一種聚合物整體柱及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型移液器吸管大孔聚合物整體柱及其制備方法和應(yīng)用。一種聚合物整體柱的制備方法，所述整體柱采用原位熱引發(fā)聚合法制備，并以二醋酸纖維素作為致孔劑，具體包括步驟：（1）移液器吸管內(nèi)壁的預(yù)處理；（2）移液器吸管內(nèi)聚合物整體柱的制備；（3）整體柱的洗滌；本發(fā)明制備的吸管整體柱具有較大的通孔尺寸、較大的柱床體積，能配合移液器操作使用，在移液器的排液壓力下即可完成SPE操作；本發(fā)明可實現(xiàn)快速、高效率富集待測目標組分的目的。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種聚合物整體柱，更具體地涉及一種新型移液器吸管大孔聚合物整 體柱及其制備方法和應(yīng)用。 一種聚合物整體柱及其制備方法和應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 當前，高效液相色譜-紫外或質(zhì)譜檢測（HPLC-UV/MS)已成為體內(nèi)藥物分析的主要 手段。然而，體內(nèi)藥物組分的快速、準確色譜分析一直面臨體液樣品(尤其是血樣)前處理的 這一瓶頸制約。近年來，藥理學、臨床藥理學以及臨床藥物治療檢測等多個研究領(lǐng)域面臨著 數(shù)量日益龐大的生理體液樣品的檢測，發(fā)展針對體液內(nèi)目標組分的快速、高效率的富集、凈 化手段就顯得尤為重要。
[0003] 固相萃取（SPE)具有操作簡單、使用靈活、回收率高、消耗溶劑少、易于自動化等優(yōu) 點，已廣泛應(yīng)用于樣品的前處理過程。目前成熟的SPE技術(shù)大多采用在表面帶有各種功能 基團（如C 18或(：8)的硅膠(或高分子)顆粒填料。一般要將SPE柱裝在專門的固相萃取儀上， 利用抽真空方式使流動相流過SPE柱。在真空負壓作用下，流動相穿過顆粒填料間隙通過 SPE柱。流動相中的目標組分主要以擴散傳質(zhì)的方式向填料表面移動，并與其表面的功能 基團發(fā)生相互作用而被吸附。隨著流速的提高，擴散傳質(zhì)效果變差導致分離效率降低。因 此，使用顆粒填料的SPE不能采用很高的操作流速以縮短SPE操作時間。另外，SPE填料粒 徑相對較大，顆粒間留有較大空隙，其較薄的填充厚度容易在填料內(nèi)引起"管道效應(yīng)"，使待 富集目標組分隨流動相快速流出SPE柱而未與固定相填料發(fā)生有效相互作用，這就影響到 SPE的萃取效率。
[0004] 與顆粒填料相比，聚合物或硅膠整體柱介質(zhì)具有背壓低、通透性好、對流傳質(zhì)速度 快、制備容易等一系列優(yōu)點，在色譜分離領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，未來有望取代顆粒填充 色譜柱實現(xiàn)快速、高效分離?；谏鲜稣w柱介質(zhì)的優(yōu)點，近年來研究人員對整體柱在SPE 領(lǐng)域的應(yīng)用給予了極大關(guān)注。
[0005] 整體柱制備簡便，尤其是可以按需要在任意形狀的容器內(nèi)制備不同形狀的整體 柱，以適應(yīng)多種不同的用途。此外，整體柱內(nèi)通透性好,流動相中的溶質(zhì)以對流傳質(zhì)方式為 主，溶質(zhì)被吸附到固定相表面的效率受流速提高的影響較小。因此，整體柱SPE可以采用較 高流速，快速處理大量的液體樣品，大大縮短樣品處理時間，同時其吸附目標物的效率又能 保持在令人滿意的狀態(tài)。在較高流速下，流動相能達到整體柱內(nèi)的所有空隙，因此將目標物 洗脫下來時消耗的洗脫液體積較小，便于后續(xù)處理程序的操作。在此基礎(chǔ)上，整體柱SPE裝 置可以做到自動化操作，實現(xiàn)對大批量樣品溶液的快速前處理。
[0006] 與聚合物整體柱介質(zhì)相比，硅膠整體柱有更多的介孔，因而內(nèi)部整體表面積要更 大。然而硅膠不能耐受高溫環(huán)境、高pH值流動相，一般環(huán)境溫度>60°C、流動相pH>8. 5時， 硅膠材質(zhì)本身穩(wěn)定性下降，會導致其SPE效果降低，而高分子聚合物整體柱材料能耐受更 高的環(huán)境溫度、更寬的pH值范圍，可以適應(yīng)更為苛刻的流動相條件。此外，聚合物整體柱的 制備方法要比硅膠材質(zhì)更為簡單、方便，而且?guī)в胁煌δ芑鶊F的聚合物單體種類更多，可 以通過簡單的原位、一步聚合反應(yīng)按需制備固相萃取整體柱裝置。因此，聚合物整體柱材料 的SPE有更多優(yōu)勢，也受到研究人員更多的關(guān)注。
[0007] 面對數(shù)量巨大、而單個樣本體積小的人血液樣品的SPE前處理，整體柱介質(zhì)SPE不 僅制備方法上有優(yōu)勢，而且相應(yīng)的淋洗、洗脫等步驟消耗的溶液體積也相對較少。可以根據(jù) 需要在小體積或微型裝置中制備微型整體柱SPE裝置，如在移液器吸管、毛細管、芯片通道 等整體柱裝置，對樣品進行SPE前處理以實現(xiàn)對目標組分的高效、快速分離與富集。其中， 移液器吸管整體柱可與移液器連接使用，憑借移液器的抽吸、排液壓力（或借助其它輔助動 力）即可實現(xiàn)對樣品中目標物的分離與富集操作，而無需專門的真空固相萃取儀。此外，這 種"離線（off-line)" SPE操作方式允許針對不同目標物的特性靈活選擇SPE的各步驟操 作條件，達到最佳萃取效果。未來也可以采用專門的機械手同時操作多個移液器吸管裝置， 實現(xiàn)對多個樣品的同步固相萃取，可以極大加快樣品前處理的速度。因此，對于微量的人血 液樣品前處理而言，移液器吸管整體柱具有極大優(yōu)勢。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)中的聚合物吸管整體柱大多是在10?55〇μ?移液器吸管內(nèi)制備，而且 柱床體積普遍較小，合成整體柱的聚合液體積為〇. 6?1〇μ?，有的則是利用毛細管作用力 將聚合液吸入到吸管尖端部位。較小柱床體積使得整體柱負載量受到限制，適合于液相色 譜-質(zhì)譜檢測（HPLC-MS)的樣品預(yù)處理，而不適用于應(yīng)用更為普遍、檢測器靈敏度相對較低 的液相色譜-紫外檢測（HPLC-UV)檢測手段。因此，現(xiàn)有的整體柱結(jié)構(gòu)極大的限制了其在 檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中整體柱體積小、通透性差的問題，提供一種聚 合物整體柱的制備方法，該方法采用原位熱引發(fā)聚合法、并采用超大分子量的二醋酸纖維 素作為致孔劑來制備整體柱，所制備的整體柱具有柱床體積大、通透性好、背壓低、對流傳 質(zhì)速度快以及制備容易等優(yōu)點，極大地拓寬了整體柱的應(yīng)用范圍。
[0010] 一種聚合物整體柱的制備方法，所述整體柱采用原位熱引發(fā)聚合法制備，并以二 醋酸纖維素作為致孔劑，按下列步驟進行： 51 :移液器吸管內(nèi)壁的預(yù)處理 將移液器吸管經(jīng)丙酮、甲醇充分潤洗，經(jīng)過硫酸銨水溶液處理，在水浴搖床上反應(yīng)，經(jīng) 水、甲醇洗滌后在吸管內(nèi)裝入三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRM)溶液，以二苯甲酮為引 發(fā)劑，紫外光照射引發(fā)聚合反應(yīng)；停止反應(yīng)后分別以丙酮、甲醇充分沖洗吸管內(nèi)壁，得到內(nèi) 壁表面經(jīng)過預(yù)處理的、帶有雙鍵的移液器吸管，備用； 52 :移液器吸管內(nèi)聚合物整體柱的制備 配制預(yù)聚混合單體溶液，加入引發(fā)劑和交聯(lián)劑，并以二醋酸纖維素（CA)溶液作為致孔 齊U ;取上述預(yù)聚混合單體溶液加入到步驟S1處理過的吸管中，采用原位熱引發(fā)聚合法在吸 管內(nèi)合成聚合物整體柱； 53 :整體柱的洗滌 分別用丙酮、甲醇充分沖洗步驟S2所得整體柱，洗出未反應(yīng)的單體、溶劑以及致孔劑， 即得吸管整體柱； 其中，步驟S2中的二醋酸纖維素的分子量為10?500萬。 toon] 本發(fā)明采用熱引發(fā)聚合方式制備聚合物整體柱。在本發(fā)明的方法條件下，偶氮類 或過氧化類引發(fā)劑適合用作引發(fā)劑合成整體柱。本發(fā)明采用了偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā) 劑，其它偶氮類引發(fā)劑亦話用于本制各方法，如偶氮二異庚腈、偶氮二異丁酸二甲酯等。此 夕卜，過氧化二酰、過氧化苯甲酰、過氧化二月桂酰、過氧化苯甲酰叔丁酯、過氧化甲乙酮等過 氧化類引發(fā)劑亦適用于本發(fā)明的方法。
[0012] 優(yōu)選地，所述二醋酸纖維素的分子量為30?150萬；進一步優(yōu)選地，所述二醋酸纖 維素的分子量為30?80萬。
[0013] 優(yōu)選地，所述預(yù)聚混合單體溶液中總單體的物質(zhì)的量與二醋酸纖維素溶液體積之 間的比值為0. 94(T3. 75mol/L ;所述步驟S2中的所述二醋酸纖維素溶液的質(zhì)量體積濃度為 0. 0100?0. 100g/mL ;所述二醋酸纖維素的添加量為0. 500?2. OOmL。
[0014] 進一步優(yōu)選地，所述二醋酸纖維素溶液的質(zhì)量體積濃度為0. 0250g/mL ;所述二醋 酸纖維素的添加量為1. 30mL。
[0015] 優(yōu)選地，所述二醋酸纖維素溶液的溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰 胺、二甲基亞砜或丙酮的一種或幾種。
[0016] 本發(fā)明采用溶解于N，N-二甲基甲酰胺（DMF)中的二醋酸纖維素為致孔劑體系。 在此體系中二醋酸纖維素用于制備大的通孔，DMF用于制備小的介孔。二醋酸纖維素結(jié)合酸 為53. 5?55. 5%，重均分子量（麗)為10萬?500萬左右。除DMF外，其它的二醋酸纖維素 良溶劑亦可用于本發(fā)明的致孔劑體系，如N，N-二甲基乙酰胺（DMAC)、二甲基亞砜（DMS0)、 丙酮（acetone)等。
[0017] 優(yōu)選地，所述預(yù)聚混合單體溶液為弱酸性功能單體、疏水性功能單體、堿性功能單 體的一種或幾種；進一步優(yōu)選地，所述預(yù)聚混合單體溶液為甲基丙烯酸(MAA)、甲基丙烯酸 丁酯（BMA)的一種或兩種。
[0018] MAA屬于弱酸性功能單體，能提供弱陽離子交換作用。除MAA夕卜，其它帶雙 鍵的酸性(或弱酸性）功能單體亦適用于整體柱的合成，如帶羧基、帶磺酸基、硼酸基、 輕基等管能基團的單體。更具體地例如：丙烯酸（acrylic acid, AA)、3, 3-二甲基丙 烯酸（3, 3-dimethylacrylic Acid,DMAA)、三氟甲基丙烯酸（trifluoro-methacrylic acid, TFMAA)、亞甲基 丁二酸（itaconic acid, ITA)、2_ 丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙 燒橫酸（2-acrylamid〇-2-methyl-l-propanesulfonic acid, AMPS)、4_ 乙烯基本 硼酸（4-vinylbenzeneboronic acid,VBBA)、4_ 乙烯基苯甲酸（4-vinylbenzoic acid, VBA)、4_ 乙烯基苯酌'(^i-vinyl phenol, VPN)、甲基丙烯酸輕乙酯（2-hydroxyethyl methacrylate, HEMA)、甲基丙烯酸輕丙酯（Hydroxypropyl methacrylate, HPMA)等。
[0019] ΒΜΑ屬于疏水性功能單體，其丁酯基團（_0CH2CH2CH2CH 3)能提供疏水性相互作用 力。除BMA外，其它帶雙鍵的具有疏水性羧酸酯類、苯環(huán)(或芳香環(huán)）類等功能基團的功 能單體也適用于整體柱的合成，如甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate, MMA)、甲基丙 烯酸乙酯（ethyl methacrylate, EMA)、甲基丙烯酸己酯（hexyl methacrylate, HMAA)、甲 基丙烯酸叔丁酯（tert-Butyl methacrylate, TBMA)、甲基丙烯酸異辛酯（2-ethylhexyl methacrylate, EHMA)、甲基丙烯酸異丁酯（isobutyl methacrylate, IBMA)、甲基丙烯 酸己酯（hexyl methacrylate, HMA)、甲基丙烯酸月桂酯（lauryl methacrylate, LMA)、 甲基丙烯酸十八燒基酯（stearyl methacrylate, SMA)、甲基丙烯酸異癸酯（isodecyl methacrylate, IDMA)、甲基丙烯酸縮水甘油酯（glycidyl methacrylate, GMA)、甲基丙烯 酸節(jié)基酯（benzyl methacrylate, BNMA)、甲基丙烯酸-9-蒽甲酯（9-anthracenylmethyl methacrylate,ANMMA)、甲基丙烯酸環(huán)己酯（cyclohexyl methacrylate, CMA)、甲基丙烯 酸苯酯（phenyl methacrylate, PMA)、丙烯酸乙酯（ethyl acrylate, EAA)、丙烯酸苯酯 (phenyl acrylate, PAA)、丙烯酸節(jié)酯（benzyl acrylate, BNAA)、苯乙烯（styrene, St)等。
[0020] 含氨基團(伯、仲、叔、季氨基團）的、或具有氮原子雜環(huán)結(jié)構(gòu)的帶雙鍵的堿性功 能單體亦適合于采用本法制備吸管整體柱。堿性功能單體既可以單獨使用，也可以與 其它疏水性功能單體聯(lián)合使用。堿性功能單體舉例如下：丙烯酰胺（acrylamide, AAM)、 甲基丙烯酰胺（methacrylamide)、甲基丙烯酸二甲氨乙酯（2_(dimethylamino) ethyl methacrylate，DMAEMA)、甲基丙烯酸二乙氨乙酯（2_(diethylamino) ethyl methacrylate, DEMA)、丙烯酸 N，N_ 二乙基氨基乙酯（2_(diethylamino) ethyl acrylate, DEA)、4_ 乙烯基苯胺（4-vinyl aniline)、4_ 乙烯基批陡（4-vinyl pyridine, 4_VP)、2-乙烯基批陡（2-vinyl pyridine, 2_VP)、1-乙烯基咪唑 (l-vinylimidazole)等。
[0021] 優(yōu)選地，所述預(yù)聚混合單體為甲基丙烯酸與甲基丙烯酸丁酯的混合物；進一步優(yōu) 選地，所述預(yù)聚混合單體中甲基丙烯酸與甲基丙烯酸丁酯的摩爾比為1:3?3:1。
[0022] 更優(yōu)選地，所述預(yù)聚混合單體溶液為由甲基丙烯酸丁酯（BMA)、甲基丙烯酸 (MAA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA)、偶氮二異丁腈（AIBN)、二醋酸纖維素（CA)、N，N-二 甲基甲酰胺（DMF)等組成； 其中，所述預(yù)聚混合液組成為：BMA 0?12〇μ?、MAA 0?75μ?、EDMA 215?317μ?、CA 的DMF溶液0. 500?2. OOmL (溶液的質(zhì)量體積濃度為0. 020(H). 100g/mL)、ΑΙΒΝ為單體總質(zhì) 量的1%?6%。取液體積為95μ?，反應(yīng)在T=6(T80°C的烘箱(或水浴）中進行60?lOOrnin。
[0023] 本發(fā)明采用溶解于DMF中的二醋酸纖維素為致孔劑體系。在此體系中二醋酸纖維 素用于制備大的通孔，DMF用于制備小的介孔。二醋酸纖維素結(jié)合酸為53. 5-55. 5%，重均分 子量（麗）為10萬?500萬左右。除DMF外，其它的二醋酸纖維素良溶劑亦可用于本發(fā)明 的致孔劑體系，例如：N，N-二甲基乙酰胺（DMAC)、二甲基亞砜（DMS0)、丙酮（acetone)等。
[0024] 在本發(fā)明中，步驟S1中對移液器吸管內(nèi)壁進行預(yù)處理，目的是在吸管內(nèi)壁鍵合上 雙鍵。之后在吸管內(nèi)進行聚合反應(yīng)時，合成的整體柱與管壁以共價相聯(lián)接，使整體柱體牢固 地固定于吸管內(nèi)壁上，確保固相萃取效果。
[0025] 優(yōu)選地，本發(fā)明中步驟S1中的TR頂溶液用量為100?16〇μ?，引發(fā)劑二苯甲酮的 添加量為40?80mg。
[0026] 優(yōu)選地，步驟S1中的TRM預(yù)聚溶液組成：TRM 100?16〇μ?，BP 40?80mg，混 合溶劑1. 0?2. OmL?；旌先軇檎?0%和正丁醇20%組成，或適當比例的正十二 醇和丙酮組成，或由適當比例的正葵烷和丙酮組成(此時宜采用λ =254nm紫外光，功率不 低于60W)。通?？刹捎忙?365ηπι (或254nm)紫外光引發(fā)聚合，功率不低于40W，反應(yīng)時間 t=20min。聚合反應(yīng)在帶有石英窗口的特制反應(yīng)器中進行，并且反應(yīng)過程中反應(yīng)器內(nèi)保持低 的正壓氮氣氛圍。
[0027] 優(yōu)選地，步驟S2中的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，其添加量為預(yù)聚混合單體總質(zhì)量的 1%?6% ;交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯(質(zhì)量分數(shù)彡98. 0%))，其用量為215?317μ?。
[0028] 優(yōu)選地，步驟S2中的交聯(lián)劑選擇乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA)，EDMA的分子上的 多個雙鍵參與聚合反應(yīng)，將高分子鏈交聯(lián)起來形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，以維持聚合物整體柱結(jié)構(gòu) 的剛性。除EDMA外，其它帶有多個雙鍵0 2個)的交聯(lián)劑亦適用于聚合物整體柱的制備，如 二丙烯酸乙二醇酯（ethylene glycol diacrylate, EGDA)、二甲基丙烯酸甘油酯（glycerol dimethacrylate，GDMA)、二丙烯酸二乙二醇酯（di (ethylene glycol) diacrylate， DEGDA)、二甲基丙烯酸二乙二醇酯（di (ethylene glycol) dimethacrylate, DEGDMA)、二 丙烯酸1，6_己二醇酯（1，6-hexanediol diacrylate, HDA)、二甲基丙烯酸1，6_己二醇酯 (1，6-Hexanediol dimethacrylate, HDMA)、二甲基丙烯酸新戊二醇酯（neopentyl glycol dimethacrylate, NGDMA)、二丙烯酸新戊二醇酯（neopentyl glycol diacrylate, NGDA)、 二甲基丙烯酸四乙二醇酯（tetraethylene glycol dimethacrylate, TGDMA)、二甲 基丙烯酸 1，3_ 丁 二醇酯（1,3-butanediol dimethacrylate, 1,3-BDMA)、二丙烯 酸 1，3- 丁 二醇酯（1，3-butanediol diacrylate, 1，3-BDA)、二甲基丙烯酸 1，4- 丁 二醇酯（1，4-butanediol dimethacrylate, 1，4-BDMA)、三輕甲基丙燒三甲基丙烯 酸酯（trimethylolpropane trimethacrylate，TRIM)、三輕甲基丙燒三丙烯酸酯 (trimethylolpropane triacrylate，TRIA)、N，N' -雙丙烯醜基-1,2-乙二胺（N，N' _e thylenebis (acrylamide)，EBAM)、N, N亞甲基雙丙烯醜胺（N, N ' -Methylenebis (acr ylamide)，MBAM)、聚乙二醇二丙烯酸酯（poly (ethylene glycol) diacrylate, PEGDA)、 季戊四醇三丙烯酸酯（pentaerythritol triacrylate, PETRA)、季戊四醇四丙烯酸 酉旨（pentaerythritol tetraacrylate，PETEA)、二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB)、 N，N ' -1，4-亞苯基二丙烯酰胺（phenylene diacrylamide, PNDAM)、3, 5-二（丙烯酰 胺）苯甲酸（3, 5_bis (acryloylamido)benzoic acid, BAMBA)、N, 〇-二丙烯醜苯丙氨醇 (N, 〇-bisacryloyl phenylalaninol, ΒΑΡΝΑ)等。
[0029] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述聚合物整體柱的制備方法制備的聚合物整體柱 在檢測血液或尿液中、動物組織勻漿提取液中的目標成分的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述二醋酸纖維素作為制備聚合物整體柱的致孔劑 的應(yīng)用。
[0031] 優(yōu)選地，所述二醋酸纖維素的分子量為30?150萬。
[0032] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： (1)本發(fā)明采用超大分子量的二醋酸纖維素的Ν，Ν_二甲基甲酰胺溶液作為致孔劑，在 整體柱內(nèi)形成大的通孔(達到5?1〇μπι)這個尺寸大于目前文獻報道的致孔劑所產(chǎn)生的通 孔尺寸。
[0033] (2)本發(fā)明由于二醋酸纖維素的使用，確保了移液器吸管整體柱良好的通透性，將 其安裝到移液器上使用時，僅憑移液器的排液壓力即可完成整個固相萃?。⊿PE)操作步驟， 而無需另外的裝置、或輔助動力。
[0034] (3)本發(fā)明采用原位熱引發(fā)聚合法制備柱床體積較大的吸管整體柱，采用熱引發(fā) 聚合反應(yīng)能確保較大體積聚合液反應(yīng)完全，得到合格的整體柱，本發(fā)明合成整體柱所采用 預(yù)聚混合液體積達到95μ?，遠大于已有文獻報道的吸管整體柱（0. 6?1〇μυ。確保了整體 柱足夠的富集容量，不僅適合HPLC-MS檢測，也滿足后續(xù)HPLC-UV檢測靈敏度的要求；采用 原位熱引發(fā)聚合法反應(yīng)能確保較大體積聚合液反應(yīng)完全，得到合格的整體柱。
[0035] 采用本發(fā)明所述的制備方法制備得到的吸管整體柱具有較大的通孔尺寸、較大的 柱床體積，能配合移液器操作使用，在移液器的排液壓力下即可完成SPE操作，而無需再借 助外在輔助動力或其它專用固相萃取操作裝置。本發(fā)明可實現(xiàn)高效率富集待測目標組分的 目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1為實施例1制備的聚合物吸管整體柱照片； 圖2為實施例1制備的聚合物吸管整體柱照片； 圖3為實施例1制備的聚合物整體柱橫截面表面形貌掃的描電子顯微鏡（SEM)表征 圖； 圖4為實施例1制備的聚合物整體柱橫截面表面形貌掃的描電子顯微鏡（SEM)表征 圖； 圖5為由壓汞儀測定的整體柱內(nèi)孔徑分布圖； 圖6為聚合物吸管整體柱對CNX結(jié)合容量的測定圖； 圖7為血清分析方法專屬性考察圖； 圖8為人血清工作曲線圖； 圖9為尿樣分析方法專屬性考察圖。
[0037] 圖10為人尿樣工作曲線圖。

【具體實施方式】
[0038] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。 除非特別說明，實施例中所涉及的材料、方法均為本領(lǐng)域常用的材料和方法。
[0039] 本發(fā)明中的試驗材料與試劑來源如下： 柯諾辛堿（Corynoxine，CNX)由廣東藥學院中藥學院曾常青老師課題組提供)，空白人 血清由廣東藥學院門診部提供，空白人尿由自愿者提供。
[0040] 甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA，分析純）、N, N-二甲基甲醜胺（DMF，分 析純)、偶氮二異丁腈（3叾0(1；^8〇1311丨5^011；[1：1'；[16,411^，分析純)、正十二醇（分析純)、正丁醇 (分析純）購自天津科密歐化學試劑有限公司，二甲基丙烯酸乙二醇酯（ethyleneglycol dimethacrylate，EDMA，質(zhì)量分數(shù)>98.0%)購自 Acros Organics 公司，甲基丙烯酸丁 酯（butyl methacrylate ,BMA，GR)和二苯甲酮（BP，分析純）購自阿拉丁化學試劑公 司（Aladdin Reagent,上海），三輕甲基丙燒三甲基丙烯酸酯（Trihydroxymethylpropyl trimethylacrylate，TRIM，含量 >90. 0%)購自東京化學試劑有限公司（Tokyo Chemical Industry Co. Ltd，TCI，日本)。BMA、EDMA、TRM使用前經(jīng)中性氧化鋁層析柱除去阻聚劑， MAA直接使用，AIBN經(jīng)乙醇重結(jié)晶提純。甲醇(色譜純）購自美國默克公司。磷酸氫二鉀 (Κ2ΗΡ0 4 ·3Η20,分析純)、濃呀04 (分析純）和過硫酸銨（（NH4)2S04,分析純）購自廣東光華化 學廠有限公司。二醋酸纖維素（MW10?500萬左右）購自上?；瘜W試劑廠。1000μ?移液器 吸管(無色聚丙烯材質(zhì))。
[0041] ρΗ7· 4磷酸鹽緩沖液的配制：稱量分析純(λ 45649g的Κ2ΗΡ04 · 3Η20,加入200 mL 水，攪拌溶解，以濃Η3Ρ04調(diào)節(jié)pH值至7. 4。水為超純水，其它試劑除特別說明外均為分析 純。
[0042] 實施例1 本實施例以具有疏水性、弱堿性的中藥活性單體柯諾辛為模型藥物，來考察所制備的 吸管整體柱對甲醇/水溶液中的目標藥物組分的SPE富集效果。
[0043] 1. 1工作液制備 精密稱取柯諾辛堿4. 05mg于4mL的EP管中，溶于2mL 60%甲醇/水溶液中，用0. 22 μ m 針筒過濾器過濾，即得2. 02mg / mL柯諾辛儲備液。由此儲備液分別用60%甲醇/水溶液 稀釋得到不同濃度的工作液，其中24. 2 μ g/mL的工作液用于吸管整體柱SPE條件的考察， 其它用于整體柱吸附性能考察。濃度大于2. 02mg / mL的柯諾辛工作液另外單獨配制，即： 分別精密稱取柯諾辛堿3. 03mg和4. 05mg，各溶于lmL 60%甲醇/水中，0· 22 μ m針筒過濾 器過濾，即得3. 04mg / mL和4. 05mg/mL柯諾辛工作液。
[0044] 1.2吸管整體柱的制備 S1 :移液器吸管內(nèi)壁的預(yù)處理 對移液器吸管內(nèi)壁進行預(yù)處理，目的是在吸管內(nèi)壁鍵合上雙鍵。之后在吸管內(nèi)進行聚 合反應(yīng)時，合成的整體柱與管壁以共價相聯(lián)接，使整體柱體牢固地固定于吸管內(nèi)壁上，確保 固相萃取效果。
[0045] 移液器吸管為聚丙烯材質(zhì)(無色、無添加劑)。將移液器吸管經(jīng)丙酮、甲醇充分潤 洗，加入一定量硫酸銨水溶液（20%)，在T=75°C水浴搖床上反應(yīng)40min，在聚丙烯內(nèi)壁表面 引入羥基基團（-0H)。分別經(jīng)過水、甲醇洗滌后，在吸管內(nèi)裝入一定體積的三羥甲基丙烷三 甲基丙烯酸酯（TRIM)溶液，以二苯甲酮（BP)為引發(fā)劑，紫外光照射引發(fā)聚合反應(yīng)，在吸管 內(nèi)壁形成TRIM聚合物層。TRIM層表面多余的雙鍵可用于參加之后的熱引發(fā)共聚反應(yīng)，以共 價鍵將合成的整體柱固定于吸管內(nèi)壁表面。停止反應(yīng)后分別以丙酮、甲醇充分沖洗吸管內(nèi) 壁，得到內(nèi)壁表面經(jīng)過預(yù)處理的、帶有雙鍵的移液器吸管，備用。
[0046] TRM預(yù)聚溶液組成：TRM 14〇μ?，ΒΡ 40mg，混合溶劑l.OmL。混合溶劑為正十二 醇80%和正丁醇20%組成。聚合反應(yīng)在帶有石英窗口的特制反應(yīng)器中進行，并且反應(yīng)過程 中反應(yīng)器內(nèi)保持低的正壓氮氣氛圍。
[0047] S2 :移液器吸管內(nèi)聚合物整體柱的制備 以甲基丙烯酸丁酯（BMA)、甲基丙烯酸（MAA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA)、偶氮二 異丁腈（AIBN)、二醋酸纖維素（CA)、N，N-二甲基甲酰胺（DMF)組成預(yù)聚混合單體溶液。取 一定體積的上述預(yù)聚混合單體溶液加入到步驟S1處理過的吸管中，采用熱引發(fā)聚合法在 吸管內(nèi)合成具有疏水性和弱陽離子交換混合作用的聚合物整體柱。
[0048] 預(yù)聚混合單體溶液的組成為：ΒΜΑ 6〇μ?、MAA 33PL、EDMA 215PL、CA的DMF溶液 1. 30mL (溶液的質(zhì)量體積濃度為0. 0250g/mL)、ΑΙΒΝ為單體總質(zhì)量的4%。取液體積為95μ?， 反應(yīng)在T=60°C的烘箱(或水?。┲羞M行80min。
[0049] S3:分別用丙酮、甲醇充分沖洗步驟S2所得整體柱，洗出未反應(yīng)的單體、溶劑以及 致孔劑，即得整體柱； 其中，步驟S2中的二醋酸纖維素的分子量為50萬。
[0050] 1.3大孔吸管整體柱的孔結(jié)構(gòu)表征 圖1、圖2為制備的聚合物吸管整體柱照片； 從圖3、圖4中可以看出整體柱內(nèi)部呈現(xiàn)堆積粒子狀態(tài)，這些堆積粒子之間的孔隙較 大，最大將近l〇Mm左右。
[0051] 圖5為由壓汞儀測定的整體柱內(nèi)孔徑分布圖；從圖5中可看出孔徑主要分布為 5. 0?l〇Mm左右，其中又以6. 5?7. OMm的居多。較大的孔徑確保了整體柱內(nèi)的通透性，使 得液體通過整個柱床體積的阻力大大減小。
[0052] 綜上所述，本發(fā)明的制備方法所制備得到的聚合物整體柱具有較大的孔徑，通透 性強，且整體柱背壓減小，當將吸管整體柱安裝到移液器上后，僅憑借移液器的排液壓力就 可完成固相萃?。⊿PE)操作。因此，就大大簡化了 SPE操作，專門的SPE裝置、或其它外在 輔助驅(qū)動力將不再成為必需。這樣不僅能大幅降低分析成本，而且還能顯著提高SPE操作 速度，縮短樣品的整個分析時間。
[0053] 同時，本實施例中整體柱的制備采用了甲基丙烯酸丁酯（BMA)和甲基丙烯酸 (MAA)兩種功能單體。其中，BMA的丁酯基團能提供疏水相互作用力，MAA的羧基基團能提 供弱陽離子交換功能。這兩種基團的存在使得整體柱能同時提供疏水和弱陽離子交換兩 種作用力，可與具有疏水性、弱堿性的藥物組分發(fā)生較強相互作用，實現(xiàn)對它們的高效率富 集。羧基基團（-C00H)的親水性給予整體柱表面一定親水能力，能促使生理體液與整體柱 表面充分接觸，使整體柱表面的功能基團與目標組分分子充分產(chǎn)生相互作用，達到高效富 集的目的。
[0054] 1. 4色譜檢測條件 色譜柱為菲羅門（Phenomenex)C18 Luna 柱（250mmX 4. 6mm，5um)，流速為 1. 0 ml,/miη , 檢測波長為247nm，流動相為甲醇-水（70:30)，進樣體積為20yL (采用20yL定量環(huán))，溫 度 T=28° C。
[0055] 在上述色譜條件下考察流動相條件對柯諾辛（CNX)色譜峰的影響。以不同比例的 甲醇-水為流動相進行測定，隨著甲醇含量的下降，出峰時間延長，峰展寬。考慮到CNX在 60?70%的甲醇/水溶液中最為穩(wěn)定，故選擇70%的甲醇/水溶液為流動相。此時出峰時 間為t=15. 2min，主色譜峰與其它異構(gòu)化雜質(zhì)峰完全基線分離，不被干擾。
[0056] 1.5吸管整體柱的固相萃?。⊿PE)操作性能 1. 5. 1吸管整體柱SPE操作條件的確定 吸管整體柱SPE操作程序為： 1)活化：吸管整體柱首先分別用甲醇、水充分潤洗活化；2)上樣：取柯諾辛工作液一 定體積加入到整體柱吸管中，此時將吸管連接到移液器上，手動操作移液器排液，使工作液 緩慢流過整體柱床，全部排出吸管；3)淋洗：取下整體柱吸管，加入一定體積水，再次將其 連接到移液器上，手動操作移液器排液，使溶液緩慢流過整體柱床，全部排出吸管；4)洗脫： 取下整體柱吸管，加入一定體積甲醇，將其連接到移液器上，手動操作移液器排液，使溶液 緩慢流過整體柱床，全部排出吸管，將吸附在整體柱上的CNX洗脫下來。
[0057] 以24. 2 μ g/mL的CNX工作液考察吸管整體柱的吸附性能。分別接收上樣流出液、 淋洗流出液、洗脫流出液，進HPLC檢測，記錄其色譜峰面積，并分別與24. 2 μ g/mL的CNX工 作液的色譜峰面積進行比較，計算各流出液中CNX含量占總含量的百分比率，以此為考察 指標。
[0058] 表1為實驗測得的各流出液中CNX占總含量的百分比率。從表中可看出以工作液 100、或20〇μ?體積上樣，在上樣流出液中均未發(fā)現(xiàn)CNX。20〇μ?體積上樣后，采用水20〇μ? 連續(xù)淋洗2次，流出液中均未發(fā)現(xiàn)CNX。采用20〇μ?甲醇連續(xù)洗脫3次，其中第一次洗脫流 出液里檢測到的CNX比率為95. 20%，第二次則僅檢測到2. 12%，第三次則未發(fā)現(xiàn)。這說明二 次的20〇μ?甲醇洗脫就可以把絕大部分CNX次脫下來，第三次洗脫已經(jīng)沒有CNX存在了（或 CNX含量很低，HPLC-UV未檢出）。甲醇可以有效洗脫富集在整體柱上的柯諾辛。
[0059] 由上述實驗結(jié)果可確定SPE操作的最佳條件為：上樣20(^L(CNX的60%甲醇/水 溶液)，水淋洗20〇μ?Χ 2次，洗脫為甲醇20〇μ?Χ 2次，計40〇μ?。
[0060] 表1各流出液中CNX占總含量的百分比率（％) 1 : ^水淋洗（200ML) 甲醇洗脫（200ML) i ； :上桿流：--'-： : 頂目： ： '第二： 合計·： 丨出液 第-次第二次第-次 次 第三次丨H 1丨 工作液 : '000:'- ： 100ML ; 工作液 ; ' 0.00 0.00 0,00 95.20 2.12 0.00 · 3T. 33 ? 200JC : ： : ： ： 注表示未測定 1. 5. 2吸管整體柱最佳SPE操作條件 根據(jù)前述實驗結(jié)果可確定最佳SPE操作條件：1)活化：吸管整體柱分別用甲醇1. 0 mL、 水2. 0 mL充分潤洗活化；2)上樣：柯諾辛工作液20〇μ? ;3)淋洗：水20〇μ?Χ2次；4)洗脫： 甲醇20〇μ?Χ2次，洗脫液全部接收于同一 ΕΡ管中；5)溶樣處理：洗脫液室溫氮氣吹干，殘 渣再用20〇μ?70%甲醇-水溶解，供HPLC測定。
[0061] 1. 5. 3整體柱最大吸附量的估測 連續(xù)以不同濃度（c)的CNX工作液20〇μ?上樣進行SPE操作，測定最終得到的供試品 色譜峰面積Μ)，作J?c曲線圖(見圖6)。
[0062] 從圖6中可看出，隨著上樣濃度的增大，最終洗脫回收得到的CNX峰面積也相應(yīng)增 大，最后上樣濃度達到4. 05mg/mL時（由于標準品數(shù)量有限，實驗中僅測定到此濃度)，洗脫 峰面積也將近平臺。以4. 05mg/mL濃度對應(yīng)的洗脫回收峰面積U 與該濃度工作液的色 譜峰面積比值估算整體柱最大負載量為： -X e X F.盧 X --- = 1-X 4.05 X 2 X1 (Γ1 X --- =0.0402( mg/mg) 本 ι* 150000 1436 其中聚合物整體柱干重為》Tm=14. 36mg。
[0063] 當上樣濃度c=l. 77mg/mL時，上樣流出液中開始出現(xiàn)微量CNX，其占總含量的百分 比率為0. 05%。以此濃度估算整體柱的最大吸附量為： c X V. ^ X -?-=177 X 2 X104 X --- =0-0247( mg/mg) 一 14.36 實施例2 :整體柱用于人血清樣的檢測 本實施例以具有疏水性、弱堿性的中藥活性單體柯諾辛（CNX)為模型藥物，來考察所制 備的吸管整體柱對人血清中的目標藥物組分的SPE富集效果。
[0064] 2. 1人血清樣的配制 2. 1. 1 CNX工作液的配制 CNX工作液的配制與"項1. 1"相同。
[0065] 2. 1. 2人血清標液的配制與前處理 取20〇μ?空白人血清，加入20μ L不同濃度的柯諾辛工作溶液，配制成所需濃度的含 藥人血清標準溶液。于此血清樣或血清標準溶液中加入60〇μ?的甲醇，渦旋振蕩沉淀蛋白， 高速（10000轉(zhuǎn)）離心lOmin，取上清液，加水40〇μ?混勻，供下一步SPE操作?？瞻兹搜?處理程序與上述相同，除了不加入柯諾辛溶液。
[0066] 本發(fā)明制備的聚合物整體柱具有疏水和弱陽離子交換雙重作用功能，能與有強疏 水性和弱堿性的CNX分子發(fā)生強相互作用，實現(xiàn)對CNX的高效富集功能。為防止人血清中 的蛋白質(zhì)等生物大分子被整體柱非特異性吸附，在血清樣中加入3倍體積的甲醇液沉淀蛋 白，高速離心后取上清液上樣?？紤]到此時上清液中甲醇含量較高，而甲醇又是CNX的良好 洗脫劑，因此離心上清液中再補加40〇μ?水，降低甲醇含量，增強整體柱對CNX的富集作用。 此時，上樣流出液中未檢出CNX，而且隨后連續(xù)2次20〇μ?水淋洗的流出液中也未檢出CNX。 這表明，CNX全部被牢固地保留在整體柱上。在后續(xù)的低、中、高（13. 32、61.94、133. 2Pg/ mL)三個濃度人血清樣的日內(nèi)、日間檢測過程中，對各批次血樣中的第一個樣的操作上 樣流出液、淋洗液和洗脫液進行檢測。上樣流出液和淋洗液中均未檢出CNX。
[0067] 2.2吸管整體柱的制備 吸管整體柱的制備與"項1. 2"同。
[0068] 2. 3色譜測定條件 色譜條件與"項1.4"同。
[0069] 2.4吸管整體柱SPE操作條件 SPE操作條件與"1.5. 2"相同。
[0070] 2. 5分析方法專屬性考察 為考察分析方法的專屬性，圖7中列出了經(jīng)過吸管整體柱SPE處理后的CNX工作液(譜 圖A)、含藥血清標準溶液(譜圖B)、空白血清(譜圖C)的色譜圖和未經(jīng)SPE處理的空白血清 色譜圖(譜圖D)。
[0071] 圖7中A、B、C、D分別表示： A :CNX工作液（24. 2Pg/mL)經(jīng)過吸管整體柱SPE ;B :CNX人血清標準溶液（24. 2Pg/ mL)經(jīng)過吸管整體柱SPE ;C :空白人血清經(jīng)過吸管整體柱SPE ;D :空白人血清未經(jīng)過吸管 整體柱SPE。色譜條件：C18色譜柱，λ=247nm，流動相甲醇/水（70 :30)，V=1.0mL/min， T=28。。。
[0072] 對比譜圖C和D可看出，經(jīng)過蛋白沉淀后殘余的血清基質(zhì)成分幾乎全部能通過整 體柱的SPE過程除掉，從而得到"清潔"的供試品。因此，含藥血清標準溶液色譜圖(譜圖Β) 與工作液色譜圖(譜圖Α)也就基本上一致。對比譜圖Β和Α可看出，血清樣中的CNX的主 峰位置基本與和工作液中的CNX峰一樣，也與異構(gòu)化的雜質(zhì)基線分離，不被干擾。這說明了 吸管整體柱SPE聯(lián)合HPLC-UV分析方法測定人血清中CNX時有良好的方法專屬性。
[0073] 2.6血清工作曲線測定 配制濃度范圍5. 440?152. 4 Pg/mL的標準血清工作液，測定工作曲線(見圖8)，一元 線性回歸方程為A=38. 68-10. 86c，相關(guān)系數(shù)r=0. 9996。
[0074] 2. 7分析方法有效性和回收率 2. 7. 1測定方法 按照項"2. 1. 2"中的方法配制低、中、高（13. 32、61. 94、133. 2Pg/mL)三個濃度人血清 控樣，并做前處理。按項" 2. 4 "進行SPE操作，最終得到的供試品樣進色譜檢測。
[0075] 當日內(nèi)隨機測定低、中、高濃度血樣各三批（3個樣/批)，計算日內(nèi)精密度和準確 度。每日測定低、中、高濃度血樣各一批（3個樣/批)，連續(xù)測定三日，計算日間精密度和準 確度。
[0076] 每個供試品樣進色譜檢測三次，計算峰面積平均值(j)，并代入工作曲線方程，求 出測定濃度c M。以與相應(yīng)樣品理論濃度ca的比值計算方法相對回收率，以每個供試品 樣色譜峰面積平均值(^)與未經(jīng)固相萃取的相同濃度工作液色譜供試品樣峰面積測定值 (4)之比計算絕對回收率。未經(jīng)固相萃取的相同濃度工作液的配制與相應(yīng)人血清樣的配 制方法相同，僅是采用甲醇代替空白人血清。室溫下，將其直接N2吹干，再重新用20〇μ? 70% 的甲醇/水溶液溶解，得到未經(jīng)固相萃取的色譜供試品樣。
[0077] 2. 7. 2人血清控樣的測定 表2列出了采用吸管整體柱SPE聯(lián)合HPLC-UV檢測低、中、高（13. 3、61. 9、133 μ g/mL) 三個濃度人血清控樣的測定結(jié)果。從測定結(jié)果可看出測定精密度符合體內(nèi)藥物分析要求 (RSD%< 15% )，相對回收率>90%，絕對回收率>80%。
[0078] 表2 CNX人工血清樣測定的日內(nèi)和日間精密度和回收率（/7=3) 加標值 側(cè)定值 RSD 相對回收率 絕對回收率 :頂目 ， ，： ： ' , : ： (jJg/mL) ： (Mg/mL) (%) . Cl) . (%) 13.3 14.0 4.1 105 91.1 曰內(nèi) 61.9 5T. 4 5.0 93.4 81.5 I 133 128 3.8 96.3 85.9 I 13.3 12.8 5.9 95.8 82.7 日間 61.9 58.0 2.4 94.3 82.2 133 123 10 92.6 82.6 實施例3整體柱用于人尿樣的檢測 本實施例以具有疏水性、弱堿性的中藥活性單體柯諾辛（CNX)為模型藥物，來考察所制 備的吸管整體柱對人尿樣中的目標藥物組分的SPE富集效果。
[0079] 3. 1人尿樣的配制 3. 1. 1 CNX工作液的配制 CNX工作液的配制與"項1. 1"相同。
[0080] 3. 1. 2人尿樣標液的配制 取20〇μ?空白人尿樣，加入20μ L不同濃度的柯諾辛工作溶液，配制成所需濃度的含 藥人尿樣標準溶液。
[0081] 3. 1. 3人尿樣的前處理 正常人尿液pH值不固定，含有大量水、無機鹽、尿素以及其它極性代謝物等，蛋白質(zhì)等 生物大分子沒有或極少。因此尿樣在進行SPE處理前，加入pH=7. 4的緩沖液以維持溶液呈 弱堿性。對24. 2Pg/mL的CNX工作液的SPE操作實驗已證明，在60%的甲醇/水溶液中上 樣，CNX依然能被完全保留在整體柱上，因此尿樣中同時又加入一定量甲醇以減輕其中其它 疏水性成分在整體柱表面的吸附。
[0082] 3.2吸管整體柱的制備 吸管整體柱的制備與"實施例1中的1. 2"同。
[0083] 3. 3色譜測定條件 色譜條件與"實施例1中的1. 4"同。
[0084] 3.4吸管整體柱SPE操作條件 SPE操作條件與"實施例1中的1. 5. 2"相同。
[0085] 3. 5分析方法專屬性考察 圖9中列出了經(jīng)過吸管整體柱SPE處理后的CNX標準工作液(譜圖A)、含藥尿樣標準溶 液(譜圖B)、空白尿樣(譜圖C)的色譜圖和未經(jīng)SPE處理的空白尿樣色譜圖(譜圖D)。
[0086] 圖9中A、B、C、D分別表示： A: CNX標準工作液（14. 5Pg/mL)經(jīng)過吸管整體柱SPE處理；B: CNX標準尿樣 (14. 5Pg/mL)經(jīng)過吸管整體柱SPE處理；C:空白尿樣經(jīng)過吸管整體柱SPE處理；D:空白尿 樣未經(jīng)過吸管整體柱SPE處理。色譜條件：C18色譜柱，λ =247nm，流動相甲醇/水（70:30)， ν=1·0 ηι]νηι;?η,Τ=28。。。
[0087] 對比譜圖C、D和Β可看出，尿樣中的基質(zhì)成分大部分能通過整體柱的SPE過程除 掉，從而得到相對"清潔"的供試品，而且剩余的基質(zhì)成分在死時間完全出峰，對CNX的主峰 無干擾。對比譜圖A和B可看出，CNX的主峰與異構(gòu)化的雜志基線分離，不被干擾。這說明 了吸管整體柱SPE聯(lián)合HPLC-UV分析方法測定人尿樣中CNX時有良好的方法專屬性。
[0088] 3.6尿樣工作曲線測定 配制濃度范圍5. 21?130. 9 Pg/mL的人尿樣標準溶液，測定工作曲線(見圖10)。得到 一元線性回歸方程為A=43. 93c-99. 89，相關(guān)系數(shù)r=0. 9996。
[0089] 3.7分析方法有效性和回收率 3. 7. 1測定方法 按照項"3. 1. 2"和"3. 1. 3"中的方法配制低、中、高（（12. 5、62. 6、115. OPg/mL)三個濃 度人尿樣、并做前處理。按項" 3. 4 "進行SPE操作，最終得到的供試品樣進色譜檢測。
[0090] 當日內(nèi)隨機測定低、中、高濃度血樣各三批（3個樣/批)，計算日內(nèi)精密度和準確 度。每日測定低、中、高濃度血樣各一批（3個樣/批)，連續(xù)測定三日，計算日間精密度和準 確度。
[0091] 每個供試品樣進色譜檢測三次，計算峰面積平均值( j)，并代入工作曲線方程，求 出測定濃度CM。以與相應(yīng)樣品理論濃度ca的比值計算方法相對回收率，以每個供試品 樣色譜峰面積平均值d)與未經(jīng)固相萃取的相同濃度工作液色譜供試品樣峰面積測定值 (4)之比計算絕對回收率。未經(jīng)固相萃取的相同濃度工作液的配制與相應(yīng)人血清樣的配 制方法相同，僅是采用甲醇代替空白人血清。室溫下，將其直接N2吹干，再重新用20〇μ? 70% 的甲醇/水溶液溶解，得到未經(jīng)固相萃取的色譜供試品樣。
[0092] 3. 7. 2人尿樣的測定 對低、中、高（12. 5、62. 6、115Pg/mL)三個濃度人尿液控樣采用吸管整體柱SPE聯(lián)合 HPLC-UV法進行測定。表3列出了測定結(jié)果。從測定結(jié)果可看出測定精密度較好，日內(nèi)、 日間測定的RSD%為1. 3?6. 3%，日內(nèi)、日間測定相對回收率為86?110%，絕對回收率為 95. 2 ?101%。
[0093] 表3 CNX人工血清樣測定的日內(nèi)和日間精密度和回收率（/7=3) 加標值 測定値 RSD 相對回收率絕對回收率 :頂目' ... . ：(Mg/mL) (Mg/mL) . (%) ￠1) (%) ： 12.5 13.8 - 1.4 110 98.2 日內(nèi) 62.6 55.9 3.5 89.3 99.3 115 98.9 4.6 86.0 95.2 ' ： 12.5 12.9 - 6.3 103 90.3 Η 間 62.6 56.6 1.3 90.5 101 ： 115 99.7 - 4.5 86. Τ 96.1 本發(fā)明中，我們采用原位熱引發(fā)聚合法在ιοοομ?移液器吸管中制備了具有較大尺寸 通孔（5?l〇Mm)和較大體積的聚合物整體柱（95μ?聚合液)。整體柱的制備采用了溶于 Ν，Ν-二甲基甲酰胺的超大分子量二醋酸纖維素（MW3(T80萬）為致孔劑，在整體柱內(nèi)形成大 的通孔。這些大尺寸通孔大幅度降低了整體柱的背壓，使得吸管整體柱安裝到移液器上后， 可以僅憑借移液器的排液壓力即可完成固相萃取操作，而無需再借助外在輔助動力，從而 實現(xiàn)對生理體液樣品便捷、高效的前處理。較大體積的聚合物整體柱還可確保足夠的富集 量，以滿足后續(xù)HPLC-UV檢測的靈敏度要求。
[0094] 在具體的整體柱制作方面，本發(fā)明采用甲基丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸兩種功能單 體來制備聚合物吸管整體柱。采用此兩種單體制備的整體柱可以提供疏水性、弱陽離子交 換兩種作用力，能有效地同生理體液中的疏水性、弱堿性藥物組分發(fā)生相互作用，達到高效 率富集目標分子的目的。
[0095] 本發(fā)明通過實驗驗證了吸管整體柱對人生理體液(血清、尿液）中柯諾辛的固相萃 取效果。實驗結(jié)果表明，該吸管整體柱能高效率富集添加于體液內(nèi)的柯諾辛堿，而且整體柱 的富集能力完全滿足后續(xù)HPLC-UV分析的要求。此外，吸管整體柱還能有效清除體液內(nèi)的 基質(zhì)組分，為后續(xù)色譜分析提供"清潔"樣品。
[0096] 采用本發(fā)明的制備方法制備的吸管整體柱未來有望應(yīng)用于對眾多體液樣品的快 速、便捷固相萃取前處理，為HPLC-UV分析提供"清潔"的供試品，實現(xiàn)對體液樣品的快速、 準確分析。
[〇〇97] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但是本發(fā)明并不限制于為實現(xiàn)本發(fā)明所公 開的【具體實施方式】，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)和原理下所作的改變、修飾、替 代、組合、簡化，均視為等效的置換方法，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種聚合物整體柱的制備方法，其特征在于，所述整體柱采用原位熱引發(fā)聚合法制 備，并以二醋酸纖維素作為致孔劑，具體操作按下列步驟進行： 51 :移液器吸管內(nèi)壁的預(yù)處理 將移液器吸管經(jīng)丙酮、甲醇充分潤洗，經(jīng)過硫酸銨水溶液處理，在水浴搖床上反應(yīng)，經(jīng) 水、甲醇洗滌后在吸管內(nèi)裝入三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯溶液，以二苯甲酮為引發(fā)劑，紫 外光照射引發(fā)聚合反應(yīng)；停止反應(yīng)后分別以丙酮、甲醇充分沖洗吸管內(nèi)壁，得到內(nèi)壁表面經(jīng) 過預(yù)處理的、帶有雙鍵的移液器吸管，備用； 52 :移液器吸管內(nèi)聚合物整體柱的制備 配制預(yù)聚混合單體溶液，加入引發(fā)劑和交聯(lián)劑，并以二醋酸纖維素溶液作為致孔劑；取 上述預(yù)聚混合單體溶液加入到步驟S1處理過的吸管中，采用原位熱引發(fā)聚合法在吸管內(nèi) 合成聚合物整體柱； 53 :整體柱的洗滌 分別用丙酮、甲醇充分沖洗步驟S2所得整體柱，洗出未反應(yīng)的單體、溶劑以及致孔劑， 即得吸管整體柱； 其中，步驟S2中的二醋酸纖維素的分子量為10?500萬。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物整體柱的制備方法，其特征在于，所述二醋酸纖維素 分子量為30?150萬。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合物整體柱的制備方法，其特征在于，所述二醋酸纖維素 分子量為30?80萬。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物整體柱的制備方法，其特征在于，所述預(yù)聚混合單體 溶液中總單體的物質(zhì)的量與二醋酸纖維素溶液體積之間的比值為〇. 94(T3. 75mol/L ;所述 二醋酸纖維素溶液的質(zhì)量體積濃度為〇. 0100?〇. l〇〇g/mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的聚合物整體柱的制備方法，其特征在于，所述二醋酸纖維素 溶液的質(zhì)量體積濃度為〇. 〇250g/mL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物整體柱的制備方法，其特征在于，所述二醋酸纖維素 溶液的溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亞砜或丙酮的一種或幾種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物整體柱的制備方法，其特征在于，所述預(yù)聚混合單體 溶液為弱酸性功能單體、疏水性功能單體、堿性功能單體的一種或幾種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的聚合物整體柱的制備方法，其特征在于，所述預(yù)聚混合單體 溶液為甲基丙烯酸、甲基丙烯酸丁酯的一種或兩種。
9. 權(quán)利要求1至8任一權(quán)利要求所述的聚合物整體柱的制備方法制備的聚合物整體柱 在檢測血液、或尿液、或動物組織勻漿提取液中的目標成分的應(yīng)用。
10. 二醋酸纖維素作為制備聚合物整體柱的致孔劑的應(yīng)用。
【文檔編號】C08F2/44GK104107687SQ201410320721
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】張紅武, 吳順?gòu)? 司徒嘉露, 梁玉珊, 黃文麗, 鐘飛燕 申請人:廣東藥學院