專(zhuān)利名稱(chēng)：一種布魯氏菌抗體免疫膠體金檢測(cè)試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種布魯氏菌抗體免疫膠體金檢測(cè)試紙條，用于動(dòng)物布魯氏菌抗體的檢 測(cè)，本發(fā)明還公開(kāi)了上述試紙條的制備方法，屬于血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(Brucellosis)是由小球桿狀布魯氏菌引起的一種人畜共患傳染病， 在世界各地都有廣泛流行。每年因此病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元，而且此病還 會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅。從上個(gè)世紀(jì)90年代起，人與動(dòng)物發(fā)病率又有上升的趨勢(shì)。
布控、疫原凈化與早期診斷是防治該病的最有效途徑，這就必然要求對(duì)該病進(jìn)行快 速、有效的檢測(cè)，但是對(duì)該病的檢測(cè)有兩困難困擾著這一問(wèn)題。其一，在我國(guó)對(duì)動(dòng)物 該病的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法是GB/T18646-2002，即虎紅平板凝集、試管凝集與補(bǔ)體相結(jié)合的 檢測(cè)方法。用該標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原對(duì)動(dòng)物布魯氏菌抗體檢測(cè)時(shí)，會(huì)與Y. enterocoliticaO : 9、 Salmonella 0:30， E. coli 0:157等細(xì)菌抗體發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，因此該標(biāo)準(zhǔn)的 檢測(cè)結(jié)果的特異性只有70%左右，布魯氏菌病檢測(cè)特異性低，靈敏度低。在我國(guó)對(duì)檢測(cè) 出該病的動(dòng)物采取捕殺政策，每年因錯(cuò)檢、漏檢對(duì)我國(guó)造成的濟(jì)經(jīng)損失達(dá)數(shù)十億元之 巨。第二個(gè)困難是，該病多發(fā)于農(nóng)村與牧區(qū)，基層單位特別是牧區(qū)設(shè)備簡(jiǎn)單、技術(shù)人 員缺少，很難對(duì)該病開(kāi)展廣泛檢測(cè)與流行病學(xué)調(diào)査。因此發(fā)明一種，高特異性、方便 快捷的布魯氏病檢測(cè)方法與試紙，具有重要的現(xiàn)實(shí)與實(shí)踐意義。
布魯氏菌L7/12蛋白是其高免疫原性蛋白。L7/L12基因是該菌高度保守基因，各 型布魯氏菌對(duì)該基因都高度表達(dá)，該基因且與Y. enterocolitica 0 : 9、 Salmonella 0:30， E.coli 0:157等細(xì)菌沒(méi)有同源序列。更值得注意的是，在我們的研究中，該基 因表達(dá)的蛋白，在人、狗、牛、羊都有較高的免疫原性，并且與Y. enterocoliticaO: 9、 Salmonella 0:30, E.coli 0:157抗體沒(méi)有血清學(xué)交叉反應(yīng)。
免疫膠體金技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，得到了迅速發(fā)展。已廣泛應(yīng)用于免疫組織(或細(xì)胞) 化學(xué)檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別是膠體金免疫層析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速靈 敏、結(jié)果清楚，易于判斷和保存，且無(wú)需任何儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，適合于臨床的快速診 斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)査大規(guī)模應(yīng)用。經(jīng)檢索未見(jiàn)有布魯氏菌抗體免疫膠體金檢測(cè)試紙條公開(kāi)的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種檢測(cè)布魯氏菌抗體免疫膠體金試紙條，解決了當(dāng)前布魯氏 菌病檢測(cè)特異性低，靈敏度低的缺點(diǎn)。
本發(fā)明還提供了上述試紙條的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的檢測(cè)布魯氏菌抗體免疫膠體金檢測(cè)試紙條，是以金黃色葡萄球菌A蛋白 (SPA)標(biāo)記膠體金制作金標(biāo)墊，以布魯氏菌L7/L12蛋白包被硝酸纖維膜作為檢測(cè)抗 原線(T)，用兔抗牛IgG或兔抗羊IgG作為質(zhì)控線(C)。 本發(fā)明檢測(cè)試紙條的制備方法如下
用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)標(biāo)記膠體金技術(shù)制作金標(biāo)墊。再克隆出布魯氏菌 L7/L12基因，把它連接到原核表達(dá)載體pET-28a上，而后把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌中， 表達(dá)并純化出L7/L12蛋白，用純化的L7/L12蛋白包被硝酸纖維膜作為檢測(cè)線抗原線 (T);檢測(cè)牛時(shí)用兔抗牛IgG作為質(zhì)控線(C),檢測(cè)羊時(shí)兔抗羊IgG作為質(zhì)控線(C), 即得檢測(cè)試紙條。
主要包括以下步驟
(1) 用SPA標(biāo)記膠體金，制備成膠體金探針，把它噴在玻璃纖維膜上制成膠體金
墊；
(2) 設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以牛布魯氏菌基因組為模板，用PCR擴(kuò)增、并純化出L7/L12
基因；
(3) 把步驟(2)中所得基因連接到質(zhì)粒pET-28a的Nde I和Sal I位置上，構(gòu)建 成原核表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，表達(dá)出L7/L12蛋白；用His-Trp純出L7/L12 蛋白；
(4) 用(3)中的純化的L7/U2蛋白為診斷抗原包被硝酸纖維膜作為本發(fā)明膠體金 試紙條的檢測(cè)線(T線)，用兔抗牛IgG (檢測(cè)牛時(shí))或兔抗羊IgG (檢測(cè)羊時(shí))、作為 質(zhì)控線(C線)；
(5) 將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維膜、吸水濾紙按從上到下依次固定于PVC板上， 制備成檢測(cè)試紙條。
本發(fā)明用純化的L7/12蛋白為檢測(cè)抗原，就能特異性的檢測(cè)出動(dòng)物血清中是否含 有布魯氏菌抗體。用純化的L7/12蛋白進(jìn)一步的制備出膠體金試紙條，保留了其特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，并增強(qiáng)了其靈敏度高、穩(wěn)定性。
本發(fā)明布魯氏菌抗體檢測(cè)膠體金試紙條的積極效果在于檢測(cè)特異性高、靈敏度 高、穩(wěn)定性好、方便、快捷。具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果清楚，易于判斷和保存， 且無(wú)需任何儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，適合于臨床的快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大 規(guī)模應(yīng)用。


圖l為本發(fā)明檢測(cè)試紙結(jié)構(gòu)示意圖2為25mn膠體金鏡鑒定結(jié)果圖； 圖3為純化的融合L7/L12蛋白SDS-PAGE檢測(cè)圖； 圖4為膠體金試紙條的檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解 到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明的任何平行改變和改動(dòng)都將落 入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例1
膠體金探針的制備
1、材料及方法
(1)兔抗牛IgG購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；兔抗牛IgG、兔抗羊IgG購(gòu)自 北京意宏安生物科技有限公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)自聯(lián)星生物科技公司；建立膠體金 免疫層析方法的耗材由上海捷寧生物科技公司提供； (2)膠體金的制備
采用檸檬酸鈉還原法，取硅化過(guò)的三角瓶，加入lOOmL去離子及l(fā)mLP/。氯金酸，
微波爐加熱沸騰；迅速加入不同劑量的1%檸檬酸三鈉，此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸
水溶液很快變成灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過(guò)程約3min，繼續(xù)煮
沸15min，冷卻后用去離子水補(bǔ)足體積至100mL。電鏡下觀察膠體金顆粒的平均直徑、
分散程度及均勻度。
(30膠體金標(biāo)記SPA探針的制備
取100mL三角瓶，加入50mL膠體金；三角瓶中加入磁性轉(zhuǎn)子后放置在磁力攪 拌器上，開(kāi)啟攪拌器邊攪拌邊加入0.1mol/LK2CO3，調(diào)pH至6.2左右；根據(jù)膠體金總 量計(jì)算出所要標(biāo)記的SPA總量。加入金標(biāo)抗體封閉液，加入10%穩(wěn)定劑BSA至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌35min;然后4。C， 3000 rpm離心30 min，棄沉淀；上清液4 。C， 13000 rpm離心，40 min，棄上清加入金標(biāo)抗體洗滌液重懸沉淀；4°C ， 13000 rpm離 心，40 min，棄上清，重復(fù)洗滌2 3次，最后的沉淀物用金標(biāo)保存液做適量稀釋。 (4 )金標(biāo)墊的制備選用優(yōu)質(zhì)的玻璃纖維膜浸入
0. 01mol/LPBS(pH6.2)+l%BSA+0.2%Tween-20+0.05mol/L NaCl配置的溶液中，37。C浸 泡30min，取出置常溫條件下通風(fēng)干燥，干燥條件下保存?zhèn)溆谩?br> 將處理好的玻璃纖維素膜切割成0.55cm左右寬的長(zhǎng)條，長(zhǎng)度依需要而定。稱(chēng)取 蔗糖少量，將其加到上述制備的膠體金標(biāo)記SPA探針溶液中，使之充分溶解混勻，然 后均勻地加到玻璃纖維膜上，4'C放置4h，在低溫條件下風(fēng)干，即為金標(biāo)墊。 (5)為了更好完成上述試驗(yàn)，應(yīng)補(bǔ)充以下實(shí)驗(yàn)。
SPA與膠體金結(jié)合的最佳pH的確定用0. 1 mol/L K2C03結(jié)合精密pH試紙調(diào)節(jié)膠 體金溶液pH依次為4. 0-9. 0，每隔0. 5個(gè)pH值為一個(gè)檢測(cè)梯度。每管加入1 mg/mL 的SPA 50叱，在振蕩器上混勻，室溫下放置20分鐘。然后每孔分別加入100叱10% Nacl 溶液，混勻，室溫放置4h，觀察膠體金顏色變化，記錄保持和空白對(duì)照顏色一致的最 低pH，即為最佳的標(biāo)記pH。
SPA與膠體金結(jié)合的最佳標(biāo)記量確定取1.5mL離心管若干，分別加入已調(diào)整為 最佳標(biāo)記pH (6.2)的膠體金l mL，各管依次加入0、 5、 10、 15.....50叱濃度為
1. 0 mg/mL的SPA，振蕩器上混勻，室溫放置20 min。然后每孔加入100 PL的10% Nacl 溶液，室溫下放置l h,觀察顏色變化，顏色仍保持紅色的最小蛋白量即為最佳蛋白標(biāo)
(6)膠體金標(biāo)記SPA探針的鑒定 用有Formvar膜的鎳網(wǎng)沾取金標(biāo)蛋白溶液，空氣中干燥后磷鎢酸復(fù)染，透射電鏡 下觀察。
2、 結(jié)果
膠體金偶聯(lián)SPA后在電鏡下觀察，可見(jiàn)金顆粒外周有明顯的低電子密度暈圈，表 明金顆粒表面吸附有蛋白質(zhì)。見(jiàn)附圖一。 實(shí)施例2
布魯氏菌L7/L12蛋白基因的克隆、表達(dá)及L7/L12蛋白的純化 1、材料與方法(1) 菌株及質(zhì)粒
布魯氏菌S19、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21(DE3)和pET28 a+載體由軍事醫(yī)學(xué) 科學(xué)院第11所5室保存，pMDl8-T simple vector購(gòu)自TakaRa公司。
(2) 相關(guān)分子生物學(xué)操作
細(xì)菌總DNA的提取、PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒重組、大腸桿菌感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提 取等操作按文獻(xiàn)[6]; T4連接酶、DNA的回收純化按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(購(gòu)自TakaRa 公司)；DNA測(cè)序委托上海生工生物工程公司完成。
(3) L7/L12基因的擴(kuò)增及克隆
設(shè)計(jì)5'端帶有限制性?xún)?nèi)切酶Nde I位點(diǎn)的上游引物5' - catatggctgatctcgca aagatcgtt-3' 和Sal I酶切位點(diǎn)的下游引物
5' -gtcgacttacttgagttcaaccaaggc-3'，以布魯氏菌S19基因組DNA中為模板擴(kuò)增 L7/L12基因。反應(yīng)條件95'C預(yù)變性5min， 94。C變性lmin ， 58'C退火1 min , 72°C 延伸lmin， 30個(gè)循環(huán);最后72。C延伸10min 。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple vector 連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDL7/L12。
(4) 重組質(zhì)粒pETL7/L12的構(gòu)建
用限制性?xún)?nèi)切酶Nde I與Sal I同時(shí)消化pMDL7/L12與pET28 a+，分別凝膠回收 純化L7/L12與線性化的pET28 a+基因片段。用T4連接酶使之連接，而成重組質(zhì)粒 pETL7/L12。
(5) 蛋白的SDS-PAGE分析及純化 將重組表達(dá)質(zhì)粒pETL7/L12轉(zhuǎn)化大腸桿菌LB21(DE3)中，挑取陽(yáng)性克隆菌在LB培
養(yǎng)基中，37°C 180rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，而后l : 100的比例接種至5mLLB培養(yǎng)基中， 37°。培養(yǎng)至<9￡ 600=0.38 ,加入IPTG至終濃度lmmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4h后收菌。將1.5mL 菌液離心取沉淀加入50"L滅菌水和50"L 2XSDS蛋白上樣緩沖液，震蕩混勻后沸 水煮15min后稍離心，取上請(qǐng)20iiL進(jìn)行12M的SDS-PAGE分析。經(jīng)組氨酸結(jié)合樹(shù)脂柱 純化回收可溶性蛋白，得到高純度的蛋白，蛋白電泳可見(jiàn)單一蛋白條帶。 2、結(jié)果
1. L7/L12蛋白純化后SDS-PAGE檢測(cè)
將層析純化的L7/L12蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)可見(jiàn)一清晰條帶，經(jīng)凝膠掃描純度 96%。見(jiàn)附圖3。 實(shí)施例3
魯氏菌病高特異性免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條組裝及測(cè)試1、 材料方法
(1) 材料2992、 903、 8964型樣品墊(sample pad)、 Ahlstrom 8964型玻璃纖維 膜(conjugate release membrane)、 Sartorius CN140、 AE99和PRIMA60型硝酸纖維素 膜(nitrocellulose membrane)、 470和2727型吸水墊(absorbent pad)、 6cmX 30cm、 8cm X30cm型PVC底板均為上海金標(biāo)生物科技有限公司產(chǎn)品。
(2) 樣品墊的處理
取優(yōu)質(zhì)的樣品墊浸入0.01mol/LPBS (pH為7,4)加入0.05%的Tween-20配成的溶 液中，37'C浸泡30min，取出置常溫條件下通風(fēng)干燥，干燥條件下保存?zhèn)溆谩?(3)硝酸纖維膜的處理 將硝酸纖維膜浸入有甲醇溶液內(nèi)浸泡10min，取0.01mol/LPBS(pH7.4)、 BSA、 Tween-20、 NaCl、蔗糖配置硝酸纖維膜的處理液，調(diào)節(jié)溶液的最終pH值為6.5左右； 將膜37。C浸泡30min， PBS洗滌數(shù)次，置于低溫條件下風(fēng)干，徹底干燥。 (4) T線及C線的點(diǎn)膜方法
將純化好的L7/L12蛋白和羊抗鼠IgG用最佳緩沖液分別稀釋至最佳濃度。將稀釋好 的L7/L12蛋白溶液裝入BIODOT劃膜機(jī)噴頭2，固定在距硝酸纖維膜下邊緣Ucm的位置 上，稀釋好的用兔抗牛IgG (檢測(cè)牛時(shí))或兔抗羊IgG (檢測(cè)羊時(shí))裝入BIODOT劃膜 機(jī)噴頭l，固定在距硝酸纖維膜下邊緣1.6cm的位置上。T線與C線間的距離為5.0mm， 參數(shù)均為l.(^L/cm噴在硝酸纖維膜上。將己噴好的硝酸纖維膜4r放置待風(fēng)干后備用。
(5) T線及C線條件的優(yōu)化 設(shè)置幾組不同的抗體濃度對(duì)硝酸纖維膜的T線(檢測(cè)線)和C線(質(zhì)控線)進(jìn)行
優(yōu)化，選出最優(yōu)的一組作為金標(biāo)濃度(T線)和包被濃度(C線)。并對(duì)T線與C線噴 膜量、噴膜速度等因素進(jìn)行優(yōu)化。
(6) 試紙條的組裝
按照底板上劃定的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜及吸水紙的尺寸，裁定符合要 求的材料和制備相關(guān)的金標(biāo)墊。戴上手套，將包被好的硝酸纖維膜粘到PVC底板上， 小心抹平膜面。將金標(biāo)墊緊靠硝酸纖維膜下邊緣粘到PVC底板上。將樣品墊一部分重 疊在金標(biāo)墊上一起粘到PVC底板上，并對(duì)齊抹平。將吸水紙緊一部分重疊在硝酸纖維 膜下邊緣粘到PVC底板上，并對(duì)齊抹平。用切條機(jī)切成3.5mm寬的試紙，在裝配區(qū)將 切好的試紙放入裝有干燥劑的包裝袋內(nèi)。
2、 結(jié)果取一滴待檢血清樣本滴加在制備好的試紙條的加樣區(qū)，樣品開(kāi)始在硝酸纖維素膜 上擴(kuò)散，待金標(biāo)墊釋放完全后，硝酸纖維素膜上出現(xiàn)了清晰的T線和C線。見(jiàn)圖4。 實(shí)施例4
膠體金抗體檢測(cè)試紙條性能的測(cè)定及實(shí)踐
1、 膠體金抗體檢測(cè)試紙條特異性的測(cè)定。
應(yīng)用制備的膠體金試紙條檢測(cè)與布氏菌種系較近的幾種細(xì)菌血清，結(jié)果均為陰 性，表明與它們之間沒(méi)有交叉反應(yīng)，試紙條特異性良好。
2、 膠體金抗體檢測(cè)試紙條敏感性
免疫25只小鼠制備的牛布氏菌S19陽(yáng)性血清，用ELISA檢測(cè)其平均效價(jià)約為 1:6400;虎紅平板凝集抗原在血清稀釋度低于50倍時(shí)檢測(cè)呈陽(yáng)性；膠體金試紙條能檢 測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果的血清效價(jià)為1:4000，血清稀釋度超過(guò)4000倍時(shí)，試紙條檢測(cè)顯色不 清晰；膠體金試紙條的靈敏度顯著高于虎紅平板凝集抗原試驗(yàn)但低于ELISA。
3、 膠體金抗體檢測(cè)試紙條重復(fù)性
進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果相一致，說(shuō)明該方法具有可重復(fù)性。 4 、膠體金抗體檢測(cè)試紙條穩(wěn)定性
4 'C放置的布病膠體金檢測(cè)試紙條定期以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣本檢測(cè)，結(jié)果顯示60天以前 的均呈穩(wěn)定的陽(yáng)性反應(yīng)；IOO天后，金釋放速度開(kāi)始減慢，并開(kāi)始出現(xiàn)金釋放不完全， 層析速度也有所減緩。在室溫放置90天，檢測(cè)線顯色不清晰。 5、樣本檢測(cè)
對(duì)接種小鼠血清檢測(cè)用ELISA試驗(yàn)和制備的膠體金試紙條進(jìn)行鑒別試驗(yàn)結(jié)果， 結(jié)果顯示兩種檢測(cè)方法的符合率為100%，表明建立的膠體金試紙條
對(duì)病料檢測(cè)從牛場(chǎng)采集的89份牛血清，用虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)有13份為陽(yáng) 性,4份為疑似布病感染;用制備的膠體金試紙條進(jìn)行布氏菌抗體檢測(cè)有15份為陽(yáng)性， 結(jié)果顯示兩種檢測(cè)方法的符合率為86.4% ;其中虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性的血清 用試紙條檢測(cè)全部為陽(yáng)性，兩者的符合率為100%。
權(quán)利要求
1、一種布魯氏菌抗體免疫膠體金檢測(cè)試紙條，特征在于以金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)標(biāo)記膠體金制作金標(biāo)墊，以布魯氏菌L7/L12蛋白包被硝酸纖維膜作為檢測(cè)抗原線(T)，用兔抗牛IgG或兔抗羊IgG作為質(zhì)控線(C)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種布魯氏菌抗體免疫膠體金檢測(cè)試紙條，用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)標(biāo)記膠體金制成本發(fā)明的膠體金抗體檢測(cè)試紙條的金膠墊。L7/L12蛋白是布魯氏菌高特異性、免疫原性蛋白。從牛布魯氏菌基因組中克隆出L7/L12基因，把它連接到pET-28a上，構(gòu)建成原核表達(dá)重組質(zhì)粒，把這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，表達(dá)出L7/L12蛋白，蛋白純化后，以它為抗原包被硝酸纖維膜，作為檢測(cè)線(T線)，同金膠墊一起裝備成本發(fā)明的免疫膠體金試紙條。本發(fā)明試紙條可用于檢測(cè)動(dòng)物血清中的布魯氏菌抗體，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高、穩(wěn)定性好、方便、快捷的特點(diǎn)，對(duì)布魯氏菌的監(jiān)測(cè)、診斷、凈化和控制具有重要意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101441215SQ20081005172
公開(kāi)日2009年5月27日 申請(qǐng)日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者宮鵬濤, 楠 張, 張西臣, 李建華, 閆廣謀 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)