一種花生粕多糖的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種花生粕多糖的提取方法，包括預(yù)處理、酶解蛋白、滅酶處理：復(fù)合酶提取多糖、分離純化五個(gè)步驟，其復(fù)合酶為纖維素酶、溶菌酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶的組合，本方法有效去除其中的蛋白質(zhì)，最大限度的保留了多糖的功能特性，避免有機(jī)溶劑的污染，提高多糖的提取率，并提高多糖的純度，其具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種花生粕多糖的提取方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】本發(fā)明屬于生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種花生柏多糖的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是世界上最重要的花生主產(chǎn)國之一，產(chǎn)量全世界總產(chǎn)量的40%以上。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國花生的年產(chǎn)量達(dá)1522萬噸，已超過大豆(1520萬噸)，成為我國油料作物之首，總產(chǎn)、單產(chǎn)和出口量均居國際第一位。除了本國利用以外，我國大量的花生都是作為原料出口，花生深加工產(chǎn)業(yè)較為薄弱。以花生出口占全國70%的山東省為例，目前有18個(gè)花生食品專業(yè)加工廠，28條生產(chǎn)線；而花生產(chǎn)量只有我國0.1%的日本擁有上千家花生食品生產(chǎn)廠，人均花生食品占有量為我國的3-4倍。
[0003]我國對花生的深度開發(fā)利用起步較晚，目前花生的消費(fèi)利用比例大致為榨油占50%~60%，直接食用和食品加工占25-35% (其中深加工的只占10%左右)，出口 3-5%，用種占8%左右?；ㄉビ褪俏覈ㄉ钪饕睦猛緩?，榨油后剩下的餅柏由于蛋白過度變性使得營養(yǎng)價(jià)值降低通常作為家畜飼料、肥料。而美國所產(chǎn)花生主要以加工系列消費(fèi)食品為主(約60%)，僅15%的花生用于榨油。花生柏含有豐富的蛋白質(zhì)資源以及一些不溶性的花生纖維成分，具有很高的利用價(jià)值。 [0004]除了粗蛋白外，花生柏中多糖含豐富，高達(dá)32.50%。多糖是指一類由10個(gè)以上單糖分子聚合而成的天然高分子化合物，是維持生命活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一。廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物(細(xì)菌和真菌)和藻類地衣中。其中研究較早且最多的是從細(xì)菌中得到的各種莢膜多糖，它在醫(yī)藥上主要用于疫苗。1984年，蘇聯(lián)人在荷蘭召開的第十二次國際碳水化合物討論會(huì)上報(bào)道了莢膜多糖用作疫苗，受到與會(huì)者的極大興趣。近年來，在對各種中藥材的化學(xué)成分研究的過程中，人們逐步提高了對植物多糖的關(guān)注。植物多糖研究比較深入的是茶多糖、胖大海多糖、南瓜多糖、苦瓜多糖、銀杏葉多糖、枸杞多糖等等，植物多糖在抗生素替代物及保健品領(lǐng)域已經(jīng)取得很好的應(yīng)用。多糖作為重要的生物活性物質(zhì)具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降低糖脂、延緩衰老等活性，在醫(yī)療保健、食品、動(dòng)物養(yǎng)殖等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0005]隨著對多糖生物學(xué)功能認(rèn)識(shí)的深入，多糖生物學(xué)研究已經(jīng)成為國際爭奪生物化學(xué)研究的制高點(diǎn)。以多糖為重點(diǎn)的糖工程研究可能是繼蛋白質(zhì)、基因工程后生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中的前沿科學(xué)。
[0006]目前國內(nèi)提取多糖大多采用的方法是:水提法或者用強(qiáng)酸強(qiáng)堿提取法。水提法雖然工藝簡單，多糖食品安全性高，但得率很低。使用強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿提取花生多糖，雖然可以獲得較高的得率，但由于反應(yīng)作用條件強(qiáng)烈，對多糖的食品安全性造成一定的影響，而且生產(chǎn)過程產(chǎn)生的廢水會(huì)造成一定的環(huán)境污染，因此需要開發(fā)一種能高效、綠色的將多糖從花生柏中提取出來的方法。
[0007]酶法提取是目前新興的一種綠色環(huán)保、高效的生物提取技術(shù)，通過酶法破壞植物細(xì)胞壁，增加多糖等有效成分的溶出率來提高提取效率。與傳統(tǒng)提取方法相比，酶法的優(yōu)點(diǎn)主要有:①反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物不易變性；②提高提取率，縮短提取時(shí)間；③降低成本。環(huán)保節(jié)能；④工藝簡單可行。本發(fā)明通過對復(fù)合酶法提取花生柏中多糖技術(shù)的研究、不同提取方式花生多糖理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的比較、不同提取方法對花生體外抗氧化性的影響，建立花生柏多糖酶法高效提取技術(shù)，為開發(fā)利用我國的花生柏多糖資源提供科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于使用高效的生物復(fù)合酶提取花生柏中的多糖，有效去除其中的蛋白質(zhì)，最大限度的保留了多糖的功能特性，避免有機(jī)溶劑的污染，提聞多糖的提取率，并提高多糖的純度；
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過如下方式來實(shí)施的:
一種花生柏多糖的提取方法，包括如下步驟:
(1)預(yù)處理:取花生柏原料，粉碎至500— 1000目，按照1: 5~1: 10的料液比(kg/L)加入濃度為70%乙醇溶液，然后在30~40°C和攪拌速度為150~260r/min的條件下，充分?jǐn)嚢?0min,抽濾,取濾洛；
(2)酶解蛋白:取預(yù)處理后濾渣，加入8— 10倍重量的培養(yǎng)液，配制懸濁液，以利于酶的充分結(jié)合，然后添加中性蛋白酶Neutral protease (諾維信),酶的添加量按照0.3g/ml懸濁液添加，酶解溫度為25 — 30°C，pH值5 — 7，酶解時(shí)間為2小時(shí)；
所述培養(yǎng)液為(每升):(NH4)2SO4 0.3g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.02g, MnSO4.H2O 0.03g，MgSO40.02g, KH2PO4 0.lg, pH 值 6.0 ;
(3)滅酶處理:酶解結(jié)束后，將反應(yīng)體系置于90— 100°C，10min，使中性蛋白酶失活，離心15min，沉淀即為去除蛋白的花生柏殘?jiān)?br> (4)復(fù)合酶提取多糖:向步驟(3)制備的殘?jiān)刑砑?0倍重量的培養(yǎng)液，配制懸濁液，添加復(fù)合酶制劑酶解，調(diào)整酶解反應(yīng)溫度40 - 45°C, pH6.5，分別加入纖維素酶3kg/m3，溶菌酶2kg/m3, β -葡聚糖酶5kg/m3,淀粉酶I kg/m3緩慢攪拌,酶解時(shí)間6h后,置于10(TC,IOmin,滅酶，獲得酶解液，
(5)分離純化:酶解液離心15min取上清液，并濃縮，濃縮液體積為上清液的1/3，加入4倍體積的95%乙醇，醇沉7~8h，離心，棄上清液，留沉淀，沉淀經(jīng)乙醇、丙酮反復(fù)沖洗后，冷凍干燥。
[0009]所述花生柏原料優(yōu)選熱榨花生柏；
本發(fā)明技術(shù)方案通過對現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)，帶來一系列的有益效果:
1、本發(fā)明采用復(fù)合生物酶和酶解工藝從熱榨花生柏中提取花生多糖，其反應(yīng)條件溫和，而且也能夠最大限度的提高多糖的提取效率、使多糖活性最大限度的得到保留，避免了傳統(tǒng)強(qiáng)酸強(qiáng)堿等有機(jī)溶劑對多糖活性及安全性的破壞，為工業(yè)副產(chǎn)物的綜合利用提供了一條高效、可循環(huán)、環(huán)保低碳的途徑。
[0010]2、本發(fā)明人通過創(chuàng)造性勞動(dòng)及多因子實(shí)驗(yàn)對酶解反應(yīng)的酶解體系、添加量、
度等進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)，得出最佳的酶解反應(yīng)參數(shù)體系，從大量酶解蛋白酶中確定最佳復(fù)合酶組合為纖維素酶、溶菌霉、β_葡聚糖酶、淀粉酶且確定了其最佳添加比例，該組合酶酶解反應(yīng)條件溫和，酶解液營養(yǎng)保持完整，更能協(xié)作互應(yīng)，提高反應(yīng)效率及轉(zhuǎn)化率；本發(fā)明酶的種類、用量及添加順序的選擇均不是偶然選擇，而是發(fā)明人經(jīng)過大量的勞動(dòng)獲得，酶及培養(yǎng)液及比例的調(diào)整均會(huì)影響最終多糖的提取率，將酶的添加量、反應(yīng)體系加以改變，均得不到最大的多糖提取率。
[0011]酶反應(yīng)結(jié)果隨PH值的改變而發(fā)生顯著的變化，每個(gè)酶促反應(yīng)均存每一酶促反應(yīng)均存在一個(gè)最適宜作用pH值，在低于最適pH值時(shí)，酶解率隨pH值的增大而增大，當(dāng)達(dá)到最適pH值后，隨pH值的增大，酶解率反而下降。本發(fā)明確定復(fù)合酶的最佳酶解PH為6.5 ;酶量的增大會(huì)提高酶對底物的作用能力，由此可引起酶解率的提高，當(dāng)酶加量增大到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)分子對酶的需求量達(dá)到飽和，酶不再是提高蛋白質(zhì)酶解率的限制性因素，所以酶解率隨著酶加量的增大變得平緩，進(jìn)一步增大，其酶解率反而下降，本研究確定最佳復(fù)合酶添加量為；纖維素酶3kg/m3,溶菌酶2kg/m3, β -葡聚糖酶5kg/m3,淀粉酶I kg/m3,酶促反應(yīng)對溫度也極為敏感，在保持酶活力的情況下，蛋白質(zhì)酶解率隨溫度升高而升高，達(dá)最高峰后，繼續(xù)升高溫度，酶活力開始減小，酶解速度迅速下降，蛋白質(zhì)酶解率隨之下降。本研究確定最佳反應(yīng)溫度為45 °C ；
3、現(xiàn)有技術(shù)提取花生多糖的純度較低，原因失花生柏里面含有大量蛋白，要獲得高純度的花生柏多糖應(yīng)有效去除花生柏里的蛋白質(zhì)，本發(fā)明采用加入10倍重量的培養(yǎng)液，配制懸池液，以利于酶的充分結(jié)合，然后添加中性蛋白酶Neutral protease (諾維信),酶的添加量按照0.3g/ml懸濁液添加，酶解溫度為25 - 30°C，pH值5 — 7，酶解時(shí)間為2小時(shí)；所述培養(yǎng)液為(每升):(NH4)2SO4 0.3g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.02g，MnSO4.H2O 0.03g，MgSO4 0.02g，KH2PO4 0.lg，pH值6.0 ;能夠有效去除其中的蛋白質(zhì)，從而提高花生柏多糖的純度。
[0012]4、本發(fā)明采用按照1: 5~1: 10的料液比加入濃度為70%乙醇溶液，然后在30~40°C和攪拌速度為150~260r/min的條件下，充分?jǐn)嚢?0min，有效去除其中的黃酮、色素等物質(zhì)，經(jīng)預(yù)處理后的花生柏中粗脂肪、色素、黃酮和多酚類物質(zhì)被去除，只剩下部分的粗蛋白和淀粉以及半纖維素和粗纖維素等成分，利于后續(xù)酶解的進(jìn)行。采用苯酚硫酸法測得花生多糖的提取率高達(dá)49.67%,純度高達(dá)95.20%。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0014]實(shí)施例1
一種花生柏多糖的提取方法，包括如下步驟:
(1)預(yù)處理:取熱榨花生柏原料，粉碎至500-1000目，按照1: 5 (kg/L)的料液比加入濃度為70%乙醇溶液，然后在溫度為30°C，攪拌速度為150~260r/min的條件下，充分?jǐn)嚢?0min，抽濾，取濾渣；
(2)酶解蛋白:取預(yù)處理后濾渣，加入8倍重量的培養(yǎng)液，配制懸濁液，以利于酶的充分結(jié)合，然后添加中性蛋白酶Neutral protease (諾維信),酶的添加量按照0.3g/ml懸池液添加，酶解溫度為25°C，pH值6，酶解時(shí)間為2小時(shí)；
所述培養(yǎng)液為(每升):(NH4)2SO4 0.3g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.02g, MnSO4.H2O 0.03g，MgSO40.02g, KH2PO4 0.lg, pH 值 6.0 ;
(3)滅酶處理:酶解結(jié)束后，將反應(yīng)體系置于90— 100°C，10min，使中性蛋白酶失活，離心15min，沉淀即為去除蛋白的花生柏殘?jiān)?br> (4)復(fù)合酶提取多糖:向步驟(3)制備的殘?jiān)刑砑?0倍重量的培養(yǎng)液(同步驟(2)中的培養(yǎng)液)，配制懸濁液，添加復(fù)合酶制劑酶解，調(diào)整酶解反應(yīng)溫度40°C，pH6.5，分別加入纖維素酶3kg/m3，溶菌酶2kg/m3，β -葡聚糖酶5kg/m3，淀粉酶I kg/m3緩慢攪拌，酶解時(shí)間6h后，置于100°c, IOmin,滅酶,獲得酶解液，
(5)分離純化:酶解液離心15min取上清液，并濃縮，濃縮液體積為上清液的1/3，加入4倍體積的95%乙醇，醇沉7~8h，離心，棄上清液，留沉淀，沉淀經(jīng)乙醇、丙酮反復(fù)沖洗后，冷凍干燥。
[0015]采用苯酚硫酸法測得花生多糖的提取率為47.50%,純度為94.85%
實(shí)施例2
一種花生柏多糖的提取方法，包括如下步驟:
(1)預(yù)處理:取熱榨花生柏原料，粉碎至500- 1000目，按照1: 10的料液比加入濃度為70%乙醇溶液，然后在40°C和攪拌速度為150~260r/min的條件下，充分?jǐn)嚢?0min，抽濾，取濾渣；
(2)酶解蛋白:取預(yù)處理后濾渣，加入10倍重量的培養(yǎng)液，配制懸濁液，以利于酶的充分結(jié)合，然后添加中性蛋白酶Neutral protease (諾維信),酶的添加量按照0.3g/ml懸池液添加，酶解溫度為30°C，pH值7，酶解時(shí)間為2小時(shí)；
所述培養(yǎng)液為(每升):(NH4)2SO4 0.3g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.02g, MnSO4.H2O 0.03g，MgSO40.02g, KH2PO4 0.lg, pH 值 6.0 ;
(3)滅酶處理:酶解結(jié)束 后，將反應(yīng)體系置于90— 100°C，10min，使中性蛋白酶失活，離心15min，沉淀即為去除蛋白的花生柏殘?jiān)?br> (4)復(fù)合酶提取多糖:向步驟(3)制備的殘?jiān)刑砑?0倍重量的培養(yǎng)液，配制懸濁液，添加復(fù)合酶制劑酶解，調(diào)整酶解反應(yīng)溫度45°C，pH6.5，分別加入纖維素酶3kg/m3，溶菌酶2kg/m3, β -葡聚糖酶5kg/m3,淀粉酶I kg/m3緩慢攪拌,酶解時(shí)間6h后,置于100°C, IOmin,滅酶，獲得酶解液，
(5)分離純化:酶解液離心15min取上清液，并濃縮，濃縮液體積為上清液的1/3，加入4倍體積的95%乙醇，醇沉7~8h，離心，棄上清液，留沉淀，沉淀經(jīng)乙醇、丙酮反復(fù)沖洗后，冷凍干燥。
[0016]采用苯酚硫酸法測得花生多糖的提取率為49.67%,純度為95.20% ；
以上列舉的僅是本發(fā)明的最佳具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種花生柏多糖的提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)預(yù)處理:取花生柏原料，粉碎至500-1000目，按照1: 5~1: 10的料液比加入濃度為70%乙醇溶液，然后在溫度為30~40°C，攪拌速度為150~260r/min的條件下，充分?jǐn)嚢?0min,抽濾,取濾洛； (2)酶解蛋白:往步驟(1)的濾渣中加入8— 10倍重量的培養(yǎng)液，配制成懸濁液，然后添加中性蛋白酶，酶的添加量按照0.3g酶:Iml懸濁液的比例添加，酶解溫度為25-30°C，pH值5-7，酶解時(shí)間為2小時(shí)； (3)滅酶處理:酶解結(jié)束后，將反應(yīng)體系置于90-100°C，10min，使中性蛋白酶失活，然后離心15min，沉淀即為去除蛋白的花生柏殘?jiān)? (4)復(fù)合酶提取多糖:向步驟(3)制備的花生柏殘?jiān)刑砑?0倍重量的培養(yǎng)液，配制成懸濁液，調(diào)整酶解反應(yīng)溫度40-45°C，pH6.5，分別加入纖維素酶3kg/m3，溶菌酶2kg/m3，β -葡聚糖酶5kg/m3以及淀粉酶lkg/m3緩慢攪拌,酶解6h后，置于10(TC, IOmin,滅酶,獲得酶解液； (5)分離純化:將步驟(4)獲得的酶解液離心15min，取上清液，并濃縮，濃縮液體積為上清液的1/3，然后加入濃縮液4倍體積的95%乙醇，醇沉7~8h，離心，棄上清液，留沉淀，沉淀經(jīng)乙醇、丙酮反復(fù)沖洗后，冷凍干燥即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液組成為=(NH4)2SO40.3g,FeSO4.7H20 0.02g, MnSO4.H2O 0.03g, MgSO4 0.02g, KH2PO4 0.lg, pH 值 6.0，余量為水，配成IL0
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所`述的方法，其特征在于，所述花生柏為熱榨花生柏。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK103864954SQ201410139919
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】高冠勇, 陳寧 申請人:山東金勝糧油集團(tuán)有限公司