鑒定細胞中的多個表位的方法交叉引用本申請要求以下共同未決的專利申請的優(yōu)先權(quán)：提交于2011年1月31日的序列號為61/437,854的申請；其通過引用并入本文。發(fā)明背景雖然人體內(nèi)的所有細胞都含有相同的遺傳物質(zhì)，但是相同的基因并非在所有這些細胞中都是活性的?；鶊F表達模式的改變可對生物功能產(chǎn)生深遠的影響。此外，理解基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))、其變體以及相互作用配偶體的動力學(xué)和調(diào)控在理解例如遺傳疾病/和環(huán)境誘導(dǎo)的疾病背后的機制或藥物介導(dǎo)治療的影響方面是必要的。這種理解有可能成為進一步臨床和診斷分析的潛在基礎(chǔ)。因此，鑒定和量化細胞內(nèi)基因和/或其產(chǎn)物的表達和調(diào)控可有助于新的治療和診斷靶標的發(fā)現(xiàn)。對這些研究來說至關(guān)重要的是，定性地確定基因表達和整個蛋白質(zhì)的特定變體(例如，剪接變體、點突變、翻譯后修飾的形式和環(huán)境/治療誘導(dǎo)的修飾)的能力以及觀察它們的定量調(diào)節(jié)的能力。而且，對細胞內(nèi)不只一個而是多個靶分子進行這些分析變得日益重要。迄今為止，可用的方法仍然需要大量的生物樣品或?qū)⒉惶峁┘毎禺愋缘男畔?。此外，由于蛋白質(zhì)樣品中固有的額外挑戰(zhàn)，所以只有有限的多路復(fù)用蛋白質(zhì)測定技術(shù)的方法。因此，對于精確且靈敏地檢測、鑒定和量化復(fù)雜細胞群體的每個細胞中的靶分子并保留有關(guān)該靶分子的細胞特異性信息存在需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明總的涉及樣品中靶分子的檢測、鑒定和量化的領(lǐng)域。本發(fā)明部分地涉及復(fù)雜細胞群體的單細胞中單獨(individual)靶分子的檢測、鑒定和量化，同時保留有關(guān)該靶分子的細胞特異性信息。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定在多個細胞中是否存在多個靶標的方法，該方法包括：將多個標簽(tag)與靶標結(jié)合，其中標簽包含代碼(code)，該代碼代表a)靶標身份和b)標簽結(jié)合在其中的細胞的身份。在一些實施方案中，單獨的細胞的分開或分離對于結(jié)合步驟不是必要的。在一些實施方案中，標簽包含彼此直接或間接地相關(guān)聯(lián)(例如，通過共價結(jié)合或通過親和關(guān)聯(lián))的結(jié)構(gòu)單元。在一些實施方案中，標簽通過結(jié)構(gòu)單元在適當(dāng)?shù)奈恢镁酆隙纬伞Ｔ谝恍嵤┓桨钢?，在一個步驟中加入多個結(jié)構(gòu)單元。在一些實施方案中，在每個步驟中加入一個結(jié)構(gòu)單元。在一些實施方案中，細胞是活的。在一些實施方案中，細胞是裂解的或固定的。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定與靶標相關(guān)聯(lián)的單細胞的方法，該方法包括：將標簽與靶標結(jié)合，其中標簽包含代表a)靶標和b)單細胞的代碼；其中在結(jié)合期間不從細胞群體中分離單細胞，并且其中代表單細胞的代碼在結(jié)合之前是未知的。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定與靶標相關(guān)聯(lián)的單細胞的方法，該方法包括：將標簽與靶標結(jié)合，其中標簽包含代表a)靶標和b)單細胞的代碼；其中在結(jié)合期間從細胞群體中分離單細胞，并且其中代表單細胞的代碼在結(jié)合之前是未知的。在一些實施方案中，本發(fā)明進一步包括檢測所述代碼，其中單獨的細胞的分開或分離對于檢測步驟不是必要的。在一些實施方案中，每個靶標是蛋白質(zhì)或核酸。在一些實施方案中，標簽是核酸或多肽。在一些實施方案中，標簽是包含可破譯代碼(decipherablecode)的一系列單體亞單位。在一些實施方案中，標簽是編碼的分子組分，其可被解碼。在一些實施方案中，標簽包含可被解碼以確定標簽的性質(zhì)的部分的組合。在一些實施方案中，標簽包含UBA。在一些實施方案中，UBA對所述靶標中的一種是特異性的。在一些實施方案中，標簽包含UBA。在一些實施方案中，UBA包含抗體。在一些實施方案中，標簽包含ESB。在一些實施方案中，ESB包含共同連接體(CL)。在一些實施方案中，ESB編碼靶標身份。在一些實施方案中，ESB包含核酸。在一些實施方案中，標簽包含APS。在一些實施方案中，APS是可檢測的，是可檢測地不同的編碼單元。在一些實施方案中，在結(jié)合步驟期間，在連續(xù)數(shù)輪分配混合合成(splitpoolsynthesis)過程中將多個APS以有序的方式添加至標簽上。在一些實施方案中，標簽包含至少10個APS。在一些實施方案中，APS包含核酸。在一些實施方案中，標簽包含通過連接作用(ligation)而連接的多個APS、一個ESB和一個UBA。在一些實施方案中，多個APS、所述ESB和/或所述UBA能夠通過點擊化學(xué)(Clickchemistry)而連接。在一些實施方案中，APS或ESB包含擴增引物結(jié)合區(qū)。在一些實施方案中，UBA、ESB或APS是可模板化的。在一些實施方案中，UBA、ESB或APS具有不同的可辨別成分(GPN：是指一部分代碼可以是核酸，另一部分可以是多肽，另一部分可以是小分子，等等)。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及組合物，其包含：a)第一靶分子，b)對該第一靶分子特異性的第一獨特結(jié)合劑(UBA)，c)第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)，和d)多個有序的可測定聚合物亞單位(APS)，其中APS的順序是可檢測的。在一些實施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及包含顆粒群體的組合物，每個顆粒包含至少第一靶分子，其中該第一靶分子關(guān)聯(lián)于：a)對第一靶分子特異性的第一獨特結(jié)合劑(UBA)，b)第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)，和c)第一多個有序的可測定第一聚合物亞單位(APS)，其中與該群體中第一顆粒的第一靶分子相關(guān)聯(lián)的多個有序APS可檢測地不同于與該群體中第二顆粒的第一靶分子相關(guān)聯(lián)的多個有序APS。在一些實施方案中，多個有序APS包含2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個APS。在一些實施方案中，多個有序APS包含多于20個APS。在一些實施方案中，APS是可模板化的。在一些實施方案中，至少一個離散顆粒選自細胞、脂質(zhì)體、細胞器、膠束、小滴和珠。在一些實施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。在一些實施方案中，第一ESB包含第一共同連接體(CL)。在一些實施方案中，所述第一靶分子直接與所述第一UBA結(jié)合，并且所述第一ESB直接與所述第一UBA結(jié)合。在一些實施方案中，多個有序APS是通過在單獨的輪次中逐步添加APS而形成的。在一些實施方案中，每輪添加的APS與第一復(fù)合物連接。在一些實施方案中，連接按輪次的順序進行。在一些實施方案中，連接通過結(jié)合親和力進行。在一些實施方案中，使用化學(xué)方法進行APS、ESB或UBA的連接。在一些實施方案中，化學(xué)方法包含點擊化學(xué)。在一些實施方案中，連接在CuI的存在下進行。在一些實施方案中，UBA、APS或ESB包含核酸。一些實施方案還包含第一連接寡核苷酸，該第一連接寡核苷酸包含與選自UBA、APS和ESB的兩個組分互補的第一和第二互補區(qū)。在一些實施方案中，使用包含與選自UBA、APS和ESB的兩個組分互補的第一和第二互補區(qū)的連接寡核苷酸來連接UBA、APS或ESB。一些實施方案還包含第二連接寡核苷酸，該第二連接寡核苷酸包含與選自UBA、APS和ESB的兩個組分互補的第三和第四互補區(qū)。在一些實施方案中，使用包含與選自UBA、APS和ESB的兩個組分互補的第三和第四互補區(qū)的連接寡核苷酸來連接UBA、APS或ESB。在一些實施方案中，第二和第四互補區(qū)是相同的。在一些實施方案中，第二和第四互補區(qū)是相同的。在一些實施方案中，在多個APS中的兩個APS之間共有第一或第二互補區(qū)。在一些實施方案中，所述連接通過連接作用進行。在一些實施方案中，連接寡核苷酸包含編碼APS或ESB的起源的子代碼。在一些實施方案中，APS具有編碼APS的起源的子代碼。在一些實施方案中，ESB具有編碼ESB的起源的子代碼。在一些實施方案中，單獨APS、ESB或連接寡核苷酸分子包含獨特的計數(shù)器標簽(countertag)。在一些實施方案中，獨特的計數(shù)器標簽是可檢測的。在一些實施方案中，ESB共價連接至連接寡核苷酸。在一些實施方案中，APS或ESB包含擴增引物結(jié)合區(qū)。在一些實施方案中APS和ESB在連接時能夠編碼次級產(chǎn)物。在一些實施方案中，次級產(chǎn)物是RNA或肽。在一些實施方案中，APS和ESB在連接時包含聚合酶起始位點。在一些實施方案中，肽包含親和標簽。在一些實施方案中，親和標簽是His-標簽。在一些實施方案中，UBA、ESB或APS是可模板化的。在一些實施方案中，組合物進一步包含探針。在一些實施方案中，探針連接至表面。在一些實施方案中，表面包含陣列。在一些實施方案中，表面包含珠。在一些實施方案中，UBA選自抗體、肽、適體、類肽(peptoid)和核酸。在一些實施方案中，ESB選自核酸、珠和化學(xué)亞單位。在一些實施方案中，所述APS包含核酸、小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用細胞起源條碼標記細胞群體中細胞的靶分子的試劑盒，其包含a)n組m個可測定聚合物亞單位(APS)，每個APS包含不同的信息包；其中該信息包能夠以有序的方式連接；b)靶分子特異性的獨特結(jié)合劑(UBA)。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用細胞起源條碼標記細胞群體中細胞的靶分子的試劑盒，其包含a)n組m個可測定聚合物亞單位(APS)，每個APS包含不同的信息包；其中該信息包能夠以有序的方式連接；b)多個靶分子特異性的獨特結(jié)合劑(UBA)，每個UBA連接有UBA特異性的表位特異性條碼(ESB)。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用細胞起源條碼標記細胞群體中細胞的靶分子的試劑盒，其包含a)n組m個可測定聚合物亞單位(APS)，每個APS包含不同的信息包；其中該信息包能夠以有序的方式連接；b)多個靶分子特異性的獨特結(jié)合劑(UBA)；c)多個UBA特異性的表位特異性條碼(ESB)，其中每個ESB能夠與指定的UBA連接。在一些實施方案中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方案中，m為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施方案中，n大于10。在一些實施方案中，m大于20。在一些實施方案中，第一ESB包含第一共同連接體(CL)。在一些實施方案中，所述ESB能夠直接地與所述UBA結(jié)合。在一些實施方案中，所述UBA能夠直接地與靶分子結(jié)合。在一些實施方案中，可測定聚合物亞單位(APS)組中的至少兩個是相同的。在一些實施方案中，第一組中的APS可與第二組中的APS連接。在一些實施方案中，第一組中的APS進一步可與第二組中的APS以有序的方式連接。在一些實施方案中，APS、ESB或UBA能夠使用化學(xué)方法連接。在一些實施方案中，化學(xué)方法包含點擊化學(xué)。在一些實施方案中，CuI的存在是連接所必需的。在一些實施方案中，試劑盒的組分可通過親和結(jié)合進行組裝。在一些實施方案中，UBA、APS或ESB包含核酸。在一些實施方案中，試劑盒還包含第一連接寡核苷酸，該第一連接寡核苷酸包含與選自UBA、APS和ESB的兩個組分互補的第一和第二互補區(qū)。在一些實施方案中，試劑盒還包含第二連接寡核苷酸，該第二連接寡核苷酸包含與選自UBA、APS和ESB的兩個組分互補的第三和第四互補區(qū)。在一些實施方案中，第一和第三互補區(qū)是相同的。在一些實施方案中，第二和第四互補區(qū)是相同的。在一些實施方案中，APS、ESB或UBA能夠通過連接作用而連接。在一些實施方案中，連接寡核苷酸包含編碼APS或ESB的原始組(originalset)的子代碼。在一些實施方案中，APS具有編碼APS的起源群體的子代碼。在一些實施方案中，ESB具有編碼ESB的起源群體的子代碼。在一些實施方案中，單獨APS、ESB或連接寡核苷酸包含獨特的計數(shù)器標簽。在一些實施方案中，獨特的計數(shù)器標簽是可檢測的。在一些實施方案中，ESB與連接寡核苷酸共價連接。在一些實施方案中，APS或ESB包含擴增引物結(jié)合區(qū)。在一些實施方案中，APS和ESB在連接時能夠編碼次級產(chǎn)物。在一些實施方案中，次級產(chǎn)物是RNA或肽。在一些實施方案中，APS和ESB在連接時包含聚合酶起始位點。在一些實施方案中，肽包含親和標簽。在一些實施方案中，親和標簽是His-標簽。在一些實施方案中，UBA、ESB或APS是可模板化的。在一些實施方案中，試劑盒進一步包含探針。在一些實施方案中，探針連接至表面。在一些實施方案中，表面包含陣列。在一些實施方案中，表面包含珠。在一些實施方案中，多個UBA包含2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、50個、100個、200個、300個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個或多于1000個UBA。在一些實施方案中，多個UBA包含最多達2000個UBA。在一些實施方案中，UBA選自抗體、肽、適體、類肽和核酸。在一些實施方案中，ESB選自核酸、珠和化學(xué)亞單位。在一些實施方案中，所述APS包含核酸、小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定共有共同顆粒起源的靶分子的方法，其包括用第一起源條碼標記x個顆粒的群體中第一顆粒的第一多個靶標；以及用第二起源條碼標記x個顆粒的群體中第二顆粒的第二多個靶標；其中每個起源條碼包含一組n個可測定聚合物亞單位(APS)；其中第一和第二組APS中的n個APS中的每一個選自m個不同的APS；并且其中第一和第二起源條碼彼此可檢測地不同，具有c=1-[(1–1/x)^(mn)]的確定性。在一些實施方案中，x大于1,000,000。在一些實施方案中，c大于99.9%。在一些實施方案中，c大于99.99%。在一些實施方案中，c大于99.999%。在一些實施方案中，c大于99.9999%。在一些實施方案中，c大于99.99999%。在一些實施方案中，n為2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方案中，m為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施方案中，n大于10。在一些實施方案中，m大于20。在一些實施方案中，至少一個離散顆粒選自細胞、脂質(zhì)體、細胞器、膠束、小滴和珠。在一些實施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。在一些實施方案中，至少兩個含有m個不同APS的組是相同的。在一些實施方案中，在單獨的輪次中添加n個APS。在一些實施方案中，將單獨輪次的APS連接起來。在一些實施方案中，連接按輪次的順序進行。在一些實施方案中，以所期望的確定性水平基于給定的細胞數(shù)x選擇合適的n和/或m。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及給顆粒群體中的顆粒的組分賦予顆粒特異性代碼的方法，該方法包括：將第一有序組的可測定聚合物亞單位(APS)與顆粒群體的第一顆粒的第一組分連接，其中APS的順序是可檢測的。在一些實施方案中，該方法還包括檢測與第一組分連接的第一有序組的APS，從而確定第一組分的顆粒起源。在一些實施方案中，該方法還包括將第二有序組的可測定聚合物亞單位(APS)與顆粒群體的第一顆粒的第二組分連接，其中APS的順序是可檢測的。在一些實施方案中，該方法還包括檢測與第二組分連接的第二有序組的APS，從而確定第二組分的顆粒起源。在一些實施方案中，與第一顆粒的第一和第二組分連接的第一和第二有序組的APS是相同的。在一些實施方案中，該方法還包括將第三有序組的可測定聚合物亞單位(APS)與顆粒群體的第二顆粒的第一組分連接，其中APS的順序是可檢測的。在一些實施方案中，與第一顆粒的第一組分連接的第一有序組的APS不同于與第二顆粒的第一組分連接的第三有序組的可測定聚合物亞單位。在一些實施方案中，該方法還包括將組分特異性的表位特異性條碼(ESB)與第一組分連接。在一些實施方案中，該方法還包括將組分特異性ESB與第二組分連接。在一些實施方案中，至少顆粒選自細胞、脂質(zhì)體、細胞器、膠束、小滴和珠。在一些實施方案中，所述至少一個靶分子直接與所述第一UBA結(jié)合，并且所述ESB直接與所述UBA結(jié)合。在一些實施方案中，可測定聚合物亞單位(APS)組中的至少兩個是相同的。在一些實施方案中，來自有序組的APS的每個APS與第一復(fù)合物連接。在一些實施方案中，連接按輪次的順序進行。在一些實施方案中，UBA、ESB或APS編碼次級產(chǎn)物。在一些實施方案中，次級產(chǎn)物是RNA或肽。在一些實施方案中，UBA、ESB或APS是可模板化的。在一些實施方案中，ESB還包含獨特的計數(shù)器標簽。在一些實施方案中，使用計數(shù)器標簽來估計分子的靶分子的量。在一些實施方案中，APS還包含輪次特異性子代碼。在一些實施方案中，檢測還包括確定來自指定輪次的APS的存在。在一些實施方案中，檢測是數(shù)字化的。在一些實施方案中，檢測是間接的。在一些實施方案中，檢測包括質(zhì)譜法。在一些實施方案中，檢測包括核酸測序。在一些實施方案中，檢測包括肽測序。在一些實施方案中，檢測包括質(zhì)量凝膠電泳。在一些實施方案中，檢測包括HPLC或其他色譜分離。在一些實施方案中，檢測包括檢測與一個或多個單獨APS相關(guān)的一個或多個信號。在一些實施方案中，信號是有序的。在一些實施方案中，檢測包括使用一個或多個探針。在一些實施方案中，探針連接至表面。在一些實施方案中，表面包含陣列。在一些實施方案中，表面包含珠。在一些實施方案中，檢測包括分離。在一些實施方案中，分離是多維的。在一些實施方案中，分離將第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)與第二可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)拆分(resolve)。在一些實施方案中，檢測3個、4個、5個、10個、20個、30個、50個、100個、200個、300個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個或多于1000個不同的靶分子。在一些實施方案中，檢測最多達2000個不同的靶分子。在一些實施方案中，UBA選自抗體、肽、適體、類肽和核酸。在一些實施方案中，ESB選自核酸、珠和化學(xué)亞單位。在一些實施方案中，所述APS包含核酸、小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。在一些實施方案中，APS通過連接作用或通過經(jīng)由聚合的延伸而連接。在一些實施方案中，細胞起源條碼(COB)由來自有序組APS的APS產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述多個復(fù)合物中的每個COB具有將其與所述細胞群體中的其他COB區(qū)別開的可檢測信號或序列。在一些實施方案中，采用化學(xué)方法連接APS、ESB或UBA。在一些實施方案中，化學(xué)方法包含點擊化學(xué)。在一些實施方案中，連接在CuI的存在下進行。在一些實施方案中，UBA、APS或ESB包含核酸。在一些實施方案中，使用含有與待連接的兩個組分互補的第一和第二互補區(qū)的連接寡核苷酸進行UBA、APS或ESB的連接。在一些實施方案中，在APS群體中的APS之間共有第一或第二互補區(qū)。在一些實施方案中，對于兩個不同的輪次特異性APS組，第一或第二互補區(qū)是不同的。在一些實施方案中，該方法進一步包括連接。在一些實施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。在一些實施方案中，第一ESB包含第一共同連接體(CL)。在一些實施方案中，第一ESB包含第一共同連接體(CL)。在一些實施方案中，單獨APS、ESB或連接寡核苷酸分子包含獨特的計數(shù)器標簽。在一些實施方案中，檢測包括檢測獨特的計數(shù)器標簽。在一些實施方案中，確定與特異性ESB相關(guān)聯(lián)的獨特計數(shù)器標簽的數(shù)目。在一些實施方案中，檢測到的獨特計數(shù)器標簽的數(shù)目與特異性ESB的初始量有關(guān)。在一些實施方案中，ESB與連接寡核苷酸共價連接。在一些實施方案中，APS或ESB包含擴增引物結(jié)合區(qū)。在一些實施方案中，COB編碼肽序列。在一些實施方案中，COB包含聚合酶起始位點。在一些實施方案中，肽包含親和標簽。在一些實施方案中，親和標簽是His-標簽。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測源自多個離散顆粒的多種特性的方法，該方法包括：a)提供：i)包含至少第一靶分子的顆粒群體；ii)對第一靶分子特異性的第一獨特結(jié)合劑(UBA)；iii)第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)；iv)多個輪次特異性的可測定聚合物亞單位(APS)組，每個組含有多個彼此可檢測地不同的APS；b)形成包含所述至少第一靶分子、所述第一UBA探針和所述第一ESB的至少第一復(fù)合物；c)進行n輪分配混合合成，每輪包括：i)將顆粒群體分至m個反應(yīng)體積中；ii)使一個或多個反應(yīng)體積與來自該輪特異性的APS組的APS接觸；iii)合并兩個或更多個反應(yīng)體積；d)檢測來自顆粒群體的至少一個顆粒的多種特性；其中至少一種特性與關(guān)聯(lián)于該顆粒的靶分子的量或身份相關(guān)。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測源自多個離散顆粒的多種特性的方法，該方法包括：a)提供：i)包含至少第一靶分子的顆粒群體；ii)對第一靶分子特異性的第一獨特結(jié)合劑(UBA)；iii)第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)；以及iv)多個輪次特異性的可測定聚合物亞單位(APS)組，每個組含有多個彼此可檢測地不同的APS；b)形成包含所述至少第一靶分子、所述第一UBA探針和所述第一ESB的至少第一復(fù)合物；c)進行n輪分配混合合成，每輪包括：i)將顆粒群分至m個反應(yīng)體積中；ii)使一個或多個反應(yīng)體積與來自該輪特異性的APS組的APS接觸；以及iii)合并兩個或更多個反應(yīng)體積；d)進行包括步驟c)i)和c)ii)的另一輪分配混合合成；e)檢測來自顆粒群體的至少一個顆粒的多種特性；其中至少一種特性與關(guān)聯(lián)于該顆粒的靶分子的量或身份有關(guān)。在一些實施方案中，將分配混合方法替換為例如在微孔或微流體裝置中的顆粒的分離。在一些實施方案中，用細胞起源條碼標記分離的細胞。在一些實施方案中，通過逐步加入結(jié)構(gòu)單元而在合適的位置構(gòu)建細胞起源條碼。在一些實施方案中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施方案中，n大于20。在一些實施方案中，至少兩輪之間的m是不同的。在一些實施方案中，m為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施方案中，m大于20。在一些實施方案中，至少一個離散顆粒選自細胞、脂質(zhì)體、細胞器、膠束、小滴和珠。在一些實施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。在一些實施方案中，第一ESB包含第一共同連接體(CL)。在一些實施方案中，所述至少一個靶分子直接與所述第一UBA結(jié)合，并且所述ESB直接與所述UBA結(jié)合。在一些實施方案中，可測定聚合物亞單位(APS)組中的至少兩個是相同的。在一些實施方案中，每輪添加的APS連接至第一復(fù)合物。在一些實施方案中，該連接按輪次的順序進行。在一些實施方案中，UBA、ESB或APS編碼次級產(chǎn)物。在一些實施方案中，次級產(chǎn)物是RNA或肽。在一些實施方案中，UBA、ESB或APS是可模板化的。在一些實施方案中，ESB進一步包含獨特的計數(shù)器標簽。在一些實施方案中，使用計數(shù)器標簽來估計分子的靶分子的量。在一些實施方案中，APS進一步包含輪次特異性子代碼。在一些實施方案中，檢測還包括確定來自指定輪次的APS的存在。在一些實施方案中，檢測是數(shù)字化的。在一些實施方案中，檢測是間接的。在一些實施方案中，檢測包括質(zhì)譜法。在一些實施方案中，檢測包括核酸測序。在一些實施方案中，檢測包括肽測序。在一些實施方案中，檢測包括檢測與一個或多個單獨APS相關(guān)的一個或多個信號。在一些實施方案中，信號是有序的。在一些實施方案中，檢測包括使用一個或多個探針。在一些實施方案中，探針連接至表面。在一些實施方案中，表面包含陣列。在一些實施方案中，表面包含珠。在一些實施方案中，檢測包括分離。在一些實施方案中，分離是多維的。在一些實施方案中，分離將第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)與第二可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)拆分。在一些實施方案中，檢測3個、4個、5個、10個、20個、30個、50個、100個、200個、300個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個或多于1000個不同的靶分子。在一些實施方案中，檢測最多達2000個不同的靶分子。在一些實施方案中，UBA選自抗體、肽、適體、類肽和核酸。在一些實施方案中，ESB選自核酸、珠和化學(xué)亞單位。在一些實施方案中，所述APS包含核酸、小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。在一些實施方案中，APS通過連接作用或通過經(jīng)由聚合的延伸而連接。在一些實施方案中，細胞起源條碼(COB)由輪次特異性APS組的APS產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述多個復(fù)合物中的每個COB具有將其與所述細胞群體中的其他COB區(qū)別開的可檢測信號或序列。在一些實施方案中，采用化學(xué)方法來連接APS、ESB或UBA。在一些實施方案中，化學(xué)方法包含點擊化學(xué)。在一些實施方案中，該連接在CuI的存在下進行。在一些實施方案中，UBA、APS或ESB包含核酸。在一些實施方案中，使用包含與待連接的兩個組分互補的第一和第二互補區(qū)的連接寡核苷酸進行UBA、APS或ESB的連接。在一些實施方案中，在APS群體中的APS之間共有第一或第二互補區(qū)。在一些實施方案中，對于兩個不同的輪次特異性APS組，第一或第二互補區(qū)是不同的。一些實施方案進一步包括連接作用。在一些實施方案中，連接寡核苷酸包含編碼APS或ESB的起源群體的子代碼。在一些實施方案中，APS具有編碼輪次特異性APS組的子代碼。在一些實施方案中，ESB具有編碼ESB的原始存在的子代碼。在一些實施方案中，單獨APS、ESB或連接寡核苷酸分子包含獨特的計數(shù)器標簽。在一些實施方案中，檢測包括檢測獨特的計數(shù)器標簽。在一些實施方案中，確定與特異性ESB相關(guān)聯(lián)的獨特計數(shù)器標簽的數(shù)目。在一些實施方案中，檢測到的獨特計數(shù)器標簽的數(shù)目與特異性ESB的初始量有關(guān)。在一些實施方案中，ESB與連接寡核苷酸共價連接。在一些實施方案中，APS或ESB包含擴增引物結(jié)合區(qū)。在一些實施方案中，COB編碼肽序列。在一些實施方案中，COB包含聚合酶起始位點。在一些實施方案中，肽包含親和標簽。在一些實施方案中，親和標簽是His-標簽。在一些實施方案中，通過最近的分配而創(chuàng)建的每個反應(yīng)體積接收來自APS組的不同APS。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的至少一個靶分子的方法，其包括以下步驟：(a)提供：(i)可能包含至少一個靶分子的細胞群體，(ii)對第一靶分子特異性的第一UBA，(iii)對第一UBA的區(qū)域具有特異性的第一表位特異性條碼ESB，其中該ESB包含第一共同連接體部分，和(iv)COB群體，其中該COB群體包含第二共同連接體部分，其中第二連接體部分與第一ESB中的第一共同連接體部分是互補的；(b)形成包含至少一個靶分子、第一UBA探針和第一ESB的至少第一復(fù)合物，其中至少一個靶分子與第一UBA結(jié)合，并且ESB與UBA結(jié)合；(c)加入COB群體，其中由至少一個靶分子、第一UBA探針、第一ESB和第一COB形成第二復(fù)合物，并且其中來自第一COB的第二共同連接體部分與來自第一ESB的第一連接體部分結(jié)合，并且其中來自COB群體的COB與來自細胞群體的細胞相關(guān)；以及(d)檢測第二復(fù)合物或第三復(fù)合物的至少一部分。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的至少一個靶分子的方法，其包括以下步驟：(a)提供：(i)可能包含至少一個靶分子的細胞群體，(ii)對第一靶分子特異性的第一獨特結(jié)合劑(UBA)，(iii)對第一UBA的區(qū)域具有特異性的第一表位特異性條碼(ESB)，其中該ESB包含第一共同連接體部分，和(iv)可測定聚合物亞單位(APS)群體，其中該APS包含第二共同連接體部分和第三共同連接體部分，其中第二連接體部分與第一ESB中的第一共同連接體部分是互補的；(b)形成包含至少一個靶分子、第一UBA探針和第一ESB的至少第一復(fù)合物，其中至少一個靶分子與第一UBA結(jié)合，并且ESB與UBA結(jié)合；(c)將該群體分成兩個或更多個樣品；(d)將來自APS群體的APS以每個樣品一個APS加入來自步驟(c)的兩個樣品或更多個樣品中，其中由至少一個靶分子、第一UBA探針、第一ESB和第一APS形成第二復(fù)合物，并且其中來自第一APS的第二共同連接體部分與來自第一ESB的第一連接體部分結(jié)合；(e)將來自步驟(c)的兩個或更多個樣品合并成一個樣品；(f)將來自步驟(e)的樣品分成兩個或更多個樣品；(g)將來自APS群體的APS以每個樣品一個APS加入來自步驟(e)的兩個或更多個樣品中，其中由至少一個靶分子、第一UBA探針、第一ESB、第一APS和第二APS形成第三復(fù)合物，其中來自第二APS的第二共同連接體部分與來自第一APS的第三連接體部分結(jié)合，并且其中第一APS和第二APS形成細胞起源條碼(COB)；以及(c)檢測第三復(fù)合物或第三復(fù)合物的至少一部分。在一些實施方案中，該方法還包括重復(fù)步驟(e)至(g)。在一些實施方案中，該方法進一步包括通過在步驟(b)中形成多個復(fù)合物來檢測多個靶分子，每個復(fù)合物包含(i)至少一個靶分子、(ii)第一UBA和(iii)對第一UBA的區(qū)域具有特異性的第一表位特異性條碼(ESB)，其中該ESB包含第一共同連接體部分，其中至少一個靶分子與第一UBA結(jié)合，并且ESB與UBA結(jié)合。在一些實施方案中，多個復(fù)合物中的每個COB具有將其與細胞群體中的其他COB區(qū)別開的可檢測信號。在一些實施方案中，通過測序或質(zhì)譜法檢測復(fù)合物。在一些實施方案中，通過包括對第三復(fù)合物的一個或多個分子的存在進行單獨計數(shù)的方法來檢測第三復(fù)合物，其中第三復(fù)合物的一個或多個分子的存在是細胞中靶分子濃度的指示。在一些實施方案中，單獨檢測還包括檢測數(shù)字信號。在一些實施方案中，檢測3個、4個、5個、10個、20個、30個、50個、100個、200個、300個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個或多于1000個不同的靶分子。在一些實施方案中，檢測最多達2000個不同的靶分子。在一些實施方案中，UBA選自抗體、肽、適體、類肽和核酸。在一些實施方案中，ESB選自核酸、珠和化學(xué)亞單位。在一些實施方案中，APS是核酸、小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。在一些實施方案中，APS包含與其上已連接有可檢測標記物的互補多核苷酸序列雜交的單鏈核酸。在一些實施方案中，第一APS通過連接作用或通過經(jīng)由聚合的延伸而與第一ESB連接。在一些實施方案中，第二APS通過連接作用或通過經(jīng)由聚合的延伸而與第一APS連接。在一些實施方案中，共同連接體部分是核酸。在一些實施方案中，ESB連接于USB。在一些實施方案中，所述第一COB包含多個APS。一些實施方案進一步包括通過一種方法來檢測多個靶分子，該方法包括：在步驟(b)中形成多個復(fù)合物，每個復(fù)合物包含(i)至少一個靶分子、(ii)第一UBA和(iii)對所述第一UBA的區(qū)域具有特異性的第一表位特異性條碼(ESB)，其中所述ESB包含第一共同連接體部分，其中所述至少一個靶分子與所述第一UBA相關(guān)聯(lián)，并且所述ESB與所述UBA相關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中，所述多個復(fù)合物中的每個COB具有將其與所述細胞群體中的其他COB區(qū)別開的可檢測信號或序列。在一些實施方案中，采用化學(xué)方法進行APS、ESB或UBA的連接。在一些實施方案中，化學(xué)方法包含點擊化學(xué)。在一些實施方案中，該連接在CuI的存在下進行。在一些實施方案中，利用結(jié)合親和力進行ABS、ESB或UBA的連接。在一些實施方案中，UBA、APS或ESB包含核酸。在一些實施方案中，使用包含與待連接的兩個組分互補的第一和第二互補區(qū)的連接寡核苷酸進行UBA、APS或ESB的連接。在一些實施方案中，APS群體中的APS之間共有第一或第二互補區(qū)。在一些實施方案中，第一或第二互補區(qū)對于不同APS群體而言是不同的。一些實施方案進一步包括連接作用。在一些實施方案中，連接寡核苷酸包含編碼APS或ESB的起源群體的子代碼。在一些實施方案中，APS具有編碼APS的起源群體的子代碼。在一些實施方案中，ESB具有編碼ESB的起源群體的子代碼。在一些實施方案中，單獨APS、ESB或連接寡核苷酸分子包含獨特標簽。在一些實施方案中，檢測包括檢測獨特標簽。在一些實施方案中，確定與特異性ESB相關(guān)聯(lián)的獨特標簽的數(shù)目。在一些實施方案中，檢測到的獨特標簽的數(shù)目與特異性ESB的初始量相關(guān)。在一些實施方案中，ESB與連接寡核苷酸共價連接。在一些實施方案中，APS或ESB包含擴增引物結(jié)合區(qū)。在一些實施方案中，COB編碼肽序列。在一些實施方案中，COB包含聚合酶起始位點。在一些實施方案中，肽包含親和標簽。在一些實施方案中，親和標簽是His-標簽。在一些實施方案中，所述兩個或更多個樣品包含至少5個樣品。在一些實施方案中，所述兩個或更多個樣品包含至少10個樣品。在一些實施方案中，所述兩個或更多個樣品包含至少20個樣品。在一些實施方案中，通過最近的分配而創(chuàng)建的每個樣品接收不同的APS。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及利用細胞起源條碼(COB)來標記細胞群體中細胞的連接有ESB的靶分子的方法，其包括：將每個細胞分離至單獨的反應(yīng)體積中；以及通過化學(xué)或親和手段將COB添加至ESB上。在一些實施方案中，反應(yīng)體積選自微泡、微滴、孔、微孔和微流體裝置中的包圍體(enclosure)。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及以下方法：其包括將來源于細胞的各種類型的組分分離，并將這些組分置于顆粒上，其中這些組分在所述顆粒上被標記。在一些實施方案中，所述標記包括根據(jù)細胞起源進行標記。在一些實施方案中，所述標記包括根據(jù)組分類型進行標記。在一些實施方案中，檢測步驟中的信號是有序的。在一些實施方案中，檢測包括使用一個或多個探針。在一些實施方案中，探針連接至表面。在一些實施方案中，表面包含陣列。在一些實施方案中，表面包含珠。在一些實施方案中，檢測包括分離。在一些實施方案中，分離是多維的。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于制備如本文所述的至少一個UBA、ESB和/或APS的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了如本文所述的UBA、ESB和/或APS的群體。在一些實施方案中，本文提供了包含如本文所述的UBA、ESB和APS群體及其使用說明書的試劑盒。援引并入本說明書中提及的所有出版物和專利申請均通過引用而以相同的程度并入本文，猶如每個單獨的出版物或?qū)＠暾執(zhí)貏e地和單獨地被指出為通過引用而并入。附圖說明本發(fā)明的新特征在隨附的權(quán)利要求中具體闡述。通過參考以下對在其中利用到本發(fā)明原理的說明性實施方案加以闡述的詳細描述和附圖，將會獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點更好的理解，附圖中：圖1描述了代表針對每個表位的細胞起源的不同特征(條碼)的信息量子。圖2示出了本發(fā)明的表位特異性條碼和細胞起源條碼的組分及其組裝的一個實施方案的圖示。圖3示出了本發(fā)明的一個實施方案的UBA-ESB-CL試劑。圖4描述了用UBA-ESB-CL試劑標記本發(fā)明的一個實施方案中的細胞。圖5描述了本發(fā)明的一個實施方案的ESB-COB試劑。圖6描述了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的ESB-COB組裝。圖7描述了根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案的ESB-COB組裝。圖8描述了根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案的ESB-COB組裝。圖9描述了根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案的ESB-COB組裝。圖10描述了根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案的ESB-COB組裝。圖11描述了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的基于肽的ESB-COB讀出值。具體實施方案術(shù)語“核酸”是指核苷酸聚合物，并且除非另有限制，包括能夠以與天然存在的核苷酸相似的方式起作用(例如，雜交)的、天然核苷酸的已知類似物。術(shù)語“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互換使用。它們是指任意長度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)的聚合形式。多核苷酸可具有任意三維結(jié)構(gòu)，并且可行使任何已知的或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段的編碼區(qū)或非編碼區(qū)、基因間DNA、由連鎖分析限定的多個基因座(一個基因座)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA、短干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、小核仁RNA、核酶、互補DNA(cDNA)，cDNA是mRNA的DNA呈現(xiàn)，通常通過信使RNA(mRNA)的逆轉(zhuǎn)錄或通過擴增而獲得；合成或擴增產(chǎn)生的DNA分子、基因組DNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、分離的任意序列DNA、分離的任意序列RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，在聚合物組裝之前或之后可對核苷酸結(jié)構(gòu)進行修飾。核苷酸序列可被非核苷酸組分打斷。在聚合后可對多核苷酸進行進一步的修飾，如通過與標記組分偶聯(lián)。當(dāng)提供時，多核苷酸序列以5’到3’的方向列出，除非另有說明。術(shù)語核酸包括雙鏈或三鏈核酸以及單鏈分子。在雙鏈或三鏈核酸中，核酸鏈不必是共同延伸的(即，雙鏈核酸不必沿兩條鏈的全長都是雙鏈的)。術(shù)語核酸還包含其任何化學(xué)修飾，如通過甲基化和/或通過加帽。核酸修飾可包括將附加電荷、可極化性、氫鍵、靜電相互作用以及官能性引入單獨的核酸堿基或整個核酸的化學(xué)基團的添加。此類修飾可包括堿基修飾，如2′位的糖修飾、5位的嘧啶修飾、8位的嘌呤修飾、在胞嘧啶環(huán)外胺處的修飾、5-溴尿嘧啶的取代、骨架修飾、異常堿基配對組合如異堿基異胞苷和異胍等。更具體地，在某些實施方案中，核酸可以包括多脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)和為嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷或C-糖苷的任何其他類型的核酸，以及含有正核苷酸(normucleotidic)骨架的其他聚合物，例如，聚酰胺(例如，肽核酸(PNA))和聚嗎啉基(可從Anti-Virals,Inc.,Corvallis,Oreg.作為Neugene購得)聚合物，以及其他合成的序列特異性核酸聚合物，條件是該聚合物以一種構(gòu)型含有核堿基，該構(gòu)型允許如在DNA和RNA中發(fā)現(xiàn)的堿基配對和堿基堆積。術(shù)語核酸還包括美國專利6,794,499、6,670,461、6,262,490和6,770,748中所述的連接核酸(LNA)，通過引用將其對LNA的公開內(nèi)容整體并入本文。核酸可來自于完全化學(xué)合成過程如固相介導(dǎo)的化學(xué)合成，來自于生物來源如通過從任何產(chǎn)生核酸的物種中分離，或來自于涉及通過分子生物學(xué)工具操縱核酸的過程如DNA復(fù)制、PCR擴增、逆轉(zhuǎn)錄，或來自于這些過程的組合。核酸“探針”是通過一種或多種類型的化學(xué)鍵，一般是通過互補堿基配對，常常是通過氫鍵的形成，能夠與具有互補序列的靶核酸結(jié)合，從而形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。探針與“探針結(jié)合位點”結(jié)合或雜交?？捎每蓹z測標記物來標記探針以允許便捷的探針檢測，尤其是一旦探針已與其互補靶標雜交時。然而，備選地，探針可以是未標記的，但通過直接地或間接地與標記的配體特異性結(jié)合而可以是可檢測的。探針的大小可顯著變化。通常，探針長度為至少7至15個核苷酸。其他探針為至少20、30或40個核苷酸長。再其他的探針稍長，為至少50、60、70、80或90個核苷酸長。又其他的探針更長，并且為至少100、150、200個或更多個核苷酸長。探針還可以具有以任何上述值為界限的任何范圍內(nèi)的任何長度(例如，15-20個核苷酸長度)。引物或探針可與靶核酸序列完全互補或可小于完全互補。在某些實施方案中，在至少7個核苷酸的序列上，更典型地在10-30個核苷酸的序列上，并且常常在至少14-25個核苷酸的序列上，引物與靶核酸序列的互補序列具有至少65%的同一性，并且更通常地具有至少75%的同一性，至少85%的同一性、至少90%的同一性或至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。應(yīng)當(dāng)理解，通常期望地，某些堿基(例如，引物的3′堿基)與靶核酸序列的相應(yīng)堿基完全互補。引物和探針通常在嚴格的雜交條件下與靶序列退火?；旌衔镏写嬖诘摹⒁蕾囉谟H和力的可用結(jié)合相互作用限定了對于兩種或更多種組分的結(jié)合特異性的特異性。通常，與對于第一相互作用中的一個或多個結(jié)合配偶體可用的其他可用相互作用的結(jié)合親和力相比，對于第一相互作用的高結(jié)合親和力將導(dǎo)致高特異性。具有高特異性的結(jié)合配偶體形成指定的結(jié)合配偶體?，F(xiàn)在將對本發(fā)明的特定優(yōu)選實施方案進行詳細的描述。優(yōu)選實施方案的實例在以下實施例部分進行闡述。除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本文引用的所有專利和出版物均通過引用整體并入本文。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測和量化生物分子樣品中的單獨靶分子的方法、組合物和試劑盒。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測和量化復(fù)雜細胞群體的每個細胞中的單獨靶分子而同時保留關(guān)于該靶分子的細胞特異性信息的方法、組合物和試劑盒。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測和量化具有復(fù)雜細胞群體的樣品中基于單細胞的單獨靶分子的方法、組合物和試劑盒。因此，在一些實施方案中，對每個細胞測定與該細胞相關(guān)的每個靶分子的量。尤其是，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合單獨靶分子的獨特結(jié)合劑。本發(fā)明還提供了使用表位特異性條碼來標記靶分子。本發(fā)明還提供了使用細胞起源條碼來指示起源細胞。通過表位特異性條碼和細胞起源條碼，獨特結(jié)合劑與靶分子的結(jié)合導(dǎo)致靶分子的鑒定。還提供了制備和使用此類獨特結(jié)合劑和/或表位特異性條碼和/或細胞起源條碼的方法。本文所述的方法和組合物可用于多種應(yīng)用中，如診斷、預(yù)后、質(zhì)量控制和篩選應(yīng)用。本發(fā)明的一些實施方案涉及用于單獨標記細胞的方法、組合物和試劑盒。術(shù)語“表位”和“靶分子”在本文中可互換使用，是指通過本文所述的方法檢測和/或量化的感興趣的分子(其部分或整個分子)。本發(fā)明的某些方面涉及多個靶分子的檢測。本文所述的方法在多個靶分子的檢測、量化和靈敏度方面提供了潛在的益處。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于研究多蛋白質(zhì)測定和/或多核酸測定的靈敏且可靠的方法和組合物。在單細胞水平上在一個樣品中的多路復(fù)用(multiplexing)是該方法的主要優(yōu)勢。一個樣品中的多路復(fù)用節(jié)約大量勞力，降低與測量數(shù)成比例的樣品量需求，并且通過消除由獨立樣品處理和測量步驟所復(fù)雜化的誤差來提高精確度。此外，獲得對復(fù)雜細胞群體中單細胞中的多個靶分子的測量提供了對每個單獨細胞內(nèi)生理學(xué)過程的更好的理解。在一些實施方案中，本文所述的方法允許在處理過程中將不同的樣品合并在一起以同時進行分析。這提供了通量優(yōu)勢并且可以加速不同樣品的分析。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于分析靶分子的獨特結(jié)合劑(UBA)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于多路復(fù)用分析的UBA群體。群體中的每個UBA對靶分子是特異性的。因此，UBA提供了對在細胞中識別的靶分子的特異性。而后使用表位特異性條碼(ESB)和細胞起源條碼(COB)來檢測靶分子與UBA的結(jié)合。每個ESB包含可能與特定靶分子相關(guān)的獨特代碼。每個COB包含可能與特定起源細胞相關(guān)的獨特代碼。在一些實施方案中，ESB與UBA直接或間接地連接。在其他實施方案中，ESB與細胞或樣品中的UBA結(jié)合，例如，作為分析過程的一部分。獨特的COB與特定細胞中的UBA相關(guān)聯(lián)，以使得每個COB可與該細胞中與UBA結(jié)合的靶分子相關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中，特定的ESB/COB組合被稱為代表每個靶分子或表位的信息量子(參見圖1)。在一些實施方案中，COB由一個或多個可測定聚合物亞單位(APS)組成。本發(fā)明的某些方面涉及設(shè)計的(例如，合成序列)APS的文庫或群體的選擇。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了設(shè)計的(例如，合成的)APS的群體，其中所述APS包含獨特序列和/或可檢測分子，并且其中每個COB中的一個或多個不同APS的組合具有將其與所述群體中的其他COB區(qū)別開的可檢測信號或序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含獨特序列(例如，合成的)的APS，該獨特序列與其上已連接有可檢測標記物的獨特互補多核苷酸序列雜交。在一些實施方案中，通過測序來檢測APS。因此，本發(fā)明的某些方面提供了獨特COB或ESB/COB群體，每一個包含獨特的基于APS的組合，其中該群體中每個COB或ESB/COB與群體中其他COB或ESB/COB不同。APS通常能夠形成包含COB的構(gòu)建體。允許這種形成的任何化學(xué)結(jié)構(gòu)均可用于APS。獨特結(jié)合劑(UBA)UBA是設(shè)計為與至少一個靶分子、至少一個靶分子替代物或兩者結(jié)合的分子或組裝體；并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，可形成包含UBA和靶分子的分子復(fù)合物。靶分子的實例包括但不限于蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類、離子、小分子、有機單體和藥物。僅為了方便起見，本文所述的大部分實施方案在與靶蛋白或靶mRNA結(jié)合的UBA的背景下進行解釋。然而，這些實施方案還可應(yīng)用于其他靶分子。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”、“肽”和“氨基酸序列”在本文中可互換使用，是指任意長度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，可包含修飾的氨基酸，并且可被非氨基酸或合成氨基酸中斷。這些術(shù)語還包含已修飾(例如，通過二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或任何其他操作，如與標記組分偶聯(lián))的氨基酸聚合物。如本文所用的術(shù)語“氨基酸”是指天然的和/或非天然的抑或合成的氨基酸，包括但不限于甘氨酸和D或L旋光異構(gòu)體以及氨基酸類似物和擬肽(peptidomimetics)。UBA包含至少一個反應(yīng)部分，該反應(yīng)部分使其能夠與至少一個靶分子、至少一個靶分子的至少一部分、至少一個靶分子替代物、靶分子替代物的至少一部分或其組合結(jié)合或相互作用；通常以序列特異性的、構(gòu)象特異性的方式或這兩種方式；例如但不限于抗原-抗體結(jié)合、適體-靶標結(jié)合等。在某些實施方案中，UBA包含身份部分或身份部分的至少一部分，例如，ESB、COB、ESB和/或連接體寡聚體(oligo)。在某些實施方案中，UBA包含捕獲區(qū)。在一些實施方案中，捕獲區(qū)用于UBA的分離和/或UBA向表面內(nèi)的固定。捕獲區(qū)可以是親和標簽、珠、載玻片、陣列、微滴、微流體裝置中的包圍體或本領(lǐng)域中任何其他合適的捕獲區(qū)。在一些實施方案中，捕獲區(qū)是ESB，例如，ESB可以是可檢測的珠，如具有獨特光譜特征的珠(例如，已用紅色或紅外熒光團進行了內(nèi)部染色的珠)。捕獲區(qū)可限定反應(yīng)體積，在該反應(yīng)體積中可進行本發(fā)明的組合物的操作。在一些實施方案中，UBA是抗體。如本文所用的術(shù)語抗體在廣義上使用，不僅包括完整的抗體分子，例如但不限于免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和免疫球蛋白M，而且包括免疫特異性地與至少一個表位結(jié)合的抗體分子的任何免疫反應(yīng)性組分。這類免疫反應(yīng)性組分包括但不限于FAb片段、FAb'片段、FAb'2片段、單鏈抗體片段(scFv)、迷你抗體(miniantibodies)、雙抗體、交聯(lián)抗體片段、AffibodyTM、環(huán)肽(cyclotides)、分子等。使用抗體工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)得到的免疫反應(yīng)性產(chǎn)物也明顯處于術(shù)語抗體的含義內(nèi)。關(guān)于抗體和/或蛋白質(zhì)工程的詳細描述，包括相關(guān)方案，尤其可見于J.Maynard和G.Georgiou,Ann.Rev.Biomed.Eng.2:33976(2000)；AntibodyEngineering,R.Kontermann和S.Dubel,編,SpringerLabManual,SpringerVerlag(2001)；美國專利5,831,012；和S.Paul,AntibodyEngineeringProtocols,HumanaPress(1995)。技術(shù)人員將會理解抗體可從多種來源獲得，包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、重組表達的抗體、人源化抗體、植物抗體等；并且可從各種動物物種獲得，包括兔、小鼠、山羊、大鼠、人、馬、牛、豚鼠、雞、綿羊、驢、人等。許多抗體是可購買到的，并且可從許多合約實驗室獲得定制的抗體。關(guān)于抗體的詳細描述，包括相關(guān)方案，尤其可見于CurrentProtocolsinImmunology,Coligan等人,編,JohnWiley&Sons(1999,包括截至2003年8月的更新內(nèi)容)；TheElectronicNotebook；BasicMethodsinAntibodyProductionandCharacterization,G.Howard和D.Bethel,編,CRCPress(2000)；J.Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第3版,AcademicPress(1996)；E.Harlow和D.Lane,UsingAntibodies,ColdSpringHarborLabPress(1999)；P.Shepherd和C.Dean,MonoclonalAntibodies:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(2000)；A.Johnstone和M.Turner,Immunochemistry1and2,OxfordUniversityPress(1997)；C.Borrebaeck,AntibodyEngineering,第2版,OxforduniversityPress(1995)；A.Johnstone和R.Thorpe,ImmunochemistryinPractice,BlackwellScience,Ltd.(1996)；H.Zola,MonoclonalAntibodies:PreparationandUseofMonoclonalAntibodiesandEngineeredAntibodyDerivatives(Basics:FromBackgroundtoBench),SpringerVerlag(2000)；以及S.Hockfield等人,SelectedMethodsforAntibodyandNucleicAcidProbes,ColdSpringHarborLabPress(1993)。此外，大量可商購的抗體(包括標記的或未標記的)；多克隆、單克隆和單特異性抗體，及其免疫反應(yīng)性組分；定制抗體供應(yīng)者等，都可在萬維網(wǎng)上找到，尤其是biocompare.com的抗體搜索頁、antibodyresource.com的抗體資源頁和sigmaaldrich.com的抗體瀏覽頁。在一些實施方案中，本文所述的抗體連接至核酸，例如連接體寡聚體或核酸ESB。將核酸與抗體連接的方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的方法中包括將核酸與抗體連接的任何合適的方法。可通過在Gullberg等人,PNAS101(22):228420–8424頁(2004)和Boozer等人,AnalyticalChemistry,76(23):6967-6972頁(2004)(均通過引用并入本文)中所述的方法將本文所述的抗體與核酸連接?？赏ㄟ^隨機胺連接而將本文所述的抗體與核酸連接。在一些實施方案中，可使用10:1的核酸:抗體比，通過隨機胺連接將本文所述的抗體與核酸連接?？赏ㄟ^在Kozlov等人,Biopolymers5:73(5):621–630頁(2004)(通過引用并入本文)中所述的方法將本文所述的抗體與核酸連接。可通過肼化學(xué)將本文所述的抗體與核酸連接?？扇鏝olan,NatureMethods2,11-12(2005)(通過引用并入本文)中所述，使用蝌蚪(tadpoles)將本文所述的抗體與核酸連接?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何合適的方法將本文所述的抗體與核酸連接，以產(chǎn)生包括本文所述的抗體的工程抗體。在一些實施方案中，UBA是適體。適體包括核酸適體(即，單鏈DNA分子或單鏈RNA分子)和肽適體。適體以高度特異性的、構(gòu)象依賴性的方式結(jié)合靶分子，通常具有極高的親和力，但是如果需要，也可選擇具有較低結(jié)合親和力的適體。已經(jīng)表明，適體可基于非常小的結(jié)構(gòu)差異如甲基或羥基的存在與否來區(qū)分靶標，并且某些適體可區(qū)分D對映體和L對映體。已獲得了結(jié)合小分子靶標的適體，該小分子靶標包括藥物、金屬離子和有機染料、肽、生物素和蛋白質(zhì)，包括但不限于鏈霉親和素、VEGF和病毒蛋白質(zhì)。已經(jīng)表明，在生物素化、熒光素標記之后以及當(dāng)連接至玻璃表面和微球時，適體保留功能活性。包括Speigelmer在內(nèi)的核酸適體通過被稱為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化法(SELEX)的體外選擇過程進行鑒定。在SELEX過程中，通過體外選擇和擴增的反復(fù)過程定期篩選寡核苷酸的非常大的組合文庫，例如1014-1015個單獨序列，常常長達60-100個核苷酸。大多數(shù)靶標在8-15個循環(huán)內(nèi)被親和富集，并且該過程已經(jīng)自動化，從而允許更快的適體分離。肽適體通常通過幾種不同的、本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)工程技術(shù)進行鑒定，這些蛋白質(zhì)工程技術(shù)包括但不限于噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、選擇性感染噬菌體技術(shù)(SIP)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，核酸適體和肽適體可通過以下常規(guī)程序獲得，而無需過多的實驗。關(guān)于適體的詳細描述，包括相關(guān)方案，尤其可見于L.Gold,J.Biol.Chem.,270(23):1358184(1995)；S.Jayasena,Clin.Chem.,45:1628-50(1999)；V.Sieber等人,NatBiotechnol.16(10):955-60(1998)；D.Wilson和J.Szostak,Ann.Rev.Biochem.68:611-47(1999)；L.Jermutus等人,Eur.Biophys.J.,31:179-84(2002)；SS.Spada等人,Biol.Chem.,378:445-56(1997)；B.Wlotzka等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,99:8898-8902(2002)。在一些實施方案中，適體將與核酸如連接體寡聚體或核酸ESB連接或雜交。適體的雜交或連接可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法來完成。例如，連接可由至少一種DNA連接酶或至少一種RNA連接酶來酶促進行，該酶例如但不限于：T4DNA連接酶、T4RNA連接酶、嗜熱棲熱菌(Tth)連接酶、水生棲熱菌(Taq)DNA連接酶或激烈火球菌(Pfu)連接酶。連接還可通過化學(xué)連接來進行，可使用激活劑或還原劑，如碳二亞胺、溴化氰(BrCN)、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/胱胺、N-氰基咪唑、二硫蘇糖醇(DTT)和紫外線。在一些實施方案中，UBA是類肽。類肽是能結(jié)合蛋白質(zhì)的N-取代甘氨酸合成肽的短序列。在一些實施方案中，小尺寸的類肽改善了本文所述的方法的擴散和動力學(xué)。本文所述的方法包括本領(lǐng)域已知的產(chǎn)生類肽的任何合適的方法。參見Simon等人,PNAS15;89(20):9367–9371(1992)，其通過引用并入本文。在一些實施方案中，UBA是核酸序列，例如，靶mRNA的反義DNA。核酸序列優(yōu)選為至少15個核苷酸的長度，更優(yōu)選為至少20個核苷酸的長度。在特定的實施方案中，靶標特異性序列約為10至500、20至400、30至300、40至200或50至100個核苷酸的長度。在其他實施方案中，靶標特異性序列約為30至70、40至80、50至90或60至100、30至120、40至140或50至150個核苷酸的長度。表位特異性條碼(ESB)在一些實施方案中，本發(fā)明提供了表位特異性條碼(ESB)。每個ESB包含可與特定靶分子相關(guān)的獨特代碼。ESB是設(shè)計為與至少一個UBA或UBA的一部分結(jié)合的分子或組裝體；并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，可形成包含ESB、UBA和靶分子的分子復(fù)合物。ESB可包含至少一個身份確認部分，該身份確認部分使其能夠與至少一個UBA結(jié)合或相互作用；通常以序列特異性的、構(gòu)象特異性的方式或這兩種方式；例如但不限于UBA-抗體結(jié)合、適體-靶標結(jié)合等。在一些實施方案中，ESB與UBA直接或間接地連接。在其他實施方案中，ESB與細胞或樣品中的UBA結(jié)合，例如，作為分析過程的一部分。在某些實施方案中，ESB是固體表面或捕獲區(qū)，例如，ESB可以是可檢測的珠，如具有獨特光譜特征的珠(例如，已用紅色或紅外熒光團進行了內(nèi)部染色的珠)。在一些實施方案中，UBA直接或間接地與捕獲區(qū)連接。在某些實施方案中，ESB包含共同連接體部分，例如，連接體寡聚體。在某些實施方案中，該共同連接體寡聚體與形成細胞起源條碼(COB)的可測定聚合物亞單位(APS)中的共同連接體寡聚體互補。在某些實施方案中，ESB包含捕獲區(qū)。在一些實施方案中，捕獲區(qū)用于ESB的分離和/或ESB向表面內(nèi)的固定。捕獲區(qū)可以是親和標簽、珠、載玻片或陣列。在一些實施方案中，捕獲區(qū)是可檢測的珠，如具有獨特光譜特征的珠(例如，已用紅色或紅外熒光團進行了內(nèi)部染色的珠)。在一些實施方案中，ESB是如上所述的抗體或其片段、適體、核酸或類肽。在一些實施方案中，ESB是核酸。在一些實施方案中，核酸的一部分用本領(lǐng)域已知的支鏈或滾環(huán)方法進行擴增。在一些實施方案中，ESB是類肽。類肽是能結(jié)合蛋白質(zhì)的N-取代甘氨酸合成肽的短序列。在一些實施方案中，小尺寸的類肽改善了本文所述的方法的擴散和動力學(xué)。本文所述的方法包括本領(lǐng)域已知的產(chǎn)生類肽的任何合適的方法。參見Simon等人,PNAS15;89(20):9367–9371(1992)，其通過引用并入本文。在一些實施方案中，ESB是核酸序列，例如，互補靶核酸序列的反義核酸。核酸序列優(yōu)選為至少15個核苷酸的長度，更優(yōu)選為至少20個核苷酸的長度。在特定的實施方案中，靶標特異性序列約為10至500、20至400、30至300、40至200或50至100個核苷酸的長度。在其他實施方案中，靶標特異性序列約為30至70、40至80、50至90或60至100、30至120、40至140或50至150個核苷酸的長度。細胞起源條碼(COB)在一些實施方案中，本發(fā)明提供了細胞起源條碼(COB)。每個COB提供了可能與特定起源細胞相關(guān)的獨特代碼。在一些實施方案中，在COB與和ESB相關(guān)聯(lián)的共同連接體部分(例如，共同連接體寡聚體)結(jié)合后，COB代碼確定出與UBA/ESB復(fù)合物結(jié)合的靶分子的起源細胞。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的COB包含兩個主要部分：(i)對于與UBA/ESB探針相關(guān)聯(lián)的共同連接體部分(例如，共同連接體寡聚體)具有特異性的序列；和(ii)可能與特定起源細胞相關(guān)的獨特代碼。在一些實施方案中，COB是模塊結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，COB包含多個不同的可測定聚合物亞單位(APS)。在一些實施方案中，COB包含多個以線性組合方式連接的APS。在一些實施方案中，COB是含有以下某些基本元件的分子實體：(i)多個包含標記物連接區(qū)的APS，它們以線性組合方式連接形成骨架，和(ii)包含標記物的互補多核苷酸序列，它們與骨架的標記物連接區(qū)互補并且與之連接。術(shù)語標記物連接區(qū)包括給定骨架內(nèi)限定的多核苷酸序列的區(qū)域，其可作為可檢測的分子的單獨連接點。在一些實施方案中，COB包含以線性組合方式連接的多個不同的APS，其中APS包含具有確定性重量的小分子。在一些實施方案中，COB包含以線性組合方式連接的2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個獨特APS。在一些實施方案中，COB包含以線性組合方式連接的4個或更多個APS。在一些實施方案中，以線性組合方式連接的多個APS可包含獨特設(shè)計的核酸序列。此外，COB中以線性組合方式連接的多個APS可包含至少一個模板，例如但不限于至少一個核酸序列，如線性或可線性化的病毒基因組的至少一部分，如腺病毒、肝炎病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等或諸如λ、M13、ΦX-174、T系列噬菌體等噬菌體的基因組，包括包含克隆盒、多接頭等的其衍生物；質(zhì)粒，如pBR322和pUC系列質(zhì)粒等，包括包含克隆盒、多接頭等的其衍生物；合成模板；包含人工序列的模板；等等。技術(shù)人員將會理解，實際上任何核酸片段都可作為用于構(gòu)造COB的模板，只要其大到足以包括至少兩個APS，或其可與至少一個其他的核酸序列組合，使得組合的序列大到足以包括至少兩個APS。在一些實施方案中，本發(fā)明的ESB、APS或COB涉及可模板化的結(jié)構(gòu)單元。在一些實施方案中，本發(fā)明的UBA涉及可模板化的分子。在一些實施方案中，COB還包含一個或多個含有共同連接體部分(例如，共同連接體寡聚體)的APS。共同連接體部分可與APS直接或間接連接。因此，共同連接體部分可與COB共價連接，或者共同連接體可稍后在試驗中與COB結(jié)合。術(shù)語共同連接體部分包括約10至約25個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。共同連接體部分可在COB的5'區(qū)或3'區(qū)進行連接，并且可用于COB的捕獲或固定以供成像或檢測，例如通過將與共同連接體部分互補的序列連接到固體基質(zhì)上。COB的元件可存在于單個分子實體(單COB)或兩個不同的分子實體(雙COB)中。每個分子實體可由一個分子或通過共價或非共價方式彼此連接的多于一個分子組成。在一些實施方案中，雙COB的每種組分具有與相同靶分子上的不同位點結(jié)合的靶分子特異性UBA/ESB。當(dāng)使用雙COB系統(tǒng)時，其中一個COB可以是未標記的。在一些實施方案中，未標記的COB可包含捕獲區(qū)。在本發(fā)明的許多實施方案中，COB由單獨APS結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建而成。在一些實施方案中，APS以線性方式組合。在一些實施方案中，由APS構(gòu)建的COB保留了APS的順序。在一些實施方案中，COB包含分支結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，分支的COB結(jié)構(gòu)包含關(guān)于APS添加順序的信息。在許多實施方案中，可將形成COB的單獨APS進行解碼。在一些實施方案中，可將形成COB的APS的順序或添加順序進行解碼。不受理論所限制，允許保護和解碼APS添加順序的平臺支持由同等數(shù)目的APS結(jié)構(gòu)單元產(chǎn)生更高數(shù)目的不同COB。利用較高數(shù)目的總COB分子類型，群體中的兩個細胞/顆粒被相同COB標記的可能性降低。因此，本發(fā)明的許多實施方案的方法為細胞/顆粒身份的確定給出了更高的統(tǒng)計顯著性。在一些實施方案中，與APS連接的互補多核苷酸序列用于將可檢測分子或標記物單體與APS連接?；パa多核苷酸序列可被直接標記，例如通過將一個或多個可檢測分子共價引入互補多核苷酸序列中?；蛘?，互補多核苷酸序列可被間接標記，例如通過將能夠進行特異性配體相互作用的生物素或其他分子引入互補多核苷酸序列中。在這類情況下，配體(例如，在生物素引入互補多核苷酸序列中的情況下的鏈霉親和素)可共價連接于可檢測分子。在不直接將與APS連接的可檢測分子引入互補多核苷酸序列的情況下，該序列作為可檢測分子與APS之間的橋梁，并且可稱為橋接分子，例如橋接核酸。在一些實施方案中，本發(fā)明的基于核酸的COB、COB-ESB復(fù)合物或COB/ESB/UBA復(fù)合物包含核酸，該核酸可使用與COB的恒定區(qū)(例如，共同連接體部分、捕獲區(qū)或親和標簽)互補的核酸如寡核苷酸進行親和純化或固定。如上所述，在一些實施方案中，COB包含可作為用于純化和/或固定(例如固定至固體表面)的親和標簽的至少一個共同連接體部分。共同連接體部分可包含重復(fù)核苷酸(如一系列15個堿基的重復(fù))的兩個或更多個串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。在這類示例性實施方案中，與ESB、ESB/UBA、靶分子/UBA/ESB復(fù)合或不與之復(fù)合的COB均可用涂覆有15個堿基的寡核苷酸的親和試劑進行純化或固定化，該15個堿基的寡核苷酸是重復(fù)單元的反向互補序列?？稍趦蓚€或更多個親和選擇步驟中純化COB、COB-ESB復(fù)合物或COB/ESB/UBA復(fù)合物。例如，在COB與ESB/UBA復(fù)合物連接的實施方案中，COB可包含親和標簽。在其他實施方案中，當(dāng)使用雙COB時，一個COB可包含第一親和標簽，而另一個COB可包含第二(不同的)親和標簽。將COB與靶分子混合，并通過針對一個或兩個單獨親和標簽的親和純化將包含雙COB的兩個探針的復(fù)合物從未結(jié)合的材料中分離出來。在第一步中，可將混合物與針對第一親和標簽的親和試劑結(jié)合，以使得僅有包含第一親和標簽和所需復(fù)合物的探針得到純化。結(jié)合的材料從第一親和試劑中釋放出來，并且任選地與針對第二親和標簽的親和試劑結(jié)合，從而允許從包含第一親和標簽的COB中分離出復(fù)合物。此時，僅有完整復(fù)合物將會被結(jié)合。最后，復(fù)合物從針對第二親和標簽的親和試劑中釋放出來，然后通過本文所述的方法進行分析。親和試劑可以是涂覆有親和標簽的結(jié)合配偶體的任何固體表面，如柱、珠(例如，乳膠珠或磁珠)，或涂覆有結(jié)合配偶體的載玻片。本領(lǐng)域已知的許多親和標簽，例如，可以用于純化和/或固定COB、COB-ESB復(fù)合物或COB/ESB/UBA復(fù)合物。在一些實施方案中，生物素錨與COB、ESB和/或UBA連接，這允許COB、COB-ESB復(fù)合物或COB/ESB/UBA復(fù)合物在鏈霉親和素表面(例如，涂覆的載玻片或珠)上的固定。在一些實施方案中，親和標簽與UBA連接，例如，用于純化和/或固定UBA。親和標簽可用于為了多種有用的應(yīng)用而連接至珠或其他基質(zhì)上，這些應(yīng)用包括但不限于純化。親和標簽的實例及其制備方法和/或其與核酸連接的方法在美國專利7,473,767；美國申請10/542,458；12/324,357；11/645,270和12/541,131中有述，它們通過引用整體并入本文。在一些實施方案中，ESB、UBA、APS和COB中的至少兩個包含本文所述的不同的化學(xué)組合物或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的組合物。例如，ESB可包含肽和/或核酸，而APS包含肽或類肽。所述化學(xué)成分的任意組合預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在許多實施方案中，ESB、APS和/或COB可以是模板、有序的和/或解碼的。在一些實施方案中，可檢測構(gòu)建體中這些亞單位中任何一個的順序。ESB、APS和/或COB可為添加ESB、APS和/或COB中的任意另一個提供模板，例如，通過核酸互補性或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的化學(xué)互補性進行添加。ESB、APS和/或COB可編碼次級產(chǎn)物，如編碼另一種核酸或肽的核酸。在一些實施方案中，對ESB、APS和/或COB的檢測包括對其進行解碼，例如從ESB、APS和/或COB產(chǎn)生擴增子或表達肽，以及測序或以其他方式檢測產(chǎn)物。與給定細胞的COB的各種APS相關(guān)聯(lián)的標記物單體所提供的序列、重量或信號允許對COB的獨特鑒定。例如，當(dāng)使用核酸序列時，具有獨特身份或獨特序列特征的COB與識別特定靶分子或其一部分的UBA相關(guān)聯(lián)。對COB序列的檢測允許檢測混合物中靶分子的存在(定性分析)。在另一個實例中，當(dāng)使用熒光標記物時，具有獨特身份或獨特光譜特征的COB與識別特定靶分子或其一部分的UBA相關(guān)聯(lián)。對COB信號如熒光標記的COB的光譜代碼的檢測允許檢測混合物中靶分子的存在(定性分析)。在又一個實例中，當(dāng)依據(jù)組合合成程序使用小分子時，具有獨特確定性重量的COB與識別特定靶分子或其一部分的UBA相關(guān)聯(lián)。對COB確定性重量的檢測(例如，經(jīng)由質(zhì)譜法)允許檢測混合物中靶分子的存在(定性分析)。對與給定特征(例如，光譜代碼、獨特序列或獨特的確定性重量)相關(guān)的代碼(例如，序列、標記物單體或確定性重量)的計數(shù)或量化允許計數(shù)或量化混合物中與COB偶聯(lián)的UBA相關(guān)聯(lián)的所有分子(定量分析)。因此，通過對已知生物標志物的定量分析，UBA/ESB/COB復(fù)合物對于不同生物狀態(tài)(例如，疾病與健康)的診斷或預(yù)后是有用的。此外，由本發(fā)明的COB提供的單分子檢測和量化的高靈敏度允許鑒定新的診斷和預(yù)后標志物，包括那些在不同生物狀態(tài)間的波動太微弱因而不能使用傳統(tǒng)分子方法檢測與特定生物狀態(tài)的相關(guān)性的那些標志物?；贑OB的分子檢測的靈敏度允許對小生物樣品中的治療劑和診斷劑進行詳細的藥代動力學(xué)分析。COB合成可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法(包括本文所述的方法)來進行。在許多實施方案中，本發(fā)明涉及將要通過逐步添加包含寡核苷酸的可測定聚合物亞單位(APS)而合成的COB。COB可通過共同連接體(CL)與UBA連接。CL也可以是寡核苷酸的一部分。在一些實施方案中，還提供了作為寡核苷酸的表位特異性條碼。在一些情況下，表位特異性條碼可包括在包含共同連接體的寡核苷酸中。在一些實施方案中，CL、ESB和APS都包含寡核苷酸序列。因此，可將寡核苷酸CL與寡核苷酸ESB或APS連接。可利用基本上互補或完全互補的退火區(qū)域進行雜交。可在寡核苷酸ESB或APS的兩端設(shè)置退火區(qū)域。在一些實施方案中，APS在分配混合合成或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的逐步合成的各個步驟中加入?？蓪τ谥鸩胶铣傻拿恳徊教禺愋缘耐嘶饏^(qū)引入寡核苷酸中。不受理論所限制，只要在步驟期間跳過寡核苷酸添加，下一個寡核苷酸的步驟特異性退火區(qū)將不會與前一個可用的寡核苷酸的步驟特異性退火區(qū)有效地雜交。因此，本發(fā)明的一些實施方案提供了停止缺少一個或多個APS的COB的合成的方法。在一些實施方案中，用不同的CL寡核苷酸來標記UBA，每個CL寡核苷酸都具有UBA特異性的獨特ESB序列和共有退火區(qū)。在許多情況下，在多輪分配混合合成過程中將APS組裝至COB中。在這些情況下，在每一輪，將樣品分入n個不同的容器中?？上蛎總€容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共m個不同的APS。在一些實施方案中，n和m是相同的。在其他實施方案中，n大于m或m大于n?？稍O(shè)計每個APS以使其將選擇性地與前一輪中加入的退火區(qū)雜交(圖6)。在許多實施方案中，將一對輪次特異性退火區(qū)引入每個APS中。可向APS的每一端引入退火區(qū)。引入APS每一端的退火區(qū)可以是不同的。因此，加入的APS的退火區(qū)可與來自前一輪的可用退火區(qū)互補從而促進組裝。在一些實施方案中，可使用退火引物將APS訂合在一起和/或與CL訂合(圖7和圖8)。退火引物可包含與CL互補的或與在逐步合成的前一輪中添加的APS互補的第一互補區(qū)。退火引物還可包含與在當(dāng)前一輪中加入的APS互補的第二互補區(qū)。因此，退火引物可與后幾輪的兩個寡核苷酸亞單位雜交，從而將它們訂合在一起。在一些實施方案中，每輪的退火引物的第一互補區(qū)不同于其他幾輪的退火引物的第一互補區(qū)(圖7)。在一些實施方案中，每輪的退火引物的第二互補區(qū)不同于其他幾輪的退火引物的第二互補區(qū)。在一些實施方案中，不同輪次的退火引物的第一或第二互補區(qū)在輪次之間是共同的(圖8)。在一些實施方案中，CL寡核苷酸包含成對環(huán)狀退火區(qū)(圖9和圖10)。因此，APS可設(shè)計為以環(huán)狀幾何形狀與CL雜交，其沿著環(huán)狀退火區(qū)在每一端與CL雜交。環(huán)狀退火區(qū)可以是輪次特異性的。雜交可沿著CL填充(populate)APS。可使用本文所述的任何方法或本領(lǐng)域已知的其他普通方法將APS連接起來。APS可以設(shè)計為使得它們不會沿著對于其他輪次特異性的環(huán)狀退火區(qū)與CL有效地雜交。因此，如果來自特定輪次的APS缺失，則APS可能無法成功地連接在一起，這取決于連接過程。或者，可利用缺失的APS合成COB，其位置的側(cè)翼為一對環(huán)狀退火區(qū)。之后可相應(yīng)地對得到的COB進行分析，并且可將其丟棄或可備選地處理重新獲得的信息。在給定輪次中的每個APS可包含獨特的子代碼序列，該序列不同于該輪中其余的APS(圖6-11)。該子代碼可包含獨特的核苷酸序列。CL或者一個或多個APS可進一步包含允許隨后對檢測到的COB進行標準化的隨機標簽區(qū)(圖6-11)。利用這類隨機標簽區(qū)的合適方法的變化是本領(lǐng)域已知的，例如，參見Casbon等人(NucleicAcidsResearch,2011,39:12,e81)。在一些情況下，隨機標簽區(qū)可作為分子計數(shù)器用來估計與每個序列變體相關(guān)的模板分子的數(shù)目。在一些情況下，在擴增反應(yīng)例如PCR之前將分子計數(shù)器引入CL、ESB、APS或組裝的COB中?？蓪啿A基區(qū)(DBR)的分子計數(shù)器文庫引入CL、ESB、APS或組裝的COB。文庫中獨特DBR的數(shù)目通常受到DBR的長度和堿基組成的限制。例如，DBR中的一個核苷酸將允許有四個不同的可能的計數(shù)器，一個計數(shù)器針對一個堿基。較長的DBR可以產(chǎn)生較高數(shù)目的獨特計數(shù)器序列。可將每個來自序列文庫的分子計數(shù)器引入CL、ESB、APS或組裝的COB。分子計數(shù)器可用于確定序列變體是與一個模板分子相關(guān)還是與多個模板分子相關(guān)。與一個序列變體相關(guān)的不同DBR序列的數(shù)目可作為初始模板分子數(shù)目的直接量度。該信息可以補充或替代由每個序列變體的讀數(shù)(包括例如擴增反應(yīng)如PCR后的讀數(shù))提供的信息。DBR還可用于確定序列變體源自擴增反應(yīng)期間的聚合酶錯誤或為擴增反應(yīng)如PCR之前的真實的原始變體的可能性。在一些實施方案中，在COB組裝之前或同時將獨特結(jié)合劑(UBA)固定于它們的靶標上。本發(fā)明的許多實施方案涉及COB在細胞表面上的組裝。例如，COB可與靶向細胞表面組分的UBA組裝結(jié)合。在一些實施方案中，在COB組裝之前或同時將UBA固定于細胞表面組分上。在一些實施方案中，將UBA遞送至細胞內(nèi)或細胞區(qū)室內(nèi)。在一些實施方案中，COB與細胞或細胞區(qū)室內(nèi)的UBA組裝結(jié)合?？稍诩尤險BA、ESB之前或在COB組裝之前將細胞固定。合適的細胞透化方法是本領(lǐng)域已知的，并且可用于將該試驗的組分遞送至細胞和細胞區(qū)室內(nèi)。在一些實施方案中，該試驗在非細胞的物體上進行。本領(lǐng)域已知的合適的支持材料，如珠或表面涂層，能用來以與細胞相同的方式提供原始結(jié)合表面。支持材料可用結(jié)合靶標來裝飾。在一些實施方案中，支持材料在空間上將結(jié)合靶標彼此拆分。在一些實施方案中，該試驗可包含主要結(jié)合靶標和能與主要結(jié)合靶標結(jié)合的一個或多個次要靶標。支持材料可以例如涂覆有一個或多個主要靶標?？商峁┐我袠宋膸煲越Y(jié)合主要靶標。可提供UBA以結(jié)合主要靶標和/或次要靶標的表位。如對于其他類型的靶標所述，COB可與這些UBA組裝結(jié)合?？赏ㄟ^分析COB來監(jiān)測次要靶標與主要靶標的相互依賴性結(jié)合。在一些實施方案中，多個COB在同一UBA分子上組裝。在一些實施方案中，ESB或組裝的COB編碼衍生物序列。在一些實施方案中，ESB和/或COB包含多核苷酸序列。在一些情況下，ESB和/或COB可編碼RNA序列。在一些情況下，ESB和/或COB編碼肽序列。ESB和/或COB可直接編碼肽序列?；蛘?，COB可間接地例如通過中間RNA序列來編碼肽序列。例如，多核苷酸ESB或COB可編碼開放閱讀框。在一些情況下，在將ESB或COB引入能夠進行肽表達的構(gòu)建體后，肽序列得到翻譯。在一些實施方案中，構(gòu)建體是載體。在一些實施方案中，ESB和COB由寡核苷酸組裝。連接劑可以是連接酶。在一些實施方案中，連接酶是T4DNA連接酶，采用眾所周知的程序(Maniatis,T.,MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1982))。還可使用其他DNA連接酶。關(guān)于連接，可使用其他連接酶，如來源于嗜熱生物的連接酶，從而允許在較高溫度下連接，這允許使用較長的寡核苷酸(具有增強的特異性)作為ESB、CL或APS，其在通常允許這類寡核苷酸退火的較高溫度下可同時退火和連接。然而，連接并非必須通過酶，相應(yīng)地，連接劑可以是這樣的化學(xué)試劑：其將導(dǎo)致ESB和APS連接，除非在退火區(qū)存在核苷酸堿基對錯配。為簡單起見，本發(fā)明的一些實施方案將用T4DNA連接酶作為連接劑來描述。該酶需要在將要與相鄰寡核苷酸上的3'OH基團連接的5'端存在磷酸基團。當(dāng)寡聚體堆積在一起而結(jié)合至在其末端接合處完全匹配的退火區(qū)時，導(dǎo)致與退火區(qū)的特異性結(jié)合?？蓪L、ESB和APS連接起來以形成連接有ESB的COB。連接有ESB的COB轉(zhuǎn)而可用于檢測。在一些實施方案中，ESB和/或COB組裝包括采用點擊化學(xué)。采用點擊化學(xué)連接多個分子的合適方法是本領(lǐng)域已知的(對于寡核苷酸的點擊化學(xué)連接，參見，例如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011))。在一些實施方案中，ESB和/或COB組裝在細胞內(nèi)發(fā)生。在一些實施方案中，ESB和/或APS首先在細胞內(nèi)組裝。在一些實施方案中，ESB和/或APS在細胞內(nèi)連接。在一些實施方案中，ESB和/或APS在細胞外連接。在一些實施方案中，對組裝的產(chǎn)物進行擴增，并任選地將結(jié)果與來自參比樣品的相似靶核酸的擴增進行比較。在一些實施方案中，對APS的連接產(chǎn)物進行擴增，并任選地將結(jié)果與來自參比樣品的相似COB的擴增進行比較?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法進行擴增。在一些情況下，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來擴增連接的產(chǎn)物?？墒褂玫腜CR技術(shù)的實例包括但不限于定量PCR、定量熒光PCR(QF-PCR)、多重?zé)晒釶CR(MF-PCR)、實時PCR(RTPCR)、單細胞PCR、限制性片段長度多態(tài)性PCR(PCR-RFLP)、PCK-RFLPIRT-PCR-IRFLP、熱啟動PCR、巢式PCR、原位聚合酶群落(polonony)PCR、原位滾環(huán)擴增(RCA)、橋式PCR、picotiterPCR和乳液PCR。其他合適的擴增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄擴增、自動維持序列復(fù)制、靶多核苷酸序列的選擇性擴增、共有序列引物聚合酶鏈反應(yīng)(CP-PCR)、任意引物聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、簡并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和基于核酸的序列擴增(NABSA)。本文可用的其他擴增方法包括美國專利5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中描述的方法。在一些實施方案中，擴增在細胞內(nèi)進行。在任何實施方案中，連接產(chǎn)物的擴增可在載體如珠或表面上發(fā)生。在本文的任何實施方案中，COB可在來自單細胞的靶標上進行組裝。探針群體中每個UBA/ESB探針的獨特性允許對多個靶分子進行多路復(fù)用分析。而且，探針群體中每個COB探針的獨特性允許對單細胞中的多個靶分子進行多路復(fù)用分析。例如，在一些實施方案中，每個COB含有六個APS。如果打算對APS進行測序，并且對于APS存在20個可能的獨特序列。在該實例中將存在3.84x108個可能的COB。因此，在該實例中可分析3.84x108個細胞及其相應(yīng)的UBA/ESB探針?？紤]到在測序中沒有在一些熒光方法中存在的顏色限制，所以每個細胞可以分析多個UBA/ESB探針。在一些實施方案中，每個細胞分析10個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、65個、70個、90個、100個不同的UBA/ESB。在一些實施方案中，每個細胞分析最多達100個不同的UBA/ESB。在一些實施方案中，每個細胞分析最多達1000個不同的UBA/ESB。在一些實施方案中，每個細胞分析最多達2000個不同的UBA/ESB。在某些實施方案中，在多路復(fù)用分析中執(zhí)行檢測方法，以此在同一分析(單一反應(yīng)混合物)中檢測多個靶分子。在優(yōu)選的實施方案中，該分析是雜交分析或親和結(jié)合分析，其中同時檢測多個靶分子。在優(yōu)選的實施方案中，該分析是雜交分析或親和結(jié)合分析，其中在單細胞中同時檢測多個靶分子。在某些實施方案中，在同一分析中檢測的多個靶分子是至少2個、至少5個不同的靶分子、至少10個不同的靶分子、至少20個不同的靶分子、至少50個不同的靶分子、至少75個不同的靶分子、至少100個不同的靶分子、至少200個不同的靶分子、至少500個不同的靶分子，或至少750個不同的靶分子，或至少1000個不同的靶分子。在其他實施方案中，在同一分析中檢測的多個靶分子是最多達50個不同的靶分子、最多達100個不同的靶分子、最多達150個不同的靶分子、最多達200個不同的靶分子、最多達300個不同的靶分子、最多達500個不同的靶分子、最多達750個不同的靶分子、最多達1000個不同的靶分子、最多達2000個靶分子或最多達5000個靶分子。在另外其他的實施方案中，所檢測的多個靶分子處于前述不同靶分子的數(shù)目之間的任何范圍內(nèi)，例如但不限于20至50個不同的靶分子、50至200個不同的靶分子、100至1000個不同的靶分子、500至5000個不同的靶分子等等。在一些實施方案中，檢測是數(shù)字化檢測。在一些實施方案中，檢測是直接的，即該方法獲得直接由所檢測的實體產(chǎn)生的信號。在一些實施方案中，檢測是間接的，即在獲得信號之前發(fā)生對待檢測的實體的操作。在一些實施方案中，待檢測的實體的多種組分直接地或間接地產(chǎn)生檢測信號。在一些實施方案中，可通過本文所述的檢測方法確定多個組分的順序。此類檢測方法還被描述為有序檢測方法或具有有序信號的檢測方法。在任何實施方案中，COB的檢測或量化分析可通過測序來完成。可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，例如IlluminaHiSeq2000，包括本文所述的測序方法，經(jīng)過對所有DNA標簽的完整測序來檢測APS亞單位或整個COB。可通過本領(lǐng)域公知的經(jīng)典Sanger測序法來完成測序。還可使用高通量系統(tǒng)來完成測序，其中一些高通量系統(tǒng)允許在測序的核苷酸并入增長中的鏈時或之后立即對其進行檢測，即，實時或基本上實時地檢測序列。在一些情況下，高通量測序產(chǎn)生至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少100,000或至少500,000次序列讀取/小時；其中每次讀取為至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120或至少150個堿基/讀取。在一些實施方案中，高通量測序涉及使用可通過Illumina的HiSeq2000機器獲得的技術(shù)。該機器采用通過合成化學(xué)進行的基于可逆終止子的測序。該機器在八天內(nèi)可進行2千億次DNA讀取。在一些實施方案中，高通量測序涉及使用可通過ABISolidSystem獲得的技術(shù)。這種遺傳分析平臺能夠?qū)崿F(xiàn)與珠連接的克隆擴增的DNA片段的大規(guī)模并行測序。該測序方法基于與染料標記的寡核苷酸的相繼連接。在一些實施方案中，高通量測序涉及使用可通過IonTorrentPersonalGenomeMachine(PMG)獲得的技術(shù)。PGM在兩個小時內(nèi)可以進行1千萬次讀取。在一些實施方案中，高通量測序涉及使用可通過HelicosBioSciencesCorporation(Cambridge,Massachusetts)獲得的技術(shù)，如單分子合成測序(SMSS)法。SMSS是獨一無二的，因為其允許在最多達24小時內(nèi)對整個人類基因組進行測序。這種快速測序方法還允許基本實時地或?qū)崟r地檢測序列中的SNP核苷酸。最后，SMSS是強大的，因為如MIP技術(shù)一樣，其在雜交之前不需要預(yù)擴增步驟。實際上，SMSS不需要任何擴增。在公開號為20060024711、20060024678、20060012793、20060012784和20050100932美國申請中對SMSS進行了部分描述。在一些實施方案中，高通量測序涉及使用可通過454Lifesciences,Inc.(Branford,Connecticut)獲得的技術(shù)，如PicoTiterPlate裝置，該裝置包括光纖板，該光纖板傳輸將由該儀器中的CCD照相機記錄的、測序反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號。光纖的這種使用允許在4.5小時內(nèi)檢測最少2千萬個堿基對。先采用珠擴增而后進行光纖檢測的方法在Marguiles,M.等人,"Genomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypricolitrereactors",Nature,doi:10.1038/nature03959以及公開號為20020012930、20030058629、20030100102、20030148344、20040248161、20050079510、20050124022和20060078909的美國申請中有所描述。在一些實施方案中，使用克隆單分子序列(ClonalSingleMoleculeArray)(Solexa,Inc.)或利用可逆終止子化學(xué)的合成測序(SBS)來進行高通量測序。在美國專利6,969,488、6,897,023、6,833,246、6,787,308和公開號為20040106130、20030064398、20030022207的美國申請和Constans,A.,TheScientist2003,17(13):36中對這些技術(shù)進行了部分描述。在一些實施方案中，RNA或DNA的高通量測序可使用AnyDot.chips(Genovoxx,Germany)進行。特別是，AnyDot-chips允許將核苷酸熒光信號檢測增強10-50倍。AnyDot.chips及其使用方法在公開號為WO02/088382、WO03/020968、WO03/031947、WO2005/044836、PCT/EP05/105657、PCT/EP05/105655的國際申請和德國專利申請DE10149786、DE10214395、DE10356837、DE102004009704、DE102004025696、DE102004025746、DE102004025694、DE102004025695、DE102004025744、DE102004025745和DE102005012301中有部分描述。其他高通量測序系統(tǒng)包括在Venter,J.等人,Science,2001年2月16日、Adams,M.等人,Science,2000年3月24日和M.J,Levene等人,Science299:682-686,2003年1月以及公開號為20030044781和2006/0078937的美國申請中公開的系統(tǒng)。總體上這類系統(tǒng)涉及通過經(jīng)由在核酸分子上測定的聚合反應(yīng)暫時添加堿基而對具有多個堿基的靶核酸分子進行測序，即實時跟蹤待測序的模板核酸分子上核酸聚合酶的活性。而后可通過確定在堿基添加順序的每一步中哪個堿基正在經(jīng)由核酸聚合酶的催化活性而并入靶核酸的增長互補鏈中來推斷序列。在適合沿著靶核酸分子移動并在活性位點處延伸寡核苷酸引物的位置上提供靶核酸分子復(fù)合物上的聚合酶。在接近活性位點處提供多種標記類型的核苷酸類似物，其中每個可區(qū)分類型的核苷酸類似物與靶核酸序列中的不同核苷酸互補。通過使用聚合酶將核苷酸類似物添加到核酸鏈的活性位點處，來延伸增長的核酸鏈，其中添加的核苷酸類似物與活性位點處的靶核酸的核苷酸互補。對作為聚合步驟的結(jié)果而添加到寡核苷酸引物上的核苷酸類似物進行鑒定。重復(fù)進行提供標記的核苷酸類似物、使增長的核酸鏈聚合和鑒定添加的核苷酸類似物的步驟，以使得核酸鏈進一步延伸并且確定靶核酸的序列。在許多實施方案中，直接鑒定寡核苷酸ESB或COB。直接鑒定可包含以上所述的核酸測序。在一些實施方案中，APS序列編碼衍生物序列，轉(zhuǎn)而鑒定該衍生物序列。例如，多核苷酸ESB和COB可翻譯成肽序列。而后可采用本領(lǐng)域已知的合適的方法鑒定該肽序列。在一些實施方案中，采用質(zhì)譜分析來鑒定代表COB或ESB的序列。包含質(zhì)譜法的測序方法是本領(lǐng)域已知的。在許多實施方案中，衍生物序列如肽采用質(zhì)譜法進行測序。在一些實施方案中，質(zhì)譜法包含片段化(fragmentation)。在一些實施方案中，質(zhì)譜法包含N末端測序。在一些實施方案中，質(zhì)譜法包含C末端測序。在一些實施方案中，質(zhì)譜法包含Edman降解。在許多實施方案中，衍生物序列在鑒定之前經(jīng)歷分離過程。在一些實施方案中，分離過程包含色譜法。在一些實施方案中，分離過程包含HPLC。用于分離過程的合適的分離方法包含，例如，離子交換色譜法或疏水相互作用色譜法。離子交換色譜法可使用包含強酸性(通常為磺酸基團，例如聚苯乙烯磺酸鈉或聚AMPS)、強堿性(季氨基，例如三甲基銨基團，如聚APTAC)、弱酸性(主要是羧酸基團)或弱堿性(伯、仲和/或叔氨基，如聚乙烯胺)官能團的任何基質(zhì)材料。分離方法可以例如使用磺化聚苯乙烯作為基質(zhì)，在酸溶液中加入氨基酸，并使pH穩(wěn)定增加的緩沖液過柱。當(dāng)pH達到其各自的等電點時氨基酸洗脫下來?？赏ㄟ^采用反向色譜法來使用疏水相互作用色譜法。已證明許多可商購的C8和C18硅膠柱通過使用梯度洗脫而成功分離了溶液中的肽。在一些實施方案中，設(shè)計代表ESB、APS和所得的COB的肽序列來提高檢測的容易程度。在一些情況下，可設(shè)計肽序列以改善質(zhì)譜儀中的片段化模式。本領(lǐng)域眾所周知，肽序列中鍵的片段化效率是序列依賴性的(參見，例如Tabb等人,AnalChem.2003March1；75(5):1155以及Klammer等人,Bioinformatics2008,24:348-356)。可利用序列依賴性的片段化效率設(shè)計具有期望的片段化模式的代表性肽序列。在一些實施方案中，設(shè)計代表ESB、APS和所得的COB的肽序列來賦予肽分子某些理化特性。例如，可設(shè)計代表性肽序列以得到在水溶液中的溶解度處于所需范圍內(nèi)的肽分子。再如，可設(shè)計代表性肽序列以得到具有或缺乏所需程度的二級或三級結(jié)構(gòu)的肽分子。又如，可設(shè)計代表性肽序列以得到具有或缺乏二硫鍵的肽分子。再如，可設(shè)計代表性肽序列以得到與選定的靶標具有期望的結(jié)合特性的肽分子。可進一步設(shè)計ESB、CL、APS和所得的COB的序列以在蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)中利用特別負載的tRNA。于是，可完成非天然氨基酸向所得肽分子中的并入。許多實施方案涉及在檢測之前分離與ESB連接的COB或衍生物序列，如肽序列。在一些實施方案中，分離是基于分子的合適的理化性質(zhì)。這些類型的分離對于將分子連續(xù)地引導(dǎo)至檢測器從而增加它們在檢測時的相對豐度以及信號的復(fù)雜度是特別有用的。許多實施方案包含以針對序列的方式對分子的分離。例如，包含特定ESB的所有分子可通過使ESB序列與充分互補的序列雜交、使用ESB特異性連接標簽的親和純化、使用由ESB序列編碼的衍生物序列的親和純化或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的方法而得到分離。分離方法還可針對細胞特異性COB或其一部分。在一些實施方案中，對包含ESB和COB的構(gòu)建體進行分離。例如，可根據(jù)ESB對該構(gòu)建體進行梯度或親和純化分選。在一些實施方案中，分離可包含多維度，例如2、3、4、5、6、7個或更多維度。例如，該構(gòu)建體可根據(jù)一維上的第一APS的分選和根據(jù)另一維上的第二APS的分選以及任選地根據(jù)第三維上的ESB分選而得到分離。在一些實施方案中，分離方法包含通過梯度、在凝膠上、使用電磁場和/或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的分離方法進行的分離。在一些實施方案中，可在檢測之前對包含ESB和/或COB的構(gòu)建體進行分離。例如，可根據(jù)ESB來分離該構(gòu)建體，并且可在分離后檢測該構(gòu)建體中的ESB和/或COB。檢測可以是摩爾比檢測、酶檢測、測序、梯度或凝膠中的差別親和力、電磁場例如UV、熒光或化學(xué)發(fā)光、本文所述的任何檢測方法或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的檢測方法。在一些實施方案中，分離包含固定該構(gòu)建體。例如，可將構(gòu)建體固定至陣列表面或珠上。ESB和/或COB的一部分可用于固定該構(gòu)建體?？蓮墓潭ㄎ恢脵z測ESB和/或COB。在一個實例中，可將包含寡核苷酸的ESB和/或COB固定至涂覆有互補寡核苷酸的珠或微陣列上。a.可檢測的分子或標記物單體本發(fā)明的COB可用多種標記物單體中的任一種進行標記，如放射性同位素、熒光染料、染料、酶、納米顆粒、化學(xué)發(fā)光標記物、生物素或本領(lǐng)域已知的可直接(例如，通過光發(fā)射)或間接(例如，通過熒光標記的抗體的結(jié)合)檢測的其他單體。通常，COB中一個或多個標記的APS是用一個或多個標記物單體標記的，并且由與COB的APS連接的標記物單體提供的信號構(gòu)成了鑒定UBA、COB所結(jié)合的靶標的可檢測代碼。在某些實施方案中，缺乏來自APS的給定信號(例如，暗點)也可構(gòu)成COB代碼的一部分?？膳c本文所述的COB一起使用的標記物單體和將標記物單體引入COB的方法的實例在美國專利7,473,767、美國申請10/542,458、12/324,357、11/645,270和12/541,131中有所描述，它們通過引用整體并入本文。當(dāng)將可檢測分子或標記物單體添加至COB時，除了由本發(fā)明的COB提供的定性分析能力和基于其的分析技術(shù)，本發(fā)明的COB也獨特地適合于進行定量分析。通過在本發(fā)明的COB與生物分子樣品中的其靶分子之間提供一對一結(jié)合，可對樣品中存在的所有靶分子或其代表性部分進行鑒定和計數(shù)。這種對多種分子種類的單獨計數(shù)為確定生物分子樣品中靶分子的絕對或相對濃度提供了精確而直接的方法。此外，單獨針對混合物中的每個分子的能力提供了小型化的益處，包括高靈敏度、最小樣品量需求、由小體積中的溶液相動力學(xué)提供的高反應(yīng)速率和最終非常低的試劑成本。靶分子靶分子或表位是通過UBA的結(jié)合來檢測或測定的分子，該UBA的靶標特異性區(qū)域能識別該靶分子或表位。靶分子的實例包括但不限于蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類、小分子、有機單體或藥物?？赏ㄟ^本文的方法分析的核酸包括：雙鏈DNA、單鏈DNA、單鏈DNA發(fā)夾、DNA/RNA雜合體、RNA(例如，mRNA或miRNA)和RNA發(fā)夾。僅為了方便起見，本文所述的方法主要在分析蛋白質(zhì)或mRNA的背景下進行說明。然而，本文所述的實施方案也可用于檢測非蛋白質(zhì)或非mRNA靶標。在一些實施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。靶分子可以是含有其他成分的生物分子樣品的一部分，或可以是樣品的唯一成分或主要成分。靶分子可以是全細胞或組織的成分、細胞或組織提取物、其分級分離的裂解物或基本純化的分子。靶分子可在溶液或固相中連接至，包括，例如，固體表面，如芯片、微陣列或珠。靶分子也可具有已知的或未知的結(jié)構(gòu)或序列。本文公開的組合物、方法和試劑盒還可用于許多應(yīng)用中來確定樣品中靶分子的存在。例如但不限于，該組合物、方法和試劑盒可用于藥代動力學(xué)研究，包括但不限于藥物代謝、ADME譜分析和毒性研究；用于藥物發(fā)現(xiàn)的靶標驗證；基因表達譜分析、蛋白質(zhì)表達譜分析；蛋白質(zhì)組分析；代謝物組學(xué)研究；翻譯后修飾研究，包括但不限于糖基化、磷酸化、乙酰化和氨基酸修飾，如谷氨酸修飾而形成γ-羧基谷氨酸以及脯氨酸羥基化而形成羥基化；特異性血清或粘膜抗體水平的分析；非核酸診斷指標的評估；外來抗原檢測；等等。在某一實施方案中，至少一個UBA、至少一個ESB或UBA和ESB兩者包含與至少一個靶分子特異性反應(yīng)的至少一個抗體、適體或類肽。在某些實施方案中，至少一個UBA、至少一個ESB或UBA和ESB兩者包含與至少一個靶分子特異性相互作用的結(jié)合蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，ESB包含共同連接體部分。技術(shù)人員將會理解，尤其可根據(jù)特定分子復(fù)合物或可切割組分的性質(zhì)和所采用的SMD技術(shù)和檢測裝置，在束縛或連接至基底上的同時或在溶液中的同時，單獨地檢測本文所述的分子復(fù)合物和分子復(fù)合物的至少一部分。方法本發(fā)明提供了用于檢測和量化生物分子樣品中的靶分子的方法。特別是，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合單獨靶分子的UBA。本發(fā)明還提供了ESB和COB的應(yīng)用(參見圖2)。通過ESB和COB的代碼，UBA與靶分子的結(jié)合導(dǎo)致單細胞中的靶分子的鑒定。在一些實施方案中，ESB/COB復(fù)合物代表信息量子，該信息量子代表靶分子和起源細胞(參見圖1)。還提供了制備和使用此類UBA和/或ESB以及COB的方法。一方面，本發(fā)明提供了鑒定復(fù)雜細胞群體的每個分子中的多個靶分子并保留有關(guān)該靶分子的細胞特異性信息的方法。因此，對于每個細胞測定與該細胞相關(guān)的每個靶分子的量。在一些實施方案中，確定多個信息量子以鑒定復(fù)雜細胞群體的每個細胞中的多個靶分子。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的至少一個靶分子的方法，其包括以下步驟：(a)提供：(i)可能包含至少一個靶分子的細胞群體，(ii)對第一靶分子特異性的第一UBA，(iii)對第一UBA的區(qū)域具有特異性的第一表位特異性條碼ESB，其中該ESB包含第一共同連接體部分，以及(iv)COB群體，其中該COB群體包含第二共同連接體部分，其中第二連接體部分與第一ESB中的第一共同連接體部分是互補的；(b)形成包含至少一個靶分子、第一UBA探針和第一ESB的至少第一復(fù)合物，其中至少一個靶分子與第一UBA結(jié)合，并且ESB與UBA結(jié)合；(c)加入COB群體，其中由至少一個靶分子、第一UBA探針、第一ESB和第一COB形成第二復(fù)合物，并且其中來自第一COB的第二共同連接體部分與來自第一ESB的第一連接體部分結(jié)合，并且其中來自COB群體的COB與來自細胞群體的細胞相關(guān)；以及(d)檢測第二復(fù)合物或第三復(fù)合物的至少一部分。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了通過將UBA與靶分子結(jié)合來檢測和/或量化靶分子的方法。UBA包含至少一個反應(yīng)部分，該反應(yīng)部分允許UBA與靶分子結(jié)合或相互作用；通常以序列特異性的方式、構(gòu)象特異性的方式或這兩種方式；例如但不限于抗原-抗體結(jié)合、適體-靶標結(jié)合等(參見圖2和3)。在一些實施方案中，UBA可以是至少一個探針組的一部分，其包含至少一個第一探針和至少一個第二探針。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了通過將UBA探針組與靶分子結(jié)合來檢測和/或量化靶分子的方法，其中UBA探針組包含第一UBA探針和第二UBA探針。第一UBA探針和第二UBA探針包含至少一個反應(yīng)部分，該反應(yīng)部分允許探針與靶分子的不同區(qū)域例如以序列特異性的方式、構(gòu)象特異性的方式或這兩種方式結(jié)合或相互作用。在一些實施方案中，UBA探針和/或第二UBA探針含有如本文所述的捕獲區(qū)。在某些實施方案中，UBA包含身份部分或身份部分的至少一部分，例如，ESB、COB、ESB和/或連接體寡聚體。身份部分允許在本文所述的方法的檢測步驟中鑒定與靶分子結(jié)合的UBA的存在與否。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了通過將UBA與靶分子結(jié)合來檢測和/或量化靶分子的方法，其中UBA含有身份部分(例如，ESB、COB、ESB和/或連接體寡聚體)。在一些實施方案中，靶分子在細胞內(nèi)直接用表位特異性條碼(ESB)來標記。每個ESB包含可與特定靶分子相關(guān)的獨特代碼。ESB是設(shè)計為與至少一個UBA或UBA的一部分結(jié)合的分子或組裝體；并且在合適的條件下可形成包含ESB、UBA和靶分子的分子復(fù)合物。ESB包含至少一個身份鑒定部分，該身份鑒定部分允許它們與至少一個UBA結(jié)合或相互作用；通常以序列特異性的方式、構(gòu)象特異性的方式或這兩種方式；例如但不限于UBA-抗體結(jié)合、適體-靶標結(jié)合等。在一些實施方案中，ESB與UBA直接或間接地連接。在其他實施方案中，ESB與細胞或樣品中的UBA結(jié)合，例如，作為分析過程的一部分。在某些實施方案中，UBA和/或ESB包含捕獲區(qū)。在一些實施方案中，捕獲區(qū)用于UBA/ESB的分離和/或UBA/ESB向表面內(nèi)的固定。捕獲區(qū)可以是親和標簽、珠、載玻片或陣列。在某些實施方案中，ESB包含共同連接體部分，例如，連接體寡聚體。在某些實施方案中，共同連接體寡聚體與形成細胞起源條碼(COB)的可測定聚合物亞單位(APS)中的共同連接體寡聚體互補。圖3和圖4示出了本發(fā)明的一個實施方案的示意圖，其中采用分配混合合成法將COB附加到靶分子/UBA/ESB復(fù)合物上。圖3在步驟1中示出了用UBA-ESB-CL試劑標記細胞。UBA提供了對細胞中待識別的靶分子的特異性。在一些實施方案中，UBA可以是對表面標志物如CD8或細胞內(nèi)表位如激酶如Stat-3上的磷酸表位具有特異性的抗體。在一些實施方案中，UBA可以是固定的細胞中的靶mRNA的反義DNA。UBA由具有CL部分的ESB來鑒定，CL用于隨后細胞特異性標記信息的加入。圖4在步驟2中示出了分配混合合成的開始。在該實例中，將細胞群體分配至20個管中?？蓪⒓毎后w分入孔、珠或本領(lǐng)域已知的任何合適的表面。在步驟3中，將APS單位加入每個管中。APS通過APS和ESB中的互補CL結(jié)合UBA/ESB復(fù)合物。在步驟4中，給定管中的每個細胞現(xiàn)在已附加到每個UBA-ESB對上，如由管的內(nèi)容物限定的相同亞單位(在該實例中，1-20個APS中的一個)。來自步驟3的每個分配群體現(xiàn)在具有添加至該細胞中所有DBAA上的DAPS“標簽”聚合物亞單位。在步驟5中，將來自20個管的細胞合并到一個管中。1/20的細胞具有相同的APS亞單位。在步驟6中，重復(fù)步驟2-4以將第二APS添加到先前的APS上。在該實例中，一個管中的細胞將具有細胞混合物，所有細胞都以統(tǒng)計學(xué)平均分布的方式具有來自第2輪的APS亞單位和在第1輪中使用的20個APS中的一個。因此，在第2輪，在每個單獨管混合物中，所有聚合物通過加入相同的APS而得到延伸。根據(jù)需要重復(fù)該過程。通過本領(lǐng)域已知的任何方法(包括本文所述的方法)來讀取表位/條碼以及連接的細胞起源特征。所需的分配混合輪數(shù)由試驗中的細胞數(shù)以及對導(dǎo)致確保每個細胞有獨特COB的標簽數(shù)過度表示的統(tǒng)計學(xué)估計所限定。這由以下方程給出：所需其中C=過度表示的確定性，以及其中N=細胞數(shù)因此，如果你有1百萬個細胞并且你想得到99.9%的標簽獨特性的確定性，則你需要：或大約7百萬個標簽。在許多實施方案中，標簽獨特性的高確定性確保將細胞/顆粒鑒定為不同實體的高統(tǒng)計學(xué)顯著性。不受理論所限制，標簽獨特性的高確定性提供了兩種相同的COB標簽來源于相同細胞/顆粒的高可能性。然而，對于106個細胞，7百萬個標簽意味著1000個細胞對可被標記為“相同”細胞。因此，為了獲得僅1/10的存在單對復(fù)制細胞的幾率，該方程應(yīng)設(shè)定為99.99999%因此需要比細胞多16倍的標簽。為了確定給定的輪數(shù)，給定的用于條碼創(chuàng)建的亞單位數(shù)：xy＝T得出如果你有20個亞單位，對于1.7x107個標簽，你需要以下的APS添加循環(huán)：這可以向上舍入(roundup)為6個APS添加循環(huán)。如果你有100個亞單位，你將僅需要3.6輪，或向上舍入為4個APS添加循環(huán)。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用ESB間接地標記細胞內(nèi)的靶分子的方法。細胞群體在分配混合合成方法中進行處理，該方法將指示起源細胞或細胞起源條碼的第二特征附加至表位特異性條碼上。對于蛋白質(zhì)，UBA可以是抗體、雙抗體等，或者對于RNA，可以是反義DNA標簽，而對于核酸，可以是DNA。ESB可以是可由高通量測序方法讀取的核酸或可由質(zhì)譜法測定的化學(xué)亞單位。COB可以是可由高通量測序方法讀取的核酸或可由質(zhì)譜法測定的化學(xué)亞單位。APS可以是DNA或DNA模擬物的特定鏈。APS可通過連接酶連接?？捎糜谶B接的酶的實例包括但不限于DNA連接酶和RNA連接酶如T4DNA連接酶、T4RNA連接酶、嗜熱棲熱菌(Tth)連接酶、水生棲熱菌(Taq)DNA連接酶或激烈火球菌(Pfu)連接酶。化學(xué)連接可使用激活劑和還原劑如碳二亞胺、溴化氰(BrCN)、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/胱胺、N-氰基咪唑、二硫蘇糖醇(DTT)和紫外線進行。在本發(fā)明的范圍內(nèi)也有連接技術(shù)如缺口填補連接，包括但不限于缺口填補OLA和LCR、橋接寡核苷酸連接和校正連接。關(guān)于這些技術(shù)的描述尤其可見于美國專利5,185,243、已公布的歐洲專利申請EP320308和EP439182以及PCT公開號WO90/01069和WO01/57268。APS可通過聚合酶進行延伸?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，例如IlluminaHiSeq2000，包括本文所述的測序方法，經(jīng)由對所有DNA標簽的完全測序來檢測這些APS亞單位。APS可以是按照組合合成程序得到的小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。這些亞單位可通過質(zhì)譜法進行檢測。因此，在一些實施方案中，細胞特異性信息經(jīng)由與其相關(guān)COB(信息來源于該細胞)連接的UBA(針對將被識別的表位的條碼)而組裝(參見圖5)。在一些實施方案中，UBA/ESB/COB復(fù)合物經(jīng)由如本文所述的捕獲區(qū)來分離。在一些實施方案中，捕獲區(qū)用于將UBA/ESB/COB復(fù)合物固定至表面內(nèi)。在一些實施方案中，可在隨后的COB程序(分配混合)之前，利用本領(lǐng)域已知的任何合適的擴增技術(shù)(包括本文所述的技術(shù)，如支鏈或滾環(huán)方法)來擴增UBA上的信息。在一些實施方案中，可將錯誤校正和檢測編碼至亞單位中。實現(xiàn)錯誤檢測和校正的總體思路是將一定的冗余度(即，一些額外數(shù)據(jù))添加到信息中，其接收器可用于檢查所傳遞的信息的一致性，并復(fù)原被確定為錯誤的數(shù)據(jù)。錯誤檢測與校正方案可以是系統(tǒng)的或非系統(tǒng)的：在系統(tǒng)性方案中，發(fā)射器發(fā)送原始數(shù)據(jù)，并附加固定數(shù)目的校驗位(或奇偶校驗數(shù)據(jù))，該校驗位來源于一些確定性算法獲得的數(shù)據(jù)位。如果只需要錯誤檢測，則接收器可簡單地將相同的算法應(yīng)用于所接收的數(shù)據(jù)位并且將其輸出與所接收的校驗位進行比較；如果數(shù)值不匹配，則在傳輸過程中的某一點發(fā)生了錯誤。在使用非系統(tǒng)性代碼的系統(tǒng)中，原始信息被轉(zhuǎn)化為具有至少與原始信息一樣多的位元的編碼信息。錯誤檢測與校正方案包括重復(fù)代碼、奇偶校驗位、校驗和、循環(huán)冗余校驗(CRC)、密碼雜湊函數(shù)、錯誤校正碼、自動重復(fù)請求、混合ARQ、錯誤校正代碼、卷積碼、分組碼如漢明碼、多維奇偶校驗碼、Reed-Solomon碼、渦輪碼和低密度奇偶校驗碼(LDPC)。在一些實施方案中，如果未添加聚合物，則每一輪的鏈被阻止進一步添加。如果每一輪使用不同的突出端進行互補添加，則這可用DNA作為聚合物單位來實現(xiàn)。在一些實施方案中，通過使用本領(lǐng)域已知的方法(包括本文所述的方法)進行測序來讀取表位/條碼以及所連接的細胞起源特征。對于靶蛋白而言，假設(shè)每100bp讀取代表ESB-COB對的測序方法靈敏度如下。感興趣的分子的蛋白質(zhì)拷貝數(shù)為100至100,000。假設(shè)想要讀取具有以下大體分布的100種蛋白質(zhì)：測試1蛋白質(zhì)測試1讀取測試2蛋白質(zhì)測試2讀取100個拷貝202x103202x103500個拷貝201x104201x1041000個拷貝202x104202x10410000個拷貝202x105404x105100000個拷貝202x1060在測試1中，需要能夠讀取2,232,000個序列/細胞，以訪問細胞中所有100種蛋白質(zhì)。采用可以進行2x109次讀取的測序技術(shù)如IlluminaHiSeq2000，這意味著該方法可在約1000個細胞中讀取100種蛋白質(zhì)。然而，如果通過完全避免它們或通過標準化(幾種方法可對此有效)對它們的表示進行“加帽”來限制高拷貝數(shù)蛋白質(zhì)，則我們可以增加可訪問的細胞數(shù)。假定因此進行標準化并將100,000個拷貝限制至10,000個拷貝的限制(測試2)，則讀取的總數(shù)是432,000。即，可讀取約5000個細胞中的100種蛋白質(zhì)。對于mRNA，數(shù)目是不同的，因為RNA通常表達得較低。感興趣的分子的RNA拷貝數(shù)為5至1000(基于Lewin必需基因數(shù))；不計數(shù)特化mRNA的高蛋白質(zhì)產(chǎn)生如肌動蛋白或Ig。因此，假設(shè)想要讀取具有以下大體分布的100種mRNA：測試1mRNA測試1讀取5個拷貝6030050個拷貝201000100個拷貝1010001000個拷貝1010000在測試1中，需要能夠讀取12,300個序列/細胞以訪問細胞中所有100種mRNA。采用可以進行2x109次讀取的測序技術(shù)如IlluminaHiSeq2000，這意味著該方法可讀取約162,000個細胞中的100種mRNA。這等同于高參數(shù)流式細胞術(shù)運行。具有相同分布的200種mRNA可以線性轉(zhuǎn)變?yōu)樵诩s80,000個細胞上讀取。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，增加讀取數(shù)將增加細胞數(shù)和可獲得的參數(shù)(例如，mRNA或蛋白質(zhì))。本文所述的任何實施方案可用于檢測多個靶分子。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含用于分析靶分子的UBA的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于多路復(fù)用分析的UBA群體。群體中的每個UBA對靶分子是特異性的。隨后使用ESB-COB對來檢測靶分子與UBA的結(jié)合。每個ESB-COB對包含可與特定靶分子和本文所述的起源細胞相關(guān)的獨特標記物代碼。在一些實施方案中，如下所述的ESB-COB的檢測本質(zhì)上是數(shù)字化的，因為每次計數(shù)一個分子。當(dāng)用熒光讀取代碼時，信號高，并且斑點存在或不存在，因此是數(shù)字化檢測。使用數(shù)字化檢測，而非用于量化信號的模擬熒光信號，導(dǎo)致更精確的量化。因此本文所述的方法允許多路復(fù)用達到超過當(dāng)前可能的水平，以得到更精確的量化和可能更高的靈敏度。生物分子樣品本發(fā)明的UBA和ESB/COB系統(tǒng)可用于檢測任何生物分子樣品中的靶分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，該樣品可包含任何數(shù)量的物質(zhì)，包括但不限于：生物樣品如細胞(包括原代細胞和培養(yǎng)的細胞系)、細胞裂解物或提取物、組織和組織提取物；體液(包括但不限于血液、尿液、血清、淋巴、膽汁、腦脊液、間隙液、房水或玻璃體液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門和陰道分泌物、汗液和精液、滲出液、溢泌物(例如，從膿腫或任何其他感染或炎癥部位獲得的流體)或從幾乎任何生物體的關(guān)節(jié)(例如，正常關(guān)節(jié)或受諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)或膿毒性關(guān)節(jié)炎等疾病影響的關(guān)節(jié))獲得的流體，哺乳動物樣品是優(yōu)選的，并且人類樣品是特別優(yōu)選的；環(huán)境樣品(包括但不限于空氣樣品、農(nóng)業(yè)樣品、水樣品和土壤樣品)；生物戰(zhàn)劑樣品；研究樣品，包括細胞外液、來自細胞培養(yǎng)物的細胞外上清液、細菌內(nèi)的包涵體、細胞區(qū)室、細胞周質(zhì)、線粒體區(qū)室等。生物分子樣品可間接地來源于生物標本。例如，當(dāng)感興趣的靶分子是蛋白激酶時，本發(fā)明的生物分子樣品可以是含有從細胞裂解物分離的蛋白質(zhì)的樣品。在另一個實例中，本發(fā)明的生物分子樣品是通過使生物標本經(jīng)過分級分離例如大小分級分離或膜分級分離而產(chǎn)生的。蛋白質(zhì)分離技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的，并且在至少一些這樣的技術(shù)中使用的試劑盒是可購買到的。蛋白質(zhì)分離技術(shù)通常采用一種或多種以下方法：離析(maceration)和細胞裂解，包括物理、化學(xué)和酶方法；離心；按分子量的分離，如大小排阻色譜法和制備電泳；選擇性沉淀，例如，鹽溶和鹽析程序；各種色譜法；等等。關(guān)于蛋白質(zhì)純化技術(shù)的詳細描述和相關(guān)方案尤其可見于Marchak等人,StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual,ColdSpringHarborPress(1996)；EssentialsfromCells:ALaboratoryManual,D.Spector和R.Goldman,編,ColdSpringHarborPress(2003)；R.Simpson,ProteinsandProteomics:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(2003)；和D.Liebler,IntroductiontoProteomics,HumanaPress(2002)。也可以使用可商購的試劑盒，例如但不限于，可購自CALBIOCHEM.RTM.,LaJolla,Calif的ProteoExtract.TM.部分蛋白質(zhì)組提取試劑盒(PartialProteomeExtractionKits)(P-PEK)和ProteoExtract.TM.完整蛋白質(zhì)組提取試劑盒(CompleteProteomeExtractionKits)(C-PEK)。技術(shù)人員將會理解，供本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒使用的非核酸分析物可以很容易地獲得，而無需使用此類純化技術(shù)和商品化試劑盒進行過多的實驗。本發(fā)明的生物分子樣品可以是天然的例如未經(jīng)過操作或處理，或是經(jīng)處理的，其可包括任何數(shù)量的處理，包括暴露于候選藥劑(包括藥物)、遺傳工程(例如，基因的添加或缺失)等。生物分子樣品還可包括環(huán)境樣品，如含有細菌或其他生物體如硅藻、溝鞭藻類、藻類的樣品，尤其例如在某些?；蜿懟鶚悠分?。COB的檢測COB/ESB復(fù)合物通過本領(lǐng)域中可用的、能夠檢測給定COB/ESB復(fù)合物上的特定序列或信號的任何手段來檢測。在一些實施方案中，可擴增關(guān)于UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的信息?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法進行擴增。在一些情況下，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增關(guān)于UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的信息?？梢允褂玫腜CR技術(shù)的實例包括但不限于定量PCR、定量熒光PCR(QF-PCR)、多重?zé)晒釶CR(MF-PCR)、實時PCR(RT-PCR)、單細胞PCR、限制性片段長度多態(tài)性PCR(PCR-RFLP)、PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP、熱啟動PCR、巢式PCR、原位聚合酶群落PCR、原位滾環(huán)擴增(RCA)、橋式PCR、picotiterPCR和乳液PCR。其他合適的擴增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄擴增、自動維持序列復(fù)制、靶多核苷酸序列的選擇性擴增、共有序列引物聚合酶鏈反應(yīng)(CP-PCR)、任意引物聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、簡并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和基于核酸的序列擴增(NABSA)。本文可使用的其他擴增方法包括美國專利5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中描述的那些方法。在任何實施方案中，關(guān)于UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的信息的擴增可在珠上進行。在本文的任何實施方案中，可從單細胞獲得靶核酸。在本文的任何實施方案中，在擴增步驟(例如，PCR)之前，可對關(guān)于UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的信息進行預(yù)擴增。在一些實施方案中，對UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合進行量化。核酸量化方法是本領(lǐng)域已知的并且包括但不限于氣相色譜法、超臨界流體色譜法、液相色譜法(包括分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、大小排阻色譜法、薄層色譜法和親和色譜法)、電泳(包括毛細管電泳、毛細管區(qū)帶電泳、毛細管等電聚焦、毛細管電色譜法、膠束電動毛細管色譜法、等速電泳、瞬時等速電泳和毛細管凝膠電泳)、比較基因組雜交(CGH)、微陣列、珠陣列和高通量基因分型，如使用分子倒置探針(MIP)。UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的量化可用于確定基因/等位基因拷貝數(shù)、基因或外顯子水平的表達、甲基化狀態(tài)分析，或檢測新型轉(zhuǎn)錄物，以便診斷病癥如胎兒異?；虬┌Y。在一些實施方案中，對UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合進行測序?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的經(jīng)典Sanger測序法來實現(xiàn)測序。測序還可使用高通量系統(tǒng)來實現(xiàn)，其中一些系統(tǒng)允許在測序的核苷酸引入增長中的鏈時或之后立即對其進行檢測，即，實時或基本上實時地檢測序列。在一些情況下，高通量測序產(chǎn)生至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少100,000或至少500,000次序列讀取/小時；其中每次讀取為至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120或至少150個堿基/讀取。在一些實施方案中，高通量測序涉及使用可通過Illumina的HiSeq2000機器獲得的技術(shù)。該機器使用通過合成化學(xué)進行的基于可逆終止子的測序。該機器在八天內(nèi)可進行2千億次DNA讀取。在一些實施方案中，高通量測序涉及使用可通過ABISolidSystem獲得的技術(shù)。該遺傳分析平臺能夠?qū)崿F(xiàn)與珠連接的克隆擴增的DNA片段的大規(guī)模并行測序。該測序方法基于與染料標記的寡核苷酸的相繼連接。在一些實施方案中，高通量測序涉及使用可通過IonTorrentPersonalGenomeMachine(PMG)獲得的技術(shù)。PGM在兩個小時內(nèi)可以進行1千萬次讀取。在一些實施方案中，高通量測序涉及使用可通過HelicosBioSciencesCorporation(Cambridge,Massachusetts)獲得的技術(shù)，如單分子合成測序(SMSS)法。SMSS是獨一無二的，因為其允許在最多達24小時內(nèi)對整個人類基因組進行測序。最后，SMSS在公開號為20060024711、20060024678、20060012793、20060012784和20050100932的美國申請中有部分描述。在一些實施方案中，高通量測序涉及使用可通過454Lifesciences,Inc.(Branford,Connecticut)獲得的技術(shù)，如PicoTiterPlate裝置，該裝置包括光纖板，該光纖板傳輸將由該儀器中的CCD照相機記錄的、測序反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號。光纖的這種使用允許在4.5小時內(nèi)檢測最少2千萬個堿基對。先采用珠擴增而后進行光纖檢測的方法在Marguiles,M.等人,"Genomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypricolitrereactors",Nature,doi:10.1038/nature03959以及公開號為20020012930、20030058629、20030100102、20030148344、20040248161、20050079510、20050124022和20060078909的美國申請中有所描述。在一些實施方案中，使用克隆單分子序列(ClonalSingleMoleculeArray)(Solexa,Inc.)或利用可逆終止子化學(xué)的合成測序(SBS)來進行高通量測序。在美國專利6,969,488、6,897,023、6,833,246、6,787,308和公開號為20040106110、20030064398、20030022207的美國申請和Constans,A.,TheScientist2003,17(13):36中對這些技術(shù)進行了部分描述。在一些實施方案中，高通量測序可使用AnyDot.chips(Genovoxx,Germany)進行。特別是，AnyDot-chips允許將核苷酸熒光信號檢測增強10-50倍。AnyDot.chips及其使用方法在國際公開申請?zhí)朩O02/088382、WO03/020968、WO03/031947、WO2005/044836、PCT/EP05/05657、PCT/EP05/05655和德國專利申請DE10149786、DE10214395、DE10356837、DE102004009704、DE102004025696、DE102004025746、DE102004025694、DE102004025695、DE102004025744、DE102004025745和DE102005012301中有部分描述。其他高通量測序系統(tǒng)包括在Venter,J.等人,Science,2001年2月16日、Adams,M.等人,Science,2000年3月24日和M.J,Levene等人,Science299:682-686,2003年1月以及公開號為20030044781和2006/0078937的美國申請中公開的系統(tǒng)?？傮w上這樣的系統(tǒng)涉及通過經(jīng)由在核酸分子上測定的聚合反應(yīng)暫時添加堿基而對具有多個堿基的靶核酸分子進行測序，即實時跟蹤待測序的模板核酸分子上核酸聚合酶的活性。而后可通過確定在堿基添加順序的每一步中哪個堿基正在經(jīng)由核酸聚合酶的催化活性而并入靶核酸的增長互補鏈中來推斷序列。在適合沿著靶核酸分子移動并在活性位點處延伸寡核苷酸引物的位置上提供靶核酸分子復(fù)合物上的聚合酶。在接近活性位點處提供多種標記類型的核苷酸類似物，其中每個可區(qū)分類型的核苷酸類似物與靶核酸序列中的不同核苷酸互補。通過使用聚合酶將核苷酸類似物添加到核酸鏈的活性位點處，來延伸增長的核酸鏈，其中添加的核苷酸類似物與活性位點處的靶核酸的核苷酸互補。對作為聚合步驟的結(jié)果而添加到寡核苷酸引物上的核苷酸類似物進行鑒定。重復(fù)進行提供標記的核苷酸類似物、使增長的核酸鏈聚合和鑒定添加的核苷酸類似物的步驟，以使得核酸鏈進一步延伸并且確定靶核酸的序列。在一些實施方案中，UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的序列分析可包括通過連接方案(簡并連接)進行的四色測序，其包括將錨引物與四個位置之一雜交。而后進行將引物錨定至用熒光染料標記的簡并九聚體群體的酶連接反應(yīng)。在任何給定的循環(huán)中，所使用的九聚體群體的結(jié)構(gòu)為使得其位置之一的身份與連接至該九聚體的熒光團的身份相關(guān)。在連接酶鑒別該探查的位置的互補性的情況下，熒光信號允許堿基身份的推斷。進行連接和四色成像之后，剝離錨引物：九聚體復(fù)合物，并開始新的循環(huán)。進行連接后對序列信息進行成像的方法是本領(lǐng)域已知的?？赏ㄟ^檢測和/或量化感興趣的組裝檢測復(fù)合物的存在的任何方法來檢測和/或量化一個或多個UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合復(fù)合物。此類方法可包括放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫組織化學(xué)、利用或不利用共聚焦顯微鏡檢查的免疫熒光組織化學(xué)、拉曼光譜法、X射線放射自顯影、X射線放射顯影、發(fā)光光譜法、反相測定、均相酶免疫測定和相關(guān)的非酶技術(shù)、Western印跡法、全細胞染色、免疫電子顯微鏡術(shù)、核酸擴增、基因陣列、蛋白質(zhì)陣列、質(zhì)譜法、膜片鉗、二維凝膠電泳、差示凝膠電泳、基于微球的多重蛋白質(zhì)測定、無標記的細胞測定和流式細胞術(shù)等。美國專利4,568,649描述了采用閃爍計數(shù)的配體檢測系統(tǒng)。這些技術(shù)對于修飾的蛋白質(zhì)參數(shù)是尤其有用的?？墒褂脽晒饣蚱渌麡擞浀膱蟮婪肿觼慝@得蛋白質(zhì)和其他細胞決定簇的細胞讀出值。顯微鏡方法對于測定形態(tài)學(xué)方面的參數(shù)是有用的。流式細胞術(shù)方法對于測定細胞內(nèi)參數(shù)是有用的。當(dāng)在本發(fā)明的方法和組合物中使用熒光標記的組分時，公認不同類型的熒光監(jiān)測系統(tǒng)(例如，細胞計數(shù)(Cytometric)測量裝置系統(tǒng))可用于實施本發(fā)明。在一些實施方案中，使用流式細胞計數(shù)系統(tǒng)或?qū)Ｓ糜诟咄亢Y選的系統(tǒng)，例如96孔或更大的微量滴定板，例如Lakowicz,J.R.，PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,NewYork:PlenumPress(1983)；Herman,B.,Resonanceenergytransfermicroscopy,in:FluorescenceMicroscopyofLivingCellsinCulture,PartB,MethodsinCellBiology,vol.30,編Taylor,D.L.&Wang,Y.-L.,SanDiego:AcademicPress(1989),pp.219-243；Turro,N.J.,ModernMolecularPhotochemistry,MenloPark:Benjamin/CummingsPublishingCol,Inc.(1978),pp.296-361。當(dāng)COB/ESB復(fù)合物是熒光標記的時，可對適當(dāng)激發(fā)源的合適的考慮因素進行研究?？赡艿募ぐl(fā)源可包括但不限于弧光燈、氙燈、激光、發(fā)光二級管或其一些組合。適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)源與適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)檢測系統(tǒng)(例如倒置熒光顯微鏡、表面熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡)結(jié)合使用。優(yōu)選地，使用可允許以足夠的空間分辨率進行檢測的顯微鏡來確定COB/ESB復(fù)合物上斑點的順序。如果例如，COB/ESB復(fù)合物用三種不同的顏色Alexa488、Cy3和Alexa647(分別標記為1、2和3)標記。顏色1、2和3各自在不同的通道中獲得，并且將可看作成排斑點的第一和第二寄存器(register)向上移動幾個像素以便能夠單獨地顯示每個寄存器。用于檢測可在本發(fā)明的方法中使用的多種顏色的方法的實例在美國專利號7,473,767、美國專利公開號2007/0166708、美國申請?zhí)?1/645,270和PCT申請?zhí)朥S06/049274中有所描述，其通過引用整體并入本文?？墒褂脽晒庥嫓y量樣品中的熒光。還可使用檢測熒光的其他方法，例如，量子點方法(參見，例如，Goldman等人,J.Am.Chem.Soc.(2002)124:6378-82；Pathak等人,J.Am.Chem.Soc.(2001)123:4103-4；和Remade等人,Proc.Natl.Sci.USA(2000)18:553-8，各自通過引用明確地引入本文)以及共聚焦顯微鏡檢查。在一些實施方案中，F(xiàn)ACS細胞分選儀(例如，F(xiàn)ACSVantageTM,LSRII或CantoCellSorter,BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose,Calif.)用于根據(jù)存在或不存在COB/ESB復(fù)合物來分選和收集細胞。通過賦予含有陽性細胞的小滴電磁電荷，可將該細胞與其他細胞分離。而后可在無菌收集容器中收獲陽性選擇的細胞。這些細胞分選程序在例如FACSVantageTM.培訓(xùn)手冊中有詳細描述，具體參見第3-11至3-28以及10-1至10-17節(jié)，關(guān)于上述儀器的內(nèi)容，其通過引用整體并入本文。在另一實施方案中，可基于COB/ESB復(fù)合物的存在與否采用細胞的磁分離來分選陽性細胞。在這類分離技術(shù)中，將要進行陽性選擇的細胞首先與包含可回收顆粒(例如，磁響應(yīng)性顆粒)的COB/ESB復(fù)合物接觸。而后可例如利用磁場將該細胞與非陽性或未標記的細胞進行物理分離。當(dāng)使用磁響應(yīng)性顆粒時，可利用磁場將陽性細胞或標記的細胞保留在容器中，同時去除陰性細胞。這些以及相似的分離程序在例如BaxterImmunotherapyIsolex培訓(xùn)手冊中有所描述，其整體并入本文。在一些實施方案中，將一種或多種細胞包含在96孔板或其他可商購的多孔板的孔中。在備選的實施方案中，反應(yīng)混合物或細胞在細胞計數(shù)測量裝置中?？捎糜诒景l(fā)明的其他多孔板包括但不限于384孔板和1536孔板。用于容納反應(yīng)混合物或細胞并可用于本發(fā)明的其他容器對于技術(shù)人員將是顯而易見的。在一些實施方案中，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測量COB/ESB復(fù)合物的豐度。已用特定元件標記的UBA與COB/ESB復(fù)合物結(jié)合。當(dāng)將細胞引入ICP中時，其被霧化和電離。測定包括COB/ESB復(fù)合物在內(nèi)的細胞的元件組分。與COB/ESB復(fù)合物上的標記物相對應(yīng)的信號的存在和強度指示該細胞上COB/ESB復(fù)合物的豐度(Tanner等人,SpectrochimicaActaPartB:AtomicSpectroscopy,(2007),62(3):188-195.)。在一些實施方案中，“流式細胞儀”是一種微流體裝置，其中在設(shè)計為引導(dǎo)細胞在幾組平行的多通道中通過檢測裝置的通道中進行細胞測量或細胞內(nèi)含物的一些測量。參見美國專利7,378,280、7,294,503、7,294,298和6,830,936。在一些實施方案中，細胞或其內(nèi)含物的某些部分經(jīng)超聲包裹在液體的單獨小滴內(nèi)，并利用設(shè)計為測定每個單獨小滴的特征和這些小滴內(nèi)的材料的檢測系統(tǒng)進行探查。靈活的硬件和軟件使儀器適應(yīng)于多種應(yīng)用。軟件程序模塊允許方法的構(gòu)建、修改和運行。系統(tǒng)診斷模塊允許儀器校準、正確連接和馬達運行。定制工具、實驗室器具和液體、顆粒、細胞和生物體傳輸模式允許進行不同應(yīng)用。數(shù)據(jù)庫允許方法和參數(shù)的儲存。機撲(robotic)接口和計算機接口允許儀器之間的通信。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括液體處理組件的使用。液體處理系統(tǒng)可包括包含任意數(shù)量的組件的機撲系統(tǒng)。此外，本文概述的任何或所有步驟可以是自動化的；因此，例如，該系統(tǒng)可以是完全或部分自動化的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，存在眾多可以使用的組件，包括但不限于一個或多個機撲臂；用于微孔板定位的平板處理器(handler)；取下或更換非交叉污染板上的孔蓋的自動化蓋或帽處理器；用于利用一次性吸頭進行樣品分布的吸頭組裝件；用于樣品分布的可洗吸頭組裝件；96孔加載塊；冷卻試劑架；微量滴定板移液管位置(任選地冷卻的)；平板和吸頭的堆積塔；以及計算機系統(tǒng)。完全機撲或微流體系統(tǒng)包括自動化的液體、顆粒、細胞和生物體處理，包括高通量移液以進行篩選應(yīng)用的所有步驟。這包括液體、顆粒、細胞和生物體操作，如抽吸、分配、混合、稀釋、洗滌、精確體積轉(zhuǎn)移；回收和丟棄移液吸頭；以及重復(fù)吸移相同體積以從單次樣品抽吸中進行多次遞送。這些操作是無交叉污染的液體、顆粒、細胞和生物體轉(zhuǎn)移。該儀器進行微孔板樣品通向過濾器、膜和/或子板、高密度轉(zhuǎn)移器、全板系列稀釋和高容量操作的自動化重復(fù)。在一些實施方案中，使用化學(xué)衍生的顆粒、板、盒、管、磁性顆?；?qū)y定組分具有特異性的其他固相基質(zhì)。微孔板、管或任何固相基質(zhì)的結(jié)合表面包括非極性表面、高極性表面、促進共價結(jié)合的經(jīng)修飾的葡聚糖涂層、抗體涂層、結(jié)合融合蛋白或肽的親和介質(zhì)、表面固定的蛋白質(zhì)如重組蛋白A或G、核苷酸樹脂或涂層，并且其他親和基質(zhì)在本發(fā)明中也是有用的。在一些實施方案中，將用于多孔板、多通管、支持器、盒、微型管、超聲懸浮和包裹、深孔板、微量離心管、冷凍管、方孔板、過濾器、芯片、微通道芯片、微流體芯片、光纖、珠和其他固相基質(zhì)的平臺或具有多種體積的平臺安裝在可升級的模塊平臺上以提供額外的容量。該模塊平臺包括變速軌道振蕩器，和用于源樣品、樣品和試劑稀釋的多位置工作臺、測定板、樣品和試劑儲存器、移液吸頭和活性洗滌站。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括使用讀板器。在一些實施方案中，熱循環(huán)儀和溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)用于穩(wěn)定熱交換器的溫度，如提供孵育樣品從0℃至100℃的精確溫度控制的控制組塊或平臺。在一些實施方案中，可與單個或多個磁探頭、親和探頭或移液管互換的移液管頭(單通道或多通道)機撲地操作液體、顆粒、細胞和生物體。多孔或多管磁力分離器或平臺以單樣品或多樣品形式操作液體、顆粒、細胞和生物體。在一些實施方案中，儀器將包括檢測器，該檢測器根據(jù)標記物和試驗可以是多種不同的檢測器。在一些實施方案中，有用的檢測器包括具有多熒光通道的顯微鏡；讀板器，以提供具有單和雙波長端點和動力學(xué)能力、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、發(fā)光、猝滅、雙光子激發(fā)和強度再分配的熒光、紫外線和可見光分光光度檢測；捕獲數(shù)據(jù)和圖像并將其轉(zhuǎn)換為可定量格式的CCD相機；以及計算機工作站。在一些實施方案中，機撲裝置包括與存儲器和一組輸入/輸出設(shè)備(例如，鍵盤、鼠標、監(jiān)視器、打印機等)通過總線進行通信的中央處理器。此外，如下所述，這可補充或替代用于本發(fā)明多路復(fù)用裝置的CPU。中央處理器、存儲器、輸入/輸出設(shè)備與總線之間的一般交互是本領(lǐng)域已知的。因此，根據(jù)將要運行的實驗，將多種不同的流程存儲在CPU存儲器中。這些機撲流體處理系統(tǒng)可利用任何數(shù)量的不同試劑，包括緩沖液、試劑、樣品、洗滌液、測定組分如標記物探針等。靶分子檢測的應(yīng)用本發(fā)明的組合物和方法可用于診斷、預(yù)后、治療、患者分層、藥物開發(fā)、治療選擇和篩選目的。本發(fā)明提供了采用本發(fā)明的方法可從單一生物分子樣品同時分析許多不同靶分子的優(yōu)點。這允許例如對一個樣品進行數(shù)種診斷試驗。本發(fā)明的組合物和方法可用于蛋白質(zhì)組學(xué)。本文所述的方法通常將提供對于該應(yīng)用非常理想的快速應(yīng)答。本文所述的方法和組合物可在尋找可用于診斷和預(yù)后以及用作健康和疾病指標的生物標志物的過程中使用。本文所述的方法和組合物可用于篩選藥物，例如，藥物開發(fā)、治療選擇、治療效果的確定和/或鑒定用于藥物開發(fā)的靶標。在涉及藥物的篩選試驗中檢測蛋白質(zhì)表達的能力是非常重要的，因為蛋白質(zhì)是體內(nèi)的最終基因產(chǎn)物。在一些實施方案中，本文所述的方法和組合物將同時測定蛋白質(zhì)和基因兩者的表達，這將提供最多的關(guān)于正在進行的特定篩選的信息。本發(fā)明的組合物和方法可用于基因表達分析。本文所述的方法區(qū)分核苷酸序列。靶核苷酸序列之間的差異可以是例如單核酸堿基差異、核酸缺失、核酸插入或重排。還可以檢測這類涉及一個以上堿基的序列差異。在一些實施方案中，UBA，例如，寡核苷酸探針，具有基本相同的長度，使得它們在基本相似的雜交條件下與靶核苷酸序列雜交。因此，本發(fā)明的方法能夠檢測傳染病、遺傳病和癌癥。其在環(huán)境監(jiān)測、法醫(yī)學(xué)以及食品科學(xué)中也是有用的?？稍诤怂嵘线M行的遺傳分析的實例包括例如SNP檢測、STR檢測、RNA表達分析、啟動子甲基化、基因表達、病毒檢測、病毒亞型分型和抗藥性。本方法可用于分析獲自或來源于患者的生物分子樣品，以便確定樣品中是否存在患病細胞類型，疾病的階段，患者的預(yù)后，患者響應(yīng)于特定治療的能力，或?qū)颊叩淖罴阎委?。本方法還可用于鑒定特定疾病的生物標志物。在一些實施方案中，本文所述的方法用于病癥的診斷。如本文所用的術(shù)語病癥的“診斷”包括預(yù)測或診斷病癥、確定病癥易感性、監(jiān)測病癥的治療、診斷疾病的治療反應(yīng)以及病癥的預(yù)后、病癥進展和對病癥特定治療的響應(yīng)。例如，可根據(jù)本文所述的任何方法來測定血液樣品，以確定樣品中疾病標志物或惡性細胞類型的存在和/或量，從而對疾病或癌癥進行診斷或分期。在一些實施方案中，本文所述的方法和組合物用于病癥的診斷和預(yù)后。許多免疫性、增生性和惡性疾病和病癥特別適合于本文所述的方法。免疫性疾病和病癥包括變應(yīng)性疾病和病癥、免疫功能紊亂和自身免疫疾病和病況。變應(yīng)性疾病和病癥包括但不限于變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、變應(yīng)性哮喘、特應(yīng)性濕疹、特應(yīng)性皮炎和食物變態(tài)反應(yīng)。免疫缺陷包括但不限于重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)、嗜酸細胞增多綜合征、慢性肉芽腫病、I型和II型白細胞粘附缺陷、高IgE綜合征、ChediakHigashi、中性白細胞增多癥、中性白細胞減少癥、發(fā)育不全、丙種球蛋白缺乏血癥、高IgM綜合征、迪喬治/腭-心-面綜合征以及干擾素γ-TH1途徑缺陷。自身免疫和免疫調(diào)節(jié)異常疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、格雷夫斯病、格雷夫斯眼病、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、系統(tǒng)性硬化癥、甲狀腺腫和淋巴瘤性甲狀腺腫(橋本甲狀腺炎、淋巴細胞性甲狀腺腫)、斑禿、自身免疫性心肌炎、硬化萎縮苔蘚、自身免疫性葡萄膜炎、艾迪生病、萎縮性胃炎、重癥肌無力、特發(fā)性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、原發(fā)性膽汁性肝硬化、韋格納肉芽腫病、結(jié)節(jié)性多動脈炎和炎性腸病、同種異體移植物排斥和對傳染性微生物或環(huán)境抗原的變態(tài)反應(yīng)引起的組織破壞?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法進行評估的增生性疾病和病癥包括但不限于新生兒血管瘤病；繼發(fā)性進行性多發(fā)性硬化；慢性進行性骨髓退行性疾病；多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤?。还?jié)細胞性神經(jīng)瘤??；瘢痕疙瘩形成；骨佩吉特??；纖維性囊腫病(例如，乳房或子宮纖維性囊腫病)；結(jié)節(jié)?。籔eronies和Duputren纖維化、硬化、動脈粥樣硬化和血管再狹窄。可通過本發(fā)明的方法進行評估的惡性疾病和病癥包括惡性血液病和實體瘤。當(dāng)樣品是血液樣品時，惡性血液病尤其適合于本發(fā)明的方法，因為這類惡性病涉及到血液承載的細胞的變化。這類惡性病包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非B細胞淋巴瘤和其他淋巴瘤、急性或慢性白血病、紅細胞增多癥、血小板增多癥、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常疾病、骨髓增生性疾病、骨髓纖維化、非典型免疫淋巴增生和漿細胞疾病?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法進行評估的漿細胞疾病包括多發(fā)性骨髓瘤、淀粉樣變性和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥。實體瘤的實例包括但不限于結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、腦瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、膀胱腫瘤、黑素瘤、肝癌、骨肉瘤和其他骨癌、睪丸癌和卵巢癌、頭頸腫瘤和宮頸腫瘤。遺傳疾病也可通過本發(fā)明的方法進行檢測。這可通過針對染色體和基因畸變或針對遺傳疾病的產(chǎn)前和產(chǎn)后篩查來進行。可檢測的遺傳疾病的實例包括：21-羥化酶缺乏癥、囊性纖維化、脆性X綜合征、特納綜合征、迪謝納肌營養(yǎng)不良、唐氏綜合癥或其他三體性、心臟病、單基因病、HLA分型、苯丙酮尿癥、鐮狀細胞性貧血、泰-薩克斯病(Tay-SachsDisease)、地中海貧血、克萊恩費爾特綜合征、亨廷頓病、自身免疫性疾病、脂沉積癥、肥胖缺陷、血友病、先天性代謝缺陷和糖尿病。本文所述的方法可用于通過分別確定樣品中細菌或病毒的標志物的存在和/或量來診斷病原體感染，例如，細胞內(nèi)細菌和病毒的感染。許多傳染病可通過本發(fā)明的方法來檢測。通常，這些是由細菌、病毒、寄生蟲和真菌傳染原引起的。還可利用本發(fā)明來確定各種傳染原對藥物的抗性。可通過本發(fā)明檢測的細菌傳染原包括大腸桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬(KlESBiella)、假單胞菌屬、單核細胞增生利斯特氏菌、結(jié)核分支桿菌、鳥型細胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumaviumintracellulare)、耶爾森氏菌屬、弗朗西斯氏菌屬、巴斯德氏菌屬、布魯氏菌屬、梭菌屬、百日咳博代氏菌、擬桿菌屬、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、B-溶血性鏈球菌、棒桿菌屬、軍團菌屬、支原體屬、脲原體屬、衣原體屬、淋病奈瑟氏球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血桿菌、糞腸球菌、普通變形菌、奇異變形菌、幽門螺桿菌、徹白密螺旋體、伯氏疏螺旋體、回歸熱疏螺旋體、立克次體病原體、諾卡氏菌屬和放線菌屬(Acitnomycetes)?？赏ㄟ^本發(fā)明檢測的真菌傳染原包括新型隱球菌、皮炎芽生菌、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、白色念珠菌、煙曲霉(Aspergillusfumigautus)、藻菌目(根霉屬)、申克孢子絲菌、著色真菌病和馬杜拉分支菌病?？赏ㄟ^本發(fā)明檢測的病毒傳染原包括人免疫缺陷病毒、人T細胞淋巴細胞病毒(humanT-celllymphocytotrophicvirus)、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、EB病毒、巨細胞病毒、人乳頭瘤病毒、正黏病毒、副黏病毒、腺病毒、冠狀病毒、彈狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、披膜病毒、布尼病毒(bunyaviruses)、嵌沙樣病毒(arenaviruses)、風(fēng)疹病毒和呼腸病毒。可通過本發(fā)明檢測的寄生蟲傳染原包括惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、盤尾絲蟲(Onchovervavolvulus)、利什曼原蟲屬、錐體蟲屬的種、血吸蟲屬的種、溶組織內(nèi)阿米巴、隱孢子蟲屬、賈第蟲屬的種、滴蟲屬的種、結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balatidiumcoli)、班氏吳策線蟲屬、弓形蟲屬的種、蠕形住腸蟯蟲、人蛔蟲、鞭形鞭蟲、麥地那龍線蟲(Dracunculusmedinesis)、吸蟲類、闊節(jié)裂頭絳蟲、絳蟲屬的種、卡氏肺囊蟲和美洲板口線蟲(Necatoramericanis)。本發(fā)明還可用于檢測傳染原的抗藥性。例如，抗萬古霉素糞腸球菌、抗甲氧西林金黃色葡萄球菌、抗青霉素肺炎鏈球菌、多重耐藥性結(jié)核分枝桿菌和抗AZT人類免疫缺陷病毒都可利用本發(fā)明進行鑒定。因此，使用本發(fā)明的組合物和方法檢測的靶分子可以是患者標志物(如癌癥標志物)或由外來物引起的感染的標志物如細菌或病毒標志物。由于UBA/ESB/COB的定量性質(zhì)，本發(fā)明的組合物和方法可用于量化其豐度指示生物學(xué)狀態(tài)或疾病狀況的靶分子，例如，由于疾病狀態(tài)而被上調(diào)或下調(diào)的血液標志物。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于細胞因子檢測。本文所述方法的低靈敏度將有助于例如作為病癥生物標志物的細胞因子的早期檢測，諸如癌癥等疾病的診斷或預(yù)后，以及亞臨床狀況的鑒定。試劑盒本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的一種或多種組分的試劑盒。試劑盒可包含，例如，一個或多個UBA、一個或多個ESB和/或一個或多個APS。試劑盒可用于對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的任何目的，包括以上所述的目的。在某些實施方案中，本發(fā)明還提供了可用于延伸和選擇性固定COB、UBA、ESB和/或其組合的試劑盒。該試劑盒可包含固定用基底和一種或多種結(jié)合配偶體以促進COB、UBA、ESB和/或其組合的延伸和固定。在某些實施方案中，結(jié)合配偶體可包含可用于以適當(dāng)?shù)牧ρ由霤OB、UBA、ESB和/或其組合的部分。在某些實施方案中，結(jié)合配偶體可促進COB、UBA、ESB和/或其組合向表面上的固定或選擇性固定。在進一步的實施方案中，試劑盒可包含能夠延伸COB、UBA、ESB和/或其組合的裝置。試劑盒可包含如本文所述的COB、APS、UBA、ESB和/或其組合的群體。試劑盒可包含用一種或多種用于標記APS的組分預(yù)標記的APS或未標記的APS。此外，在試劑盒中提供的ESB和/或APS可具有或可不具有預(yù)連接的UBA。在一個實施方案中，在試劑盒中提供不與ESB和/或APS連接的UBA。試劑盒可包含其他試劑如連接體寡聚體和橋接寡聚體。在一些實施方案中，試劑盒可將UBA分至不同的預(yù)混合物中。試劑盒還可包括其他試劑，例如，用于進行雜交反應(yīng)的緩沖液、連接體、限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶I。試劑盒還將包括使用該試劑盒的組分和/或制備和/或使用APS、COB、UBA和/或ESB的說明書。實施例預(yù)見性實施例1–寡核苷酸的制備可根據(jù)本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)合成寡核苷酸。例如，可在394ADNA合成儀(AppliedBiosystemsDivision,Perkin-ElmerCorp.,FosterCity,Calif.)上合成寡核苷酸。寡核苷酸在55℃下過夜脫保護后，通過乙醇沉淀來純化。用于PCR擴增的寡核苷酸的引物特異性部分通過在10%丙烯酰胺/7M尿素凝膠上的聚丙烯酰胺凝膠電泳來純化。電泳后通過對發(fā)光屏進行紫外線投影而將寡核苷酸進行可視化，并且將其從凝膠上切離(AppliedBiosystemsInc.,1992)。然后將其在64℃下于TNE(即Tris-鈉EDTA)緩沖液(含有500mMNaCl和5mMEDTA的100mMTris/HClpH8.0)中洗脫過夜，并按照生產(chǎn)商的說明書用SepPak柱(MilliporeCorp,Milford,Mass.)從洗出液中回收。將寡核苷酸重懸于100μlTE(即含有1mMEDTA的10mMTri-HClpH8.0)中。這些原始寡核苷酸溶液的典型濃度為約1μg/μl或大約74pm/μl。作為連接反應(yīng)的前提，將寡核苷酸用T4多核苷酸激酶在5’端進行磷酸化。將相當(dāng)于200pm的寡核苷酸小份與10μl10x激酶緩沖液(500mMTris/HClpH8.0，100mMMgCl2)、10μl10mMATP、20UT4激酶和足量的水-ME混合得到100μl的終體積。磷酸化在37℃下進行30分鐘，隨后在85℃下孵育10分鐘以滅活T4酶。將寡核苷酸溶液調(diào)整至合適的濃度。將經(jīng)激酶處理的寡核苷酸溶液在水中稀釋4倍以得到1000fm/μl的濃度。通過將相當(dāng)于200pm的體積的寡核苷酸與足量的水混合以得到400μl的終體積來制備寡核苷酸溶液。這對每個寡核苷酸產(chǎn)生了1000fm/μl的溶液。將經(jīng)激酶處理和未經(jīng)激酶處理的寡核苷酸的小份(20μl)冷凍以待后續(xù)使用。用于點擊化學(xué)的寡核苷酸合成和純化的一般方法如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011)所述合成寡核苷酸。簡言之，從LinkTechnologiesandAppliedBiosystems購得標準DNA亞磷酰胺、固體載體和其他試劑。在AppliedBiosystems394自動化DNA/RNA合成儀上使用酸催化的脫三苯甲基、偶聯(lián)、加帽和碘氧化的標準0.2或1.0微摩爾亞磷酰胺循環(huán)來合成寡核苷酸。在使用前即時將所有β-氰乙基亞磷酰胺單體溶解在無水乙腈中得到0.1M的溶液。正常A、G、C和T單體的偶聯(lián)時間是35秒，而反向亞酰胺(amidites)的偶聯(lián)時間是180秒。炔烴亞磷酰胺單體(圖2中的2c，El-Sagheer等人,PNAS,108:28,11338-11343,2011)和其他非標準單體偶聯(lián)360秒。通過在室溫下暴露于濃縮氨水溶液60分鐘，而后在密封管中于55℃加熱5小時，將寡核苷酸從固體載體上切下并脫保護。使用XBridgeTMBEH300PrepC1810μM10x250mm柱(Waters)，在Gilson系統(tǒng)上通過反相HPLC純化寡核苷酸，其中乙酸銨中乙腈的梯度(0%至50%緩沖液B，30分鐘，流速4mL/min)，緩沖液A：0.1M乙酸銨，pH7.0，緩沖液B：0.1M乙酸銨，pH7.0，含有50%乙腈。通過在305nm或295nm處的紫外吸收來監(jiān)測洗脫。在HPLC純化后，使用NAP-10柱將寡核苷酸脫鹽并通過凝膠電泳進行分析。i)3′-炔烴寡核苷酸的合成3’-炔烴寡核苷酸的合成如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011)所述進行。簡言之，使用3′-炔丙基胸苷亞磷酰胺單體2c，并通過使用A、G、C和T的3′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)脫氧核苷-5′-亞磷酰胺(反向亞磷酰胺，LinkTechnologies)以5′至3′方向組裝所需序列，或通過根據(jù)El-Sagheer等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107(35):15329-15334.)所述將5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-3′-O-炔丙基-5-甲基-脫氧胞苷連接至固體載體(33μmol/g負載，AM聚苯乙烯，AppliedBiosystems)，從而合成3′-炔烴寡核苷酸。將樹脂裝入扭轉(zhuǎn)柱(GlenResearch)中，而后用來通過標準亞磷酰胺寡核苷酸合成以3′至5′方向組裝所需序列。然后如上所述將寡核苷酸切下、脫保護和純化。ii)5′-疊氮寡核苷酸的合成5’-疊氮寡核苷酸的合成如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011)所述進行。簡言之，如一般方法(上述)所述，以0.2或1.0μmol的規(guī)模(三苯甲基脫離)，由正常的5’-HO-dC、5′-HO-dT(或由5′-碘代-dT，使用可從GlenResearch購得的5′-碘代dT單體)組裝寡核苷酸。為了將5′-羥基轉(zhuǎn)換為5′-碘代，用0.5M的DMF中的甲基三苯氧基碘化鏻溶液(1.0mL)處理連接至合成柱的受保護的寡聚體，該溶液在室溫下經(jīng)由兩個1mL的注射器定期過柱15分鐘。而后用無水DMF洗柱數(shù)次。為了將5′-碘代(dT或dC)轉(zhuǎn)換為5′-疊氮基(dT或dC)，將疊氮鈉(50mg)在無水DMF(1mL)中懸浮，在70℃下加熱10分鐘，而后冷卻，并將上清液吸入1mL注射器中，反復(fù)過柱，而后置于室溫過夜(或55℃下5小時)。然后用DMF和乙腈洗柱，并通過通入氬氣流進行干燥。如上所述，將得到的5′-疊氮寡核苷酸從固體載體上切下、脫保護并純化。iii)3′-炔烴-5′-疊氮寡核苷酸的合成3’-炔烴-5’疊氮寡核苷酸的合成如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011)所述進行。簡言之，將聚苯乙烯固體載體上的5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-3′-O-炔丙基-5-甲基脫氧胞苷裝入扭轉(zhuǎn)柱(GlenResearch)中，并用來利用5′端的5′-碘代dT、5′-HO-dT或5′-HO-dC以3′至5′方向組裝所需序列(標準的亞磷酰胺寡核苷酸合成)。然后使用以上對于5′-疊氮寡核苷酸的合成所述的條件將5′-羥基或碘代基團轉(zhuǎn)換為疊氮化物。預(yù)見性實施例2.點擊化學(xué)連接將寡核苷酸APS與模板退火并保持在4℃下過夜。CuI點擊催化劑溶液由如Chan等人(ChanTR,HilgrafR,SharplessKB和FokinVV(2004)Polytriazolesascopper(I)-stabilizingligandsincatalysis.Org.Lett.6(17):2853-2855；2.8μmol，在0.2MNaCl中，38.0μL)所述的三羥丙基三唑配體、抗壞血酸鈉(4.0μmol，在0.2MNaCl中，8.0μL)和CuSO4·5H2O(0.4μmol，在0.2MNaCl中，4.0μL)制備。將該溶液加入到退火的寡核苷酸中，并將反應(yīng)化合物保持在0℃下1小時，然后在室溫下再保持1小時。使用NAP-25凝膠過濾柱除去試劑。預(yù)見性實施例3.珠上COB的分配混合合成在該實施例中，合成了連接至珠上的COB。采用了4種不同的方法將APS組裝至COB中：拼接(Patchwork)COB(圖6)用十種不同的CL寡核苷酸標記氨甲基大孔聚苯乙烯(MPPS)珠，每種CL寡核苷酸具有任選的第一擴增引物互補區(qū)、10種不同ESB序列中的一種和共同退火區(qū)。進行六輪分配混合合成。在每一輪中，將珠分入20個不同的容器中。向每個容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共20個不同的APS。給定輪次中的每個APS進一步包含與該輪中其余APS不同的獨特的子代碼序列。在第一輪中，每個APS包含一端上的與CL寡核苷酸的退火區(qū)互補的退火區(qū)1以及另一端上的退火區(qū)2。添加后，寡核苷酸APS與CL寡核苷酸沿著互補退火區(qū)1雜交。退火區(qū)2保持單鏈并且可與后一輪加入的APS雜交。在隨后的輪次中，每個APS包含一端上的與來自前一輪的APS的可用退火區(qū)互補的退火區(qū)以及另一端上的附加退火區(qū)。加入的APS與前一輪加入的APS沿著互補退火區(qū)雜交。最后一個亞單位任選地包含用于PCR引物或測序引物雜交的第二擴增引物互補區(qū)。CL或者一個或多個APS進一步包含隨機標簽區(qū)，該區(qū)充當(dāng)如上所述的分子計數(shù)器，允許檢測到的COB的隨后標準化。在每一輪加入APS后，將珠合并，并將其分入20個新池(pools)中啟動后一輪。如上所述在每一輪加入新的一組20個具有一對輪次特異性退火區(qū)的APS。加入6個APS后，使用聚合酶/連接酶將珠上雜交的APS拼接在一起。任選地使用針對CL和最后一個APS亞單位上的擴增引物互補區(qū)的引物，PCR擴增COB以供測序。使用引物的特異性退火訂合(stitch)COB(圖7)用十種不同的CL寡核苷酸標記氨甲基大孔聚苯乙烯(MPPS)珠，每種CL寡核苷酸具有任選的第一擴增引物互補區(qū)、10種不同ESB序列中的一種和共同退火區(qū)。進行六輪分配混合合成。在每一輪，將珠分入20個不同的容器中。向每個容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共20個不同的APS。給定輪次中的每個APS進一步包含與該輪中其余APS不同的獨特的子代碼序列。還加入了退火引物。在第一輪中，退火引物具有與CL寡核苷酸互補的互補區(qū)和與APS互補的互補區(qū)。退火引物與二者雜交，將它們訂合在一起。在隨后的輪次中，退火引物具有與在前一輪過程中加入的APS互補的互補區(qū)和與當(dāng)前一輪加入的APS互補的互補區(qū)。同樣，退火引物與來自隨后輪次的APS雜交，將它們訂合在一起。退火引物的互補區(qū)對每一輪具有特異性，從而允許僅來自前一輪和當(dāng)前一輪的亞單位有效雜交。因此，退火引物不與更早輪次的亞單位雜交，這些亞單位不具有與當(dāng)前一輪的退火引物互補的互補區(qū)，因此阻斷了缺失特定輪次的亞單位的COB的進一步合成。最后一個亞單位任選地包含用于PCR引物或測序引物雜交的第二擴增引物互補區(qū)。CL或者一個或多個APS進一步包含隨機標簽區(qū)，該區(qū)充當(dāng)如上所述的分子計數(shù)器，允許檢測到的COB的隨后標準化。在每一輪加入APS和退火引物后，將珠合并，并將其分入20個新池中啟動后一輪。如上所述在每一輪加入新的一組20個具有一對輪次特異性退火區(qū)的APS。加入6個APS后，使用聚合酶/連接酶或使用如實施例2所述的點擊化學(xué)將珠上雜交的APS永久訂合在一起。任選地使用針對CL和最后一個APS亞單位上的擴增引物互補區(qū)的引物，PCR擴增COB以供測序。使用具有共同互補區(qū)的引物的退火訂合COB(圖8)用十種不同的CL寡核苷酸標記氨甲基大孔聚苯乙烯(MPPS)珠，每種CL寡核苷酸具有任選的第一擴增引物互補區(qū)、10種不同ESB序列中的一種和共同退火區(qū)。進行六輪分配混合合成。在每一輪，將珠分入20個不同的容器中。向每個容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共20個不同的APS。給定輪次中的每個APS進一步包含與該輪中其余APS不同的獨特的子代碼序列。還加入了退火引物。在第一輪中，退火引物具有與CL寡核苷酸互補的互補區(qū)和與當(dāng)前一輪加入的APS互補的第二互補區(qū)。退火引物與二者雜交，將它們訂合在一起。在隨后的輪次中，退火引物具有與在前一輪過程中加入的APS互補的第一互補區(qū)和與當(dāng)前一輪加入的APS互補的第二互補區(qū)。同樣，退火引物與來自隨后輪次的APS雜交，將它們訂合在一起。在退火引物的這兩個互補區(qū)中，第一互補區(qū)對每一輪具有特異性，從而允許與僅來自前一輪的亞單位有效雜交。因此，退火引物不與更早輪次的亞單位雜交，這些亞單位不具有與當(dāng)前一輪的退火引物互補的互補區(qū)，因此阻斷了缺失特定輪次的亞單位的COB的進一步合成。最后一個亞單位任選地包含用于PCR引物或測序引物雜交的第二擴增引物互補區(qū)。CL或者一個或多個APS進一步包含隨機標簽區(qū)，該區(qū)充當(dāng)如上所述的分子計數(shù)器，允許檢測到的COB的隨后標準化。在每一輪加入APS和退火引物后，將珠合并，并將其分入20個新池中啟動后一輪。如上所述在每一輪加入新的一組20個具有一對輪次特異性退火區(qū)的APS。加入6個APS后，使用聚合酶/連接酶或使用如實施例2所述的點擊化學(xué)將珠上雜交的APS永久訂合在一起。任選地使用針對CL和最后一個APS亞單位上的擴增引物互補區(qū)的引物，PCR擴增COB以供測序。環(huán)狀COB(圖9)用十種不同的CL寡核苷酸標記氨甲基大孔聚苯乙烯(MPPS)珠，每種CL寡核苷酸具有任選的第一擴增引物互補區(qū)、10種不同ESB序列中的一種、六對APS特異性環(huán)狀退火區(qū)和任選的第二擴增引物互補區(qū)。進行六輪分配混合合成。在每一輪，將珠分入20個不同的容器中。向每個容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共20個不同的APS。給定輪次中的每個APS進一步包含與該輪中其余APS不同的獨特的子代碼序列。APS設(shè)計為以環(huán)狀幾何形狀與CL雜交，沿著對該輪特異性的環(huán)狀退火區(qū)在每一端上與CL雜交。雜交沿著CL填充APS，而后將其連接起來。APS設(shè)計為使其不能沿著對其他輪次特異性的環(huán)狀退火區(qū)與CL有效地雜交。因此，如果來自特定輪次的APS缺失，則APS可能無法成功地連接起來，這取決于連接方法?；蛘?，用缺失的APS合成COB，缺失的APS的位置的側(cè)翼為一對環(huán)狀退火區(qū)。之后可相應(yīng)地對得到的COB進行分析，并且可將其丟棄或可備選地處理重新獲得的信息。CL或者一個或多個APS進一步包含隨機標簽區(qū)，該區(qū)充當(dāng)如上所述的分子計數(shù)器，允許檢測到的COB的隨后標準化。在每一輪加入APS和退火引物后，將珠合并，并將其分入20個新池中啟動后一輪。如上所述在每一輪加入新的一組20個具有一對輪次特異性退火區(qū)的APS。加入6個APS后，使用聚合酶/連接酶或使用如實施例1所述的點擊化學(xué)將珠上雜交的APS永久訂合在一起。任選地使用針對CL上的擴增引物互補區(qū)的引物，PCR擴增COB以供測序。無聚合酶的COB-ESB連接(圖10)用十種不同的CL寡核苷酸標記氨甲基大孔聚苯乙烯(MPPS)珠，每種CL寡核苷酸具有對10種不同環(huán)狀ESB序列中的一種特異性的一對環(huán)狀退火區(qū)和六對APS特異性環(huán)狀退火區(qū)。加入所有10種環(huán)狀ESB序列以環(huán)狀幾何形狀與CL的環(huán)狀ESB特異性部分退火。環(huán)狀ESB序列設(shè)計為使得與CL的環(huán)狀ESB特異性區(qū)域的剩余部分的非特異性退火最小化。環(huán)狀ESB序列包含任選的第一擴增引物互補區(qū)、ESB序列和與CL中環(huán)狀ESB特異性環(huán)狀退火區(qū)充分互補的一對退火區(qū)。進行6輪分配混合合成。在每一輪中，將珠分入20個不同的容器中。向每個容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共20個不同的APS。給定輪次中的每個APS進一步包含與該輪其余APS不同的獨特的子代碼序列。最后一輪中的APS任選地進一步包含第二擴增引物互補區(qū)。APS設(shè)計為以環(huán)狀幾何形狀與CL雜交，沿著對該輪特異性的環(huán)狀退火區(qū)在每一端上與CL雜交。雜交沿著CL填充APS，而后將其連接起來。APS設(shè)計為使其不能沿著對其他輪次特異性的環(huán)狀退火區(qū)與CL有效地雜交。因此，如果來自特定輪次的APS缺失，則APS可能無法成功地連接起來，這取決于連接方法。或者，用缺失的APS合成COB，缺失的APS的位置的側(cè)翼為一對環(huán)狀退火區(qū)。之后可相應(yīng)地對得到的COB進行分析，并且可將其丟棄或可備選地處理重新獲得的信息。CL或者一個或多個APS進一步包含隨機標簽區(qū)，該區(qū)充當(dāng)如上所述的分子計數(shù)器，允許檢測到的COB的隨后標準化。在每一輪加入APS和退火引物后，將珠合并，并將其分入20個新池中啟動后一輪。如上所述在每一輪加入新的一組20個具有一對輪次特異性退火區(qū)的APS。加入6個APS后，使用如實施例2所述的點擊化學(xué)將珠上雜交的APS永久訂合在一起。任選地使用針對CL和最后一個APS亞單位上的擴增引物互補區(qū)的引物，PCR擴增COB以供測序。預(yù)見性實施例4.通過核酸測序的檢測由實施例3中的任意方法得到的組裝的、ESB連接的COB通過Illumina的HiSeq2000機器進行測序。得到的序列包含10種不同ESB序列中的至少一種、隨機標簽區(qū)和來源于在6輪分配混合合成過程中添加到特定珠上的APS的6個子代碼的組合。預(yù)見性實施例5.通過肽測序的檢測(圖11)采用實施例3中的任意方法合成ESB連接的COB。得到的序列包含T7啟動子、SP6起始位點、起始密碼子、ESB、COB和任選的編碼His(6)標簽的區(qū)域(圖11)。可采用用來并入ESB的相同方法，將T7啟動子和SP6起始位點并入與ESB連接的序列中?；蛘?，可將這些序列并入最后的APS中。任選地，可并入His(6)標簽編碼區(qū)，與最后的APS或與ESB連接。采用ExpresswayTMMaxi無細胞大腸桿菌表達系統(tǒng)(Invitrogen)將組裝的、ESB連接的COB轉(zhuǎn)錄并翻譯成肽序列。在使用串聯(lián)質(zhì)譜儀進行測序之前，采用親和色譜法和/或HPLC分離肽序列。預(yù)見性實施例6.COB在細胞表面上的分配混合合成利用COB在細胞表面上的分配混合合成來檢測和量化白細胞細胞系(HL60、JY和U937)上的細胞表面受體。使用抗體-寡核苷酸一體化偶聯(lián)試劑盒(Solulink)，將抗CD1、CD3、CD8和CD4的抗體與實施例3中所述的胺修飾的CL寡核苷酸偶聯(lián)起來。使用針對CL寡核苷酸中的序列的互補寡核苷酸，采用親和色譜法分離單獨標記的抗體，并且使用質(zhì)譜法來證實每一抗體上的標簽數(shù)。將107個細胞的細胞懸浮液與抗體組合在合適的條件下孵育，而后進行6輪分配混合合成。如實施例3或?qū)嵤├?中所述檢測得到的ESB連接的COB。針對每個COB組合，對檢測到的與COB連接的ESB相關(guān)的信號進行量化。成對繪制細胞上CD1、CD3、CD8和CD4抗原中的每一個的共表達。使用主成分分析來確定表達譜中的最強相關(guān)性。預(yù)見性實施例7.COB在細胞中的分配混合合成將甲醇冷卻至-20℃。采用本領(lǐng)域已知的合適的組織培養(yǎng)條件培養(yǎng)包含107個HeLa細胞的細胞培養(yǎng)物。通過抽吸去除生長培養(yǎng)基。立即固定細胞并通過加入50mL冷甲醇進行透化。使細胞在環(huán)境溫度、輕柔振蕩下孵育10分鐘。通過抽吸小心地去除甲醇。用100mL1XPBS漂洗細胞三次。細胞在室溫下用150ml在0.2%PBS中的0.1%酪蛋白溶液在輕柔振蕩下封閉1.5小時。如實施例5所述，兔抗已切割的胱天蛋白酶3、兔抗phos-p38、兔抗phos-ERK2、小鼠抗ERK2和小鼠抗β微管蛋白(克隆AA2)是CL偶聯(lián)的。細胞與CL偶聯(lián)的抗體在4℃、輕柔振蕩下孵育過夜。在室溫下用1XPBS+0.1%Tween-20洗滌細胞5次，每次5分鐘，隨后進行6輪分配混合合成。如實施例3或?qū)嵤├?中所述檢測得到的ESB連接的COB。針對每個COB組合，對檢測到的與COB連接的ESB相關(guān)的信號進行量化。成對繪制細胞中Phospho-p53、ERK1中每一個的共表達。使用主成分分析來確定表達譜中的最強相關(guān)性。雖然本文已經(jīng)顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但對于本領(lǐng)域中技術(shù)人員顯而易見的是，此類實施方案僅通過舉例的方式提供。在不偏離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)將想到眾多更改、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，在實施本發(fā)明的過程中可采用本文所述的本發(fā)明實施方案的各種替代方案。以下權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，從而涵蓋這些權(quán)利要求的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等效方案。