將ptxD作為單獨的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域表達的細胞中降低的水平基因轉(zhuǎn)移

對于將ptxD作為單獨結(jié)構(gòu)域(NS18+ptxD-斷裂)表達或作為單一多肽(NS18+ptxD)表達的解脂耶氏酵母菌株來確定ptxD水平轉(zhuǎn)移到其它生物體的速率。各菌株在含有亞磷酸鹽作為磷源的確定培養(yǎng)基中、在搖瓶中在不具有ptxD基因的污染生物體(例如不表達ptxD基因的解脂耶氏酵母菌株NS18)的存在下生長。為了區(qū)分污染細胞與表達ptxD的菌株，預(yù)先用表達ptxD的菌株中不存在的抗生素抗性標(biāo)記來轉(zhuǎn)化該污染細胞。隨后對菌株施以系列轉(zhuǎn)移，其中細胞培養(yǎng)物每24-48小時用新鮮培養(yǎng)基稀釋100倍。每次稀釋細胞時，向瓶中再次加入污染細胞。持續(xù)該系列轉(zhuǎn)移用于多代細胞分裂(1,000-10,000或更多)，并通過將混合培養(yǎng)物鋪在含有污染物特異性抗生素的培養(yǎng)基上來分離污染物細胞并測量污染細胞獲得利用亞磷酸鹽的能力的百分比，由此測量ptxD轉(zhuǎn)移的速率。將來自NS18+ptxD-斷裂菌株的水平基因轉(zhuǎn)移速率與來自NS18+ptxD菌株的水平基因轉(zhuǎn)移速率進行比較。

作為用于檢查與NS18+ptxD菌株相比降低的來自NS18+ptxD-斷裂菌株的水平轉(zhuǎn)移的水平的第二種方法，分離來自NS18+ptxD-斷裂菌株和NS18+ptxD菌株的基因組DNA并將其用于轉(zhuǎn)化污染生物體如酵母或細菌。為了提高將ptxD表達盒整合到污染生物體的基因組中的效率，用限制酶來消化NS18+ptxD-斷裂菌株與NS18+ptxD菌株的基因組DNA。通過計算在具有限定培養(yǎng)基的板上的轉(zhuǎn)化體和每微克用于轉(zhuǎn)化的基因組DNA的作為磷源的亞磷酸鹽的量來測量功能ptxD水平轉(zhuǎn)移的速率。

通過引用并入

所有本文中引用的美國專利和美國公開專利申請都通過引用由此并入。

等效方案

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，或僅使用常規(guī)試驗即能夠確定對本文中描述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等效方案。此類等效方案意在由下列權(quán)利要求書涵蓋。