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一種采用逆流色譜技術(shù)一步純化大蒜多糖的方法

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一種采用逆流色譜技術(shù)一步純化大蒜多糖的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明是一種以新鮮大蒜為原料制備和純化大蒜多糖的一種采用逆流色譜技術(shù)一步純化大蒜多糖的方法;本發(fā)明通過(guò)洗滌去雜,破碎浸提等步驟,得大蒜粗提液,經(jīng)大孔樹(shù)脂處理,洗脫得大蒜多糖粗提液,再經(jīng)逆流色譜一步純化得大蒜多糖精品。本方法實(shí)現(xiàn)了一步純化制備高純度大蒜多糖的理想;該方法采用逆流色譜技術(shù)純化大蒜多糖不僅能夠?qū)崿F(xiàn)純度高、操作簡(jiǎn)單、效率高、價(jià)格低,而且還優(yōu)化了制備高純度大蒜多糖的提取工藝,為規(guī)模分離純化大蒜多糖精品提供技術(shù)支持,有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種采用逆流色譜技術(shù)一步純化大蒜多糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種純化大蒜多糖的方法,特別是一種采用逆流色譜技術(shù)一步純化得到高純度的大蒜多糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]大蒜多糖是大蒜中含量最高的保健功能成分,占鮮蒜的15%?25%,具有增殖腸道益生菌,協(xié)助消化、增強(qiáng)免疫力、防止肝損傷、抗氧化和抗病毒等多種功效。大蒜多糖在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有較廣泛的實(shí)際應(yīng)用前景。
[0003]目前,大蒜多糖的提取方法主要有熱水、稀鹽、稀堿和稀酸提取,也有用復(fù)合酶處理、超聲輔助加速多糖釋放的提取方法。熱水浸提法是一種常用的提取植物多糖的方法,其優(yōu)點(diǎn)是成本低廉、工藝簡(jiǎn)單、無(wú)需特殊儀器設(shè)備,可用于大規(guī)模生產(chǎn),其缺點(diǎn)是提取工藝時(shí)間長(zhǎng)。酶法提取是采用酶與熱水浸提相結(jié)合的方法,有復(fù)合酶法和單一酶法。常用的酶有蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等。酶法提取植物多糖具有反應(yīng)條件溫和、提取率高、雜質(zhì)易除、提取時(shí)間短,工藝簡(jiǎn)便,而且能保持多糖的天然活性,但有些酶的價(jià)格較高,使用的條件比較苛刻。酸堿提取法是利用在稀酸或稀堿作用下,植物或菌類(lèi)的細(xì)胞、細(xì)胞壁被充分溶脹以致破裂,使其中游離的多糖增加,更易溶解在稀酸或堿水溶液中,利用這一特性可提高此類(lèi)多糖的提取率。但是,稀酸、稀堿在濃度因子難以控制的情況下易使多糖發(fā)生糖苷鍵的斷裂,使部分多糖發(fā)生水解而降低提取率。因此,開(kāi)發(fā)高效的大蒜多糖分離提取法是非常必要的。
[0004]高速逆流色譜技術(shù)(high-speedcounter-current chromatography, HSCCC)是一種連續(xù)高效的無(wú)固相載體的液-液分配色譜技術(shù),最初由美國(guó)國(guó)立健康研究院Ito教授研制開(kāi)發(fā)。由于不需要固相載體,物質(zhì)的分離依據(jù)其在互不相溶的兩相液體中的分配系數(shù)的差異而實(shí)現(xiàn),因而避免了物質(zhì)在固定相不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等問(wèn)題,分離到的樣品更能反映其本來(lái)的特性,特別適合于天然產(chǎn)物中有效成分的分離。高速逆流色譜因其不使用固體固定相,不存在不可逆吸附現(xiàn)象,并且有廣泛的溶劑體系可供選擇。從理論上講HSCCC可以適用于任何極性范圍樣品的分離,甚至可以分離多糖和蛋白之類(lèi)物質(zhì),因此應(yīng)用范圍很廣,具有很好的適應(yīng)性,在分離天然化合物方面有其獨(dú)到之處。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服目前大蒜多糖提取的工藝時(shí)間長(zhǎng)、價(jià)格較高、條件比較苛刻及提取效率較低的問(wèn)題,本發(fā)明提供一種采用逆流色譜技術(shù)一步純化大蒜多糖的方法;該方法采用逆流色譜技術(shù)純化大蒜多糖不僅能夠?qū)崿F(xiàn)純度高、操作簡(jiǎn)單、效率高、價(jià)格低,而且還優(yōu)化了制備高純度大蒜多糖的提取工藝,為規(guī)模分離純化大蒜多糖精品提供技術(shù)支持,有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟:
A.洗滌去雜:將新鮮大蒜去皮,洗去雜質(zhì)。
[0007]B.破碎浸提濃縮:將洗凈的大蒜破碎,用75%乙醇水溶液超聲循環(huán)提取兩次,兩次提取液合并濃縮。
[0008]C.大蒜多糖粗提液經(jīng)大孔樹(shù)脂處理:將濃縮液復(fù)溶上DA201極性大孔樹(shù)脂柱,上樣量為柱體積的10%,用水作淋洗液,濃縮流出液。
[0009]D.經(jīng)逆流色譜一步純化大蒜多糖:逆流色譜溶劑系統(tǒng)為MgS04:PEG:H20,硫酸鎂的百分含量為14?18%,PEG (聚乙二醇)分子量為1000?1500,含量為12%?15%。配置好的溶劑放入分液漏斗中,靜止過(guò)夜,取上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相。逆流色譜儀柱溫為25°C,轉(zhuǎn)速為800-1000r/min,轉(zhuǎn)向?yàn)檎?。用上下?:1的溶液對(duì)濃縮液進(jìn)行稀釋?zhuān)苟嗵呛繛镮?2mg/mL。上樣體積為柱體積的1/10?1/20。定時(shí)或定量進(jìn)行收集,對(duì)收集到的各管采用硫酸一苯酚法進(jìn)行多糖測(cè)定。
[0010]E.透析及干燥:將適量體積的上述溶液裝入截留分子量為3000的透析袋中,對(duì)水透析過(guò)夜,將透析過(guò)的溶液進(jìn)行冷凍干燥,得大蒜多糖精品。
[0011]以本發(fā)明所述方法制備的大蒜多糖分子量為5400,純度為97%以上。純度和分子量的測(cè)定方法為凝膠柱層析法,所用柱填料為葡聚糖凝膠G-100,分離范圍:3000-120000,柱高為35cm,檢測(cè)器為蒸發(fā)光檢測(cè)器,漂移管溫度:80°C,氣流量:4.5L/min,葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn):4320、12600、60600、110000。多糖含量測(cè)定方法為硫酸——苯酚法。
[0012]純化大蒜多糖采用的是逆流色譜法。
[0013]逆流色譜法所用的溶劑系統(tǒng)為MgSO4:PEG:H20,其中,硫酸鎂的百分含量為14?18%, PEG (聚乙二醇)分子量為1000?1500,含量為12%?15%。
[0014]經(jīng)逆流色譜儀純化過(guò)的大蒜多糖溶液是裝入截留分子量為3000的透析袋中,對(duì)水透析過(guò)夜后,冷凍干燥,得大蒜多糖精品。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:該方法采用逆流色譜技術(shù)純化大蒜多糖不僅能夠?qū)崿F(xiàn)純度高、操作簡(jiǎn)單、效率高、價(jià)格低,而且還優(yōu)化了制備高純度大蒜多糖的提取工藝,為規(guī)模分離純化大蒜多糖精品提供技術(shù)支持,有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1
A.洗滌去雜:將新鮮大蒜去皮,洗去雜質(zhì)。
[0017]B.破碎浸提濃縮:將洗凈的大蒜破碎,按1:5的料液比用75%的乙醇水溶液超聲循環(huán)提取兩次,兩次提取液合并濃縮。
[0018]C.大蒜多糖粗提液經(jīng)大孔樹(shù)脂處理:將濃縮液復(fù)溶上DA201極性大孔樹(shù)脂柱,上樣量為柱體積的10%,用水作淋洗液,濃縮流出液。
[0019]D.經(jīng)逆流色譜一步純化大蒜多糖:逆流色譜溶劑系統(tǒng)為MgSO4 = PEG (分子量1000):H2O=H:12:74。配置好的溶劑放入分液漏斗中,靜止過(guò)夜,取上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相。逆流色譜儀柱體積為30mL,柱溫為25°C,轉(zhuǎn)速為1000r/min,轉(zhuǎn)向?yàn)檎?。用上下?:1的溶液配制濃度為lmg/mL樣品液,上樣體積為2mL。以0.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫,每1min收集I管。采用硫酸一苯酚法對(duì)收集到的各管進(jìn)行測(cè)定。
[0020]E.透析及干燥:將檢測(cè)到含有大蒜多糖的各管分別裝入截留分子量為3000的透析袋中,對(duì)水透析過(guò)夜,將透析過(guò)的多糖溶液進(jìn)行冷凍干燥,得大蒜多糖精品。采用凝膠柱層析法對(duì)得到的多糖純度和分子量進(jìn)行檢測(cè)。
[0021]實(shí)施例2
A.洗滌去雜:將新鮮大蒜去皮,洗去雜質(zhì)。
[0022]B.破碎浸提濃縮:將洗凈的大蒜破碎,按1:5的料液比用75%乙醇水溶液超聲循環(huán)提取兩次,兩次提取液合并濃縮。
[0023]C.大蒜多糖粗提液經(jīng)大孔樹(shù)脂處理:將濃縮液復(fù)溶上DA201極性大孔樹(shù)脂柱,上樣量為柱體積的10%,用水作淋洗液,濃縮流出液。
[0024]D.經(jīng)逆流色譜一步純化大蒜多糖:逆流色譜溶劑系統(tǒng)為MgSO4 = PEG (分子量1500) IH2O= 16:12 -J2。配置好的溶劑放入分液漏斗中,靜止過(guò)夜,取上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相。逆流色譜儀柱體積為30mL,柱溫為25°C,轉(zhuǎn)速為1000r/min,轉(zhuǎn)向?yàn)檎?。用上下?:1的溶液配制濃度為2mg/mL樣品液,上樣體積為2mL。以0.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫,每1min收集I管。采用硫酸一苯酚法對(duì)收集到的各管進(jìn)行測(cè)定。
[0025]E.透析及干燥:將檢測(cè)到含有大蒜多糖的各管分別裝入截留分子量為3000的透析袋中,對(duì)水透析過(guò)夜,將透析過(guò)的多糖溶液進(jìn)行冷凍干燥,得大蒜多糖精品。采用凝膠柱層析法對(duì)多到的多糖純度和分子量進(jìn)行檢測(cè)。
[0026]實(shí)施例3
A.洗滌去雜:將新鮮大蒜去皮,洗去雜質(zhì)。
[0027]B.破碎浸提濃縮:將洗凈的大蒜破碎,按1:5的料液比用75%乙醇水溶液超聲循環(huán)提取兩次,兩次提取液合并濃縮。
[0028]C.大蒜多糖粗提液經(jīng)大孔樹(shù)脂處理:將濃縮液復(fù)溶上DA201極性大孔樹(shù)脂柱,上樣量為柱體積的10%,用水作淋洗液,濃縮流出液。
[0029]D.經(jīng)逆流色譜一步純化大蒜多糖:逆流色譜溶劑系統(tǒng)為MgSO4 = PEG (分子量1000) IH2O= 16:12 -J2。配置好的溶劑放入分液漏斗中,靜止過(guò)夜,取上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相。逆流色譜儀柱體為300mL,柱溫為25°C,轉(zhuǎn)速為800r/min,轉(zhuǎn)向?yàn)檎?。用上下?:1的溶液配制濃度為2mg/mL樣品液,上樣體積為20mL。以3mL/min的流速進(jìn)行洗脫,每6min收集I管。采用硫酸一苯酚法對(duì)收集到的各管進(jìn)行測(cè)定。
[0030]E.透析及干燥:將檢測(cè)到含有大蒜多糖的各管分別裝入截留分子量為3000的透析袋中,對(duì)水透析過(guò)夜,將透析過(guò)的溶液進(jìn)行冷凍干燥,得大蒜多糖精品。采用凝膠柱層析法對(duì)得到的多糖純度和分子量進(jìn)行檢測(cè)。
[0031]實(shí)施例4
A.洗滌去雜:將新鮮大蒜去皮,洗去雜質(zhì)。
[0032]B.破碎浸提濃縮:將洗凈的大蒜破碎,按1:5的料液比用75%乙醇水溶液超聲循環(huán)提取兩次,兩次提取液合并濃縮。
[0033]C.大蒜多糖粗提液經(jīng)大孔樹(shù)脂處理:將濃縮液復(fù)溶上DA201極性大孔樹(shù)脂柱,上樣量為柱體積的10%,用水作淋洗液,濃縮流出液。
[0034]D.經(jīng)逆流色譜一步純化大蒜多糖:逆流色譜溶劑系統(tǒng)為MgSO4 = PEG (分子量1500):H2O=H:15:71。配置好的溶劑放入分液漏斗中,靜止過(guò)夜,取上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相。逆流色譜儀柱體積為300mL,柱溫為25°C,轉(zhuǎn)速為800r/min,轉(zhuǎn)向?yàn)檎?。用上下?:1的溶液配制濃度為2mg/mL樣品液,上樣體積為20mL。以3mL/min的流速進(jìn)行洗脫,每6min收集I管。采用硫酸一苯酚法對(duì)收集到的各管進(jìn)行測(cè)定。
[0035]E.透析及干燥:將檢測(cè)到含有大蒜多糖的各管分別裝入截留分子量為3000的透析袋中,對(duì)水透析過(guò)夜,將透析過(guò)的多糖溶液進(jìn)行冷凍干燥,得大蒜多糖精品。采用凝膠柱層析法對(duì)得到的多糖純度和分子量進(jìn)行檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種采用逆流色譜技術(shù)一步純化大蒜多糖的方法,其特征在于包括如下步驟: A.洗滌去雜:將新鮮大蒜去皮,洗去雜質(zhì); B.破碎浸提濃縮:將洗凈的大蒜破碎,用75%的乙醇水溶液超聲循環(huán)提取2次,兩次提取液合并濃縮; C.大蒜多糖粗提液經(jīng)大孔樹(shù)脂處理:將濃縮液復(fù)溶上DA201極性大孔樹(shù)脂柱,上樣量為柱體積的10%,用水作淋洗液,濃縮流出液; D.經(jīng)逆流色譜一步純化大蒜多糖:逆流色譜溶劑系統(tǒng)為MgSO4:PEG:H2O,硫酸鎂的百分含量為14?18%,PEG (聚乙二醇)分子量為1000?1500,含量為12%?15% ;配置好的溶劑放入分液漏斗中,靜止過(guò)夜,取上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相;逆流色譜儀柱溫為25°C,轉(zhuǎn)速為800?1000r/min,轉(zhuǎn)向?yàn)檎?;用上下?:1的溶液對(duì)濃縮液進(jìn)行稀釋?zhuān)苟嗵呛繛镮?2mg/mL ;上樣體積為柱體積的1/10?1/20 ;定時(shí)或定量進(jìn)行收集,對(duì)收集到的各管采用硫酸一苯酚法進(jìn)行多糖測(cè)定; E.透析及干燥:將適量體積的上述收集液裝入截留分子量為3000的透析袋中,對(duì)水透析過(guò)夜,將透析過(guò)的溶液進(jìn)行冷凍干燥,得大蒜多糖精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用逆流色譜技術(shù)一步純化大蒜多糖的方法,其特征在于:純化大蒜多糖采用的是逆流色譜法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用逆流色譜技術(shù)一步純化大蒜多糖的方法,其特征在于:逆流色譜法所用的溶劑系統(tǒng)為MgS04:PEG:H20,其中,硫酸鎂的百分含量為14?18%,PEG (聚乙二醇)分子量為1000?1500,含量為12%?15%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用逆流色譜技術(shù)一步純化大蒜多糖的方法,其特征在于:經(jīng)逆流色譜儀純化過(guò)的大蒜多糖溶液是裝入截留分子量為3000的透析袋中,對(duì)水透析過(guò)夜后,冷凍干燥,得大蒜多糖精品。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK104387493SQ201410728613
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】鞠秀云, 蔣繼宏, 袁博, 姜素平 申請(qǐng)人:江蘇師范大學(xué)
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