一種高純度鱘魚硫酸軟骨素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從鱘魚骨中制備高純度硫酸軟骨素的方法。利用鱘魚頭骨和脊骨為原料，經硫酸軟骨素提取專用酶與堿性蛋白酶聯(lián)合酶解新工藝，制得鱘魚硫酸軟骨素粗品。上述粗品經季銨鹽純化，乙醇沉淀，透析后即可制得硫酸軟骨素純品。本制備方法，可使鱘魚硫酸軟骨素產品純度高達95%左右，葡萄糖醛酸含量高達40%左右，工藝簡單，用酶量少，且鱘魚軟骨蛋白可以回收利用，因而極大的提高了經濟效益。
【專利說明】一種高純度鱘魚硫酸軟骨素的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從鱘魚頭骨及脊骨中提取制備高純度硫酸軟骨素的方法。
【背景技術】
[0002]鱘魚迄今已有2億多年的歷史，稱之為“水中活化石”。中國是鱘魚品種最多，分布最廣，資源最為豐富的國家之一，目前我國鱘魚養(yǎng)殖量已達到世界鱘魚養(yǎng)殖總量的80%。鱘魚全身遍布軟骨，鱘魚的頭、脊索、鰭中軟骨約占魚體10%，從鱘魚軟骨中提取的硫酸軟骨素具有獨特的醫(yī)藥和保健價值，它可以調節(jié)機體免疫、抗關節(jié)炎、抗凝血、調脂降脂、抗動脈粥樣硬化和神經元保護和修復作用；添加于食品中具有保濕、掩蓋異味、改善口感等作用，添加于化妝品中可以改善皮膚細胞代謝和保持皮膚水分等作用，因而在醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)中有廣泛的用途，市場前景巨大。
[0003]硫酸軟骨素是一種天然酸性粘多糖，通常與蛋白質結合在一起以蛋白多糖的形式存在。目前國內外主要從豬、牛、羊等畜禽結締組織，即畜禽軟骨、喉骨、鼻骨和氣管等組織中提取硫酸軟骨素。在提取工藝上，國內主要采用中性鹽法、堿法、酶法、超聲波法、乙酸抽提法等，而以鱘魚為原料提取硫酸軟骨素的方法目前還僅局限于超聲波-酶解法、堿-酶法:郝淑賢(201210483108，一種利用鱘魚軟骨制備硫酸軟骨素的方法)利用超聲波酶解方法從鱘魚軟骨中提取硫酸軟骨素的得率為31.0%，純度81.3% ;李剛(200810101962.0, 一種鱘魚軟骨素的提取、應用及其制備方法)利用堿-酶法從鱘魚魚頭及脊骨中提取產品得率達30%左右；楊賢慶(200610124066.7，一種鱘魚軟骨素提取方法)利用堿-酶法從鱘魚軟骨中提取粗產品得率為16.30%，其中氨基己糖的含量為23.66% ;這些方法在應用中硫酸軟骨素純度普遍較低，且存在有不同的缺陷，堿的使用不僅使產品顏色變深，且會造成環(huán)境污染；超聲波去除雜質較難，且產品質量和色澤達不到要求，得率較低，限制了生產上應用。酶法由于作用專一性強，產品純度高、顏色潔白，對環(huán)境污染小，因而正發(fā)展成為硫酸軟骨素行業(yè)生產工藝改進的方向。利用酶解法制備硫酸軟骨素需要保證酶的品質，在目前硫酸軟骨素提取酶市場中，常使用豬胰臟、胰酶粉、木瓜蛋白酶等不同叫法的固體酶制劑，這些酶在生產應用時用酶量大，大量生產易增加后續(xù)產品除雜的難度，而且由于其本身品質波動變化，從而難以保證產品質量穩(wěn)定。為了實現(xiàn)硫酸軟骨素生產的規(guī)?；⑹股a在連續(xù)、標準、規(guī)范的基礎上進行，采用新的酶法工藝，特別是復合酶法的改進和實施將成為今后行業(yè)的發(fā)展趨勢。
[0004]采用硫酸軟骨素提取專用酶和堿性蛋白酶可實現(xiàn)從軟骨中直接分離純化硫酸軟骨素，經三氯乙酸除雜、乙醇沉淀和季銨鹽沉淀即可得到高純度的硫酸軟骨素。這是一種新型鱘魚硫酸軟骨素酶解工藝，目前還未見報道。硫酸軟骨素提取專用酶和堿性蛋白酶本身質量穩(wěn)定，聯(lián)合使用可以減少酶用量，縮短提取時間，不需使用堿，且可以從廢液中回收蛋白，這對于提高產品質量穩(wěn)定性、提高硫酸軟骨素得率和純度、簡化生產工藝，開拓國內鱘魚硫酸軟骨素市場和進一步研究利用其生理功能具有重要意義。
【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種利用鱘魚軟骨制備高純度硫酸軟骨素的方法，具體包括以下步驟:
[0006](I)預處理:以新鮮鱘魚頭骨和脊骨為原料，將其放入鍋中水煮I小時，取出放冷后剔除頭部、脊索軟骨上殘留的肌肉、脂肪和其他結締組織，然后將其切碎后加入10倍量(v/m)95%的乙醇浸泡2小時,之后更換乙醇重復浸泡一遍。將軟骨冷凍干燥后粉碎,稱重，備用。
[0007](2)酶解:將⑴中鱘魚軟骨粉溶于25倍量(v/m) pH值為7的碳酸鈉溶液中，碳酸鈉溶液PH值用12mol/L鹽酸溶液調節(jié)。向溶液中加入0.005~0.025倍軟骨粉重量的鱘魚硫酸軟骨素提取專用酶，優(yōu)選0.015倍，控溫50~60°C，優(yōu)選55°C，機械攪拌3~5小時，優(yōu)選4小時，之后煮沸10分鐘使酶失活。待溶液冷卻后向其加入0.03~0.07倍軟骨粉重量的堿性蛋白酶，優(yōu)選0.05倍，控溫50~70°C，優(yōu)選60°C，機械攪拌I~3小時，優(yōu)選2小時，之后煮沸10分鐘使酶失活。
[0008](3)三氯乙酸除蛋白:將步驟(2)中的酶解液進行過濾，得濾液，濾液冷卻至4°C后向其中加入1/19倍濾液體積6.lmol/L三氯乙酸。靜置3小時沉淀析出，之后于4°C離心15分鐘收集濾液。
[0009](4)醇沉:向步驟(3)中的濾液中加入4倍量(v/v)乙醇，靜置過夜后于4°C離心15分鐘去除上清液，所得沉淀在80°C烘干，得到鱘魚硫酸軟骨素粗品。
[0010](5)季銨鹽沉淀:將(4)中的硫酸軟骨素粗品溶解于50倍量(m/m)水中，向其中加入0.5~1.5倍硫酸軟骨素粗品重量的氯化十六烷吡啶進行混合，優(yōu)選I倍量，并于15~25°C條件下，優(yōu)選20°C，靜置I~2小時，優(yōu)選1.5小時，之后于4°C離心15分鐘去收集沉淀
[0011](6)醇沉:將步驟 (5)中的沉淀溶解于62.5倍量(v/m)2.5mol/L的氯化鈉溶液中，向其中加入0.65~0.85倍體積乙醇，優(yōu)選0.75倍量，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6~8，優(yōu)選pH值至7，靜置120分鐘待沉淀析出，之后于4°C離心15分鐘收集沉淀。
[0012](7)膜透析:將步驟(6)中的沉淀溶解于100倍量(v/m)水中，將溶液用透析膜進行透析，其中透析膜截留分子量為7000道爾頓，透析2天。
[0013](8)真空干燥:將步驟(7)中的透析液于_50°C真空干燥過夜，即得硫酸軟骨素純品O
[0014]有益效果:
[0015](I)利用硫酸軟骨素提取專用酶與堿性蛋白酶提取鱘魚硫酸軟骨素，大大縮短了提取時間，提高了產品得率與純度，減少堿的用量，還可以從廢液中回收蛋白，從而減輕了對環(huán)境污染，增加了經濟效益，有利于工業(yè)化生產。
[0016](2)采用單因素實驗、正交實驗方法優(yōu)化酶解提取工藝，發(fā)現(xiàn)酶濃度、酶解溫度和酶解時間對硫酸軟骨素提取效果影響依次減弱，進而以硫酸軟骨素得率，葡萄糖醛酸含量，蛋白質含量為指標進行綜合考察進，優(yōu)化得出適宜的酶解條件為:硫酸軟骨素提取專用酶用量1.5%，酶解溫度55°C，酶解時間4小時，堿性蛋白酶用量5%，酶解溫度60°C，酶解時間2小時。
[0017](3)透析能將小分子蛋白質、糖、脂類物質及鹽過濾掉，進一步提高了產品純度?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0018]圖1鱘魚頭骨中提取的硫酸軟骨素純品
[0019]圖2鱘魚脊骨中提取的硫酸軟骨素純品
【具體實施方式】
[0020]以下結合實例來進一步解釋本發(fā)明，但實施案例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。
[0021]實施例1
[0022](I)預處理:以15g新鮮鱘魚頭骨原料，將其放入鍋中水煮I小時，取出放冷后剔除頭骨上殘留的肌肉、脂肪和其他結締組織，然后將其切碎后(約IOg)加入100mL95%的乙醇浸泡2小時,之后更換乙醇重復浸泡一遍。將軟骨冷凍干燥后粉碎，稱重，備用。
[0023](2)酶解:將步驟⑴中所制得6g鱘魚軟骨粉溶于150mLpH值為7的碳酸鈉溶液中，向其中加入30~150mg的鱘魚硫酸軟骨素提取專用酶，優(yōu)選90mg，控溫50~60°C，優(yōu)選55°C，機械攪拌3~5小時，優(yōu)選4小時，之后煮沸10分鐘使酶失活。待溶液冷卻后向其加入180~420mg，優(yōu)選300mg，控溫50~70°C，優(yōu)選60°C，機械攪拌I~3小時，優(yōu)選2小時，之后煮沸10分鐘使酶失活。
[0024](3)三氯乙酸除蛋白:將步驟(2)中的酶解液進行過濾，得濾液140mL，濾液冷卻至4°C后向其中加入7.37mL6.lmol/L三氯乙酸。靜置3小時沉淀析出，之后于4°C離心15分鐘，得濾液145mL。
[0025](4)醇沉:向步驟(3)中145mL濾液中加入580mL乙醇，靜置過夜后于4°C離心15分鐘得沉淀，所得沉淀在80°C烘干，得到鱘魚硫酸軟骨素粗品2.58g。
[0026](5)季銨鹽沉淀:將(4)中2.58g硫酸軟骨素粗品溶解于129mL水中，向其中加入1.29~3.87g氯化十六烷吡啶進行混合，優(yōu)選2.58g，并于15~25°C下，優(yōu)選20°C，靜置I~2小時，優(yōu)選1.5小時，之后于4°C離心15分鐘得沉淀2g。
[0027](6)醇沉:將步驟(5)中的2g沉淀溶解于125mL2.5mol/L的氯化鈉溶液中，向其中加入81.25~106.25mL乙醇,優(yōu)選93.75mL。用0.lmol/1氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6~8，優(yōu)選溶液pH值調至7，靜置120分鐘待沉淀析出，之后于4°C離心15分鐘得沉淀1.56g。
[0028] (7)膜透析:將步驟(6)中的1.56g沉淀溶解于156mL水中，將溶液用透析袋進行透析，其中透析袋截留分子量為7000道爾頓，透析2天。
[0029](8)真空干燥:將步驟(7)中的透析液于-50°C溫度下真空干燥過夜，即得1.17g硫酸軟骨素成品。樣品檢測分析結果見表1。
[0030]實施例2
[0031](I)預處理:以IOg新鮮鱘魚脊骨原料，將其放入鍋中水煮I小時，取出放冷后剔除脊骨上殘留的肌肉、脂肪和其他結締組織，然后將其切碎后(約Sg)加入80mL95%的乙醇浸泡2小時，之后更換乙醇重復浸泡一遍。將軟骨冷凍干燥后粉碎，稱重，備用。
[0032](2)酶解:將(I)中5g鱘魚軟骨粉溶于125mLpH值為7的碳酸鈉溶液，加入25~125mg鱘魚硫酸軟骨素提取專用酶，優(yōu)選75mg，控溫50~70°C，優(yōu)選60°C，機械攪拌3~5小時，優(yōu)選4小時，之后煮沸10分鐘使酶失活。待溶液冷卻后向其加入150~350mg堿性蛋白酶，優(yōu)選250mg，控溫50~70°C，優(yōu)選60°C，機械攪拌I~3小時，優(yōu)選2小時，之后煮沸10分鐘使酶失活。
[0033](3)三氯乙酸除蛋白:將步驟(2)中的酶解液進行過濾，得濾液116mL，濾液冷卻至4°C后向其中加入6.llmL6.lmol/L三氯乙酸。靜置3小時沉淀析出，之后于4°C離心15分鐘，得濾液120mL。
[0034](4)醇沉:向步驟(3)中120mL濾液中加入480mL乙醇，靜置小時后于4°C離心15分鐘得沉淀4.32g，所得沉淀在80°C烘干，得到鱘魚硫酸軟骨素粗品2.3g。
[0035](5)季銨鹽沉淀:將(4)中的2.3g硫酸軟骨素粗品溶解于115mL水中，向其中加入
1.15~3.45mg氯化十六烷吡啶進行混合，優(yōu)選2.3mg，并于15~25°C下，優(yōu)選20°C，靜置1~2小時，優(yōu)選1.5小時，之后于4°C離心15分鐘得沉淀1.8g。
[0036](6)醇沉:將步驟(5)中的1.8g沉淀溶解于112.5mL2.5mol/L的氯化鈉溶液中，向其中加入72.13~95.63mL乙醇，優(yōu)選84.38mL,用0.lmol/1氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6~8，優(yōu)選pH值調至7，靜置120分鐘待沉淀析出，之后于4°C離心15分鐘得沉淀1.4g。
[0037](7)膜透析:將步驟(6)中的1.4g沉淀溶解于140mL水中，將溶液用透析袋進行透析，其中截留分子量為7000道爾頓，透析2天。
[0038](8)真空干燥:將步驟(7)中的透析液于_50°C溫度下真空干燥過夜，即得1.1g硫酸軟骨素成品。樣品檢測分析結果見表2。
[0039]將上述提取工藝制得的硫酸軟骨素進行分析，結果如下:
[0040]表1實施例1樣品檢測結果分析
【權利要求】
1.一種高純度鱘魚硫酸軟骨素的制備方法，其特征是，包括以下步驟: (1)預處理:以新鮮鱘魚頭骨和脊骨為原料，將其放入鍋中水煮I小時，取出放冷后剔除頭部、脊索軟骨上殘留的肌肉、脂肪和其他結締組織，用10倍量(v/m) 95%乙醇浸泡2小時，之后更換乙醇重復浸泡一遍，冷凍干燥后粉碎備用。 (2)酶解:將步驟(I)中所得鱘魚軟骨粉溶于25倍量(v/m)pH值為7的氯化鈉溶液中，碳酸鈉溶液PH值用12mol/L鹽酸溶液調節(jié)。向溶液中加入硫酸軟骨素提取專用酶進行酶解，酶解完后煮沸10分鐘使酶失活，之后加入堿性蛋白酶進行酶解，酶解完后煮沸10分鐘使酶失活，過濾收集酶解液。 (3)三氯乙酸除蛋白:將步驟(2)中的酶解液進行冷卻，冷卻至4°C后向其中加入1/19倍量(v/v)6.lmol/L三氯乙酸。靜置3小時沉淀析出，之后于4°C離心15分鐘收集濾液。 (4)醇沉、干燥:向步驟(3)中的濾液中加入4倍量(v/v)乙醇，于4°C離心15分鐘收集沉淀，將沉淀在80°C烘干后得到鱘魚硫酸軟骨素粗品。 (5)季銨鹽沉淀:將(4)中的硫酸軟骨素粗品溶解于50倍量(m/m)水中，向其中加入氯化十六烷吡啶進行混合，于4°C離心15分鐘收集沉淀。 (6)醇沉:將步驟(5)中的沉淀溶解于62.5倍量(v/m) 2.5mol/L的氯化鈉溶液中，向其中加入乙醇，于4°C離心15分鐘收集沉淀。 (7)膜透析、干燥:將步驟(6)中的沉淀溶解于100倍量(v/m)水中，將溶液用截留分子量為7000Da透析袋進行透析。將透析液于_50°C真空干燥后即得硫酸軟骨素純品。
2.根據(jù)權利要求1中所述制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于步驟(2)中所述添加量為0.005~0.025倍，優(yōu)選為0.015倍，酶解溫度為50~60°C，優(yōu)選為55°C，酶解時間為3~5小時，優(yōu)選為4小時。
3.根據(jù)權利要求1中所述制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于步驟(2)中所述堿性蛋白酶添加量為軟骨粉重量的0.03~0.07倍，優(yōu)選為0.05倍，酶解溫度為50~70°C，優(yōu)選為60°C，酶解時間為I~3小時，優(yōu)選為2小時。
4.根據(jù)權利要求1中所述制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于步驟(5)中所述添加量為0.5~1.5倍，優(yōu)選為I倍，作用溫度為15~25°C，優(yōu)選為20°C，作用時間為I~2小時，優(yōu)選為1.5小時。
5.根據(jù)權利要求1中所述制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于步驟(6)中所述乙醇添加量為氯化鈉溶液體積的0.65~0.85倍，優(yōu)選0.75倍，添加乙醇后用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)溶液PH值到6~8，優(yōu)選pH值為7。
【文檔編號】C08B37/08GK103467621SQ201310428351
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權日:2013年9月18日
【發(fā)明者】李平蘭, 桂萌, 宋居易, 劉麗莎, 章志超 申請人:中國農業(yè)大學