專利名稱：一種超低分子肝素鈉的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種超低分子肝素鈉(ULMWH)的制備方法及所述超低分子肝素鈉的藥物應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝素是一種來自于動物的硫酸化多糖，在臨床上常被作為主要的抗凝、抗血栓藥物來使用。但由于使用肝素有較高的出血危險性，它的使用需要進(jìn)行醫(yī)務(wù)觀察，并及時調(diào)整劑量，因此它的臨床使用有很大的局限性。低分子肝素是從普通肝素通過不同的方法降解得到的小分子肝素制品，具有生物利用率高、血漿半衰期長等優(yōu)點(diǎn)，特別是其引起的出血副作用大幅降低。但低分子肝素的抗 FIIa值仍舊較高，如通過專利EP0040144方法制備得到的低分子肝素的抗FIIa值在30左右，抗FXa/抗FIIa的比值在3. 5 5. 5。使用這類低分子肝素，雖然較普通肝素的安全性有大幅提高，但仍有一定的出血危險性。同樣，在美國專利US6384021中報道了一種很低分子量肝素的合成方法，雖然得到的很低分子量肝素的分子量較低，但它的抗FXa值不超過120IU/mg，抗FXa/抗FIIa比值在15 50之間。超低分子肝素是比低分子肝素鈉平均分子量更小(通常低于3000道爾頓)，抗FIIa值更低的一類肝素衍生物。與低分子肝素相比，超低分子肝素具抗凝作用安全，其抗血栓作用強(qiáng)，皮下注射易吸收，主要用于血栓栓塞性疾病的預(yù)防，如腎病綜合癥，手術(shù)后靜脈血栓的形成、老年靜脈血栓和心腦血管疾病的預(yù)防以及防治高血脂癥等。中國專利CN200810020765報道了超低分子肝素的一種制備方法，但利用這種制備方法得到的超低分子肝素抗FXa活性低，難以滿足臨床要求，且工業(yè)化生產(chǎn)的可行性不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種超低分子肝素鈉的制備方法，該制備方法降解條件溫和可減少磺酸基從肝素上的脫落，通過該方法制備的超低分子肝素鈉平均分子量小于3000Da，具有高抗Fxa生物活性。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明一種超低分子肝素鈉的制備方法，包括如下步驟(I)取精品肝素配成10%的水溶液，室溫下邊攪拌邊加入季銨鹽如芐索氯銨，I 2小時后停止攪拌，沉降、傾倒、洗滌沉淀物，最后過濾、干燥，得到白色肝素季銨鹽固體；(2)將⑴中的肝素季銨鹽固體溶解于有機(jī)溶劑(無水二氯甲烷)中配成5% 10%的溶液，加入與肝素季銨鹽等量的氯化芐，30°C 35°C下，攪拌反應(yīng)24小時后，冷至室溫，加入2倍體積的10%醋酸鈉/甲醇溶液，攪拌30分鐘后，靜止沉淀，過濾，甲醇洗滌，室溫下真空干燥，得到肝素的酯化物；(3)將(2)得到的肝素酯化物溶于10倍的水中配成溶液，將2. 3 2. 5倍的酯化物量的芐索氯銨溶于10倍的水中，完全溶解后，室溫、劇烈攪拌下將此溶液慢慢加入到肝素酯化物的水溶液中；添加完成后，繼續(xù)攪拌1-2小時，然后停止攪拌；待白色固體沉降后，傾去上層清夜，加水洗滌，過濾，再洗滌，然后真空下干燥(不高于50°C )，得到肝素酯化物的季銨鹽；(4)將(3)得到的肝素酯化物的季銨鹽溶于10倍的干燥的二氯甲烷中，待溶解后，加入O. 05 O. 5摩爾濃度的有機(jī)堿如芐基三甲基氫氧化銨、在溫度為30°C 35°C下反應(yīng)4 24小時(優(yōu)選8 12小時)進(jìn)行β -消除降解；(5)將(4)反應(yīng)結(jié)束后的降解物，在室 溫下加入兩倍體積的10%的醋酸鈉的甲醇溶液，攪拌I 2小時后，在O °C 4°C下沉降、過濾、甲醇洗滌，在25 °C 35 °C下真空干燥，得到超低分子肝素鈉的粗品；(6)上述(5)中的超低分子肝素鈉粗品配成10%的溶液，(TC 4°C下加入氫氧化鈉溶液，調(diào)pH在9 10,并在此溫度下反應(yīng)3小時；而后用IM鹽酸中和,加入氯化鈉至鹽度為8 10%，用5倍的甲醇沉淀，沉淀物用甲醇洗滌，真空干燥；(7)上述(6)中的低分子肝素鈉粗品配成10%的溶液，IM氫氧化鈉溶液，調(diào)pH值為9 10，加入30%的過氧化氫室溫攪拌6小時后，滴加IM的鹽酸至中性，然后加入8 10%的氯化鈉，再用5倍的甲醇沉淀超低分子肝素鈉；過濾，用甲醇洗滌后干燥制得低分子肝素鈉的精品；(8)將上述(7)得到的產(chǎn)物溶于水配成10%的溶液后，添加氯化鈉至濃度為10%，用5倍體積的甲醇沉淀，過濾，甲醇洗滌，真空干燥得到超低分子肝素鈉精品；(9)將上述(8)得到的精品超低分子肝素鈉溶解于去離子水配成10%的溶液，用O. 2微米的膜過濾后，冷凍干燥，最終得到醫(yī)用超低分子肝素鈉，其抗FXa效價在140 200IU/mg (典型值為160 180IU/mg)，抗FIIa效價在O. 5 2IU/mg (典型值為O. 5 IIU/mg)，平均分子量在1600 3000Da (典型值為1800 2400Da)，其中肝素六糖占總超低分子肝素的比例在40 50%。本發(fā)明還提供了醫(yī)用超低分子肝素鈉在制備抗凝、抗血栓藥物中的應(yīng)用，作為抗凝、抗血栓藥物，所述制備方法步驟(I)中使用的精品肝素來自于豬小腸，且其中含有的硫酸皮膚素< 1% ;本發(fā)明制備的醫(yī)用超低分子肝素經(jīng)配制、過濾、灌封、滅菌、質(zhì)量檢查、包裝滅菌等常規(guī)注射劑制備工藝，可制成供皮下注射的注射劑，用藥量為成人每天一次20 IOOmg0與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為I、本發(fā)明提供的制備方法是將普通肝素制成肝素酯化物的季銨鹽在有機(jī)溶劑中進(jìn)行β -消除降解，減少了磺酸基從肝素上脫落，制備方法可行且降解條件溫和，因而保證了最終產(chǎn)物的高抗凝活性。2、按照本方法制備的超低分子肝素鈉的抗FXa效價在140 200IU/mg、抗FIIa效價在O. 5 2IU/mg，平均分子量在1600 3000Da，其中肝素六糖片段的含量為40 50%。
具體實施例方式實施例I取100克的精品肝素鈉溶解于I升水，然后在快速攪拌下加入含270克芐索氯銨的水溶液600毫升，反應(yīng)2小時后，加入2升水，靜止沉降，傾倒去上部清夜，再加水洗滌,然后過濾，水洗滌，干燥，約得到270克的肝素季銨鹽；
取上述反應(yīng)得到的肝素季銨鹽100克溶解于500毫升的二氯甲烷中，室溫下加入100毫升的氯化芐，在30-35°C下反應(yīng)24小時后，加入I. 2升的10%醋酸鈉甲醇溶液，攪拌20分鐘后，沉降、過濾、甲醇洗滌、干燥，得到肝素酯化物44克；將10克肝素酯化物溶于200毫升水中配成溶液，室溫、快速攪拌下加入含23克芐索氯銨的100毫升的水溶液，反應(yīng)2小時后，沉降，用水洗滌，45-50°C下真空干燥，得到22克肝素酯化物的季銨鹽；將10克肝素酯化物的季銨鹽溶于100毫升干燥的二氯甲烷中，室溫下加入17毫升的芐基三甲基氫氧化銨，在35°C下攪拌反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻到室溫，加入200毫升的10%醋酸鈉甲醇溶液，繼續(xù)攪拌I小時，靜止沉降，過濾，甲醇洗滌，室溫真空干燥，得到3. 6克超低分子肝素粗品；將得到的粗品超低分子肝素鈉3克溶于30毫升水，(TC下加入IM的氫氧化鈉調(diào)pH到9. 5，攪拌反應(yīng)3 4小時后，加入30%的過氧化氫至濃度為O. 5-1 %，室溫下攪拌6小時后，用IM的鹽酸調(diào)溶液到中性，加入氯化鈉，使得氯化鈉的濃度為8%，用100毫升的甲醇沉·淀。過濾，甲醇洗滌，45-50°C下真空干燥，得到半精制產(chǎn)品2. 6克；將半精品超低分子肝素鈉I克溶于10毫升配成10%的溶液，加入10克氯化鈉溶解后，加入50毫升甲醇沉淀，4°C靜止放置4小時后過濾，甲醇洗滌，室溫下真空干燥，得到
O.8克超低分子肝素鈉精品；將O. 8克超低分子肝素鈉溶于去離子水配成10%溶液，用O. 2微米的膜過濾，冷凍干燥，最終得到醫(yī)用超低分子肝素鈉。上述超低分子肝素鈉的平均分子量為2400Da，肝素六糖片段占總量的45%，抗FXa(抗凝血因子a)值為165IU/mg，抗FIIa(凝血酶)值為O. 6IU/mg。實施例2將100毫克超低分子肝素溶于2. 5毫升O. 5%的生理鹽水中，O. 2微米的膜過濾后，樣品進(jìn)行大鼠(體重為140 160g)皮下注射，注射劑量為2毫克/只，分別于注射后
O.5，I，I. 5，2，3，4，6，8，12小時各點(diǎn)采取O. 5毫升血清，進(jìn)行抗FXa分析，達(dá)峰時間Tmax約為2小時，12小時后藥物在老鼠血液中基本消失。
權(quán)利要求
1.一種超低分子肝素鈉的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)取精品肝素的水溶液，加入季銨鹽，得到白色肝素季銨鹽固體； (2)上述(I)中的肝素季銨鹽固體溶解于有機(jī)溶劑中，加入氯化芐得到肝素酯化物； (3)上述(2)中的肝素酯化物溶于水，加 入季銨鹽，得到白色肝素酯化物季銨鹽固體； (4)上述(3)中的肝素酯化物的季銨鹽溶于有機(jī)溶劑中，在有機(jī)堿作用下進(jìn)行β_消除降解； (5)上述(4)中的降解物在氫氧化鈉作用下轉(zhuǎn)化為鈉鹽，得到精品超低分子肝素鈉的粗品； (6)上述(5)中得到的超低分子肝素鈉經(jīng)沉淀、精密過濾、冷凍干燥得到醫(yī)用超低分子肝素原料藥。
2.按照權(quán)利要求I所述一種超低分子肝素鈉的制備方法，其特征在于制備步驟(I)中所述季銨鹽為芐索氯銨。
3.按照權(quán)利要求I所述一種超低分子肝素鈉的制備方法，其特征在于制備步驟(4)中所述有機(jī)溶劑為無水二氯甲烷。
4.按照權(quán)利要求I所述一種超低分子肝素鈉的制備方法，其特征在于制備步驟(4)中所述有機(jī)堿為芐基三甲基氫氧化銨。
5.按照權(quán)利要求I所述一種超低分子肝素鈉的制備方法，其特征在于按照本制備方法制得的超低分子肝素鈉為抗FXa效價在140 200IU/mg、抗FIIa效價在O. 5 2IU/mg，平均分子量在1600 3000Da，肝素六糖片段的含量為40 50%。
6.按照權(quán)利要求5所述一種超低分子肝素鈉的制備方法，其特征在于按照本制備方法制得的超低分子肝素鈉為抗FXa效價在160 180IU/mg、抗FIIa效價在O. 5 lIU/mg，平均分子量在1800 2400Da，肝素六糖片段的含量為40 50%。
7.按照權(quán)利要求5所述一種超低分子肝素鈉的制備方法，其特征在于步驟(I)所述精品肝素中含有的硫酸皮膚素<I%。
8.權(quán)利要求7制備的醫(yī)用超低分子肝素鈉在制備抗凝、抗血栓藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種超低分子肝素鈉的制備方法，該方法將普通肝素在有機(jī)溶劑中進(jìn)行β-消除降解后得到超低分子肝素鈉，再經(jīng)過精制純化得到醫(yī)用超低分子肝素鈉。本發(fā)明提供的制備方法可行且降解條件溫和，保證了最終產(chǎn)物的抗凝活性。按照本方法制備的超低分子肝素鈉的抗FXa效價在140～200IU/mg(典型值為160-180IU/mg)、抗FIIa效價在0.5～2IU/mg(典型值為0.5～1IU/mg)，平均分子量在1600～3000Da(典型值為1800～2400Da)，其中肝素六糖片段的含量為40～50％。按照本方法制得的超低分子肝素鈉適合于抗凝、抗血栓的臨床使用，給藥方法為皮下注射，給藥劑量為成人每天一次20～100mg。
文檔編號C08B37/10GK102952202SQ20111024502
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者王芃 申請人:蘇州鴻洋醫(yī)藥科技有限公司