人瘤變的上皮增殖性或間充質(zhì)侵襲性表型的新標(biāo)記

背景技術(shù)：
本發(fā)明已經(jīng)被授予由UIBM經(jīng)濟(jì)發(fā)展部在2010年4月30日頒發(fā)的國(guó)外申請(qǐng)?jiān)S可，案號(hào)40718。本發(fā)明涉及新的Ena/VASP蛋白同工型、其用途、診斷方法及包含它們的試劑盒。腫瘤病灶的癌發(fā)生和發(fā)展以不同的基因表達(dá)圖譜為特征。這些表達(dá)圖譜由不同的剪接變體定義，并且特別地，擇一性剪接事件經(jīng)常影響控制腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞骨架組構(gòu)的基因(WangGS,CooperTA.2007；GardinaPJ等人,2006)。已經(jīng)報(bào)道，控制肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)途徑在癌細(xì)胞中下調(diào)，并且經(jīng)常出現(xiàn)控制肌動(dòng)蛋白聚合的蛋白質(zhì)的表達(dá)的改變，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和遷移(OlsonMF，SahaiE.ClinExpMetastasis.2009)。不幸的是，盡管對(duì)癌發(fā)生的分子機(jī)制的理解取得了進(jìn)展，但是沒(méi)有能夠預(yù)測(cè)人類患者中腫瘤病灶的臨床進(jìn)展的分子標(biāo)記或病理預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)?？杉せ?血管舒張劑刺激磷蛋白(Ena/VASP)是控制細(xì)胞形狀、運(yùn)動(dòng)且尤其是肌動(dòng)蛋白組構(gòu)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。這些蛋白質(zhì)靶向F-肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)并且在多種細(xì)胞類型和生物的細(xì)胞遷移方面發(fā)揮重要作用。Ena/VASP蛋白的特征在于，介導(dǎo)胞內(nèi)定位的高度保守的N端EVH1結(jié)構(gòu)域、與G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白profillin相互作用的富含脯氨酸的中心結(jié)構(gòu)域、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的SH3和WW結(jié)構(gòu)域以及Ena/VASP蛋白藉此四聚化的C端EVH2結(jié)構(gòu)域，所述C端EVH2結(jié)構(gòu)域還擁有功能性F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Ena/VASP蛋白參與基于肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)運(yùn)動(dòng)(BearJE等人,2002)，參與細(xì)胞粘附(ScottJA等人,2006)。Ena/VASP蛋白可以在鈣黏著蛋白-粘性接觸處調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白組構(gòu)的不同模式，并且精細(xì)調(diào)節(jié)它們的表達(dá)是準(zhǔn)確的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)所必需的。Mena是Ena/VASP家族的成員，所述Ena/VASP家族包括Mena、VASP和Evl，它們均是肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物(KrauseM等人,2003)。對(duì)特異于存活期長(zhǎng)的乳腺癌患者的自體腫瘤表達(dá)的所述分子的抗體庫(kù)的分析，已經(jīng)分離出Mena的人直向同源物(hMena)并將其作為在癌癥患者中但不在健康供體中刺激抗體應(yīng)答的腫瘤抗原(DiModugno等人,2004)。在人中(UrbanelliL等人,2006)和在鼠模型中(GertlerF等人,1996)均已經(jīng)描述了多種Mena剪接變體，將其進(jìn)行了測(cè)序并且一些剪接變體已經(jīng)與特定的組織表達(dá)圖譜相關(guān)聯(lián)。在小鼠中描述了一種神經(jīng)元(N-Mena)形式，其擁有較長(zhǎng)的外顯子6，所述外顯子6在蛋白質(zhì)水平包含較大的脯氨酸富含區(qū)(GertlerF等人,1996)，然而已經(jīng)報(bào)道了一個(gè)衍生自缺少脯氨酸富含區(qū)的同工型的剪接變體是脾特異性的(TaniK等人,2003)。Mena在小鼠和大鼠侵襲性乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)(Wang等人,2007)，在人乳腺癌組織中過(guò)量表達(dá)，它在乳腺癌組織中是乳腺癌的早期標(biāo)記(DiModugno等人,2006)。最近，體內(nèi)侵襲測(cè)試方法已經(jīng)使得能夠鑒定鼠和大鼠腫瘤細(xì)胞中的侵襲特異性剪接變體(GoswamiS等人,2009；Philippar等人,2008)。在人體中，之前已經(jīng)報(bào)道了hMena和來(lái)自管腔乳腺癌細(xì)胞系的剪接變體hMena11a的分子克隆。這種hMena+11a同工型在該蛋白質(zhì)的EVH2結(jié)構(gòu)域中包含額外的21氨基酸肽，在EGF和NRG1處理后磷酸化并且表現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系的上皮表型(DiModugnoF等人,2007)。用hMena11a同工型表達(dá)表征胰腺癌細(xì)胞系，所述胰腺癌細(xì)胞系顯示上皮標(biāo)記E-鈣黏著蛋白表達(dá)、EGFR依賴性和對(duì)厄洛替尼治療敏感(PinoMS等人,2008；和專利WO2009150494)。最近已經(jīng)報(bào)道這種同工型表達(dá)受上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1和2(ESRP1和ESRP2)(上皮細(xì)胞類型特異性剪接程序的協(xié)調(diào)者)(WarzechaCC等人,2009)調(diào)節(jié)。已經(jīng)報(bào)道在鼠和大鼠模型中，侵襲性腫瘤細(xì)胞表達(dá)較高水平的含有+++外顯子的MenamRNA，但是缺少hMena11a同工型，然而對(duì)于非侵襲性腫瘤細(xì)胞，這兩種同工型不以擇一(alternative)方式表達(dá)(Goswami等人,2008)。鑒于以上情況，顯然，為了鑒定出可以在早期可靠預(yù)測(cè)瘤性病灶或甚至是前瘤性病灶的行為的標(biāo)記，進(jìn)一步弄清界定人體瘤性病灶腫瘤形成和發(fā)展的早期標(biāo)記的表型變化的分子途徑是有用的。這類標(biāo)記還可以使醫(yī)師確定最適宜的治療方案。實(shí)際上，在前瘤性病灶或瘤性病灶的早期對(duì)患者進(jìn)行預(yù)測(cè)的能力、對(duì)臨床進(jìn)展進(jìn)行預(yù)測(cè)的能力有利于設(shè)計(jì)最合適、有效的治療方案。發(fā)明簡(jiǎn)述本申請(qǐng)的發(fā)明人已經(jīng)找到一種新的hMena剪接變體，在此稱作hMenaΔv6(SEQIDNo1)，其相對(duì)于已知的hMena蛋白缺少外顯子6。在沒(méi)有任何進(jìn)一步說(shuō)明的情況下，新同工型的序列已經(jīng)由作者在GenBank上公布，登錄號(hào)EU255274項(xiàng)。hMenaΔv6cDNA編碼一種533個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其缺乏位于hMena的LERER和脯氨酸富含區(qū)之間的37個(gè)氨基酸的內(nèi)肽(圖1)。這個(gè)肽的缺乏使得兩個(gè)關(guān)鍵區(qū)域LERER結(jié)構(gòu)域和PKASer磷酸化位點(diǎn)(小鼠中的Ser236)與脯氨酸富含結(jié)構(gòu)域更靠近。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，顯示遷移能力的細(xì)胞如正常成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)侵襲性腫瘤細(xì)胞表達(dá)hMena的新同工型變體，即本說(shuō)明書中的hMenaΔv6或hMena的Δv6同工型。本說(shuō)明書首次提供了所述新變體用于診斷和醫(yī)療目的的用途，其中連同hMena11a的表達(dá)一起分析了所述變體的表達(dá)。具體而言，發(fā)明人實(shí)施的實(shí)驗(yàn)顯示，hMenaΔv6表達(dá)與hMena11a不表達(dá)與細(xì)胞的遷移和侵襲(invasive)能力相關(guān)，并且hMenaΔv6相對(duì)于hMena11形式以可選方式表達(dá)，即，表達(dá)hMenaΔv6的細(xì)胞不表達(dá)hMena11a，反之亦然。另外，在早期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中，與hMenaΔv6表達(dá)相關(guān)的hMena11a表達(dá)是一項(xiàng)有力的預(yù)測(cè)因子并且可用于補(bǔ)充用于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)個(gè)體患者風(fēng)險(xiǎn)的臨床參數(shù)。因此，本說(shuō)明書的的一個(gè)目的是一種用于預(yù)測(cè)前瘤性病灶或瘤性病灶的增殖或侵襲行為的方法，包括步驟：-體外或體內(nèi)檢測(cè)hMena的hMena11a和hMenaΔv6剪接變體在包含所述病灶的細(xì)胞的生物學(xué)樣品中的表達(dá)，其中檢測(cè)到hMena11a表達(dá)并且未檢測(cè)到hMenaΔv6表達(dá)表示增殖行為，而檢測(cè)到hMenaΔv6表達(dá)并且未檢測(cè)到hMena11a表達(dá)表示侵襲行為。本發(fā)明的目的還是一種用于預(yù)測(cè)前瘤性病灶或瘤性病灶的增殖或侵襲行為的方法，所述方法包括步驟：-體外或體內(nèi)檢測(cè)體液樣品中對(duì)對(duì)hMena的hMena11a剪接變體特異的抗體和對(duì)hMena的hMenaΔv6剪接變體特異的抗體的存在，其中檢測(cè)到存在對(duì)hMena11a特異的抗體并且未檢測(cè)到存在對(duì)hMenaΔv6特異的抗體表示增殖行為，而檢測(cè)到存在對(duì)hMenaΔv6特異的抗體并且未檢測(cè)到存在對(duì)特異hMena11a的抗體表示侵襲行為。本說(shuō)明書的又一個(gè)目的是一種用于預(yù)測(cè)前瘤性病灶或瘤性病灶的增殖或侵襲行為的試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測(cè)hMena11a和hMenaΔv6剪接變體在所述前瘤性病灶或瘤性病灶的生物學(xué)樣品中的表達(dá)的試劑。本發(fā)明的其他目的是：如SEQIDNO:1中所述的編碼hMena的Δv6同工型的核苷酸序列或其片段，所述片段包含SEQIDNO1的第797至807位核苷酸(對(duì)hMena的Δv6同工型特異)或者SEQIDNo1或所述片段的互補(bǔ)序列；-用作診斷工具的以上序列和/或片段；-如SEQIDNO:2中所示的編碼hMena的Δv6同工型的氨基酸序列或其片段，所述片段包含第267至270位氨基酸(對(duì)hMena的Δv6同工型特異)；-用作診斷工具的所述序列和/或片段；-多克隆或單克隆抗體或其片段，所述抗體或其片段特異性結(jié)合具有SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)或其對(duì)hMena的Δv6同工型特異的片段或結(jié)合具有SEQIDNo3的肽(因此仍對(duì)hMena的Δv6同工型特異)；-多克隆或單克隆抗體或其片段，所述抗體或其片段特異性結(jié)合具有SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)或其對(duì)hMena的Δv6同工型特異的片段或具有SEQIDNo3的肽，用作藥物；-對(duì)SEQIDNo1或包含SEQIDNO1第797至807位核苷酸的其片段特異的siRNA；-多克隆或單克隆抗體或其片段，所述抗體或其片段特異性結(jié)合具有SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)或其對(duì)hMena的Δv6同工型特異的片段或具有SEQIDNo3的肽，用于抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲的治療中；-對(duì)SEQIDNo1或包含SEQIDNO1的第797至807位核苷酸的其片段特異的siRNA，其用于抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲的治療中；-用于抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲行為的方法，其包括抑制hMenaΔv6的表達(dá)或功能性和/或低聚化的步驟；-藥物組合物，其包含針對(duì)hMenaΔv6表達(dá)或功能性和/或低聚化的至少一種抑制劑和至少可藥用的載體和/或賦形劑；-用于篩選抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲行為的候選化合物的方法，所述方法包括步驟：使所述化合物與表達(dá)hMena的hMenaΔv6同工型的細(xì)胞系或組織培養(yǎng)物接觸，其中所述同工型的表達(dá)減少表示所述化合物是抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲行為的候選化合物。hMenaΔv6同工型與其他hMena同工型并與Ena/VASP家族其他成員相互作用以形成調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的功能性四聚體。就肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)而言并且最終就細(xì)胞侵襲的能力而言，抑制hMenaΔv6納入四聚體或hMena11a的異源納入可以改變四聚體的功能。由于已經(jīng)分離出了hMena并將其作為能夠在腫瘤患者中且不在健康供體中誘導(dǎo)抗體反應(yīng)的腫瘤抗原(DiModugno等人2004)，本發(fā)明還提供了一種使用本領(lǐng)域中新的和/或可獲得的每種hMena同工型獨(dú)有的重組蛋白或肽和常規(guī)ELISA檢測(cè)法，檢測(cè)對(duì)前瘤性或腫瘤癌癥患者血清中的每種hMena同工型特異的抗體的方法。本申請(qǐng)中公開(kāi)的研究結(jié)果不僅能夠預(yù)測(cè)前瘤性或瘤性病灶的增殖或侵襲行為，由此帶來(lái)了在腫瘤形成的早期階段確定有效醫(yī)學(xué)治療的優(yōu)點(diǎn)，還證實(shí)了hMenaΔv6同工型的抑制劑或阻斷劑的治療作用，其中對(duì)hMenaΔv6同工型的表達(dá)或其活性或低聚化的抑制直接抑制了表達(dá)所述同工型的細(xì)胞和組織的侵襲行為。附圖說(shuō)明圖1hMenaΔv6同工型變體。A.hMenaΔv6蛋白同工型的示意圖。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域用相對(duì)氨基酸編號(hào)指示。顯示了在hMenaΔv6同工型中不存在的肽V6的序列和位置。B.使用CKLK1Ab(10μg/mL)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析法分析體外翻譯的hMena和hMenaΔv6。還通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢驗(yàn)(用來(lái)獲得hMenaΔv6和hMenacDNA的)MDAMB231乳腺癌細(xì)胞系的蛋白質(zhì)提取物(30μg)，以便鑒定完整細(xì)胞裂解物中的相應(yīng)體外翻譯的蛋白質(zhì)條帶。C.對(duì)MDAMB231、BT549、MCF7和SBTRNA用可變剪接區(qū)域旁側(cè)的引物(MTC1f和MTC4r)進(jìn)行RT-PCR。也對(duì)含有3種hMena變體的pcDNA3.1載體進(jìn)行了PCR實(shí)驗(yàn)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色法分析PCR產(chǎn)物。圖2.hMena11a和hMenaΔv6擇一表達(dá)并且分別與上皮表型或間充質(zhì)表型相關(guān)。采用hMena同工型特異性抗體、抗E-鈣黏著蛋白和N-鈣黏著蛋白抗體對(duì)正常角質(zhì)形成細(xì)胞(NHK)、成纖維細(xì)胞(NHF)及血小板和腫瘤細(xì)胞系的裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析表明，正常的人角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)hMena11a和上皮標(biāo)記E-鈣黏著蛋白，而表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)記N-鈣黏著蛋白的成纖維細(xì)胞為hMena11a陰性并且表達(dá)hMenaΔv6。如所示，正常細(xì)胞顯示十分低水平的hMena表達(dá)并且血小板為陰性。表達(dá)hMena11a的所有乳腺癌和肺癌細(xì)胞系均顯示同時(shí)表達(dá)E-鈣黏著蛋白。相反，hMena11a表達(dá)的缺乏總是與不存在E-鈣黏著蛋白、間充質(zhì)標(biāo)記(如N-鈣黏著蛋白)的表達(dá)和hMenaΔv6同工型的表達(dá)相關(guān)。圖3.乳腺癌細(xì)胞系的侵襲需要hMenaΔv6。對(duì)用所示siRNA轉(zhuǎn)染的BT549細(xì)胞進(jìn)行基質(zhì)膠侵襲測(cè)定。已經(jīng)在轉(zhuǎn)染最后24小時(shí)期間通過(guò)針對(duì)EGF或血清梯度使用基質(zhì)膠包被的transwell濾膜(BDBiosciences)對(duì)侵襲能力進(jìn)行了測(cè)量。重復(fù)該測(cè)定3次，每次一式三份進(jìn)行。柱狀圖代表在10個(gè)不同視域中計(jì)數(shù)的侵襲性細(xì)胞的均數(shù)±SD。顯示了代表性圖像。插圖：siRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)后所收集的BT549細(xì)胞的裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析。這幅圖中所報(bào)告的實(shí)驗(yàn)證明，在表達(dá)hMena/hMenaDv6的侵襲性乳腺腫瘤細(xì)胞中敲減hMena同工型顯著降低了細(xì)胞的侵襲行為。圖4.hMenaΔv6轉(zhuǎn)染僅在不存在hMena11a的情況下提高乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。對(duì)采用空載體或hMenaΔv6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MDA-MB-23(hMena11a陰性、hMena/hMenaΔv6陽(yáng)性)、DAL(表達(dá)不可檢測(cè)水平的hMena同工型)和MCF7(hMena/hMena11a陽(yáng)性，hMenaΔv6陰性)細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)血清的基質(zhì)膠侵襲測(cè)定。已經(jīng)通過(guò)針對(duì)血清梯度使用基質(zhì)膠包被的transwell濾膜(BDBiosciences)測(cè)量了侵襲能力。所示結(jié)果表明，hMenaΔv6過(guò)量表達(dá)提高了hMena11a陰性的MDAMB231和DAL細(xì)胞的侵襲行為，但是對(duì)hMena11a陽(yáng)性的MCF7細(xì)胞沒(méi)有影響。重復(fù)3次該測(cè)定，每次一式三份進(jìn)行。柱狀圖代表在10個(gè)不同視域中計(jì)數(shù)的侵襲性細(xì)胞的均數(shù)±SD。在柱狀圖的頂部顯示了已轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析，其顯示了hMenaDv6轉(zhuǎn)染的效率。圖5.hMena11a轉(zhuǎn)染抑制乳腺癌細(xì)胞系的侵襲和定向遷移并且決定肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的大幅重組構(gòu)。A.用空載體或hMena11a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231(hMena11a陰性hMena/hMenaΔv6陽(yáng)性)的基質(zhì)膠侵襲測(cè)定。已經(jīng)通過(guò)針對(duì)血清梯度使用基質(zhì)膠包被的transwell濾膜(BDBiosciences)測(cè)量了侵襲能力。重復(fù)3次該測(cè)定，每次一式三份進(jìn)行。顯示P值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。在柱狀圖的頂部顯示了經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析。B.如小圖A中所述，用空載體或hMena11a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BT549細(xì)胞(hMena11a陰性hMena/hMenaΔv6陽(yáng)性)的基質(zhì)膠侵襲測(cè)定。在柱狀圖的頂部顯示了經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析。C.轉(zhuǎn)染空載體或hMena11a的BT549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染鬼筆環(huán)肽的MCF7細(xì)胞(紅色)的免疫熒光分析。使用免疫熒光顯微鏡DMIRE2(LeicaMicrosystems)將細(xì)胞成像并使用FW4000Software處理。放大率：63X。圖6.用于免疫組織化學(xué)分析的hMena11a和hMenaΔv6特異性抗體的表征。用特異性肽的預(yù)處理消除了hMena同工型的抗體的免疫組織化學(xué)反應(yīng)性。A-B.使用通過(guò)無(wú)關(guān)肽(Δv6)(A)或通過(guò)特異性11a肽(B)預(yù)處理的抗hMena11a抗體處理的表達(dá)hMena11a的乳腺癌組織的連續(xù)切片。C-D.使用通過(guò)無(wú)關(guān)肽(11a)(C)或通過(guò)特異性Δv6肽(D)預(yù)處理的抗hMenaΔv6抗體處理的表達(dá)hMenaΔv6的乳腺癌組織的連續(xù)切片。圖7.兩個(gè)侵襲性乳腺腫瘤組織的連續(xù)切片的代表性免疫組織化學(xué)分析。小圖A中的報(bào)道例是pan-hMena染色陽(yáng)性并且表達(dá)hMena11a，但為hMenaDv6陰性。小圖B中的報(bào)道例是pan-hMena染色陽(yáng)性并且表達(dá)hMenaDv6，但為hMena11a陰性。腫瘤是上皮腫瘤。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，用于檢測(cè)所述兩種剪接變體的方法是通過(guò)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)相應(yīng)的蛋白質(zhì)實(shí)施的。在本發(fā)明的又一個(gè)備選實(shí)施方案中，對(duì)hMena剪接變體的檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)包含SEQID8或其片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及包含hMena的外顯子5和7之間的連接的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而實(shí)施的。本發(fā)明的具體實(shí)施方案本說(shuō)明書公開(kāi)了一種用于預(yù)測(cè)前瘤性病灶或瘤性病灶的增殖或侵襲行為的方法，所述方法包括步驟：-體外或體內(nèi)檢測(cè)hMena的hMena11a和hMenaΔv6剪接變體在包含所述病灶的細(xì)胞的生物學(xué)樣品中的表達(dá)，其中檢測(cè)到hMena11a表達(dá)并且未檢測(cè)到hMenaΔv6表達(dá)表示增殖行為，而檢測(cè)到hMenaΔv6表達(dá)并且未檢測(cè)到hMena11a表達(dá)表示侵襲行為。hMena的人Mena11a同工型(本文中又定義為hMena11a)(F.DiModugno等人,2007)是hMena剪接變體，產(chǎn)生相應(yīng)hMena11a蛋白同工型。這種剪接變體含有63個(gè)核苷酸的額外外顯子11a，其與表征這種同工型的EVH2結(jié)構(gòu)域中21個(gè)氨基酸的額外肽相對(duì)應(yīng)。hMena11a具有SEQIDNO:6的核苷酸序列，其編碼SEQIDNO7的氨基酸序列，而外顯子11a具有SEQIDNO:8的核苷酸序列，其編碼SEQIDNO:9的肽。本發(fā)明人已經(jīng)在具有間充質(zhì)表型的人乳腺癌細(xì)胞系中鑒定到新的hMena剪接變體。所述剪接變體(GENBANKNOEU255274)被稱作人MenaΔv6，并且與hMena相比，其特征是缺少具有111個(gè)核苷酸的內(nèi)部外顯子6(圖1A)。hMenaΔv6具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，其編碼SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)同工型Δv6，并且缺少位于hMena的LERER結(jié)構(gòu)域和脯氨酸富含區(qū)之間37個(gè)氨基酸的內(nèi)肽。這個(gè)肽的缺乏使得在Δv6蛋白中兩個(gè)關(guān)鍵區(qū)域LERER結(jié)構(gòu)域和PKASer磷酸化位點(diǎn)(小鼠中的Ser236)與富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域彼此靠近。外顯子6涵蓋了包含于編碼hMena11a的SEQIDNO：6中的核苷酸803至核苷酸813。hMena11a的編碼序列與hMena序列相同多到核苷酸1540。在本說(shuō)明書中，表述“前瘤性或瘤性病灶的侵襲行為”指包含下述細(xì)胞的前瘤性或瘤性病灶從原發(fā)部位擴(kuò)散并遷移至身體內(nèi)其他地方的一個(gè)或多個(gè)部位，其中所述細(xì)胞傾向于離開(kāi)原發(fā)腫瘤并獲得遷移能力和侵襲能力。表述“前瘤性病灶”(即前癌病灶)指在形成惡性贅生物之前的病灶，即在很多情況下均假定惡性腫瘤由其形成并且可能或可能不在臨床上識(shí)別或通過(guò)受累組織中的顯微鏡可見(jiàn)的變化而識(shí)別的病灶，即傾向于變惡性但不必然如此的病狀。表述“瘤性病灶”指涉及腫瘤或瘤變(neoplasia)的病灶，即細(xì)胞的異常生長(zhǎng)，其可以導(dǎo)致贅生物或腫瘤。由發(fā)明人實(shí)施的實(shí)驗(yàn)顯示，所述兩種剪接變體，即hMena11a和hMenaΔv6，主要以擇一方式表達(dá)并且表征兩種不同的細(xì)胞表型。具體而言，hMena11a在顯示上皮表型的細(xì)胞(即表達(dá)上皮黏著連接的主要組分E-鈣黏著蛋白的細(xì)胞)中表達(dá)，而hMenaΔv6僅存在于下述這些細(xì)胞中，所述細(xì)胞顯示遷移能力(如成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)、不表達(dá)E-鈣黏著蛋白和hMena11a，但是表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)記N-鈣黏著蛋白和或波形纖維蛋白。如圖2A中所示，在正常細(xì)胞(如角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)和在人癌細(xì)胞系中，缺乏hMena11a表達(dá)均總是與存在hMenaΔv6同工型表達(dá)和間充質(zhì)標(biāo)記表達(dá)(如N-鈣黏著蛋白)相關(guān)。相反，缺乏hMenaΔv6表達(dá)總是與存在hMena11a和諸如E-鈣黏著蛋白的標(biāo)記的表達(dá)相關(guān)。作者獲得的結(jié)果可以證明，檢測(cè)到hMena11a表達(dá)并且未檢測(cè)到hMenaΔv6表達(dá)表示增殖性抗侵襲行為，而檢測(cè)到hMenaΔv6表達(dá)并且未檢測(cè)到hMena11a表達(dá)表示人類患者中前瘤性或瘤性病灶的侵襲行為。出于本發(fā)明的目的，瘤性病灶可以是源自身體任何組織的腫瘤；在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，病灶可以是選自以下的腫瘤：胰腺腫瘤、乳腺腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤、尿路上皮腫瘤、頭頸腫瘤、食管腫瘤、皮膚腫瘤，包括黑色素瘤。在本發(fā)明的意思范圍內(nèi)，包含病灶細(xì)胞的生物學(xué)樣品意指前瘤性或瘤性病灶組織、前瘤性或瘤性病灶細(xì)胞或從體液樣品中采集的不含血液的循環(huán)性腫瘤細(xì)胞的樣本，所述體液如血液、血清、淋巴液。所述生物學(xué)樣品可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如活組織檢查、手術(shù)或抽吸)從受試者獲得。本發(fā)明的方法也可以在患者的血液樣品上實(shí)施，以檢測(cè)循環(huán)性腫瘤細(xì)胞(CTC)即在血液中自由循環(huán)的瘤性病灶細(xì)胞的存在。實(shí)際上，可以在患有多種實(shí)體癌的患者的外周血中的檢測(cè)到這些細(xì)胞。因?yàn)樗鼈兊念l率十分低，使用常規(guī)的細(xì)胞學(xué)方法不容易檢測(cè)到這些腫瘤細(xì)胞。在過(guò)去數(shù)十年中，眾多小組已經(jīng)試圖使用高度敏感的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)實(shí)體惡性腫瘤的CTC，所述逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)已經(jīng)顯示優(yōu)于常規(guī)技術(shù)。然而，CTC的生物學(xué)意義及其檢測(cè)的治療相關(guān)性仍在爭(zhēng)論中。本文中所述的方法允許鑒定正在增生或有侵襲性的腫瘤的CTC，因此也能夠使研究者進(jìn)一步研究鑒定和分子表征負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移形成的CTC亞類的潛力。CTC的預(yù)測(cè)價(jià)值將為臨床醫(yī)生提供用于對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)更好分級(jí)的獨(dú)特工具并且為基礎(chǔ)研究提供了用于開(kāi)發(fā)新治療方案的新靶。本發(fā)明的方法有利地能夠檢測(cè)不同腫瘤的一大類CTC?？梢栽诒磉_(dá)過(guò)程的不同階段實(shí)施所述兩種剪接變體的檢測(cè)。換而言之，可以通過(guò)檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì)同工型或通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即hMena剪接變體轉(zhuǎn)錄物mRNA或可選地通過(guò)檢測(cè)由逆轉(zhuǎn)錄所述mRNA所獲得的cDNA，檢測(cè)hMena變體。因此，可以通過(guò)直接或間接檢測(cè)hMena變體的核苷酸序列或氨基酸序列實(shí)施所述檢測(cè)。在任何情況下，hMena11a和hMenaΔv6表達(dá)應(yīng)當(dāng)相對(duì)于其表達(dá)在增殖性或侵襲性/轉(zhuǎn)移性腫瘤中不變化的其他蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物歸一化。這類對(duì)照的實(shí)例包括hMena同工型(88kDa)和VASP。適于這種檢測(cè)的方法是定性或定量方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)一種或兩種所述剪接變體的檢測(cè)通過(guò)用免疫組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定蛋白質(zhì)變體來(lái)實(shí)施。通過(guò)使用抗體和利用特異性抗原-抗體相互作用，免疫組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)可以定位細(xì)胞、組織等中的靶抗原。因此出于說(shuō)明目的，采用免疫化學(xué)技術(shù)通過(guò)直接分析細(xì)胞而檢測(cè)hMena變體的一些合適方法是蛋白質(zhì)印跡法、免疫熒光技術(shù)等。實(shí)施免疫組織化學(xué)在組織樣品上直接實(shí)施，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知；該技術(shù)的全部階段在大部分實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中均有詳述?？梢允褂脤?duì)hMena蛋白的同工型11a特異的多克隆或單克隆抗體或其免疫活性片段用于hMena11a檢測(cè)，使用對(duì)hMena蛋白的同工型Δv6特異的多克隆或單克隆抗體或其免疫活性片段用于hMenaΔv檢測(cè)，從而實(shí)施本發(fā)明的方法。這些多克隆或單克隆抗體可以由技術(shù)人員按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得，例如通過(guò)免疫兔或小鼠或其他合適的動(dòng)物，從而獲得對(duì)所需變體特異的抗體。為了制備抗hMena11a抗體，動(dòng)物可以例如用對(duì)hMena11a特異的免疫原性肽(例如包含SEQIDNO:9的外顯子11a或包含于其中的肽)或?qū)Mena11a特異的hMena11aSEQIDNO:7的抗原性部分或?qū)λ柰ば吞禺惖臉?gòu)象表位進(jìn)行免疫。為了制備抗hMenaΔv6抗體，動(dòng)物可以例如用對(duì)hMenaΔv6特異的免疫原性肽，例如用包含核苷酸797至807的SEQIDNO1的片段所編碼的肽或用對(duì)hMenaΔv6特異的SEQIDNO:2的抗原性部分或用對(duì)hMenaΔv6特異的任何適合免疫肽(如SEQIDNO:3的肽)或用對(duì)所需同工型特異的構(gòu)象表位進(jìn)行免疫。在本說(shuō)明書的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)hMena11a同工型特異的所述抗體或其片段是對(duì)SEQIDNO9中所包含的或由其組成的表位特異的，并且對(duì)hMenaΔv6同工型特異的所述抗體或其片段是對(duì)SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中所包含的或由其組成的表位特異的。可以通過(guò)用與蛋白質(zhì)載體例如KLH或BSA綴合的抗原免疫兔，獲得用于實(shí)施本文中所述方法的有效多克隆抗體。如此獲得的免疫血清可以通過(guò)親和層析純化，例如在與免疫原性肽綴合的瓊脂糖凝膠樹(shù)脂CnBr上。在用于純化抗hMenaΔv6的親和層析中使用的免疫原性肽可以是例如SEQIDNO:4的肽。如此獲得的抗hMena11a或hMenaΔv6將特異性識(shí)別hMena11a或thehMenaΔv6同工型，而不與其他hMena同工型交叉反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)以下方式制造合適的單克隆抗體：切除用上述免疫原免疫的動(dòng)物的脾并將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，從而形成雜交瘤，雜交瘤在培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生單克隆抗體?？贵w可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。IgA抗體可以是IgA1或IgA2，IgG可以是IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4。另外，還可以使用抗體亞型的組合。所述抗體可以是人、小鼠、山羊或兔抗體。所述抗體可以通過(guò)使用技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)人源化。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整抗體和其片段，其中所述片段與所述hMena蛋白同工型之一特異性結(jié)合。根據(jù)本說(shuō)明書的片段可以是F(ab')2片段、Fab片段或單鏈抗體，而不限于此。也可以使用適配體檢測(cè)hMena蛋白同工型。適配體是與特定靶分子(如蛋白質(zhì))結(jié)合的單鏈寡核苷酸。因此，適配體在功能上與抗體相似。使用例如SELEX方法等，可以選擇結(jié)合靶分子的適配體。結(jié)合hMena同工型(其源自hMenaRNA剪接變體)的試劑可以與可檢測(cè)標(biāo)記復(fù)合或可選地是本身通過(guò)第二帶標(biāo)記試劑(如第二抗體)而可檢測(cè)。標(biāo)記可以通過(guò)許多已知的技術(shù)實(shí)施，所述技術(shù)包括但不限于過(guò)氧化物酶、化學(xué)發(fā)光、放射性標(biāo)記。標(biāo)記可以是非放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記如生物素、熒光素(FITC)、吖啶、羧基-X-羅丹明和技術(shù)人員已知的可以通過(guò)熒光技術(shù)或其他圖像分析技術(shù)檢測(cè)到的其他標(biāo)記?？蛇x地，標(biāo)記可以是發(fā)出輻射的放射性同位素，例如35S、32P、o3H?？梢酝ㄟ^(guò)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，閃爍照相術(shù))檢測(cè)到發(fā)射的放射性活度。也可以在轉(zhuǎn)錄水平實(shí)施hMena剪接變體的檢測(cè)。因此，可以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如mRNA或相關(guān)的cDNA。從包含目的細(xì)胞的樣品獲得mRNA或cDNA的操作方案是技術(shù)人員熟知的，并且另外，它們?cè)趯?shí)驗(yàn)室手冊(cè)中和在用于mRNA提取和cDNA擴(kuò)增的市售試劑盒中都有詳述。可以通過(guò)任何適合的方法如RNA印跡、微陣列、PCR、實(shí)時(shí)PCR、在固相支持物上雜交等實(shí)施轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)以下方式實(shí)施一種或兩種所述剪接變體的檢測(cè)：對(duì)于hMena11a變體的檢測(cè)，檢測(cè)包含SEQIDNO8或其片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，對(duì)于hMenaΔv6變體的檢測(cè)，檢測(cè)包含SEQIDNO1第797至807位核苷酸的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。可以使用以特異性方式與所述變體的mRNA或cDNA雜交的一種或多種探針通過(guò)核酸雜交分析檢測(cè)hMena11a和hMenaΔv6剪接變體的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)以下方式實(shí)施檢測(cè)：將從樣品獲得的mRNA或cDNA與包含SEQIDNO8和/或其互補(bǔ)序列或其片段的帶標(biāo)記寡核苷酸以及與包含SEQIDNO1第797至807位核苷酸或和/或與SEQIDNO1互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)核苷酸的另一個(gè)帶標(biāo)記寡核苷酸雜交。這種寡核苷酸可以是DNA或RNA并且可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)制備，所述技術(shù)包括而不限于，限制性酶消化hMena變體、自動(dòng)化合成寡核苷酸。技術(shù)人員理解，獲知核苷酸序列(hMena11a的SEQIDNO6及外顯子11a的序列SEQIDNO8和hMenaΔv6的SEQIDNO1以及在SEQIDNO1第797至807位核苷酸之間包含的外顯子5和外顯子7的連接的確切序列)將能夠設(shè)計(jì)適于實(shí)施雜交方法的探針，而無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)。根據(jù)所用的具體雜交技術(shù)，對(duì)于hMena11a檢測(cè)，用于雜交的寡核苷酸可以在長(zhǎng)度方面從約SEQIDNO1的8個(gè)核苷酸變動(dòng)至其整個(gè)序列，并且可以從SEQIDNO1的第797至807位核苷酸(每側(cè)加或減去一個(gè)核苷酸)變動(dòng)至其包含第797-807位核苷酸的約10-500個(gè)核苷酸的片段。通常，探針的長(zhǎng)度可以是適于雜交的長(zhǎng)度。如技術(shù)人員已知，合適的長(zhǎng)度可以例如在500和10個(gè)核苷酸之間，如約400、300、200、150、100、60、50、40、30、20、10個(gè)核苷酸。可以通過(guò)不同方法如RNA印跡(用于RNA檢測(cè))，DNA印跡(用于cDNA檢測(cè))，在固相即在固相支持物如微量滴定板、微陣列芯片等上的雜交而實(shí)施雜交。這種檢測(cè)歸因于與靶分子或其片段和相應(yīng)探針之間的雜交相對(duì)應(yīng)的發(fā)光信號(hào)。如技術(shù)人員熟知，可以根據(jù)所用的具體方法將探針或靶分子標(biāo)記。因此，例如，當(dāng)在固相支持物上實(shí)施雜交時(shí)，對(duì)兩種hMena變體之一的檢測(cè)歸因于與標(biāo)記的靶分子和結(jié)合在支持物上的相應(yīng)探針之間的雜交相對(duì)應(yīng)的(由熒光團(tuán)發(fā)射的)發(fā)光信號(hào)。每種變體將用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記，以便能夠直接鑒定表達(dá)的變體。相反，在DNA印跡和RNA印跡技術(shù)中將寡核苷酸探針標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中詳述了適于實(shí)施這些雜交技術(shù)中任一項(xiàng)技術(shù)的操作方案，并且根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案，技術(shù)人員將能夠?qū)嵤﹉Mena變體的檢測(cè)，而無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)以下方式實(shí)施所述檢測(cè)：通過(guò)PCR用擴(kuò)增SEQID8或其片段的引物對(duì)和用擴(kuò)增SEQIDNO1的片段的另一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增從樣品獲得的mRNA或cDNA，所述SEQIDNO1的片段包含SEQIDNO1的第797至807位核苷酸。即便在這種情況下，技術(shù)人員也能夠在知曉核苷酸序列(SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO1和SEQIDNO1的第797至807位的序列)將的情況下設(shè)計(jì)適于實(shí)施擴(kuò)增的引物。另外，引物可以用可檢測(cè)標(biāo)記(如熒光團(tuán)和技術(shù)人員已知的其他標(biāo)記)進(jìn)行標(biāo)記，以便鑒定特異性擴(kuò)增子，例如，在RT-PCR后。如技術(shù)人員熟知，通過(guò)設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增具有不同數(shù)目核苷酸的序列的引物，可以檢測(cè)通過(guò)使用未標(biāo)記引物進(jìn)行的PCR獲得的與多于一種變體相關(guān)的擴(kuò)增子。因此，可以通過(guò)它們?cè)陔娪灸z上的不同遷移圖譜檢測(cè)到所獲得的擴(kuò)增子。在實(shí)時(shí)PCR中，靶序列的檢測(cè)基于解鏈曲線的研究，因此，與用于披露的方法無(wú)關(guān)，所獲得的擴(kuò)增子可以具有相同長(zhǎng)度。本說(shuō)明書還提供了一種用于預(yù)測(cè)前瘤性病灶或瘤性病灶的增殖或侵襲行為的方法，所述方法包括步驟：體外或體內(nèi)檢測(cè)體液樣品中對(duì)hMena的hMena11a同工型特異的抗體和對(duì)hMena的hMenaΔv6同工型特異的抗體的存在。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括能夠與所述hMena蛋白的一個(gè)同工型或其片段特異性結(jié)合的完整抗體和其片段。出于說(shuō)明目的，用于實(shí)施上述方法的可檢測(cè)抗體是能夠識(shí)別并且特異性結(jié)合SEQIDNO2或其片段、SEQIDNO9、SEQIDNO7或其片段或SEQIDNO10的可檢測(cè)抗體。體液樣品中檢測(cè)到存在對(duì)hMena11a特異的抗體并且未檢測(cè)到存在對(duì)hMenaΔv6同工型特異的抗體表示前瘤性病灶或瘤性病灶的增殖行為，而檢測(cè)到存在對(duì)hMenaΔv6特異的抗體并且未檢測(cè)到存在對(duì)hMena11a特異的抗體表示所述病灶的侵襲行為。在一個(gè)實(shí)施方案中所述病灶是瘤性病灶，并且所述病灶選自胰腺腫瘤、乳腺腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤、尿路上皮腫瘤、頭頸腫瘤、食管腫瘤和皮膚腫瘤，包括黑色素瘤。對(duì)所述hMena同工型特異的抗體可以是在體液樣品中可檢測(cè)的。適于實(shí)施以上方法的體液包括：血液、血清、乳汁、腹膜液、胸膜液、心包液、淋巴液。如技術(shù)人員熟知，用檢測(cè)流體中抗體的技術(shù)在大部分實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中均有詳述，并因此在本文中它們不需要任何其他的技術(shù)詳述。無(wú)論如何，用于實(shí)施所述方法的合適技術(shù)是，例如ELISA測(cè)定。本說(shuō)明書也公開(kāi)了一種用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。本文中所述的試劑盒能夠通過(guò)檢測(cè)hMena11a和hMenaΔv6同工型在前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的生物學(xué)樣品中的表達(dá)，預(yù)測(cè)前瘤性病灶或瘤性病灶的增殖或侵襲行為。本說(shuō)明書的試劑盒將包含適于檢測(cè)兩種變體的試劑和任選地陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒將包含對(duì)hMena蛋白的同工型11a特異的多克隆或單克隆抗體或其免疫活性片段和對(duì)hMena蛋白的同工型Δv6特異的多克隆或單克隆抗體或其免疫活性片段。試劑盒的抗體或多種抗體可以等分于一個(gè)或多個(gè)小藥瓶中、在主溶液或即用型溶液中，它們可以按上述方式的任一種進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)所選的標(biāo)記方法，本發(fā)明的的試劑盒還可以包含適于檢測(cè)所述抗體的試劑。所有標(biāo)記方法選項(xiàng)均是本領(lǐng)域熟知的并且檢測(cè)操作方案和試劑也是技術(shù)人員熟知的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)hMena11a同工型特異的所述抗體或其片段是對(duì)SEQIDNO9中所包含的表位或?qū)Mena11a同工型特異的任何其他表位特異的，并且其中所述抗體或其片段特異性結(jié)合具有SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)或?qū)MenaΔv6同工型特異的任何其他表位或具有SEQIDNo3的肽。可選地，試劑盒可以包含帶標(biāo)記的寡核苷酸和另一種帶標(biāo)記的寡核苷酸，所述帶標(biāo)記的寡核苷酸包含SEQIDNO8和/或其互補(bǔ)序列或其片段，所述另一種帶標(biāo)記的寡核苷酸包含SEQIDNO1第797至807位核苷酸或和/或SEQIDNO1的互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)核苷酸。當(dāng)歸因于在cDNA上雜交時(shí)，可以設(shè)計(jì)探針以便與有義鏈或反義鏈雜交，并且所述探針將包含編碼hMena11acDNA的序列的至少部分區(qū)域(所述區(qū)域包含SEQIDNO8)或?qū)幋ahMenaΔ6cDNA的序列的至少部分區(qū)域(所述區(qū)域包含SEQIDNO1的第797至807位核苷酸)。如前文，標(biāo)記方法可以是上文所示的任何適合的標(biāo)記方法。試劑盒因此還可以包含適于檢測(cè)帶標(biāo)記探針的試劑?？蛇x地，試劑盒可以包含擴(kuò)增SEQID8或其片段的引物對(duì)和擴(kuò)增SEQIDNO1的片段的另一個(gè)引物對(duì)，所述SEQIDNO1的片段包含SEQIDNO1的第797至807位核苷酸。該試劑盒還可以包含適于檢測(cè)hMena11a和hMenaΔv6剪接變體表達(dá)的其他試劑，如緩沖液、支持物、凝膠、膜和其他。換而言之，本發(fā)明的試劑盒可以包含為實(shí)施上文描述的一種或多種檢測(cè)方法必需的任何和全部試劑。例如，試劑可以是一個(gè)或多個(gè)等分的合適緩沖液(Tris緩沖液)、dNTP、Taq聚合酶、MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶、微陣列、微量滴定板、凝膠、膜、特定酶等。本發(fā)明的試劑盒可以是一種局部試劑盒，其僅包含必需試劑或酶的部分，在這種情況下，使用者可以提供剩余的組分。試劑盒可以包含用于實(shí)施上文描述一種或多種方法的工具(means)。例如，試劑盒可以包括微量滴定板、固體支持物、預(yù)制凝膠(電泳凝膠、RNA印跡凝膠、DNA印跡凝膠)等。試劑盒還可以包含陽(yáng)性和/或陰性對(duì)照樣品，如表達(dá)hMena11a或hMenaΔv6的即用型組織或細(xì)胞樣品、hMena同工型轉(zhuǎn)染或敲減的固定或新鮮的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物和/或來(lái)自表達(dá)hMena11a或hMenaΔv6的細(xì)胞和或組織中的cDNA?？梢蕴峁┻@些樣品用于兩種同工型或用于兩種同工型之一。陽(yáng)性對(duì)照和/或陰性對(duì)照的存在將能夠使使用者驗(yàn)證試劑的有效性和檢測(cè)法中可能存在的背景信號(hào)。本發(fā)明也提供如SEQIDNO:1中所述的編碼hMena的Δv6同工型的核苷酸序列或其片段，所述片段包含SEQIDNO1的第797至807位核苷酸或者SEQIDNo1或所述片段的互補(bǔ)序列。這些核苷酸序列可以作為診斷工具，例如用來(lái)鑒定，用來(lái)確定前瘤性病灶或瘤性病灶的性質(zhì)、原因、行為(增殖或侵襲行為)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是如SEQIDNO:2中所述的編碼hMena的Δv6同工型的氨基酸序列或其片段，所述片段包含第267至270位氨基酸。這些氨基酸序列，作為相應(yīng)的核苷酸序列，可以用作診斷工具或用于制備同工型特異性抗體或適配體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案還是一種多克隆或單克隆抗體或其片段，其特異性結(jié)合具有SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)或?qū)MenaΔv6同工型特異的表位或具有SEQIDNo3的肽。所述多克隆或單克隆抗體或其片段可以用作藥物。表述“作為藥物”在本說(shuō)明書中意指，所述抗體能夠調(diào)節(jié)hMenaΔv6蛋白的功能性或寡聚化并且隨后在體內(nèi)和體外均引起細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改變，因此抑制其侵襲行為。本發(fā)明仍進(jìn)一步提供對(duì)SEQIDNo1或其包含SEQIDNO1第797至807位核苷酸的片段特異的siRNA，作為藥物。RNA干擾(RNAi)是使用雙鏈RNA(dsRNA)來(lái)使基因表達(dá)沉默的方法。RNAi始于較長(zhǎng)的dsRNA被RNaseIII-樣酶dicer切割成小干擾RNA(siRNAs)。siRNA是通常約19至28個(gè)核苷酸或20至25個(gè)核苷酸的dsRNA。單個(gè)dsRNA被引入稱作RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)的核糖核蛋白復(fù)合物中。RISC使用siRNA的反義鏈(或引導(dǎo)鏈)來(lái)鑒定至少部分與所述siRNA鏈互補(bǔ)的mRNA分子，并且隨后抑制它們的翻譯。因此，另一條siRNA鏈，稱作過(guò)客鏈或有義鏈，因它部分與靶mRNA同源而從siRNA中去除。RISC介導(dǎo)切割具有與引導(dǎo)鏈至少部分互補(bǔ)的序列的mRNA導(dǎo)致這種mRNA和由這種mRNA編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)水平降低?？蛇x地，RISC也可以通過(guò)翻譯阻遏作用在不切割mRNA分子的情況下降低蛋白質(zhì)的表達(dá)。本發(fā)明涉及利用干擾性RNA通過(guò)切割hMenaΔv6mRNA或阻抑其翻譯而抑制或減少hMena，尤其是hMenaΔv6剪接變體的表達(dá)。為了實(shí)施上文描述的干擾過(guò)程，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易地從SEQIDNO1的相應(yīng)DNA序列中推導(dǎo)hMenaΔv6的mRNA序列。這種mRNA序列與DNA有義鏈序列相同，而“T”堿基替換為“U”堿基。因此，從SEQIDNO1中獲知hMena的mRNA序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，siRNA具有與SEQIDNO1或其包含SEQIDNO1第797至807位核苷酸的片段相同的有義鏈。hMenaΔv6的合適siRNA可以使用可獲得的設(shè)計(jì)工具(如在http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlhttp://www.genscript.com/design_center.html)可免費(fèi)獲得的AmbionoGenscript程序)設(shè)計(jì)或可以向?qū)I(yè)化商業(yè)供應(yīng)商訂購(gòu)。用于選擇合適siRNA的技術(shù)由洛克菲勒大學(xué)網(wǎng)站上可獲得的Tuschl,T等人,“ThesiRNAuserguide(siRNA用戶指南)”提供；和由其他基于網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)工具(例如在Invitrogen,IntegratedDNATechologies,Genscript網(wǎng)站)提供?？梢酝ㄟ^(guò)用技術(shù)人員熟知的技術(shù)(例如，蛋白質(zhì)印跡法，PCR等)測(cè)量經(jīng)所述siRNA處理的細(xì)胞中的mRNA水平或相應(yīng)蛋白質(zhì)水平，檢驗(yàn)所設(shè)計(jì)的與靶分子相對(duì)應(yīng)的siRNA。本說(shuō)明書用于靶向hMenaΔv6mRNA的siRNA可以是，例如有義鏈siRNA：UAUCAAGUGCUGGCAUUGUUU(SEQIDNO17)；反義鏈siRNA：ACAAUGCCAGCACUUGAUAUU(SEQIDNO18)。出于本文中所述的本發(fā)明目的，siRNA的反義鏈可以與hMenaΔv6mRNA序列具有80%至多到100%之間的互補(bǔ)性，例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補(bǔ)性。根據(jù)本發(fā)明，可以使用單鏈干擾RNA(ssRNA)，以便實(shí)現(xiàn)hMenaΔv6表達(dá)的抑制。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案也是與SEQIDNo1或其包含SEQIDNO1第797至807位核苷酸的片段特異性雜交的ssRNA?？蛇x地，可以在細(xì)胞中通過(guò)具有以下編碼序列的表達(dá)載體實(shí)施干擾，所述編碼序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生對(duì)hMenaΔv6特異的雙鏈或單鏈siRNA。任選地，可以使用被加工成siRNA的發(fā)夾RNA(shRNA)。在本發(fā)明的意義下，siRNA包括以上全部實(shí)施方案、適合于使所需基因表達(dá)沉默的雙鏈、單鏈(ssRNA)和發(fā)夾(shRNA)干擾RNA。McCaffrey等人,Nature2002(詳見(jiàn)下文)中描述了制造和使用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沉默的這類發(fā)夾RNAin的實(shí)例。干擾RNA(雙鏈或單鏈或hsRNA)可以在化學(xué)上合成或由病毒載體或質(zhì)粒載體或表達(dá)盒內(nèi)源表達(dá)。市售質(zhì)粒表達(dá)載體的實(shí)例包括pSilencer系列(Ambion,AustinTX)和pCpG-siRNA(InvivoGen,SanDiego)的成員。用于干擾RNA的病毒載體可以源自多種病毒，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒、桿狀病毒和皰疹病毒。用于干擾RNA的市售病毒載體的實(shí)例包括pSilenceradeno(Ambion,AustinTX)和pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST(Invitrogen)。選擇質(zhì)?；虿《据d體、從載體表達(dá)干擾RNA的方法在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。干擾RNA可以因添加、缺失、置換一個(gè)或多個(gè)核苷酸而不同于天然存在的RNA。非核苷酸物質(zhì)可以與siRNA結(jié)合，以便提高核酸酶抗性、改善細(xì)胞攝取、增強(qiáng)細(xì)胞靶向作用、進(jìn)一步改善穩(wěn)定性。具體而言，將siRNA遞送至靶分子和細(xì)胞的機(jī)制包括病毒載體或質(zhì)粒載體、脂質(zhì)體、納米粒子以及化學(xué)修飾。脂質(zhì)體和納米粒子代表體內(nèi)和體外的高效遞送體系。未修飾的siRNA在人血漿中具有小于1小時(shí)的半壽期并且siRNA被腎快速排泄。脂質(zhì)體和納米粒子可以充當(dāng)封套以保護(hù)siRNA免遭代謝和排泄，但是也可以攜帶被設(shè)計(jì)成將siRNA靶向特定組織類型的特定分子。由陽(yáng)離子脂質(zhì)如DOTAP(1,2-雙(油酰氧)-3,3-(三甲銨)丙烷)、中性脂質(zhì)如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)制成的脂質(zhì)體可以用來(lái)攜帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞。納米粒子如陽(yáng)離子聚合物、聚乙烯亞胺(PEI)可以用來(lái)成功地遞送siRNA至靶細(xì)胞。取而代之，化學(xué)修飾的實(shí)例包括3'端生物素分子(一種具有細(xì)胞滲透特性的肽)或3'固醇綴合。另外，可以修飾磷酸酯-糖骨架或核苷，如可以修飾天然RNA的磷酸二酯鍵以包含至少一個(gè)雜原子(硫代磷酸酯、磷酰胺酯等)。為了使siRNA進(jìn)入靶細(xì)胞，可以使用轉(zhuǎn)染試劑如Lipofectamine、Lipofectin。然而，本領(lǐng)域中包括的且技術(shù)人員已知的用于遞送和/或增強(qiáng)siRNA(dsRNA、ssRNA、hsRNA、表達(dá)RNAi載體)通過(guò)細(xì)胞膜并因此發(fā)揮其生物學(xué)活性的任何常規(guī)適用方法或化學(xué)修飾(包括方法或化學(xué)修飾)都是本說(shuō)明書的一部分。可以使用遞送siRNA至體內(nèi)和體外特定組織和器官系統(tǒng)的多種策略，包括直接局部注射siRNA至前瘤性或瘤性病灶中?？蛇x地，siRNA，例如用脂質(zhì)體配制的siRNA可以與有效結(jié)合靶細(xì)胞上特定細(xì)胞表面蛋白的一種或多種配體結(jié)合，從而在一些情況下增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)siRNA的攝取。僅出于說(shuō)明，葉酸、VEGF、EGF是適于靶向上皮癌的配體的實(shí)例。根據(jù)本說(shuō)明書，siRNA(dsRNA、ssRNA、hsRNA、表達(dá)RNAi載體)用于抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲力的治療中。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合hMenaΔv6同工型蛋白的多克隆或單克隆抗體可以用于抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲力的治療中。具體而言，所述多克隆或單克隆抗體或其片段特異性結(jié)合具有SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)或其對(duì)hMenaΔv6同工型特異的片段或具有SEQIDNo3的肽。上文詳述了本發(fā)明的多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種用于抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲行為的方法，所述方法包括抑制hMenaΔv6的表達(dá)或功能性或低聚化的步驟。這種方法可以包括通過(guò)使用合適的抑制劑在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平介入。hMenaΔv6同工型與其他hMena同工型并與Ena/VASP家族其他成員相互作用以形成調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的功能性四聚體。就肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)而言并且最終就細(xì)胞侵襲的能力而言，抑制hMenaΔv6納入四聚體或hMena11a的異源納入可以改變四聚體的功能。因此，如上文所述，可以通過(guò)使用例如siRNA、抗體或適配體實(shí)現(xiàn)對(duì)hMenaΔv6的抑制?？梢詫?duì)體外和體內(nèi)待處理的生物學(xué)樣品或病灶直接或間接地添加這些抑制劑。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案也是一種藥物組合物，其包含針對(duì)hMenaΔv6表達(dá)或功能性或低聚化的至少一種抑制劑和至少可藥用的載體和/或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物可以包含抑制劑如對(duì)hMenaΔv6同工型特異的siRNAs和/或抗體和/或適配體。配制這種組合物用于遞送治療有效量的所述抑制劑至靶部位。具體而言，包含在所述siRNA內(nèi)的siRNA或其鹽的組合物可以例如在陽(yáng)離子或中性脂質(zhì)載體、脂質(zhì)體、聚合物、納米粒子中配制。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的適合于遞送siRNA至靶部位的任何手段實(shí)施施用。例如，siRNA可以通過(guò)電穿孔或通過(guò)其他合適的腸胃外或腸內(nèi)施用途徑施用。合適的施用途徑包括，例如血管內(nèi)施用；組織內(nèi)施用(例如腫瘤內(nèi)或病灶內(nèi)注射)；直接施加至靶部位區(qū)域或其附近；吸入。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)待到達(dá)的靶部位容易地確定適宜施用途徑。本發(fā)明的藥物組合物包含本發(fā)明的siRNA(例如以重量計(jì)0.1至90%)或其生理可接受的鹽，其與生理可接受的載體如水、緩沖液、鹽水溶液、甘氨酸、透明質(zhì)酸、甘露醇、乳糖、葡萄糖等混合。所述組合物還包含藥物賦形劑和/或添加物，如穩(wěn)定劑、抗氧化劑、重量摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑。包含siRNA的藥物組合物也可以凍干?？蛇x地，藥物組合物包含能夠特異性結(jié)合hMena蛋白的Δv6同工型(并且抑制其功能性或僅抑制寡聚化能力)的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合編碼hMena的Δv6同工型的SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段，所述片段包含第267至270位氨基酸。通過(guò)將具有所需純度的抗體與一種或多種可藥用載體和/或賦形劑和/或穩(wěn)定劑混合制備包含所述抗體的藥物組合物?？山邮艿妮d體或賦形劑或穩(wěn)定劑包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸，抗氧化劑如抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠；單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖、糊精、山梨醇。用于制備包含抗體和可接受的載體和/或賦形劑和/或穩(wěn)定劑的藥物組合物的方法是技術(shù)人員熟知，所述技術(shù)人員能夠制備本發(fā)明的藥物組合物，而無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)?？贵w可以包埋于藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、納米粒子、白蛋白微球)中，目的在于誘導(dǎo)靶細(xì)胞的內(nèi)化，從而產(chǎn)生藥物組合物的治療功效。包含所述抗體的本發(fā)明藥物組合物可以按任何適合的施用方式施用，所述施用方式包括腸胃外、腸內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、局部、經(jīng)鼻、口含等施用。所述組合物將由技術(shù)人員在考慮例如待到達(dá)的靶部位、待治療患者的臨床狀況后配制、給藥和施用。本發(fā)明還提供了一種用于篩選抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲行為的候選化合物的方法，所述方法包括步驟：使所述化合物與表達(dá)hMena的hMenaΔv6同工型的細(xì)胞系或組織培養(yǎng)物接觸，其中所述同工型的表達(dá)或它從Ena/VASP四聚體中的置換表示所述化合物是抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲行為的候選化合物。換而言之，與化合物接觸后，所述病灶或其細(xì)胞中hMenaΔv6同工型表達(dá)(或相反增加)或其置換不降低，表示這種化合物不是抑制前瘤性或瘤性病灶或其細(xì)胞的侵襲行為的合適候選分子。由于已經(jīng)分離出hMena作為能夠在腫瘤患者中且不在健康供體中誘導(dǎo)抗體反應(yīng)的腫瘤抗原，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)來(lái)自前瘤性或腫瘤癌癥患者的血清中對(duì)每種hMena同工型特異的抗體的方法?；颊哐逯刑禺愋钥贵w的存在不僅可以代表癌癥發(fā)生的早期標(biāo)記，還可以有助于理解腫瘤的增殖或侵襲行為，幫助臨床醫(yī)生正確選擇有效的治療治療。在以下實(shí)驗(yàn)中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，闡明這些實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趲椭斫獗景l(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)被理解為在以任何方式限制本文中所述的本發(fā)明范圍。實(shí)施例實(shí)施例1：hMenaΔv6編碼序列的分子克隆和表征采用針對(duì)人Mena編碼序列所設(shè)計(jì)并分別擁有ATG和終止密碼子的兩條引物，對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。PCR產(chǎn)物測(cè)序揭示，這些細(xì)胞表達(dá)hMena(1713nt)并且此外表達(dá)一種尚未描述的從ATG至終止密碼子共1602個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物。這個(gè)序列與hMena相同，但是缺少111個(gè)核苷酸的內(nèi)部外顯子6，因此，我們將這種剪接變體命名為hMenaΔv6(GenBank，登錄號(hào)：1030575)，SEDIDNO1。hMenaΔv6cDNA編碼一種533個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQID2)，其缺少位于hMena的LERER和脯氨酸富含區(qū)之間37個(gè)氨基酸的內(nèi)肽(圖1)。這個(gè)肽的缺少在這種蛋白質(zhì)中使LERER結(jié)構(gòu)域與脯氨酸富含結(jié)構(gòu)域接近。當(dāng)進(jìn)行蛋白質(zhì)比對(duì)時(shí)，hMenaΔv6顯示與526個(gè)氨基酸的褐家鼠(Rattusnorvegicus)ENAH(NCBI登錄號(hào)：AAH83927)具有88%的同一性，大部分的不同位于LERER結(jié)構(gòu)域中；與來(lái)自原雞(Gallusgallus)的513個(gè)氨基酸的avenaII(NCBI登錄號(hào)：BAB18909)具有87%的同一性，并且與來(lái)自非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的535個(gè)氨基酸的可激活蛋白(NCBI登錄號(hào)：AAW31125)具有77%的同一性。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)不包括顯示缺少外顯子6的小鼠或人完整序列，但是EST數(shù)據(jù)庫(kù)顯示了來(lái)自胚胎干細(xì)胞(登錄號(hào)：AV470522)和來(lái)自乳腺滲入性導(dǎo)管癌(登錄號(hào)：BI664046)的兩個(gè)小鼠序列，和來(lái)自十二指腸腺癌細(xì)胞系的一個(gè)人類序列(登錄號(hào)：BF982593)。在蛋白質(zhì)水平，利用識(shí)別全部同工型的抗hMena抗體(pan-hMena)對(duì)hMena和hMenaΔv6體外翻譯蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析揭示，如圖1的小圖B中所示，這些蛋白質(zhì)以表觀分子量88kDa(hMena)和80kDa(hMenaΔv6)遷移，而預(yù)測(cè)的分子量分別是66kDa和60kDa。這種較慢的遷移率可以歸因于序列中存在的富含脯氨酸的基序。如圖1小圖B中所示，兩種體外翻譯的hMena和hMenaΔv6同工型對(duì)應(yīng)于MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物中由蛋白質(zhì)印跡分析所揭示的條帶。實(shí)施例2：hMena11a和hMenaΔv6擇一表達(dá)并且分別與上皮表型和間充質(zhì)表型相關(guān)。隨后采用分別位于外顯子5和外顯子12中的兩條引物(MTC1f；MTC4r)，通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)一系列乳腺癌細(xì)胞系分析hMena、hMena11a和hMenaΔv6的表達(dá)。在hMena總是存在的情況下，兩種剪接變體hMena11a和hMenaΔv6是互斥地表達(dá)(圖1，小圖B、C)。如圖1中所示，兩個(gè)管狀乳腺癌細(xì)胞系MCF7和SBT表達(dá)hMena11a但不表達(dá)hMenaΔv6，這在基底乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和BT549中情況相反，它們?nèi)鄙偕掀Mena11a同工型，這表明hMenaΔv6表達(dá)是間充質(zhì)表型獨(dú)有的。在蛋白質(zhì)水平，用我們產(chǎn)生的特異性抗體表征hMena同工型表達(dá)表明，在一個(gè)大的細(xì)胞組中，hMena11a和hMenaΔv6分別與上皮表型或間充質(zhì)表型相關(guān)(圖2小圖A)。正常人角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)hMena11a和E-鈣黏著蛋白，而表達(dá)N-鈣黏著蛋白的成纖維細(xì)胞為hMena11a表達(dá)陰性并且表達(dá)hMenaΔv66。如所述，正常細(xì)胞顯示十分低水平的hMena表達(dá)并且血小板為陰性(GertlerFB,NiebuhrK,ReinhardM,WehlandJ,SorianoP.Mena,arelativeofVASPandDrosophilaEnabled,isimplicatedinthecontrolofmicrofilamentdynamics.Cell.1996Oct18；87(2):227-39.)。表達(dá)hMena11a的全部乳腺癌和肺癌細(xì)胞系均顯示同時(shí)表達(dá)E-鈣黏著蛋白。僅表達(dá)E-鈣黏著蛋白的DAL細(xì)胞表達(dá)十分低水平的hMena11a。相反，hMena11a表達(dá)缺乏總是與不存在E-鈣黏著蛋白相關(guān)，例外是SKBr3細(xì)胞，其中不存在E-鈣黏著蛋白是由于基因突變。在這些細(xì)胞中，顯示無(wú)hMenaΔv6表達(dá)，而缺少E-鈣黏著蛋白且間充質(zhì)標(biāo)記(如N-鈣黏著蛋白)為陽(yáng)性的全部乳腺和肺癌細(xì)胞系為hMena11a陰性并且表達(dá)hMenaΔv6。神經(jīng)膠質(zhì)瘤和黑色素瘤是高度侵襲性瘤變形式，我們檢驗(yàn)了6個(gè)黑色素瘤細(xì)胞系和3個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(T98G、U87MG、U373)中的hMena同工型表達(dá)。6個(gè)黑色素瘤細(xì)胞中有5個(gè)顯示hMenaΔv6表達(dá)并同時(shí)表達(dá)N-鈣黏著蛋白(ME10538顯示十分模糊的hMenavv6信號(hào))。僅表達(dá)E-鈣黏著蛋白的黑色素瘤細(xì)胞系(1007)不表達(dá)hMenaΔv6。檢驗(yàn)的全部膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均對(duì)hMenaΔv6為陽(yáng)性并對(duì)hMena11a為陰性，如利用抗hMena11a抗體所揭示那樣(圖2小圖A)。如pan-hMenaAb所檢測(cè)的，hMena同工型(88kDa)總是表達(dá)，例外是血小板。總之，這些結(jié)果表明hMena11a表達(dá)可鑒別上皮細(xì)胞表型。與這些結(jié)果相符，最近已經(jīng)報(bào)道上皮特異性調(diào)節(jié)蛋白(ESRPs)能夠誘導(dǎo)在hMena11a陰性MDA-MB-231細(xì)胞的hMenaRNA轉(zhuǎn)錄物中包含11a外顯子(WarzechaCC,SatoTK,NabetB,HogeneschJB,CarstensRP.ESRP1andESRP2areepithelialcell-type-specificregulatorsofFGFR2splicing.MolCell.2009；33:591-601)。實(shí)施例3：hMena11a轉(zhuǎn)染抑制hMena11a陰性乳腺癌細(xì)胞的基質(zhì)膠侵襲。為了理解hMena11a的缺乏是否歸因于表達(dá)hMenaΔv6的細(xì)胞的侵襲和遷移行為，我們用hMena11a轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞。相對(duì)于對(duì)照，基質(zhì)膠侵襲測(cè)定法在MDA-MB-231-hMena11a轉(zhuǎn)染細(xì)胞中顯示十分明顯的侵襲抑制(圖6小圖A)。此外，傷口愈合遷移測(cè)定法的結(jié)果清楚地顯示，與對(duì)照細(xì)胞(pcDNA3)的行為相反，MDA-MB-231-hMena11a轉(zhuǎn)染細(xì)胞不分散并且在24小時(shí)后或在48小時(shí)后更明顯地不遷移至傷口中。如圖6小圖B中所示，在高度侵襲性BT549細(xì)胞中也觀察到由hMena11a轉(zhuǎn)染測(cè)定的侵襲特性的顯著減少。免疫熒光分析(圖6小圖D)顯示在hMena11a外源表達(dá)后的細(xì)胞骨架變化。在BT549中，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中不同的肌動(dòng)蛋白組構(gòu)圖相對(duì)于對(duì)照是明顯的。用鬼筆環(huán)肽處理的肌動(dòng)蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中采取皮質(zhì)定位(corticallocalization)。這種模式與表達(dá)hMena11a的管狀MCF7細(xì)胞中所觀察到的相似，因此提示hMena11a可能對(duì)外周肌動(dòng)蛋白纖絲的重建是關(guān)鍵的。實(shí)施例4：hMena/hMenaΔv6敲減降低了而hMenaΔv6轉(zhuǎn)染提高了hMena11a陰性乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞遷移和侵襲。如hMena11a轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞系中所顯示的，在功能水平上，我們先前已經(jīng)顯示，hMena11a過(guò)量表達(dá)和磷酸化導(dǎo)致增加的p42/44促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化和細(xì)胞增殖。表達(dá)hMenaΔv6和缺少hMena11a的兩個(gè)基礎(chǔ)乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231，BT549)顯示星狀形態(tài)和侵襲及遷移行為。為評(píng)價(jià)hMenaΔv6是否影響細(xì)胞的遷移和侵襲行為，我們借助siRNA(SMART匯集物si-ENAH,Dharmacon)在MDA-MB-231和BT549細(xì)胞中敲減hMena/hMenaΔv6表達(dá)72小時(shí)。在轉(zhuǎn)染的最后24小時(shí)期間對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行傷口愈合遷移測(cè)定，結(jié)果表明敲減hMena/hMenaΔv6降低了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移。已經(jīng)在用hMena/hMenaΔv6siRNA轉(zhuǎn)染的高度侵襲性BT549中測(cè)量了侵襲能力。我們已經(jīng)在轉(zhuǎn)染最后24小時(shí)期間通過(guò)針對(duì)EGF或FBS梯度使用基質(zhì)膠包被的transwell濾膜(BDBiosciences)評(píng)價(jià)侵襲能力。如圖5中所示，無(wú)論使用FBS或EGF作為趨化劑，hMena/hMenaΔv6敲減均大幅降低了BT549細(xì)胞的侵襲能力。由于hMena/hMenaΔv6敲減抑制了表達(dá)hMenaΔv6的細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲，所以我們已經(jīng)在MDA-MB-231細(xì)胞以及在hMenaΔv6陰性DAL和MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了這種同工型。圖6中報(bào)道的結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照，在MDA-MB-231-hMenaΔv6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的群體中侵襲性細(xì)胞數(shù)明顯更高(p=0,0023)。類似地，在hMena11a/hMenaΔv6陰性DAL細(xì)胞中，在hMenaΔv6轉(zhuǎn)染后觀察到細(xì)胞侵襲行為的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。相反，如通過(guò)傷口愈合(未顯示)和侵襲測(cè)定所評(píng)價(jià)的，hMenaΔv6的外源表達(dá)沒(méi)有在表達(dá)hMena11a的MCF7細(xì)胞中誘導(dǎo)遷移或侵襲行為，因此表明相對(duì)于其他hMena同工型，hMena11a的存在發(fā)揮明顯的抗侵襲作用。這個(gè)結(jié)果，即所述兩種剪接變體的擇一表達(dá)由以下實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其中在hMena11a陰性的癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染hMenaΔv6誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移性和侵襲行為增加。相反，hMena11a外源表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖性能力增加。有趣地，hMena11a在表達(dá)hMenaΔv6的癌細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)引起hMenaΔv6同工型表達(dá)的抑制或顯著減少，如圖2B中所示。實(shí)驗(yàn)部分細(xì)胞系以下細(xì)胞系從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)購(gòu)買：MDAMB468、MDAMB361、T47D、SKBr3、MCF7、BT474、MDA-MB-231和BT549(乳腺癌)，A549、AE2、H1299、Calu3(肺癌)，T98G、U87MG和U373(膠質(zhì)瘤)。所用的其他細(xì)胞系是：黑色素瘤4405和1007，它們?cè)谖覀兊膶?shí)驗(yàn)室中從原發(fā)性黑色素瘤病灶形成。DAL在我們的實(shí)驗(yàn)室中從兩位乳腺癌患者的腹水中形成；正常人角質(zhì)形成細(xì)胞(NHK)和正常人成纖維細(xì)胞(NHF)分別由Dr.A.Venuti(ReginaElenaCancerInstitute，羅馬，意大利)惠贈(zèng)；黑色素瘤ME10538、VAS、3046、4405和1007由Dr.A.Anichini(IstitutoTumoriMilano,意大利)惠贈(zèng)。hMena和hMenaΔv6的克隆和測(cè)序使用第一鏈cDNA合成試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech,LittleChalfont,UK)，通過(guò)使用Trizol試劑(LifeTechnologiesInc,Rockville,MD,USA)從MDA-MB-231細(xì)胞系所提取的2微克總RNA來(lái)通獲得相關(guān)cDNA。在PCR反應(yīng)中使用PlatinumPfxDNA聚合酶(Invitrogen)擴(kuò)增cDNA，所述PCR反應(yīng)由在變性溫度94°C(30秒/循環(huán))、復(fù)性溫度55°C(1分鐘/循環(huán))和延伸溫度68°C(3分鐘/循環(huán))的30個(gè)循環(huán)組成。所用的引物(Invitrogen)含有hMena的ATG和終止密碼子：P1-ATG(5'-CACCATGAGTGAACAGAGTATC-3')SEQID11和P8-終止(5'-CTGTTCCTCTATGCAGTATTTGAC-3')SEQID12。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上分析，從凝膠中切下并且使用凝膠提取試劑盒(Qiagen,Crawley,UK)純化。樣品與1單位AmpliTaq聚合酶和1μl10mMdATP(二者均來(lái)自AppliedBiosystems,Branchburg,NJ,USA)孵育以添加3'腺嘌呤并且隨后借助pcDNA3.1/V5-HISTOPOTA表達(dá)試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行克隆。質(zhì)粒DNA由WizardPlus微量制備DNA純化系統(tǒng)(PromegaCorporation,Madison,WI,USA)分離并且用T7和T3引物初步測(cè)序。一旦獲得初始序列，則合成額外的引物以便對(duì)插入物測(cè)序(P4-for5'-GAGCGACTGGAACAAGAACAGCTG-3'SEQID13；P5-for5'-GAGAGCGCAGAATATCAAGTGCTG-3'SEQID14；P6-rev5'-GGCGATTGTCTTCTGACATGG-3'SEQID15；P7-for5'-GAATTGCTGAAAAGGGATC-3'SEQID19；P7-rev5'-GATCCCTTTTCAGCAATTC-3')SEQID16。DNA測(cè)序由NucleicAcidFacilityService(IstitutoDermopaticodell'Immacolata，羅馬，意大利)使用ABIPRISM377-96自動(dòng)測(cè)序儀(AppliedBiosystem)進(jìn)行。RT-PCR使用MTC1f(5'-GCTGGAATGGGAGAGAGAGCGCAGAATATC-3'SEQID20)和MTC4r(GTCAAGTCCTTCCGTCTGGACTCCATTGGC-3'SEQID21)引物，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)hMena剪接變體。PCR反應(yīng)由在變性溫度94°C(30秒/循環(huán))、復(fù)性溫度和延伸溫度68°C(2分鐘/循環(huán))的30個(gè)循環(huán)組成。依賴1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色法分析PCR產(chǎn)物。偶聯(lián)體外轉(zhuǎn)錄的翻譯在偶聯(lián)體外轉(zhuǎn)錄的翻譯系統(tǒng)中，按照制造商的說(shuō)明(TNT，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)，PromegaCorporation)檢驗(yàn)(插入至pcDNA3.1載體中的)hMena和hMenaΔv6cDNA的體外翻譯?？贵w通過(guò)使用PrimmService(Primmsrl，Milan，意大利)形成對(duì)hMena11a同工型特異的兔多克隆抗體，其針對(duì)這種同工型特有的11a序列的18-aa肽(RDSPRKNQIVFDNRSYDSSEQID10)。為獲得對(duì)hMenaDv6同工型特異的抗體，將兔用由覆蓋第5和第7外顯子的連接區(qū)域編碼的肽(SEQID3)免疫。隨后使用由第5和第6外顯子連接或第6和第7外顯子連接編碼的肽(SEQID4和5)通過(guò)兩個(gè)親和層析步驟純化兔抗血清，以便耗盡血清中識(shí)別全部hMena同工型共有的區(qū)域的抗體。隨后使用免疫原性肽(SEQID3)通過(guò)親和層析純化特定的IgG。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法在MCF7(hMena11a陽(yáng)性hMenaΔv6陰性)和MDA-MB-231(hMena11a陰性，hMenaΔv6陽(yáng)性)細(xì)胞(圖2)以及在用hMena11a、hMenaΔv6或用空載體(未顯示)轉(zhuǎn)染的DAL細(xì)胞上，并通過(guò)免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)所獲得的抗體的特異性，其中所述免疫組織化學(xué)通過(guò)用免疫原性肽預(yù)處理消除抗體針對(duì)乳腺癌組織的反應(yīng)性(圖7)。蛋白質(zhì)印跡分析如所報(bào)道那樣裂解細(xì)胞。裂解物(30μg或50μg)如所述那樣在10%聚丙烯酰胺凝膠上解析并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(AmershamBioscience)上。印跡物用3%脫脂乳中的以下抗體在4°C過(guò)夜檢測(cè)：10μg/mL抗hMena兔CKLK1抗體；抗hMena11a(0.5μg/mL)和抗hMenaΔv6(0.6μg/mL)；來(lái)自BDBiosciences的小鼠抗E-鈣黏著蛋白；來(lái)自DakoCytomation(Glostrup，Denmark)的小鼠抗N-鈣黏著蛋白。對(duì)于肌動(dòng)蛋白信號(hào)，印跡物用1μg/mL單克隆抗肌動(dòng)蛋白-小鼠腹水克隆AC-40(SigmaAldrich，Poole，UK)重新檢測(cè)。也對(duì)5μl體外翻譯的hMena和hMenaΔv6進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。免疫熒光分析將在用100μg/mL大鼠尾1型膠原蛋白(BDBiosciencesSanJose，CA，USA)包被的玻璃蓋玻片上培育至半?yún)R合的細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定(EMS,FortWashington,PA,USA)15分鐘，用含0.2%TritonX-100的PBS透化。與1%(w/v)牛血清白蛋白(Sigma，St.Louis，MO，USA)孵育后，細(xì)胞與采用AlexaFluor532(LifeTechnologies/Invitrogen)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽孵育1小時(shí)，用PBS洗滌并且用含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚)(DAPI)的H-1200Vectashield封片介質(zhì)(VectorLaboratoriesInc.,Burlingame,CA,USA)封裝。圖像代表一式兩份進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染和小干擾性RNA處理處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以密度3x105個(gè)細(xì)胞/孔鋪種于6孔平板中。在24小時(shí)后，使用LipofectAMINE2000試劑(Invitrogen)，根據(jù)制造商的操作方案，將細(xì)胞用1.5μg/mLhMena+11a、hMenaΔv6cDNA或用單獨(dú)的載體(pcDNA3)或用100nmol/L匯集的hMena特異性siRNA雙鏈體(siENASMART匯集物)或非特異性對(duì)照siRNA(Dharmacon，Lafayette，CO)轉(zhuǎn)染。通過(guò)用含500μg/mLG418(Invitrogen,Pisley,UK)的完整培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。傷口愈合測(cè)定法將細(xì)胞在6孔平板上接種并且用所示的siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用吸管尖端劃開(kāi)匯合的細(xì)胞。在其他情況下，將細(xì)胞在6孔平板中培育至匯合并且隨后劃開(kāi)。根據(jù)細(xì)胞類型，使用倒置顯微鏡，在24小時(shí)和48小時(shí)后對(duì)細(xì)胞拍照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行并且重復(fù)至少3次。隨后將細(xì)胞裂解并且在蛋白質(zhì)印跡法中分析以確定siRNA轉(zhuǎn)染的效率。細(xì)胞侵襲測(cè)定siRNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，計(jì)數(shù)細(xì)胞并且按照制造商的說(shuō)明書，將相等數(shù)目的細(xì)胞一式兩份接種至基質(zhì)膠侵襲室(24孔；BDBiocoat基質(zhì)膠侵襲室，BD，Biosciences)。允許細(xì)胞侵襲24小時(shí)并且在一些情況下侵襲72小時(shí)，隨后進(jìn)行染色、照相和計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。統(tǒng)計(jì)分析全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)最少3次。從侵襲測(cè)定和摻入測(cè)定采集的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±SD。在一些圖中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)來(lái)自一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)，其與重復(fù)實(shí)驗(yàn)在性質(zhì)上相似。通過(guò)兩組數(shù)據(jù)集之間的Studentt檢驗(yàn)(雙尾)比較確定統(tǒng)計(jì)顯著性。信號(hào)表示與相應(yīng)對(duì)照條件相比實(shí)驗(yàn)組的顯著差異(P<0.05，見(jiàn)圖注)。使用GraphPadPrism4，V4.03軟件(GraphPadInc.，SanDiego，CA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。序列表SEQIDNO：1hMena剪接變體△v6atgagtgaacagagtatctgtcaggcaagagctgctgtgatggtttatgatgatgccaataagaagtgggtgccagctggtggctcaactggattcagcagagttcatatctatcaccatacaggcaacaacacattcagagtggtgggcaggaagattcaggaccatcaggtcgtgataaactgtgccattcctaaagggttgaagtacaatcaagctacacagaccttccaccagtggcgagatgctagacaggtgtatggtctcaactttggcagcaaagaggatgccaatgtcttcgcaagtgccatgatgcatgccttagaagtgttaaattcacaggaaacagggccaacattgcctagacaaaactcacaactacctgctcaagttcaaaatggcccatcccaagaagaattggaaattcaaagaagacaactacaagaacagcaacggcaaaaggagctggagcgggaaaggctggagcgagaaagaatggaaagagaaaggttggagagagagaggttagaaagggaaaggctggagagggagcgactggaacaagaacagctggagagagagagacaagaacgggaacggcaggaacgcctggagcggcaggaacgcctggagcggcaggaacgcctggagcggcaggaacgcctggatcgggagaggcaagaaagacaagaacgagagaggctggagagactggaacgggagaggcaagaaagggagcgacaagagcagttagaaagggaacagctggaatgggagagagagcgcagaatatcaagtgctggcattgtcttgggaccacttgcacctccacctcctccaccactcccaccagggcctgcacaggcttcagtagccctccctcctcccccagggccccctccacctcctccactcccatccaccgggcctccaccgccccctcctccccctcctctccctaatcaagtaccccctcctcctccaccacctcctgccccacccctccctgcatctggattctttttggcatccatgtcagaagacaatcgccctttaactggacttgcagctgcaattgccggagcaaaacttaggaaagtgtcacggatggaggatacctctttcccaagtggagggaatgctattggtgtgaactccgcctcatctaaaacagatacaggccgtggaaatggaccccttcctttagggggtagtggtttaatggaagaaatgagtgccctgctggccaggaggagaagaattgctgaaaagggatcaacaatagaaacagaacaaaaagaggacaaaggtgaagattcagagcctgtaacttctaaggcctcttcaacaagtacacctgaaccaacaagaaaaccttgggaaagaacaaatacaatgaatggcagcaagtcacctgttatctccagaccaaaatccacacccttatcacagcccagtgccaatggagtccagacggaaggacttgactatgacaggctgaagcaggacattttagatgaaatgagaaaagaattaacaaagctaaaagaagagctcattgatgcaatcaggcaggaactgagcaagtcaaatactgcatagSEQIDNO：2△v6hMena同工型的氨基酸序列MetSerGluGlnSerIleCysGlnAlaArgAlaAlaValMetValTyrAspAspAlaAsnLysLysTrpValProAlaGlyGlySerThrGlyPheSerArgValHisIleTyrHisHisThTGlyAsnAsnThrPheArgValValGlyArgLysIleGlnAspHisGlnValValIleAsnCysAlaIleProLysGlyLeuLysTyrAsnGlnAlaThrGlnThrPheHisGlnTrpArgAspAlaArgGlnValTyrGlyLeuAsnPheGlySerLysGluAspAlaAsnValPheAlaSerAlaMetMetHisAlaLeuGluValLeuAsnSerGlnGluThrGlyProThrLeuProArgGlnAsnSerGlnLeuProA1aGlnValGlnAsnGlyProSerGlnGluGluLeuG1uI1eG1nArgArgGlnLeuGlnGluGlnG1nArgGlnLysGluLeuG1uArgGluArgLeuGluArgGluArgMetGluArgGluArgLeuGluArgGluArgLeuGluArgGluArgLeuGluArgGluArgLeuGluGlnGluGlnLeuGluArgGluArgGlnGluArgGluArgGlnGluArgLeuGluArgGlnGluArgLeuGluArgGlnGluArgLeuGluArgGlnGluArgLeuAspArgGluArgGlnGluArgGlnGluArgGluArgLeuGluArgLeuGluArgGluArgGlnGluArgGluArgGlnGluGlnLeuGluArgGluGlnLeuGluTrpGluArgGluArgArgIleSerSerAlaGlyIleValLeuGlyProLeuAlaProProProProProProLeuProProGlyProA1aGlnAlaSerValAlaLeuProProProProGlyProProProProProProLeuProSerThrGlyProProProProProProProProProLeuProAsnGlnValProProProProProProProProAlaProProLeuProAlaSerGlyPhePheLeuAlaSerMetSerGluAspAsnArgProLeuThrGlyLeuAlaAlaAlaIleAlaGlyAlaLysLeuArgLysValSerArgMetGluAspThrSerPheProSerGlyGlyAsnAlaIleGlyValAsnSerAlaSerSerLysThrAspThrGlyArgGlyAsnGlyProLeuProLeuGlyGlySerGlyLeuMetGluGluMetSerAlaLeuLeuAlaArgArgArgArgIleAlaGluLysGlySerThrI1eGluThrGluGlnLysGluAspLysGlyGluAspSerGluProValThrSerLysAlaSerSerThrSerThrProGluProThrArgLVsProTrpGluArgThrAsnThrMetAsnGlySerLysSerProValIleSerArgProLysSerThrProLeuSerGlnProSerAlaAsnGlyValGlnThrGluGlyLeuAspTyrAspArgLeuLysGlnAspIleLeuAspGluMetArgLysGluLeuThrLysLeuLysGluGluLeuIleAspAlaIleArgGlnGluLeuSerLysSerAsnThrAlaSEQIDNO∶3用來(lái)獲得抗Δv6抗體的免疫原性肽GluArgArgIleSerSerAlaGlyIleValLeuGlySEQIDNO:4由第5和第6外顯子的連接編碼的用于親和層析中以便分離Δv6特異性抗體的肽GluTrpGluArgGluArgArgIleSerSerAlaAlaAlaSEQIDNO:5由第6和第7外顯子的連接編碼的用于親和層析中以便分離Δv6特異性抗體的肽SerGinGinGlylieValLeuGlyProLeuAlaProProSEQIDNO：6hMena剪接變體11a的核苷酸序列atgagtgaacagagtatctgtcaggcaagagctgctgtgatggtttatgatgatgccaataagaagtgggtgccagctggtggctcaactggattcagcagagttcatatctatcaccatacaggcaacaacacattcagagtggtgggcaggaagattcaggaccatcaggtcgtgataaactgtgccattcctaaagggttgaagtacaatcaagctacacagaccttccaccagtggcgagatgctagacaggtgtatggtctcaactttggcagcaaagaggatgccaatgtcttcgcaagtgccatgatgcatgccttagaagtgttaaattcacaggaaacagggccaacattgcctagacaaaactcacaactacctgctcaagttcaaaatggcccatcccaagaagaattggaaattcaaagaagacaactacaagaacagcaacggcaaaaggagctggagcgggaaaggctggagcgagaaagaatggaaagagaaaggttggagagagagaggttagaaagggaaaggctggagagggagcgactggaacaagaacagctggagagagagagacaagaacgggaacggcaggaacgcctggagcggcaggaacgcctggagcggcaggaacgcctggagcggcaggaacgcctggatcgggagaggcaagaaagacaagaacgagagaggctggagagactggaacgggagaggcaagaaagggagcgacaagagcagttagaaagggaacagctggaatgggagagagagcgcagaatatcaagtgctgctgcccctgcctctgttgagactcctctaaactctgtgctgggagactcttctgcttctgagccaggcttgcaggcagcctctcagccggccgagactccatcccaacagggcattgtcttgggaccacttgcacctccacctcctccaccactcccaccagggcctgcacaggcttcagtagccctccctcctcccccagggccccctccacctcctccactcccatccaccgggcctccaccgccccctcctccccctcctctccctaatcaagtaccccctcctcctccaccacctcctgccccacccctccctgcatctggattctttttggcatccatgtcagaagacaatcgccctttaactggacttgcagctgcaattgccggagcaaaacttaggaaagtgtcacggatggaggatacctctttcccaagtggagggaatgctattggtgtgaactccgcctcatctaaaacagatacaggccgtggaaatggaccccttcctttagggggtagtggtttaatggaagaaatgagtgccctgctggccaggaggagaagaattgctgaaaagggatcaacaatagaaacagaacaaaaagaggacaaaggtgaagattcagagcctgtaacttctaaggcctcttcaacaagtacacctgaaccaacaagaaaaccttgggaaagaacaaatacaatgaatggcagcaagtcacctgttatctccagacgggattctccaaggaaaaatcagattgtttttgacaacaggtcctatgattcattacacagaccaaaatccacacccttatcacagcccagtgccaatggagtccagacggaaggacttgactatgacaggctgaagcaggacattttagatgaaatgagaaaagaattaacaaagctaaaagaagagctcattgatgcaatcaggcaggaactgagcaagtcaaatactgcatagSEQIDNO：7hMena同工型11a的氨基酸序列MetSerGluGlnSerIleCysGlnAlaArgAlaAlaValMetValTyrAspAspAlaAsnLysLysTrpValProAlaGlyGlySerThrGlyPheSerArgValHisIleTyrHisHisThrGlyAsnAsnThrPheArgValValGlyArgLysIleGlnAspHisGlnValValIleAsnCysAlaIleProLysGlyLeuLysTyrAsnGlnAlaThrGlnThrPheHisGlnTrpArgAspAlaArgGlnValTyrGlyLeuAsnPheGlySerLysGluAspAlaAsnValPheAlaSerAlaMetMetHisAlaLeuGluValLeuAsnSerGlnGluThrG1yProThrLeuProArgGlnAsnSerGlnLeuProAlaGlnValGlnAsnGlyProSerGlnGluGluLeuGluIleGlnArgArgGlnLeuGlnGluGlnGlnArgGlnLysGluLeuGluArgGluArgLeuGluArgGluArgMetGluArgGluArgLeuGluArgGluArgLeuGluArgGluArgLeuGluArgGluArgLeuGluGlnGluGlnLeuGluArgGluArgGlnGluArgGluArgGlnGluArgLeuGluArgGlnGluArgLeuGluArgGlnGluArgLeuGluArgGlnGluArgLeuAspArgGluArgGlnGluArgGlnGluArgGluArgLeuGluArgLeuGluArgG1uArgGlnGluArgGluArgGlnGluGlnLeuGluArgGluGlnLeuGluTrpGluArgGluArgArgIleSerSerAlaAlaAlaProAlaSerValGluThrProLeuAsnSerValLeuGlyAspSerSerAlaSerGluProGlyLeuGlnAlaAlaSerGlnProAlaGluThrProSerGlnGlnGlyIleValLeuGlyProLeuAlaProProProProProProLeuProProGlyProAlaGlnAlaSerValAlaLeuProProProProGlyProProProProProProLeuProSerThrGlyProProProProProProProProProLeuProAsnGlnValProProProProProProProProAlaProProLeuProAlaSerGlyPhePheLeuAlaSerMetSerGluAspAsnArgProLeuThrGlyLeuAlaAlaAlaIleAlaGlyAlaLysLeuArgLysValSerArgMetGluAspThrSerPheProSerGlyGlyAsnAlaIleGlyValAsnSerAlaSerSerLysThrAspThrGlyArgGlyAsnGlyProLeuProLeuGlyGlySerGlyLeuMetGluGluMetSerAlaLeuLeuAlaArgArgArgArgIleAlaGluLysGlySerThrIleGluThrGluGlnLysGluAspLysGlyGluAspSerGluProValThrSerLysAlaSerSerThrSerThrProGluProThrArgLysProTrpGluArgThrAsnThrMetAsnGlySerLysSerProValIleSerArgArgAspSerProArgLysAsnGlnIleValPheAspAsnArgSerTyrAspSerLeuHisArgProLysSerThrProLeuSerGlnProSerAlaAsnGlyValGlnThrGluGlyLeuAspTyrAspArgLeuLysGlnAspIleLeuAspGluMetArgLysGluLeuThrLysLeuLysGluGluLcuIleAspAlaIleArgGlnGluLeuSerLysSerAsnThrAlaSEQIDNO：8編碼hMena11a同工型的外顯子11a的核苷酸序列acgggattctccaaggaaaaatcagattgtttttgacaacaggtcctatgattcattacacagSEQIDNO:9編碼hMena11a同工型的外顯子11a的氨基酸序列ArgAspSerProArgLySAsnGlnIleValPheAspAsnArgSerTyrAspSerLeuHisArgSEQIDNO10hMena11a免疫原性肽ArgAspSerProArgLysAsnGlnIleValPheAspArgSerTyrAspSePSEQIDNO11用于擴(kuò)增hMena的正向引物P1-ATG5'-CACCATGAGTGAACAGAGTATC-3'SEQIDNO12用于擴(kuò)增hMena的反向引物P8-終止5'-CTGTTCCTCTATGCAGTATTTGAC-3'SEQIDNO13用于hMena測(cè)序的正向引物P45'-GAGCGACTGGAACAAGAACAGCTG-3'SEQIDNO14用于hMena測(cè)序的正向引物P55'-GAGAGCGCAGAATATCAAGTGCTG-3’SEQIDNO15用于hMena測(cè)序的反向引物P65'-GGCGATTGTCTTCTGACATGG-3’SEQIDNO16用于hMena測(cè)序的反向引物P75'-GATCCCTTTTCAGCAATTC-3'SEQIDNO17hMenaΔ6的有義鏈siRNAuaucaagugcuggcauuguuuSEQIDNO18hMenaΔ6的反義鏈siRNAacaaugccagcacuugauauuSEQIDNO19用于hMena測(cè)序的正向引物P7gaattgctgaaaagggatc參考文獻(xiàn)-BearJEetal.AntagonismbetweenEna/VASPproteinsandactinfilamentcappingregulatesfibroblastmotility.Cell.2002May17;109(4):509-21-DiModugnoF,BronziG,ScanlanMJ,etal.HumanMenaprotein,aserex-definedantigenoverexpressedinbreastcancerelicitingbothhumoralandCD8+T-cellimmuneresponse.IntJCancer2004;109:909–18.DiModugnoF,MottoleseM,DiBenedettoA,etal.Thecytoskeletonregulatoryproteinhmena(ENAH)isoverexpressedinhumanbenignbreastlesionswithhighriskoftransformationandhumanepidermalgrowthfactorreceptor-2-positive/hormonalreceptor-negativetumors.ClinCancerRes2006;12:1470–8.-DiModugnoFetal.MolecularcloningofhMena(ENAH)anditssplicevarianthMena+11a:epidermalgrowthfactorincreasestheirexpressionandstimulateshMena+11aphosphorylationinbreastcancercelllines.CancerRes2007;67:2657-65-PinoMSetal.hMena+11aisoformservesasamarkerofepithelialphenotypeandsensitivitytoEGFRinhibitioninhumanpancreaticcancercelllines.ClinCancerRes2008;14:4943-50-GardinaPJetal.Alternativesplicinganddifferentialgeneexpressionincoloncancerdetectedbyawholegenomeexonarray.BMCGenomics.2006Dec27;7:325-GertlerFBetal..Mena,arelativeofVASPandDrosophilaEnabled,isimplicatedinthecontrolofmicrofilamentdynamics.Cell.1996Oct18;87(2):227-39-GoswamiSetal.IdentificationofinvasionspecificsplicevariantsofthecytoskeletalproteinMenapresentinmammarytumorcellsduringinvasioninvivo.ClinExpMetastasis.2009;26:153-9.-McCaffreyAP,MeuseL,PhamTT,ConklinDS,HannonGJ,KayMA.RNAinterferenceinadultmice.Nature.20024;418(6893):38-9.-KrauseM,etal.Ena/VASPproteins:regulatorsoftheactincytoskeletonandcellmigration.AnnuRevCellDevBiol2003;19:541-64-OlsonMF,SahaiE.Theactincytoskeletonincancercellmotility.ClinExpMetastasis.2009;26(4):273-87-PhilipparUetal.AMenainvasionisoformpotentiatesEGF-inducedcarcinomacellinvasionandmetastasis.DevCell.2008;15:813-28-ScottJA,etal.MolBiolCell2006;3:1085-95-TaniKetal.Ablinteractor1promotestyrosine296phosphorylationofmammalianenabled(Mena)byc-Ablkinase.JBiolChem.2003Jun13;278(24):21685-92-UrbanelliLetal.CharacterizationofhumanEnahgene.BiochimBiophysActa2006;1759:99-107-WangW,GoswamiS,LapidusK,etal.Identificationandtestingofageneexpressionsignatureofinvasivecarcinomacellswithinprimarymammarytumors.CancerRes2004;64:8585–942004-WangGS,CooperTA.Splicingindisease:disruptionofthesplicingcodeandthedecodingmachinery.NatRevGenet.2007Oct;8(10):749-61.-WarzechaCCetal.ESRP1andESRP2areepithelialcell-type-specificregulatorsofFGFR2splicing.MolCell.2009;33:591-601