神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)及其制備方法。該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)包括緩釋膜、吸附于所述緩釋膜上的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系及分散于所述緩釋膜中的帶正電的導(dǎo)電聚合物，其中，所述緩釋膜為聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成的水凝膠膜。將該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)用于治療受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)時，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞能夠在光照刺激下特異性增加ATP釋放，帶負(fù)電的ATP被帶正電的導(dǎo)電聚合物吸引而沉積在緩釋膜的表面上，通過擴散作用實現(xiàn)ATP的緩釋，克服了常規(guī)藥物治療的一過性釋放的缺陷，能夠較好地促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元的定向分化，有效地修復(fù)受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
【專利說明】神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞調(diào)控【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞替代療法在受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)中已得到越來越多人的關(guān)注。因此，促進(jìn)干細(xì)胞在生物體內(nèi)的增殖和定向分化一直是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的重中之重。三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate, ATP)是一種核苷酸,作為細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的“分子通貨”，儲存和傳遞化學(xué)能。ATP作為一種重要的神經(jīng)膠質(zhì)分子，參與對中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他細(xì)胞如神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞等的調(diào)控作用。已有大量報道證實，ATP參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞(如神經(jīng)干細(xì)胞)的增殖、遷移和分化功能，進(jìn)而促進(jìn)受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的修復(fù)作用。
[0003]然而，ATP在胞外能被腺苷酶迅速降解為腺苷(adenosine)，而腺苷可以刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞(miciOglia)的增殖從而影響ATP在調(diào)控干細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)中的作用。生物體在正常生理條件下自身釋放的ATP難以滿足ATP調(diào)控干細(xì)胞從而發(fā)揮受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)的作用的需求。因此，刺激細(xì)胞釋放更多的ATP以補充被腺苷酶迅速降解的ATP對受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的修復(fù)有促進(jìn)作用。
[0004]迄今為止，促進(jìn)細(xì)胞釋放ATP以實現(xiàn)對受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)的方法主要通過電刺激或藥物來實現(xiàn)。用電刺激或藥物的方法在生物體內(nèi)缺乏細(xì)胞特異性及時間可控性，因為無論是電刺激還是藥物作用往往都是一過性釋放，療效較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]基于此，有必要提供一種能夠緩釋ATP的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)。
[0006]進(jìn)一步，提供一種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法。
[0007]進(jìn)一步，還提供上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的應(yīng)用。
[0008]一種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)，包括緩釋膜、吸附于所述緩釋膜上的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系及分散于所述緩釋膜中的帶正電的導(dǎo)電聚合物，其中，所述緩釋膜為聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成的水凝膠膜。
[0009]在其中一個實施例中，還包括分散于所述緩釋膜上的生物活性物質(zhì)和三磷酸腺苷。
[0010]在其中一個實施例中，還包括神經(jīng)假體，所述緩釋膜設(shè)置于所述神經(jīng)假體的表面上。
[0011]在其中一個實施例中，所述神經(jīng)假體為植入式神經(jīng)電極、植入式神經(jīng)支架或植入式神經(jīng)導(dǎo)管。
[0012]在其中一個實施例中，所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞的數(shù)量比為1:1。
[0013]在其中一個實施例中，所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞為攜帶有光敏基因的動物海馬星型膠質(zhì)細(xì)胞或攜帶有光敏基因的紋狀體星型膠質(zhì)細(xì)胞。
[0014]一種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟:
[0015]構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞；
[0016]構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系；
[0017]制備緩釋膜，所述緩釋膜為聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成的水凝膠薄膜；
[0018]將導(dǎo)電聚合物分散于所述緩釋膜中；及
[0019]將所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系接種于所述緩釋膜上，使所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系吸附于所述緩釋膜上，得到所述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)。
[0020]在其中一個實施例中，所述構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的步驟為:將攜帶有光敏基因的病毒感染星型膠質(zhì)細(xì)胞，得到光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞。
[0021]在其中一個實施例中，所述攜帶有光敏基因的病毒的制備方法具體為:用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因及用于特定性標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞的啟動子GFAP的融合質(zhì)粒和病毒包裝相關(guān)的混合質(zhì)粒pCMV Δ R8.74和pMD2.G.至293FT細(xì)胞，然后將所述293FT細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，破碎細(xì)胞膜、過柱，取上清液，得到含有攜帶光敏基因的病毒的細(xì)胞液。
[0022]在其中一個實施例中，所述構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系的步驟為:將所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共同接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37°C下孵育24小時。
[0023]在其中一個實施例中，所述制備緩釋膜的步驟為:將丙烯酸溶于聚乙烯醇的水溶液中，丙烯酸現(xiàn)場聚合生成聚丙烯酸，聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成水凝膠薄膜。
[0024]在其中一個實施例中，所述將導(dǎo)電聚合`物分散于所述緩釋膜中的步驟為:將所述緩釋膜放入含有導(dǎo)電聚合物單體的電沉積溶液中充分溶脹后，在恒定電壓作用下，導(dǎo)電聚合物單體聚合成導(dǎo)電聚合物，并分散于所述緩釋膜中。
[0025]在其中一個實施例中，所述構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞后，構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系之前，還包括檢測所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞興奮性和檢測所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性的步驟。
[0026]在其中一個實施例中，所述檢測所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞興奮性步驟為采用激光刺激系統(tǒng)對所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行點刺激，并測定所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞由光所誘發(fā)的內(nèi)向光電流；所述檢測所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性的步驟為采用ATP濃度的熒光素酶檢測試劑盒檢測光刺激光敏膠質(zhì)細(xì)胞釋放的ATP濃度，同時檢測細(xì)胞外液中乳酸脫氫酶的活力度。
[0027]一種上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)在治療帕金森癥、癲癇、運動神經(jīng)障礙、中風(fēng)或抑郁癥中的應(yīng)用。
[0028]上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系吸附于緩釋膜中，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞能夠在光照刺激下特異性增加ATP釋放，帶負(fù)電的ATP被帶正電的導(dǎo)電聚合物吸引而沉積在所述緩釋膜的表面上，通過擴散作用實現(xiàn)ATP的緩釋，克服了常規(guī)藥物治療的一過性釋放的缺陷，能夠較好地促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元的定向分化，有效地修復(fù)受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為一實施方式的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法的流程圖；[0030]圖2為含有光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因及用于特定性標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞的啟動子GFAP的融合質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031]圖3為實施例1的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的星型膠質(zhì)細(xì)胞的顯微鏡圖；
[0032]圖4 (a)為通過電壓鉗方式記錄到的光誘發(fā)的實施例1的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)向光電流；
[0033]圖4 (b)為圖4 Ca)所示的光電流的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果；
[0034]圖4 (C)為光刺激實施例1的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞I小時后，所述誘發(fā)的內(nèi)向光電流；
[0035]圖5 (a)~圖5 (c)為實施例1的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的釋放ATP檢測圖；
[0036]圖6為光刺激后，實施例1的光敏星型膠質(zhì)的細(xì)胞外液中的LDH的活力度檢測圖；
[0037]圖7為測試光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞對干細(xì)胞功能的影響的檢測方法的示意圖；
[0038]圖8 (a)~圖8 (b)為實施例1的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系的mRNA表達(dá)分析的檢測圖；
[0039]圖8 (C)~圖8 Cd)為實施例1的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中EdU摻入DNA示意圖；
[0040]圖9 (a)~圖9 (b)為采 用大鼠大腦中動脈線拴腦卒中模型，缺陷48小時后，用實施例1的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)治療后進(jìn)行Tujl免疫組染色實驗的實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0041]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。
[0042]一實施方式的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)，包括緩釋膜、吸附于緩釋膜上的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系及分散于緩釋膜中的帶正電的導(dǎo)電聚合物。
[0043]緩釋膜為聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成的水凝膠膜。
[0044]這種水凝膠膜具有較好的生物相容性、較高的離子導(dǎo)通能力、較強的機械強度、較高的穩(wěn)定性以及較為合適的溶脹率。因此，這種水凝膠膜對人體的安全性較高，并且能夠較好吸附生物活性物質(zhì)和ATP。
[0045]優(yōu)選地，丙烯酸和聚乙烯醇重復(fù)鏈段的摩爾比為1:1。
[0046]光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系包含光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞。
[0047]星型膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類重要的細(xì)胞類型，能夠調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的活動。改變星型膠質(zhì)細(xì)胞的興奮性，可以引起其釋放神經(jīng)膠質(zhì)分子或神經(jīng)營養(yǎng)因子，這些神經(jīng)膠質(zhì)分子或神經(jīng)營養(yǎng)因子進(jìn)而影響干細(xì)胞的功能。星型膠質(zhì)細(xì)胞在興奮或靜息狀態(tài)下能夠?qū)TP釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中。
[0048]光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞是指攜帶光敏基因的星型膠質(zhì)細(xì)胞。優(yōu)選為攜帶光敏基因的動物海馬星型膠質(zhì)細(xì)胞或攜帶了光敏基因的紋狀體星型膠質(zhì)細(xì)胞。
[0049]光敏基因是指可以編碼光敏感型陽離子通道蛋白的基因，如從綠藻中克隆出來的channelrhodopsin-2 基因，簡稱為 ChR2。[0050]進(jìn)行光刺激能夠可以在特定細(xì)胞亞群水平上控制光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的活性，使得光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放ATP具有細(xì)胞特異性和時間上毫秒水平上的精確性。
[0051]干細(xì)胞優(yōu)選為神經(jīng)干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0052]優(yōu)選地，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞的數(shù)量比為1:1，以保證光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放的ATP能夠很好地調(diào)控干細(xì)胞的活動，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元分化。
[0053]光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系接種于緩釋膜上，使光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系吸附于緩釋膜上。光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞在光照刺激下緩釋ATP，ATP促進(jìn)干細(xì)胞往神經(jīng)元方向分化，有利于修復(fù)受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
[0054]帶正電的導(dǎo)電聚合物為聚吡咯、聚3，4-乙撐二氧噻吩、聚噻吩及聚苯乙烯磺酸鈉中的至少一種。
[0055]帶正電的導(dǎo)電聚合物均勻分散于緩釋膜中，并與聚丙烯酸和聚乙烯醇組成網(wǎng)際互穿高分子聚合物。
[0056]由于ATP帶有負(fù)電，因此光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞特異性釋放的ATP可以與帶正電的導(dǎo)電聚合物共沉積在緩釋膜上，然后通過擴散進(jìn)行緩釋，實現(xiàn)ATP的緩釋，從而提高ATP對周圍干細(xì)胞功能的調(diào)控。
[0057]使用上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)時，將該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)植入病灶區(qū)，48小時后，在移植區(qū)垂直插入直徑為200微米的光纖，進(jìn)行470納米的藍(lán)光刺激或593納米的黃光刺激，持續(xù)30min，同時在光刺激的區(qū)域和光纖成18度角，中間間隔1.8mm,植入Y型微透析管，該微 透析管一端通過塑料導(dǎo)管連接至微量注射器，灌注人工腦脊液(mmol/L:NaC1124、KC13、CaCl22.4,MgSO41.3、葡萄糖 10 和羥乙基哌嗪乙硫磺酸 10 ；pH=7.3，灌流速度2L/min)，另一端通過同樣的塑料導(dǎo)管將析出液收集到置于冰浴中的1.5mL的安培管里。
[0058]使用上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)治療受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，在光照刺激下，光敏型膠質(zhì)細(xì)胞特異性釋放ATP，所釋放的ATP沉積于緩釋膜表面上，通過擴散緩慢釋放，從而實現(xiàn)ATP的緩釋，提高ATP對周圍干細(xì)胞的調(diào)控，提高對受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的修復(fù)作用。這種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)能夠在細(xì)胞亞群水平上控制細(xì)胞活性，促使光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放較多的ATP，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放ATP具有空間上的細(xì)胞特異性和時間上毫秒水平上的精確性，并且，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放的ATP能夠通過緩釋膜進(jìn)行緩釋，克服了常規(guī)藥物治療的一過性釋放的缺陷，能夠較好地促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元的定向分化，有效地修復(fù)受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
[0059]優(yōu)選地，上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)還包括分散于緩釋膜上生物活性物質(zhì)和三磷酸腺苷(ATP)。
[0060]生物活性物質(zhì)為神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)、神經(jīng)生長因子、血管生長因子、多肽及蛋白質(zhì)分子中的至少一種。
[0061]生物活性物質(zhì)可以促進(jìn)血管和神經(jīng)生長，進(jìn)一步有利于對受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的修復(fù)。
[0062]分散于緩釋膜上的ATP作為光敏膠質(zhì)細(xì)胞釋放的ATP的補充，以通過緩釋膜的緩控釋放更多的ATP，以使ATP更多地參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化，進(jìn)而促進(jìn)對受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的修復(fù)作用。
[0063]優(yōu)選地，上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)還包括神經(jīng)假體。緩釋膜設(shè)置于神經(jīng)假體的表面上。[0064]神經(jīng)假體為植入式神經(jīng)電極、植入式神經(jīng)支架或植入式神經(jīng)導(dǎo)管。
[0065]上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)包括神經(jīng)假體，使得該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的ATP緩釋對干細(xì)胞的調(diào)控結(jié)合植入式神經(jīng)電刺激療法的作用，更好地受損調(diào)控神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
[0066]并且，由于上述緩釋膜具有較好的生物相容性高和穩(wěn)定性高的特性，將其設(shè)置于神經(jīng)假體表面上，用于修飾神經(jīng)假體的界面，可以在神經(jīng)假體的界面上形成生物相容高且長期穩(wěn)定的高分子聚合物層，不僅可以提高神經(jīng)假體的生物相容性，并且長時間使用后，該神經(jīng)假體的性能仍能得到較好的保持，可以滿足長期植入人體的需求。因此，上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)能夠較好地綜合ATP的緩釋和植入式神經(jīng)電刺激療法的協(xié)調(diào)作用，提高療效。[0067]基于上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的優(yōu)點，能夠廣泛應(yīng)用于治療帕金森癥、癲癇、運動神經(jīng)障礙、中風(fēng)、抑郁癥等疾病中。
[0068]請參閱圖1，一實施方式的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟SllO~步驟S150。
[0069]步驟SllO:構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞。
[0070]光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞由星型膠質(zhì)細(xì)胞、光敏基因及攜帶光敏基因的病毒載體共同構(gòu)建而成。
[0071]星型膠質(zhì)細(xì)胞優(yōu)選為動物海馬星型膠質(zhì)細(xì)胞或紋狀體星型膠質(zhì)細(xì)胞。
[0072]光敏基因優(yōu)選為ChR2。病毒載體可以慢病毒或腺病毒。
[0073]用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因及用于特定性標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞的啟動子GFAP的融合質(zhì)粒及與慢病毒包裝相關(guān)的混合質(zhì)粒pCMV Δ R8.74和pMD2.G.至293FT細(xì)胞，每200，000個293FT細(xì)胞用6L脂質(zhì)體。
[0074]其中，含有光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因及用于特定性標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞的啟動子GFAP的融合質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖2所示。
[0075]將該轉(zhuǎn)染后的293FT細(xì)胞傳代至25代后即需要更換新的一批細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染24小時后，將培養(yǎng)293FT細(xì)胞的培養(yǎng)液換成無血清含有5mM丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)液后繼續(xù)孵育16小時。
[0076]然后，用超速離心機對上述293FT細(xì)胞進(jìn)行破膜得到細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液通過20%的蔗糖濾柱，收集上清，得到含有攜帶光敏基因的病毒的細(xì)胞液。該病毒滴度能達(dá)3X IO8TUAiL以上，用滅菌的磷酸鹽緩沖液重懸含有攜帶光敏基因的病毒的細(xì)胞液得到重懸液，其中含有攜帶光敏基因的病毒的細(xì)胞液與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:1000。
[0077]將上述重懸液加入無血清DMEM培養(yǎng)液中，用于感染星型膠質(zhì)細(xì)胞。其中，重懸液和無血清DMEM培養(yǎng)液的體積比為1:400。
[0078]為了檢測是否感染成功，感染6小時后，將感染后的細(xì)胞液接種于新鮮含有10%胎牛血清的DMEM，于37°C繼續(xù)培養(yǎng)48小時~72小時；放到顯微鏡下觀察，如果80%左右的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的標(biāo)記蛋白，可初步證實轉(zhuǎn)染成功。
[0079]優(yōu)選地，為了確保能夠發(fā)揮光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞在空間上具有細(xì)胞特異性和在時間上具有毫米水平上準(zhǔn)確性地釋放ATP，在后續(xù)步驟之前，還包括檢測光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞興奮性和檢測光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性的步驟。
[0080]檢測光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞興奮性的方法是以膜片鉗技術(shù)結(jié)合光刺激的方式對光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞中光敏通道蛋白的功能性表達(dá)進(jìn)行驗證。采用一套激光刺激系統(tǒng)對上述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行點刺激的模式，這種系統(tǒng)在此刺激模式下，每個點的掃描速度達(dá)10ms，光強到1.1mW左右；光刺激的相關(guān)參數(shù)為:10HZ，50ms ;以電壓鉗的形式記錄相關(guān)由光所誘發(fā)的內(nèi)向光電流，以確認(rèn)光敏型膠質(zhì)細(xì)胞被光特異性地改變了興奮性。
[0081]檢測光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性的方法是以10Hz、50ms的刺激模式對上述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行隨機模式的光刺激，刺激時長分別為30min、60min和120min ;收集每個時間節(jié)點的細(xì)胞培養(yǎng)液200L左右并置于_80°C儲存。采用市售ATP濃度的熒光素酶檢測試劑盒，檢測光刺激光敏膠質(zhì)細(xì)胞釋放的ATP濃度，同時檢測細(xì)胞外液中乳酸脫氫酶(LDH)的活力度，以確認(rèn)細(xì)胞膜的完整性。
[0082]步驟S120:構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系。 [0083]干細(xì)胞優(yōu)選為神經(jīng)干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞。。
[0084]將步驟SllO構(gòu)建得到的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共同接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37°C下孵育24小時。
[0085]優(yōu)選地，將光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共同接種于6-孔板內(nèi)，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、于37°C下孵育24小時。
[0086]優(yōu)選地，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞的接種密度為3 X IO5細(xì)胞/孔，其中，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞的個數(shù)比為1:1。
[0087]步驟S130:制備緩釋膜，緩釋膜為聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成的水凝膠薄膜。
[0088]將丙烯酸溶于聚乙烯醇的水溶液中，丙烯酸現(xiàn)場聚合生成聚丙烯酸，聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成水凝膠薄膜。
[0089]優(yōu)選地，當(dāng)所制備的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)還包括神經(jīng)假體時，還包括將該水凝膠薄膜涂覆于神經(jīng)假體表面上，并充分干燥，形成均一的薄膜。
[0090]步驟S140:將導(dǎo)電聚合物分散于緩釋膜中。
[0091]配制含有導(dǎo)電聚合物單體的電沉積溶液。優(yōu)選地，導(dǎo)電聚合物單體為吡咯、3，4-乙撐二氧噻吩、噻吩及苯乙烯磺酸鈉中的至少一種。
[0092]優(yōu)選地，吡咯的含量為0.01摩爾/升、3，4-乙撐二氧噻吩的含量為0.01摩爾/
升、噻吩的含量為0.01摩爾/升、苯乙烯磺酸鈉的含量為0.1摩爾/升。
[0093]將緩釋膜浸泡于含有導(dǎo)電聚合物單體的電沉積溶液中，使緩釋膜充分溶脹，導(dǎo)電聚合物單體在該溶脹后的緩釋膜中均勻分布。在恒定電壓的作用下，導(dǎo)電聚合物單體聚合生成導(dǎo)電聚合物，并與聚丙烯酸和聚乙烯醇組成網(wǎng)際互穿高分子聚合物。
[0094]當(dāng)前一個步驟還將水凝膠膜涂覆于神經(jīng)假體表面上時，將涂覆了水凝膠膜的神經(jīng)假體浸泡于含有導(dǎo)電聚合物單體中。
[0095]優(yōu)選地，電沉積液還含有生物活性物質(zhì)和ATP。
[0096]生物活性物質(zhì)優(yōu)選為神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)、神經(jīng)生長因子、血管生長因子、多肽及蛋白質(zhì)分子中的至少一種。
[0097]當(dāng)生物活性物質(zhì)只有一種時，生物活性物質(zhì)的含量為10毫克/L。當(dāng)生物活性物質(zhì)為兩種或兩種以上時，各種物質(zhì)的含量分別為10暈克/L。
[0098]ATP的含量優(yōu)選為70納摩爾/L，該濃度下ATP飽和。
[0099]在恒定電壓作用下，生物活性物質(zhì)和ATP均勻分散于緩釋膜表面。
[0100]步驟S150:將光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系接種于緩釋膜上，使光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系吸附于緩釋膜上，得到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)。
[0101]將光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中，接種于緩釋膜上。優(yōu)選地，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞的總細(xì)胞個數(shù)為4X IO5個，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞的數(shù)量比為1:1。細(xì)胞培養(yǎng)液優(yōu)選為DMEM。
[0102]優(yōu)選地，將總細(xì)胞個數(shù)為4X IO5個為光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系懸浮于5微升DMEM中再接種于緩釋膜上，使光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系吸附于緩釋膜上。
[0103]上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法通過將光敏基因引入星型膠質(zhì)細(xì)胞中，以便能夠精確地特異性調(diào)控光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放ATP，并且將光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)體系引入緩釋膜中，制備得到能夠緩釋ATP從而能夠較好地修復(fù)受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)。
[0104]以下通過具體實施例進(jìn)一步闡述。
[0105]實施例1
[0106]制備神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)
[0107](I)構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞
[0108]將人源化GFAP_ChR2密碼子(由Stanford大學(xué)Karl Deisseroth教授的實驗室獲得)通過Hindlll/BamHI酶切位點融入到開放型框架質(zhì)粒pCS2_eYFP (Clotech公司購得)的N末端。構(gòu)建成功后的質(zhì)粒通過Qiagen公司的maxiprep試劑盒純化擴增,得到含有光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因及用于特定性標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞的啟動子GFAP的融合質(zhì)粒。PCR擴增的正向引物序列為SEQ ID N0`.1所示的序列，反向引物序列為SEQ ID N0.2所示的序列，GFAP的來源是人。
[0109]用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染0.5μ g含有光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因及用于特定性標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞的啟動子GFAP的融合質(zhì)粒及1.5 μ g與慢病毒包裝相關(guān)的混合質(zhì)粒pCMVA R8.74和PMD2.G.(均購自8(1(^61^公司)至293?1'細(xì)胞，每200，000個細(xì)胞用61^脂質(zhì)體。其中，月旨質(zhì)體為Invitrogen公司產(chǎn)品，293FT細(xì)胞為ATCC公司產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染24小時后，將培養(yǎng)293FT細(xì)胞的培養(yǎng)液接種至無血清含有5mM丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)液后繼續(xù)孵育16小時。
[0110]進(jìn)一步，利用超速離心機在50，OOOg速度下對上述293FT細(xì)胞破膜得到細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液通過20%的蔗糖濾柱，收集上清，得到含有攜帶光敏基因的病毒的細(xì)胞液。采用稀釋計數(shù)法測試病毒滴度，為3X IO8TUAiL以上。用滅菌的磷酸鹽緩沖液重懸含有攜帶光敏基因的病毒的細(xì)胞液得到重懸液，其中含有攜帶光敏基因的病毒的細(xì)胞液與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:1000。將上述重懸液加入無血清DMEM培養(yǎng)液中，用于感染動物海馬星型膠質(zhì)細(xì)胞，感染6小時，得到光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞。其中，重懸液和無血清DMEM培養(yǎng)液的體積比為1:400。
[0111]將該光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞接種于新鮮的含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM，于37°C繼續(xù)培養(yǎng)48小時；放到顯微鏡下觀察，80%左右的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的標(biāo)記蛋白，如圖3所示，其中(a)為光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的顯微鏡圖，(b)為普通星型膠質(zhì)細(xì)胞的顯微鏡圖。對比圖3的(a)和(b)，可初步證實轉(zhuǎn)染成功，制備得到光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞。
[0112](2)光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞興奮性和細(xì)胞膜完整性檢測
[0113]采用一套激光刺激系統(tǒng)(華中科技大學(xué)武漢光電國家實驗室(籌)生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)功能實驗室研制)對上述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行點刺激的模式，這種系統(tǒng)在此刺激模式下，每個點的掃描速度達(dá)10ms，光強到1.1mW左右；光刺激的相關(guān)參數(shù)為:10Hz和50ms ;以電壓鉗的形式記錄相關(guān)由光所誘發(fā)的內(nèi)向光電流。
[0114]檢測結(jié)果如圖4 (a)~圖4 (C)所述。由圖4 (a)~圖4 (C)可看出，電壓鉗成功記錄到光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞中由光誘發(fā)的內(nèi)向電流，且一一對應(yīng)性良好，證明光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞被光特異性地改變了興奮性。
[0115]以10Hz、50ms的刺激模式對上述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行隨機模式的光刺激，刺激時間分別為30min、60min和120min ;收集每個時間節(jié)點的細(xì)胞培養(yǎng)液200L左右并置于_80°C儲存。采用市售ATP濃度的熒光素酶檢測試劑盒，檢測光刺激光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放的ATP濃度，同時檢測細(xì)胞外液中乳酸脫氫酶(LDH)的活力度，并以經(jīng)過光刺激和不經(jīng)過光刺激的普通星型膠質(zhì)細(xì)胞及不經(jīng)過光刺激的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞作為對比。
[0116]光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放的ATP濃度檢測結(jié)果如圖5 (a)~圖5 (C)所示，其中，圖5 Ca)為光刺激時間為30分鐘的ATP濃度圖，圖5 (b)光刺激時間為60分鐘的ATP濃度圖，圖5 (c)光刺激時間為120分鐘的ATP濃度圖。其中，ChR2+Light表示本實施例1構(gòu)建的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞受光刺激的情況，ChR2表示本實施例1構(gòu)建的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞不受光刺激的情況，N-ACM表示普通星型膠質(zhì)細(xì)胞不受光刺激的情況，Light表示普通星型膠質(zhì)細(xì)胞受光刺激的情況。
[0117]由圖5 (a)~圖5 (C)可看出，120分鐘刺激時間內(nèi)，光能誘發(fā)光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放ATP，但是60分鐘時達(dá)到最高值，進(jìn)一步的刺激并未引起更高地提高。因此，刺激時間優(yōu)選為60分鐘。
[0118]光刺激后，細(xì)胞外液中乳酸脫氫酶(LDH)的活力度的檢測結(jié)果如圖6所示。其中，ChR2+Light表示本實施例1構(gòu)建的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞受光刺激的情況，ChR2表示本實施例1構(gòu)建的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞不受光刺激的情況，N-ACM表示普通星型膠質(zhì)細(xì)胞不受光刺激的情況，Light表示普通星型膠質(zhì)細(xì)胞受光刺激的情況。由圖6可看出，細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測到的LDH的活力度并無顯著差異，表明ATP`的釋放并非由于細(xì)胞膜破裂引起。
[0119]由ATP釋放的情況和細(xì)胞細(xì)胞外液中LDH的活力度檢測情況可表明，經(jīng)過光刺激后，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞能夠保持細(xì)胞膜的完整性。
[0120](3)構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系
[0121]將光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞共同接種于6-孔板內(nèi)，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、于37°C下孵育24小時，得到光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系。其中，接種密度為3X105細(xì)胞/孔，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞的個數(shù)比為1:1。孵育24小時后，總細(xì)胞個數(shù)約為4X105個。
[0122](4)測試光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞對干細(xì)胞功能的影響
[0123]制備方法如圖7所示。
[0124]A、對上述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行470nm的藍(lán)光刺激(10Hz、50ms)，每次連續(xù)刺激60分鐘，收集光刺激后的培養(yǎng)液(光刺激星型光敏膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基)，離心去雜質(zhì)后，凍于-20°C冰箱內(nèi)待用。
[0125]B、將干細(xì)胞接種于另一個6孔板內(nèi)，待干細(xì)胞長到3X IO5細(xì)胞/孔時，將上述收集到的條件培養(yǎng)基和常規(guī)神經(jīng)兀誘導(dǎo)培養(yǎng)基(主要配方為:neurobasal medium(Gibco公司)、體積分?jǐn)?shù)為1%B27 (Sigma公司)、50ng/mL腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、25ng/mL堿性成纖維生長因子(bFGF)及 500ng/mL 音猬因子(sonic hedgehog) (PeproTech Inc))按 1:1的比例混合，在37°C下孵育干細(xì)胞，連續(xù)孵育20天，每隔2天換一次液，在第21天用RT-PCR法進(jìn)行mRNA表達(dá)分析測試，測試結(jié)果如圖8 (a)~圖8 (b)所示。
[0126]C、將上述收集到的條件培養(yǎng)基和生長到3X IO5細(xì)胞/孔的干細(xì)胞接入新鮮的條件培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基中，在37°C下孵育24小時后，進(jìn)行EdU摻入DNA試驗。試驗結(jié)果如圖8 (c)~圖8 (d)所示。
[0127]圖8 Ca)~圖8 Cd)中，CTRL指空白對照組，即將上述的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞換為普通星型膠質(zhì)細(xì)胞，eYFP指增強型黃色熒光蛋白，Pax6和Tujl是神經(jīng)元標(biāo)記物，Gapdh是一個內(nèi)參，用來表不做定量PCR的時候，各個樣本的上樣量是一致的。
[0128]由圖8 (a)~圖8 (b)可看出，ChR2組中，神經(jīng)元標(biāo)記物TujI和Pax6的信使RNA水平增高，也就是證明干細(xì)胞往神經(jīng)元方向的分化增多。
[0129]由圖8 Ca)~圖8 Cd)可看出，光特異性刺激光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞后產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基孵育間充質(zhì)干細(xì)胞，有效提高干細(xì)胞的神經(jīng)元方向分化(神經(jīng)元標(biāo)記物Tujl和Pax6表達(dá)顯著增高)和干細(xì)胞的增殖(標(biāo)記細(xì)胞增殖時DNA含量增多的EdU表達(dá)增多)。
[0130](5)制備緩釋膜
[0131]將丙烯酸溶于聚乙烯醇的水溶液中，丙烯酸現(xiàn)場聚合生成聚丙烯酸，聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成水凝膠薄膜。其中，丙烯酸和聚乙烯醇重復(fù)鏈段的質(zhì)量比為1:1。
[0132](6)將導(dǎo)電聚合物分散于緩釋膜
[0133]將導(dǎo)電聚合物單體和生物活性物質(zhì)溶于水中得到電沉積溶液。
[0134]其中，導(dǎo)電聚合物單體為3，4-乙撐二氧噻吩和苯乙烯磺酸鈉，3，4-乙撐二氧噻吩的含量為0.01摩爾/升，苯乙烯磺酸鈉的含量為0.1摩爾/升。
[0135]生物活性物質(zhì)為濃度為10毫克/L的神經(jīng)生長因子。
[0136]將緩釋膜浸泡于含有導(dǎo)電聚合單體的電沉積溶液中，使緩釋膜充分溶脹，3，4-乙撐二氧噻吩和苯乙烯磺酸鈉在該溶脹后的緩釋膜中均勻分布。在恒定電壓的作用下，3，4-乙撐二氧噻吩聚合生成聚3，4-乙撐二氧噻吩，苯乙烯磺酸鈉聚合生成聚苯乙烯磺酸鈉，聚3，4-乙撐二氧噻吩、聚苯乙烯磺酸鈉與聚丙烯酸和聚乙烯醇組成網(wǎng)際互穿高分子聚合物。
[0137](7)接種光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系
[0138]將總細(xì)胞個數(shù)為4X IO5個為光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系懸浮于5微升DMEM中，然后接種于緩釋膜中，使光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)吸附于緩釋膜的表面，得到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)。其中，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞的數(shù)量比為1:1。
[0139]利用大鼠大腦中動脈線拴模型制備腦卒中動物模型，缺血48小時后，將上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)移植到缺血腦區(qū)，24小時后在細(xì)胞移植區(qū)垂直插入市售光纖(200m直徑)進(jìn)行470nm的藍(lán)光刺激(10Hz，50ms)，持續(xù)30min，同時在光刺激的區(qū)域和光纖成18度角，中間間隔1.8mm,植入Y型微透析管(2mm長半透膜，Bioanalytical Systems公司),該微透析管一端通過塑料導(dǎo)管連接至微量注射器，灌注人工腦脊液(mmol/L:NaC1124，KC13, CaCl22.4,MgSO4L 3, glucoselO, and HEPES10, pH=7.3,灌流速度 2L/min),另一端通過同樣的塑料導(dǎo)管將析出液收集到置于冰浴中的1.5mL的安培管里。[0140]上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)表示為MSC+As+ChR2，治療14天后，進(jìn)行Tujl免疫組染色實驗，并用未經(jīng)任何治療的腦卒中大鼠模型作為空白對照組，表示為CTRL;用間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦卒中大鼠模型作為對照組，表示為MSC;用間充質(zhì)干細(xì)胞和黃色熒光蛋白轉(zhuǎn)染的星型膠質(zhì)細(xì)胞共移植治療腦卒中大鼠模型組作為對照組，表示為MSC+Astro-eYFP。
[0141]Tujl免疫組染色實驗的結(jié)果參見圖9 (a)~圖9 (b)。
[0142]其中，圖9 (a)為經(jīng)不同治療組治療的神經(jīng)功能恢復(fù)情況。神經(jīng)功能評分采用0-5分制打分:分?jǐn)?shù)越高表示腦卒中的損傷越厲害。具體見下表所示:
[0143]表1神經(jīng)功能評分
【權(quán)利要求】
1.一種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)，其特征在于，包括緩釋膜、吸附于所述緩釋膜上的光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系及分散于所述緩釋膜中的帶正電的導(dǎo)電聚合物，其中，所述緩釋膜為聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成的水凝膠膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)，其特征在于，還包括分散于所述緩釋膜上的生物活性物質(zhì)和三磷酸腺苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)，其特征在于，還包括神經(jīng)假體，所述緩釋膜設(shè)置于所述神經(jīng)假體的表面上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)，其特征在于，所述神經(jīng)假體為植入式神經(jīng)電極、植入式神經(jīng)支架或植入式神經(jīng)導(dǎo)管。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)，其特征在于，所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞的數(shù)量比為1:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)，其特征在于，所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞為攜帶有光敏基因的動物海馬星型膠質(zhì)細(xì)胞或攜帶有光敏基因的紋狀體星型膠質(zhì)細(xì)胞。
7.—種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟: 構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞； 構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系； 制備緩釋膜，所述緩釋膜為聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成的水凝膠薄膜； 將導(dǎo)電聚合物分散于所述緩釋膜中；及· 將所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系接種于所述緩釋膜上，使所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系吸附于所述緩釋膜上，得到所述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的步驟為:將攜帶有光敏基因的病毒感染星型膠質(zhì)細(xì)胞，得到光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述攜帶有光敏基因的病毒的制備方法具體為:用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因及用于特定性標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞的啟動子GFAP的融合質(zhì)粒和病毒包裝相關(guān)的混合質(zhì)粒PCMVAR8.74和pMD2.G.至293FT細(xì)胞，然后將所述293FT細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，破碎細(xì)胞膜、過柱，取上清液，得到含有攜帶光敏基因的病毒的細(xì)胞液。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系的步驟為:將所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共同接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37°C下孵育24小時。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述制備緩釋膜的步驟為:將丙烯酸溶于聚乙烯醇的水溶液中，丙烯酸現(xiàn)場聚合生成聚丙烯酸，聚丙烯酸和聚乙烯醇交聯(lián)形成水凝膠薄膜。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述將導(dǎo)電聚合物分散于所述緩釋膜中的步驟為:將所述緩釋膜放入含有導(dǎo)電聚合物單體的電沉積溶液中充分溶脹后，在恒定電壓作用下，導(dǎo)電聚合物單體聚合成導(dǎo)電聚合物，并分散于所述緩釋膜中。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞后，構(gòu)建光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)體系之前，還包括檢測所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞興奮性和檢測所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述檢測所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞興奮性步驟為采用激光刺激系統(tǒng)對所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行點刺激，并測定所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞由光所誘發(fā)的內(nèi)向光電流；所述檢測所述光敏星型膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性的步驟為采用ATP濃度的熒光素酶檢測試劑盒檢測光刺激光敏膠質(zhì)細(xì)胞釋放的ATP濃度，同時檢測細(xì)胞外液中乳酸脫氫酶的活力度。
15.一種如權(quán)利要求1~6任一項所述的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)系統(tǒng)在治療帕金森癥、癲癇、運動神經(jīng)障礙、 中風(fēng)或抑郁癥中的應(yīng)用。
【文檔編號】C08L29/04GK103585646SQ201310468737
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】屠潔, 魯藝, 楊帆, 劉運輝, 王立平 申請人:中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院