本發(fā)明涉及一種替諾福韋前藥或其異構(gòu)體、可藥用鹽、水合物或溶劑化物，及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus)是指引起人類急性肝炎和慢性肝炎的DNA病毒，簡(jiǎn)稱HBV。由于HBV感染直接導(dǎo)致人類嚴(yán)重的肝臟疾病，包括肝硬化和肝細(xì)胞癌，因此，乙型肝炎是人類健康的一大威脅。乙型肝炎病毒DNA(脫氧核糖核酸)，是乙肝病毒的核心物質(zhì)和病毒復(fù)制的基礎(chǔ)，核苷類化合物可通過直接競(jìng)爭(zhēng)性地與天然脫氧核糖底物相結(jié)合而抑制病毒聚合酶，及通過插入DNA中終止DNA鏈，因此核苷類化合物是治療乙型肝炎的主要藥物，其中包括，西多福韋、阿德福韋、拉米夫定以及替諾福韋(tenofovir)等。替諾福韋是一種新型核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，可有效對(duì)抗多種病毒，用于治療病毒感染性疾病。由于替諾福韋在生理pH條件下為雙負(fù)離子的膦酸基團(tuán)，故替諾福韋不易透過細(xì)胞膜吸收，生物利用度很低，并且還存在劑量依賴性腎毒性，限制了其治療作用，因此必須通過酯化、成鹽等手段制成膦酸酯前藥才能用于臨床。例如，富馬酸替諾福韋酯(Tenofovirdisoproxilfumarate)是吉里德科學(xué)公司(GileadScience)研發(fā)的第一代口服有效的替諾福韋前藥，用于治療艾滋病感染和乙型肝炎。由于富馬酸替諾福韋酯對(duì)由血清酶介導(dǎo)的水解反應(yīng)高度敏感，不能有效增加作用部位藥物濃度，同時(shí)在代謝過程釋放兩當(dāng)量的具有潛在毒性的甲醛，在臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)乳酸性酸中毒，嚴(yán)重的肝腫大，以及脂肪代謝障礙等副作用。為了提高替諾福韋前藥在血漿中的穩(wěn)定性，降低其代謝產(chǎn)物-替諾福韋在血漿中的濃度從而降低藥物毒性，許多制藥公司正在進(jìn)行研究和開發(fā)新一代替諾福韋前藥，并已取得了一些成果，有的新型前藥已處在I/II臨床研究階段，例如，WO0208241披露了一類用天然氨基酸(單取代)合成的替諾福韋磷酰胺酯前藥(例如，GS-7340)，WO2009105513公開了一類新型替諾福韋磷酸雙酰胺前藥，與替諾福韋磷酸雙酯相比，此類新型前藥增加了血漿中的穩(wěn)定性，從而增加了外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中活性代謝物替諾福韋的累積濃度，提高了治療效果，例如，GS-7340與替諾福韋酯和替諾福韋相比，GS-7340在PBMCs中產(chǎn)生的活性成分替諾福韋總濃度為替諾福韋酯和替諾福韋的10倍和30倍。然而，GS-7340在血漿中還有一定程度的降解，在血漿中可檢測(cè)到1-2％的代謝產(chǎn)物-替諾福韋，從而不可避免地存在像替諾福韋酯所產(chǎn)生的毒副作用，導(dǎo)致藥物使用的安全性存在問題。因此，進(jìn)一步研究開發(fā)具有高療效低毒性的替諾福韋前藥具有重要意義。本發(fā)明從進(jìn)一步提高替諾福韋前藥在血漿中的穩(wěn)定性設(shè)計(jì)理念出發(fā)，利用雙取代氨基酸合成了一系列替諾福韋磷酰胺酯前藥，該類前藥一方面在血漿中非常穩(wěn)定，在血漿中完全沒有檢測(cè)到代謝產(chǎn)物-替諾福韋，另一方面，與GS-7340相比，外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中活性代謝物替諾福韋的濃度顯著增加，從而有可能提供一類提高療效減低毒副作用的新型替諾福韋前藥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了一些與現(xiàn)有技術(shù)相比藥效更高而副作用大幅降低的化合物，與GS-7340相比，本發(fā)明化合物在血漿中足夠穩(wěn)定，其代謝產(chǎn)物-替諾福韋在血漿中完全檢測(cè)不到，而其在PBMCs中的濃度反而大大提高了，這樣的結(jié)果完全出乎本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)料之外。本發(fā)明涉及一種如通式(I)所示的化合物或其異構(gòu)體、可藥用鹽、水合物或溶劑化物，其中：R1，R2分別為C1-6烷基，或者R1、R2與所連的碳原子形成C3-7環(huán)烷基；R3是氫或C1-6烷基、取代或非取代的C6-10芳基或6至10元雜芳基；Ar為取代或非取代的C6-10芳基或6至10元雜芳基。本發(fā)明所述通式(I)所示的化合物可作為替諾福韋的前藥，該類前藥在血漿中穩(wěn)定，而且在外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中的活性代謝物替諾福韋的濃度與GS-7340相比顯著提高。所述的如通式(I)所示的化合物中磷原子具有手性，其構(gòu)型是S-或R-構(gòu)型，或者是S-構(gòu)型和R-構(gòu)型的混合物。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，如通式(I)所示的化合物或其異構(gòu)體、可藥用鹽、水合物或溶劑化物中，所述異構(gòu)體包括互變異構(gòu)體、順反異構(gòu)體、構(gòu)象異構(gòu)體、內(nèi)消旋化合物和具有對(duì)映或非對(duì)映關(guān)系的光學(xué)異構(gòu)體。在本發(fā)明的優(yōu)選的具體實(shí)施方案中公開了具有如下的結(jié)構(gòu)的化合物，但本發(fā)明的如通式(I)所示的化合物不僅限于以下結(jié)構(gòu)：在本發(fā)明的優(yōu)選的具體實(shí)施方案中進(jìn)一步公開了具有如下的結(jié)構(gòu)的手性化合物，但本發(fā)明的如通式(I)所示的化合物不僅限于以下結(jié)構(gòu)：本發(fā)明的如通式(I)所示的化合物可經(jīng)如下方法制備得到：其中，如通式(II)所示的化合物可通過中國(guó)專利ZL01813161.1中提供的方法制備，也可通過本領(lǐng)域的其它常規(guī)方法使用替諾福韋制備得到。手性異構(gòu)體(I1)可以通過對(duì)異構(gòu)體混合物(I’)的反相柱分離或手性柱分離得到。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其含有如通式(I)所示的化合物或其異構(gòu)體、可藥用鹽、水合物或溶劑化物與藥學(xué)上可接受載體，其中藥學(xué)上可接受載體可以選自注射用水、凍干粉劑輔料或口服制劑輔料。本發(fā)明另一方面還涉及如通式(I)所示的化合物或其異構(gòu)體、可藥用鹽、水合物或溶劑化物或前述的藥物組合物在制備治療病毒感染性疾病的藥物中的用途，優(yōu)選在制備治療乙型肝炎或乙肝病毒引起的疾病的藥物中的用途。除非有相反陳述，本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)具有下列的含義：“烷基”指飽和的脂族烴基團(tuán)，包括1至6個(gè)碳原子的直鏈和支鏈基團(tuán)。非限制性實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或未取代的，當(dāng)被取代時(shí)，取代基可以在任何可使用的連接點(diǎn)上被取代，優(yōu)選為一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)，獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、硫醇、羥基、硝基、氰基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷硫基、雜環(huán)烷硫基、氧代?！碍h(huán)烷基”指飽和或部分不飽和單環(huán)或多環(huán)環(huán)狀烴取代基，其包括3至7個(gè)碳原子。單環(huán)環(huán)烷基的非限制性實(shí)例包含環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚基、環(huán)庚三烯基等。多環(huán)環(huán)烷基包括螺環(huán)、稠環(huán)和橋環(huán)的環(huán)烷基。環(huán)烷基可以是取代的或未取代的，當(dāng)被取代時(shí)，取代基優(yōu)選為一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)，獨(dú)立地選自烷基、烷氧基、鹵素、羥基、硝基、氰基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基?！胺蓟敝?至10元全碳單環(huán)或稠合多環(huán)(也就是共享毗鄰碳原子對(duì)的環(huán))基團(tuán)，具有共軛的π電子體系的多環(huán)(即其帶有相鄰對(duì)碳原子的環(huán))基團(tuán)，例如苯基和萘基。芳基可以是取代的或未取代的，當(dāng)被取代時(shí)，取代基優(yōu)選為一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)，獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、硫醇、羥基、硝基、氰基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷硫基、雜環(huán)烷硫基。“雜芳基”是指包含1、2、3或4個(gè)雜原子，6至10個(gè)環(huán)原子的雜芳族體系，優(yōu)選5至6個(gè)環(huán)原子，其中雜原子包括氧、硫和氮；例如吡啶基、嘧啶基等?！半s芳基”可以是任選取代的或未取代的，當(dāng)被取代時(shí)，取代基優(yōu)選為一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)，獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、硫醇、羥基、硝基、氰基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷硫基、雜環(huán)烷硫基。具體實(shí)施方式以下將結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)地解釋本發(fā)明，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本專利，具體實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并不以任何方式限定本發(fā)明。實(shí)施例1步驟1：在0℃下，向苯酚(5g)和三乙胺(10.1mL)的二氯甲烷(150mL)溶液中，滴加三甲基氯硅烷(6.0g)，滴加結(jié)束后，升溫至20℃，攪拌反應(yīng)18小時(shí)。濾去白色固體，用二氯甲烷洗滌固體。合并濾液，蒸除溶劑后，得到無(wú)色油狀苯氧基三甲基硅烷4.2g。步驟2：在70℃下，向替諾福韋(1g，從蘇州漢德森醫(yī)藥科技有限公司購(gòu)買)的環(huán)丁砜(2.5mL)混濁液中，滴加和DMF(0.1mL)和二氯亞砜(0.73g)，升溫至100℃，混合物在100℃下繼續(xù)反應(yīng)1.5小時(shí)至混合物全部澄清，快速加入苯氧基三甲基硅烷(0.70g)，混合物在100℃下反應(yīng)1.5小時(shí)后，減壓蒸除溶劑，得到粘稠狀黃色油狀液體，甲醇溶解后，用45％的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至3，過濾，干燥得到白色粉末狀固體IIa0.7g。MS(m/z)363.96(MH+).步驟3：在60℃下，向化合物IIa(600mg)的環(huán)丁砜(1mL)混合物中加入DMF(0.1mL)和二氯亞砜(343mg)，混合物在60℃下攪拌反應(yīng)30分鐘至溶解澄清。在0℃下將上述溶液加到氨基酸酯IIIa(750mg，從上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司購(gòu)買)和二異丙胺(452mg)的二氯甲烷(7mL)溶液中。升溫至20℃反應(yīng)2小時(shí)，依次用5％磷酸二氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑得黃色油狀粗產(chǎn)物，經(jīng)柱層析純化后，得到油狀液體產(chǎn)物Ia150mg。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.34(m，1H)，8.05(m，1H)，7.36～6.95(m，5H)，6.49(b，2H)，6.22～5.84(m，1H)，5.01(m，1H)，4.42(m，1H)，4.40～3.60(m，3H)，1.52～1.18(m，15H).MS(m/z)491.13(MH+).手性化合物Ia1和Ia2的制備：方法一：非手性柱制備：粗產(chǎn)物Ia(150mg)經(jīng)HPLC制備分離(制備柱：WatersSymmetryC18，流動(dòng)相：A：0.02％磷酸水溶液；B：甲醇)后得到50mg化合物Ia1(保留時(shí)間：50.65min)：MS(m/z)491.17(MH+)和61mg化合物Ia2(保留時(shí)間：47.57min)：MS(m/z)491.10(MH+).方法二：手性柱制備：粗產(chǎn)物Ia(150mg)經(jīng)HPLC制備分離(制備柱：ChiralpakAS-H，流動(dòng)相：A：正己烷；B：乙醇)后得到62mg化合物Ia1(保留時(shí)間：6.53min)和78mg化合物Ia2(保留時(shí)間：6.11min)。實(shí)施例2在60℃下，向IIa(600mg)的環(huán)丁砜(1mL)混合物中加入DMF(0.1mL)和二氯亞砜(343mg)，混合物在60℃下攪拌反應(yīng)30分鐘至溶解澄清。在0℃下，將上述溶液加到氨基酸酯IIIb(760mg，從上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司購(gòu)買)和二異丙胺(452mg)的二氯甲烷(7mL)溶液中。升溫至20℃反應(yīng)2小時(shí)，依次用5％磷酸二氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑，得黃色油狀粗產(chǎn)物，經(jīng)柱層析純化后，得到油狀液體產(chǎn)物Ib221mg。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.38(m，1H)，8.01(m，1H)，7.34～6.95(m，5H)，6.48～6.18(m，1H)，5.84(b，2H)，5.01～4.82(m，1H)，4.42(m，1H)，4.20～3.60(m，5H)，2.68(m，1H)，1.41～1.10(m，12H).粗產(chǎn)物Ib(100mg)經(jīng)HPLC制備分離(制備柱：ChiralpakAS-H，流動(dòng)相：A：正己烷；B：乙醇)后得到35mg化合物Ib1。MS(m/z)489.26(MH+).實(shí)施例3步驟1：在0℃下，向?qū)β缺椒?5g)和三乙胺(10.8mL)的二氯甲烷(150mL)溶液中，滴加三甲基氯硅烷(6.3g)，滴加結(jié)束后，升溫至20℃，攪拌反應(yīng)18小時(shí)。蒸除溶劑后，得到無(wú)色油狀對(duì)氯苯氧基三甲基硅烷5.1g。步驟2：在70℃下，向替諾福韋(1g)的環(huán)丁砜(2.5mL)混濁液中，滴加DMF(0.1mL)和二氯亞砜(0.73g)，升溫至100℃，混合物在100℃下繼續(xù)反應(yīng)1.5小時(shí)至混合物全部澄清，加入對(duì)氯苯氧基三甲基硅烷(0.77g)，混合物在100℃下反應(yīng)1.5小時(shí)后，減壓蒸除溶劑，得到粘稠狀黃色油狀液體，加甲醇溶解(2mL)后，于0℃用45％的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至3，過濾，干燥得到白色粉末狀固體IIc800mg。MS(m/z)398.05(MH+).步驟3：在60℃下，向IIc(600mg)的環(huán)丁砜(1mL)混合物中加入DMF(0.1mL)和二氯亞砜(343mg)，混合物在60℃下攪拌反應(yīng)30分鐘至溶解澄清。在0℃下，將上述溶液加到氨基酸酯IIIa(731mg)和二異丙胺(452mg)的二氯甲烷(7mL)溶液中。升溫至20℃反應(yīng)2小時(shí)，依次用5％磷酸二氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑，得一黃色油狀粗產(chǎn)物，經(jīng)柱層析純化后得到油狀液體產(chǎn)物Ic121mg。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.35(m，1H)，8.01(m，1H)，7.28(m，1H)，7.22(m，1H)，7.15～7.13(m，1H)，6.94(m，1H)，5.88(b，2H)，5.07(m，2H)，4.42(m，1H)，4.21(m，1H)，3.90～3.81(m，2H)，3.71～3.54(m，1H)，1.56～1.24(m，15H).粗產(chǎn)物Ic(70mg)經(jīng)HPLC制備分離(制備柱：ChiralpakAS-H，流動(dòng)相：A：正己烷；B：乙醇)后得到21mg化合物Ic1。MS(m/z)525.26(MH+).實(shí)施例4步驟1：在0℃下，向?qū)籽趸椒?5g)和三乙胺(10.8mL)的二氯甲烷(150mL)溶液中，滴加三甲基氯硅烷(6.3g)，升溫至20℃攪拌反應(yīng)18小時(shí)。蒸除溶劑后，得到無(wú)色油狀對(duì)甲氧苯氧基三甲基硅烷4.7g。步驟2：在70℃下，向替諾福韋(1g)的環(huán)丁砜(2.5mL)混濁液中，滴加和DMF(0.1mL)和二氯亞砜(0.73g)，升溫至100℃，混合物在100℃下繼續(xù)反應(yīng)1.5小時(shí)至混合物全部澄清，加對(duì)甲氧苯氧基三甲基硅烷(0.75g)，混合物在100℃下反應(yīng)1.5小時(shí)后，減壓蒸除溶劑，得到粘稠狀黃色油狀液體，加甲醇溶解(2mL)后，于0℃用45％的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至3，過濾，干燥得到白色粉末狀固體IId600mg。MS(m/z)394.11(MH+).步驟3：在60℃下，向IId(300mg)的環(huán)丁砜(1mL)混合物中加DMF(0.1mL)和二氯亞砜(181mg，1.52mmol)，混合物在60℃下攪拌反應(yīng)30分鐘至溶解澄清。在0℃下將上述溶液加到氨基酸酯IIIa(386mg)和二異丙胺(343mg)的二氯甲烷(5mL)溶液中。升溫至20℃，反應(yīng)2小時(shí)，依次用5％磷酸二氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑，得黃色油狀粗產(chǎn)物，經(jīng)柱層析純化后得到油狀液體產(chǎn)物Id40mg。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.35(m，1H)，8.04(m，1H)，7.12～6.85(m，4H)，5.86(b，2H)，5.06(m，1H)，4.42(m，1H)，4.18(m，1H)，4.08～3.94(m，3H)，3.82(m，3H)，3.77～3.61(m，1H)，1.55～1.17(m，15H).粗產(chǎn)物Id(30mg)經(jīng)HPLC制備分離(制備柱：ChiralpakAS-H，流動(dòng)相：A：正己烷；B：乙醇)后得到12mg化合物Id1。MS(m/z)521.23(MH+).實(shí)施例5按合成化合物Ic和Ic1類似的方法，合成了化合物Ie和Ie1。Ie：1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.27(m，1H)，8.04(s，1H)，7.96(m，1H)，7.84(m，1H)，7.62(m，1H)，7.52～7.33(m，4H)，5.78(b，2H)，5.04～4.98(m，1H)，4.38～3.71(m，6H)，1.57～1.06(m，15H).Ie1：MS(m/z)541.11.實(shí)施例6按合成化合物Ic和Ic1類似的方法，合成了化合物If和If1。If：1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.33(m，1H)，8.02(s，1H)，7.81～7.66(m，4H)，7.49～7.41(m，2H)，7.31～7.06(m，1H)，5.72(b，2H)，5.06～4.99(m，1H)，4.43～4.35(m，1H)，4.19～3.91(m，4H)，3.74～3.65(m，1H)，1.57～1.20(m，15H).If1：MS(m/z)541.10.實(shí)施例7按合成化合物Ic和Ic1類似的方法，合成了化合物Ih和Ih1。Ih：1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.33(m，1H)，7.95(m，1H)，7.00～6.95(m，3H)，5.83(b，2H)，5.05～4.99(m，2H)，4.35～4.31(m，1H)，4.23～4.17(m，1H)，4.01～3.83(m，3H)，3.80～3.77(m，1H)，2.35(s，3H)，2.31(s，3H)，1.33～1.19(m，15H).Ih1：MS(m/z)519.15.實(shí)施例8按合成化合物Ic和Ic1類似的方法，合成了化合物Ii和Ii1。Ii：1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.36(m，1H)，8.00(m，1H)，7.17(m，1H)，7.02(m，1H)，6.97(m，2H)，5.71(b，2H)，5.06(m，1H)，4.43(m，1H)，4.20(m，1H)，4.06～3.84(m，3H)，3.72～3.61(m，1H)，1.56～1.22(m，15H).Ii1：MS(m/z)509.25.實(shí)施例9按合成化合物Ic和Ic1類似的方法，合成了化合物Ij和Ij1。Ij：1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.32(m，1H)，8.06(s，1H)，7.58(m，2H)，7.52(m，2H)，5.89(b，2H)，5.02～4.96(m，1H)，4.43～4.36(m，2H)，4.04～3.91(m，4H)，1.58～1.23(m，15H).IJ1：MS(m/z)559.08.實(shí)施例10：Ia1富馬酸鹽的制備在20℃下，向一個(gè)單口燒瓶中依次加入化合物Ia1(480mg)，富馬酸(120mg)和乙腈，升溫到60℃并在此溫度下攪拌直至固體全部溶解，繼續(xù)攪拌5分鐘，冷卻至20℃，過濾，得白色顆粒狀固體Ia1富馬酸鹽490mg。1HNMR(400MHz，D2O)：δ7.21(m，2H)，7.11(m，1H)，6.67(m，2H)，6.57(s，2H)，4.77(m，1H)，4.29(m，1H)，4.17(m，1H)，4.06(m，1H)，3.93(m，1H)，1.07(m，6H)，1.21(m，9H).實(shí)施例11：抗病毒實(shí)驗(yàn)1、體外抗乙型肝炎病毒活性研究以HepG2.2.15細(xì)胞為乙型肝炎病毒載體，測(cè)定化合物抑制乙型肝炎病毒進(jìn)行DNA復(fù)制的能力。測(cè)試方法：HepG2.2.15細(xì)胞種96孔培養(yǎng)板，24小時(shí)后按不同稀釋度分別加入樣品及陽(yáng)性對(duì)照藥，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔，加藥72小時(shí)后分別更換含不同稀釋濃度樣品的培養(yǎng)液，于加藥后第6天分別收集細(xì)胞上清及2.2.15細(xì)胞，采用點(diǎn)雜交的方法檢測(cè)細(xì)胞中HBVDNA復(fù)制程度，計(jì)算IC50(結(jié)果見表1)。2、細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)試方法：HepG2.2.15細(xì)胞種96孔培養(yǎng)板，按不同稀釋度分別加入樣品及陽(yáng)性對(duì)照藥，于加藥后第6天加CellTiter-Blue(Promega，Catalog#G8081)，使用Flexstation3儀測(cè)得熒光讀數(shù)，計(jì)算CC50(結(jié)果見表1)。表1、各化合物的HBV抑制率和細(xì)胞毒性結(jié)果化合物IC50(nM)ToxicityCC50(nM)陽(yáng)性對(duì)照GS-7171(混合物)35＞10000陽(yáng)性對(duì)照GS-7340(手性)14＞10000Ia(混合物)21＞10000Ia1(手性)5.0＞10000Ia2(手性)32＞10000Ib1(手性)15＞10000Ic1(手性)5.3＞10000Id1(手性)6.2＞10000Ie1(手性)5.7＞10000If1(手性)7.5＞10000Ih1(手性)5.9＞10000Ii1(手性)8.3＞10000Ij1(手性)7.0＞10000陽(yáng)性對(duì)照藥使用的是中國(guó)授權(quán)專利ZL01813161.1的實(shí)施例2和實(shí)施例3中公開的化合物GS-7171和GS-7340，其中GS-7171可拆分成兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體GS-7340和GS-7339，GS7340藥效更佳。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物Ia1、Ib1、Ic1、Id1、Ie1、If1、Ih1、Ii1和Ij1對(duì)乙型肝炎病毒DNA復(fù)制具有強(qiáng)烈的抑制作用，但沒有細(xì)胞毒性，其中化合物Ia1、Ic1、Id1、Ie1、If1、Ih1、Ii1和Ij1對(duì)乙型肝炎病毒DNA復(fù)制的抑制作用優(yōu)于陽(yáng)性化合物GS7340。實(shí)施例12：酸性介質(zhì)和模擬胃液中的穩(wěn)定性試驗(yàn)1、試劑和原料以及來(lái)源名稱含量廠家胃蛋白酶1∶3000倍上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司HCl36％江蘇強(qiáng)盛化工有限公司醋酸銨98.0％國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司GS-734098.7％上海源力生物技術(shù)有限公司合成Ia198.7％上海源力生物技術(shù)有限公司合成2、試劑的配制2.1鹽酸溶液(pH2.0)精密量取4.5mL36％鹽酸到1L容量瓶中，加水至刻度，搖勻備用，標(biāo)示為儲(chǔ)備液。再精密量取10mL上述溶液至50mL的容量瓶中，加水至刻度，搖勻，測(cè)量pH為2.0，標(biāo)示為鹽酸溶液。2.2模擬胃液(pH2.0)精密量取儲(chǔ)備液10mL至50mL容量瓶中，再精確稱取500.0mg的胃蛋白酶至50mL容量瓶中，加水至刻度，超聲溶解(此時(shí)溶液不澄清)，過濾既得澄清溶液。標(biāo)示為模擬胃液。2.3樣品溶液的配制2.3.1GS-7340鹽酸溶液精密稱取5.0mgGS-7340到5mL容量瓶中，先加2.5mL異丙醇至容量瓶中，振搖溶解，然后加鹽酸溶液(pH2.0)至刻度。振蕩搖勻，過濾備用。2.3.2GS-7340模擬胃液溶液精密稱取5.0mgGS-7340到5mL容量瓶中，先加2.5mL異丙醇至容量瓶中，振搖溶解，然后加模擬胃液至刻度。振蕩搖勻，過濾備用。2.3.3Ia1鹽酸溶液精密稱取5.0mgIa1到5mL容量瓶中，先加2.5mL異丙醇至容量瓶中，振搖溶解，然后加鹽酸溶液(pH2.0)至刻度。振蕩搖勻，過濾備用。2.3.4Ia1模擬胃液溶液精密稱取5.0mgIa1到5mL量瓶中，先加2.5mL異丙醇至容量瓶中，振搖溶解，然后加模擬胃液至刻度。振蕩搖勻，過濾備用。2.4樣品溶液的取樣把配制好的樣品裝入進(jìn)樣小瓶后馬上進(jìn)樣，作為初始樣品。與此同時(shí)把剩余的樣品馬上放入已達(dá)到和處于穩(wěn)定37度的恒溫箱里，6.0小時(shí)后取樣進(jìn)高效液相?；衔颕a1和GS-7340在酸介質(zhì)和模擬胃液中的穩(wěn)定性結(jié)果見表2。表2、化合物Ia1和GS-7340在酸介質(zhì)和模擬胃液中的穩(wěn)定性結(jié)果3、實(shí)驗(yàn)結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與用單取代氨基酸制得的替諾福韋磷酰胺酯前藥(GS-7340)相比，用雙取代氨基酸制得的替諾福韋磷酰胺酯前藥(Ia1)在酸介質(zhì)和模擬胃液中的穩(wěn)定性顯著提高。實(shí)施例13：替諾福韋前藥在新鮮人全血中的代謝穩(wěn)定性和在PBMCs細(xì)胞中的分布試驗(yàn)1、材料化合物：化合物Ia1和GS-73402、試驗(yàn)方法在37℃條件下，將不同替諾福韋前藥和新鮮人全血共同孵育，分別在孵育1小時(shí)、2小時(shí)后分離血漿和PBMC細(xì)胞(Ficoll密度梯度離心法)，測(cè)定血漿和PBMCs細(xì)胞中藥物原形及代謝物替諾福韋的濃度，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算PBMCs細(xì)胞，并以每個(gè)PBMC細(xì)胞為200fL計(jì)算細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。3、血漿/PBMC樣品處理向100μL血漿樣品或PBMC樣品中分別加入20μL內(nèi)標(biāo)溶液(400ng/mLSN-38溶液)，5.0μL甲醇-水(50∶50，v/v)和200μL乙腈，渦流混勻1min，離心5min(14000rpm)。取20μL上清液和180μl流動(dòng)相混勻，渦流1min，取10μL進(jìn)行LC/MS/MS分析。替諾福韋前藥在新鮮人全血中的代謝穩(wěn)定性和在PBMCs細(xì)胞中的分布結(jié)果見表3。表3、替諾福韋前藥在新鮮人全血中的代謝穩(wěn)定性和在PBMCs細(xì)胞中的分布結(jié)果注：PAMA為前藥的活性代謝產(chǎn)物-替諾福韋4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論從表3可以看出，陽(yáng)性對(duì)照物GS-7340在與新鮮人全血共同孵育后，在血漿中檢測(cè)到一定量的活性代謝產(chǎn)物-替諾福韋，并且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，在血漿中所釋放的活性代謝產(chǎn)物-替諾福韋成倍增長(zhǎng)，而本發(fā)明的化合物Ia1在與新鮮人全血共同孵育后，完全沒有檢測(cè)到活性代謝產(chǎn)物-替諾福韋，并且即使隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，在血漿中始終也未檢測(cè)到活性代謝產(chǎn)物-替諾福韋，說明化合物Ia1在血漿中的穩(wěn)定性顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照物GS-7340，因此，與陽(yáng)性對(duì)照物GS-7340相比，本發(fā)明的化合物Ia1在降低因血漿中代謝生產(chǎn)替諾福韋所產(chǎn)生的毒副作用方面具有顯著的優(yōu)越性。從表3還可以看出，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，本發(fā)明化合物Ia1在外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中的活性代謝產(chǎn)物-替諾福韋的濃度顯著增大，而GS-7340在外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中的活性代謝產(chǎn)物-替諾福韋的濃度基本上不隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。本發(fā)明化合物Ia1經(jīng)2小時(shí)孵育后在外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中的活性代謝產(chǎn)物-替諾福韋的濃度大約是陽(yáng)性對(duì)照物GS-7340的三倍。因此，與陽(yáng)性對(duì)照物GS-7340相比，本發(fā)明的化合物Ia1在療效方面也具有顯著的優(yōu)越性。實(shí)施例14：抗艾滋病(HIV)病毒實(shí)驗(yàn)1、目的：評(píng)價(jià)三個(gè)化合物對(duì)HIV的活性和細(xì)胞毒性EC50、CC50值2、材料和方法：2.1材料化合物：化合物Ia1、GS-7340和替諾福韋酯RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen21969-035)DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen21969-035)谷氨酸200mM(Invitrogen25030)胎牛血清((Invitrogen16000-044)盤尼西林/鏈霉素((Invitrogen15140-122)DPBS緩沖液(Invitrogen14190-094)胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen25200)臺(tái)盼藍(lán)SigmaT8154DMSOSigmaD2650MUGBiochemika695902.2試驗(yàn)方法1)MT-2細(xì)胞感染HIV-1(IIIb)形成感染復(fù)數(shù)(MOI)0.01TCID50每細(xì)胞2)將病毒和細(xì)胞混合物在384孔板中孵育3天3)用于細(xì)胞毒性檢測(cè)的細(xì)胞在384孔板中孵育3天4)將上清轉(zhuǎn)移到新孔板中然后加入報(bào)告細(xì)胞(Hela)共同孵育24h5)檢測(cè)beta-GAL活性評(píng)價(jià)藥物抗HIV活性6)未加入病毒的細(xì)胞孵育三天后檢測(cè)luminescent信號(hào)評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性7)按以下方程計(jì)算抗病毒活性和細(xì)胞毒性抗病毒活性(％)＝100-(檢測(cè)值-最高值)/(最低值-最高值)*100細(xì)胞毒性(％)＝100-(檢測(cè)值-最高值)/(最低值-最高值)*1008)使用GraphpadPrism5擬合曲線，計(jì)算EC50、CC50值(結(jié)果見表4)。表4、化合物抗HIV病毒活性和細(xì)胞毒性結(jié)果化合物EC50(nM)ToxicityCC50(μM)陽(yáng)性對(duì)照(GS-7340)12＞150陽(yáng)性對(duì)照(替諾福韋酯)1116.9Ia1(手性)8＞1503.實(shí)驗(yàn)結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物Ia1對(duì)HIV病毒具有強(qiáng)烈的抑制作用，但沒有細(xì)胞毒性。由于已根據(jù)其特殊的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，某些修飾和等價(jià)變化對(duì)于精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。