專利名稱：具有新穎核殼結構和pH響應性的磁性納米粒子及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的目的是提供一種具有磁性、pH敏感、最外層為生物相容 性好的聚乙二醇、次外層為疏水性可調節(jié)的聚陰離子和核為Fe304納米 粒子的多層核-殼結構的復合納米粒子(納米載體)及其制備方法和該 復合納米粒子作為藥物的栽體的應用。
背景技術：
聚合物/磁性納米粒子復合材料是將磁性無機納米粒子分散于聚 合物基體中形成的復合材料。由于此種材料結合了聚合物和磁性無機 納米粒子的優(yōu)點，兼具磁響應性和聚合物的功能性，因而在醫(yī)學、生 物化學及工業(yè)應用等領域顯示出廣泛的應用前景，包括細胞分離、分 類、免疫測定、固定化酶、催化劑分離、核磁共振成像等。其中，對 聚合物/磁性納米粒子復合材料在藥物控釋方面的應用研究的最為廣 泛。
某些用于治療的藥物如癌的化療藥通常具有毒性高、溶解性差、 體內循環(huán)時間短等缺點，導致應用受到了很大的限制。減少藥物的毒 性，提高藥物的生物利用度是醫(yī)藥學面臨的一個具有挑戰(zhàn)性的問題。 由于各種藥物釋放和靶向系統(tǒng)能夠減少藥物降解及損失，降低副作用， 提高生物利用度，因而對它們的研究越來越受重視。其中藥用載體發(fā) 展迅速，微球、脂質體和聚合物納米粒子是研究最多的藥用栽體，它 們各具優(yōu)缺點。微球適合化學栓塞及局部注射，但不適于注射用藥； 脂質體可用于多種給藥途徑和制劑，當它作為抗癌藥物載體時可使藥
物選擇性地殺傷癌細胞，提高療效，但它的結構不穩(wěn)定，易被網狀內 皮組織系統(tǒng)清除。與前兩者相比，聚合物納米粒子作為藥物載體具有
4獨特的優(yōu)勢。組成納米粒子的聚合物的結構多變、穩(wěn)定、載藥范圍廣。 聚合物納米粒子的表面如果由親水性和生物相容性好的聚合物如聚乙
二醇(PEG)覆蓋，則其不易被網狀內皮組織系統(tǒng)清除，具有優(yōu)良的組 織滲透性，在體內滯留時間長。聚乙二醇(包括曱氧基聚乙二醇等衍 生物)具有非常好的生物相容性，其免疫原性極弱，已經獲美國FDA 批準用作多種藥物制劑的添加物或載體，可用于口服、靜脈注射等給藥。
耙向釋放策略包括(l)被動耙向納米粒子不易透過正常組織 的毛細血管壁，但易透過癌、炎癥和血管梗塞等病變組織的多孔性的 血管系統(tǒng)，進入到這些組織中，而這些組織的弱的淋巴引流作用又使 進入的納米粒子不易再擴散出去，即EPR作用。(2)配體靶向將對 癌細胞有特異識別作用的配體偶聯(lián)于載體的表面，從而識別癌細胞。 (3)生理微環(huán)境感應釋放如pH感應釋放，負栽的藥物在血液中(pH 7. 4 )不釋放，當負載藥物的載體到達癌組織并通過細胞內吞作用進入 癌細胞后，由于細胞內較酸性的環(huán)境(pH 4-6)使藥物釋放。(4) 物理作用激發(fā)靶向釋放如超順磁性的栽藥納米粒子通過外磁場達到 耙向目的。近年來，將多種靶向策略集中于同一體系來增加靶向作用。 如Nasongkla等將抗癌藥阿霉素和磁性Fe^納米粒子簇通過疏水作用 包埋于PEG-PLA (PLA為聚乳酸)的膠束中，在酸性條件下阿霉素質子 化使其水溶性增大而釋放，在pH 7.4和5. 0時6小時分別釋放1.7%和 10.4%。這一釋放體系的缺點是藥物負載量低和釋放速率低(參考N. Nasongkla, E. Bey， J. Ren， H. Ai， C. Khemtong， J. S. Guth，S. F. Chin, A. D. Sherry, D. A. Boothman and J. Gao， Nano Lett., 2006， 6， 2427-2430 ) 。 Yang等報道了類似的多功能體系，所用嵌段 共聚物為PEG-PLGA (PLGA為乳酸和2-羥基乙酸的無規(guī)共聚物)，此載 體對阿霉素的負栽量也僅有3.5% (參考J. Yang, C. H. Lee, H. J. Ko， J. S. Suh， H. G. Yoon， L Lee, Y. M. Huh and S. Haam, Angew. Chem. Int. Ed., 2007， 46， 8836-8839 )。
因此，開發(fā)載藥量高、釋放速度快的多功能藥物靶向控釋載體是十分需要的。
文獻報道(參考Shourong Wan， Yuee Zheng， Yuanqin Liu， Husheng Yan and Keliang Liu， J. Mater. Chem. ， 2005， 15， 3424 3430 ),在丙烯酸甘油單酯或甲基丙烯酸甘油單酯與丙烯酸或曱基 丙烯酸的二嵌段共聚物的存在下，堿性共沉淀Fe27Fe3+(摩爾比為1: 2 ) 得到分散于水中的二嵌段共聚物包裹Fe304納米粒子的復合納米粒子， 其中聚丙烯酸甘油單酯或聚甲基丙烯酸甘油單酯嵌段附著于Fe304納 米粒子表面上，而聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸嵌段處于復合納米粒子的 表面，帶正電荷的藥物可通過離子作用負栽于復合納米粒子表面的聚 陰離子上。但在中性或酸性條件下復合納米粒子的表面帶負電荷(羧 酸根負離子)，具有細胞毒性，因此不適合作為藥物載體。聚乙二醇 與聚丙烯酸甘油單酯或聚甲基丙烯酸甘油單酯的二嵌段共聚物包裹 FeA納米粒子的復合納米粒子，其聚乙二醇處于復合納米粒子的表面 (參考Shourong Wan, Yuee Zheng, Yuanqin Liu， Husheng Yan and Keliang Liu， J. Mater. Chem. ， 2005, 15, 3424 3430 )，應該具 有好的生物相容性，但該復合納米粒子沒有載藥的功能基。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有磁性、pH敏感、最外層為生物相容 性好的聚乙二醇、次外層為疏水性可調節(jié)的聚陰離子和核為Fe力4納米 粒子的多層核-殼結構的復合納米粒子(納米載體)及其制備方法和該 復合納米粒子作為藥物的載體的應用。具體地說，該納米載體是由三 嵌段共聚物包裹FeA納米粒子組成，F(xiàn)e3(K納米粒子核的尺寸為5 ~ 20 納米，三嵌段共聚物的結構可用下面通式表示
<formula>formula see original document page 6</formula>上式中b表示嵌段共聚物，r表示無規(guī)共聚物。第一嵌段為甲氧 基聚乙二醇(MPEG)，其平均聚合度x為10~ 230，第二嵌段為聚丙 烯酸、或聚曱基丙烯酸、或丙蜂酸與丙烯酸酯的無規(guī)共聚物、或甲基 丙烯酸與甲基丙烯酸酯的無規(guī)共聚物。R-H或CH3， m-10~ 100， n- 0~ 30, R'= CH3、 C2H5、 C3H7、 C^或C6H13。此段為疏水性在一定范圍內可 調節(jié)(通過含酯基的鏈節(jié)比例的調節(jié))的聚陰離子。第三嵌段為聚丙 烯酸甘油單酯或聚曱基丙烯酸甘油單酯，z - 10~50。
納米載體的制備方法包括直接法和間接法。直接法為將二價鐵鹽 和三價鐵鹽(摩爾比1:2)與三嵌段共聚物溶于去離子水中，鐵鹽的 總濃度(以Fe計)為0. 5% ~ 5%，鐵鹽(以Fe計)與三嵌段共聚物的 質量濃度比為2: 1 ~ 1: 3。溶液在氮氣保護下在攪拌下向溶液中加入堿 性溶液如氨水或NaOH水溶液，使體系的pH值大于8，反應一定的時 間后形成三嵌段共聚物包裹Fe304納米粒子的復合納米粒子，所需反應 時間與溫度有關，如在室溫下需反應12~24小時，如果在80。C下反 應僅需0. 5 ~ 1小時。待反應完全后其混合液離心(5000rpra x 10 min), 將上清夜轉移到透析袋中，用去離子水反復透析，得到分散于水中的 三嵌段聚合物包裹Fe晶納米粒子的納米載體。冷凍干燥后得到三嵌段 聚合物包裹Fe304納米粒子的納米栽體固體產品。間接法制備三嵌段聚 合物包裹Fe304納米粒子的納米載體的方法為首先制備在水介質無機 陰離子如高氯酸根離子包裹Fe304納米粒子的磁硫體(參考R. Massart, IEEE Trans. Magn. , 1981， MAG-17, 1247 )，然后向》茲石克體中'漫'漫 加入聚合物的水溶液，室溫下攪拌12小時后，混合液離心(5000 rpm xlO min)后，將上清夜轉移到透析袋中，用去離子水反復透析，得 到分散于水中的三嵌段聚合物包裹Fe304納米粒子的納米栽體。
三嵌段共聚物包裹Fe304納米粒子的納米載體中三嵌段聚合物中 的第三嵌段聚丙烯酸甘油單酯或聚甲基丙烯酸甘油單酯的作用是與 Fe304納米粒子表面結合。第一嵌段曱氧基聚乙二醇處于納米載體的最 外層，使栽體具有好的生物相容性；第二嵌段聚陰離子形成納米載體 的次外層，為藥物負載層。陽離子藥物(如含氨基或胺基的藥物)或
7同時帶陽離子和疏水性基團的藥物(如阿霉素、表阿霉素、正定霉素、 絲裂霉素或米托蒽醌等)通過離子作用、或離子作用和疏水作用的共
同作用負載于納米載體的聚陰離子層。在中性條件下(pH - 6~8)， 納米載體中的聚陰離子的羧基以羧酸根負離子的形式存在，而藥物的 氨基或胺基以質子化的正離子形式存在，藥物通過離子作用負載于聚 陰離子層。如果陽離子藥物帶有疏水性的基團，則可與聚陰離子層的 疏水基團如聚陰離子層帶酯基的鏈節(jié)和(或)聚陰離子的主鏈存在疏 水作用。根據熱力學第二定律的原理，當離子作用和疏水作用同時作 用于同一分子時，即螯合作用，其總的作用力大于它們單獨作用時作 用力的力口和(參考S. Cheng， H. Yan， C. Zhao, J. Chromatogr. A， 2006， 1108， 43-49 )。因此離子作用和疏水作用的共同作用會大大增 大其負載作用力。當體系的酸性增大時，負載藥物的納米載體中的聚 陰離子的羧酸根負離子質子化而變?yōu)橹行缘聂然顾幬锱c載體間的 離子作用消失。如果負載的藥物與載體之間還存在疏水作用，則離子 作用消失后，由于螯合作用的消失，疏水作用單獨的作用力較小，使 負載的藥物釋放。實現(xiàn)使負載的藥物pH感應釋放。
本發(fā)明所用三嵌段共聚物的合成可用現(xiàn)有任何合成嵌段共聚物的 方法，如活性自由基聚合(包括原子轉移自由基聚合(ATRP)、可逆 加成-裂解鏈轉移自由基聚合(RAFT)等)、陰離子聚合等。


圖1: MPEG-b-PMAA-b-PGMA-FeA復合納米粒子的透射電鏡照片。
圖2:動態(tài)光散射測定的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304納米粒子在 水中的粒徑分布圖。
圖3: MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe力4納米粒子的/f茲滯回歸曲線，H為 磁場強度，M為磁化強度。
圖4:紫外吸收測定的復合納米粒子在Pb(Ac)r溶液中的穩(wěn)定性比較。
圖5:鼠成纖維細胞在不同濃度納米粒子存在的條件下培養(yǎng)24小 時后的相對存活率曲線。圖6:負載阿霉素的復合納米粒子釋放阿霉素的曲線。
具體實施例方式
下面，通過示例性的實施例具體說明本發(fā)明。應當理解，本發(fā)明 的范圍不應局限于實施例的范圍。任何不偏離本發(fā)明主旨的變化或改 變能夠為本領域的技術人員所理解。本發(fā)明的保護范圍由所附權利要 求的范圍確定。
下面的實施例中所用縮寫為MPEG，聚乙二醇單甲醚；MPEG-Br， a-溴代異丁酸MPEG酯；tBA，丙烯酸叔丁酯；PtBA,聚丙烯酸叔丁酯； tBMA，甲基丙烯酸叔丁酯；PtBMA，聚曱基丙烯酸+又丁酯；nBMA，甲基 丙烯酸正丁酯；PnBMA，聚甲基丙烯酸正丁酯；PAA，聚丙烯酸；PMAA， 聚甲基丙烯酸；SA，丙烯酸2， 2-二甲基-l， 3-二氧戊烷-4-曱醇酯；PSA， 聚丙烯酸2， 2-二曱基-l， 3-二氧戊烷-4-甲醇酯；SMA，甲基丙烯酸2， 2-二甲基-1， 3-二氧戊烷-4-曱醇酯；PSMA，聚甲基丙烯酸2， 2-二甲基 -l， 3-二氧戊烷-4-甲醇酯；PGA,聚丙烯酸甘油單酯；PGMA,聚甲基丙 烯酸甘油單酯；PMDETA, 1， 1， 4， 7，卜五甲基二乙烯三胺；b,表示嵌段 共聚物；r，表示無規(guī)共聚物。
實施例1
MPEG-Br的制備將10 g干燥的MPEG (平均分子量為2000 )和 1.4 inL三乙胺溶于70 mL四氬呋喃中，冰水浴冷卻和攪拌下緩慢滴加 4.3 mL a-溴代異丁酰溴與20 mL四氫呋喃的混合液，滴加完畢后， 室溫下攪拌反應48小時。旋轉蒸發(fā)除去四氫呋喃，加入100 mL水溶 解所得產物。然后以二氯甲烷萃取，每次30 mL，共萃取5次，收集 有機相。分別用1 mol/L HC1 (30 mL x 3) , 1 mol/L NaOH (30 mL x 3),飽和食鹽水(30mL x 3)依次洗滌，并收集有4幾相，最后以 無水MgS04干燥。過濾，除去干燥劑，旋轉蒸發(fā)除去溶劑，所得濃縮 液以冰無水乙醚沉淀，收集沉淀，真空干燥，得MPEG-Br。
實施例2
分別用平均分子量為600、 1000、 5000和10000的干燥MPEG各10 g代替實施例1中的平均分子量為2000的MPEG，除所用oc-溴代異 丁酰溴的量不同外，其它操作同實施例1。所用a-溴代異丁酰溴的量 分別為14. 3mL、 8. 6 mL、 3mL和2mL。制得相應分子量的MPEG-Br。 實施例3
MPEG-b-PtBMA的制備將2 g實施例1制備的MPEG-Br, 150 mg CuBr， 2.8 g tBMA溶于2. 5 mL環(huán)己酮中，在氮氣保護和攪拌下向體 系中加入210 jliL PMDETA,溶液變?yōu)闇\綠色，繼續(xù)反應2小時后，取 下反應瓶，浸入預熱到60'C的油浴中，攪拌反應10小時，得綠色粘 稠物。以丙酮溶解所得綠色聚合物，得深綠色溶液，溶液過Al203柱， 收集濾液，旋轉蒸發(fā)濃縮，以水與甲醇的混合液(4: 1,體積比)沉 淀之，得乳白色絮狀物。真空干燥24小時，即可制得MPEG-b-PtBMA。 經1[1 NMR峰面積積分，以MPEG為參比得PtMBA的聚合度為18。
實施例4
MPEG-b-PtBMA-b-PSMA )的制備將2 g實施例3制備的 MPEG-b—PtBMA, 48 mg CuBr， 2.5 g SMA溶于2 mL環(huán)己酮中，在氮氣 保護和攪拌下向體系中加入69 PMDETA，溶液變?yōu)闇\綠色，繼續(xù)反 應2小時后，取下反應瓶，浸入已預熱到90'C的油浴中，攪拌反應12 小時。以丙酮溶解所得聚合物，溶液過A1力3柱，收集濾液。旋轉蒸發(fā) 濃縮，以石油醚(30匸~ 60'C )沉淀之，得樣史黃色粘稠物。真空干燥 24小時，即可制得MPEG-b-PtBMA-b-PSMA。經^NMR峰面積積分，以 MPEG和PtMBA為參比，得PSMA的聚合度為15。
實施例5
MPEG-b-PtBA的制備將0. 35 g MPEG-Br (實施例2中由分子量 為600的MPEG得到)，150mgCuBr， 6. 2 g tBA溶于5 mL環(huán)己酮中， 在氮氣保護和攪拌下向體系中加入210 PMDETA,溶液變?yōu)闇\綠色， 繼續(xù)反應2小時后，取下反應瓶，浸入預熱到60。C的油浴中，攪拌反 應IO小時，得綠色粘稠物。以丙酮溶解所得綠色聚合物，得深綠色溶 液，溶液過人1203柱，收集濾液，旋轉蒸發(fā)濃縮，以水與甲醇的混合液 (4: 1，體積比)沉淀之，得乳白色絮狀物。真空千燥24小時，即可
10制得MPEG-b-PtBA。經111 NMR峰面積積分測定PtBA的聚合度為75。 實施例6
MPEG-b-PtBA-b-PSA的制備將2 g實施例5制備的MPEG-b-PtBA， 30 mg CuBr， 3.1 g SA溶于3.0 mL環(huán)己酮中，在氮氣保護和攪拌下 向體系中加入42 jliL PMDETA,溶液變?yōu)闇\綠色，繼續(xù)反應2小時后， 取下反應瓶，浸入已預熱到90。C的油浴中，攪拌反應12小時。以丙 酮溶解所得聚合物，溶液過叭1203柱，收集濾液。旋轉蒸發(fā)濃縮，以石 油醚(30°C ~60°C )沉淀之，得微黃色粘稠物。真空干燥24小時，即 可制得MPEG-b-PtBA-b-PSA。經^ NMR峰面積積分測定PSA的聚合度 為45。
實施例7
將2 g MPEG-Br (實施例2中由分子量為5000的MPEG得到)， 60 mg CuBr， 2.8 g tBMA溶于2. 5 mL環(huán)己酮中，在氮氣保護和攪拌 下向體系中加入82]nLPMDETA,溶液變?yōu)闇\綠色，繼續(xù)反應2小時后， 取下反應瓶，浸入預熱到60'C的油浴中，攪拌反應10小時，得綠色 粘稠物。以丙酮溶解所得綠色聚合物，得深綠色溶液，溶液過A1203 柱，收集濾液，旋轉蒸發(fā)濃縮，以水與甲醇的混合液(4: 1，體積比) 沉淀之，得乳白色絮狀物。真空干燥24小時，即可制得MPEG-b-PtBMA。 經111 NMR峰面積積分測定PtMBA的聚合度為46。
實施例8
將2 g實施例7制備的MPEG-b-PtBMA， 25 mg CuBr, 2. 5 g SMA 溶于2mL環(huán)己酮中，在氮氣保護和攪拌下向體系中加入35 ^tL PMDETA， 溶液變?yōu)闇\綠色，繼續(xù)反應2小時后，取下反應瓶，浸入已預熱到90 。C的油浴中，攪拌反應12小時。以丙酮溶解所得聚合物，溶液過A1203 柱，收集濾液。旋轉蒸發(fā)濃縮，以石油醚(30°C ~60°C )沉淀之，得 微黃色粘稠物。真空干燥24小時，即可制得MPEG-b-PtBMA-b-PSMA。 經111 NMR峰面積積分測定PSMA的聚合度為28。
實施例9
MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)的制備將2g實施例1制備的MPEG-Br, 150 mg CuBr, 2.3 g tBMA， 0.6 g nBMA'溶于2.5 mL環(huán)己 酮中，在氮氣保護和攪拌下向體系中加入210 pL PMDETA，溶液變?yōu)?淺綠色，繼續(xù)反應2小時后，取下反應瓶，浸入預熱到60。C的油浴中， 攪拌反應10小時，得綠色粘稠物。以丙酮溶解所得聚合物，溶液過 入1203柱，收集濾液，為無色液體。旋蒸充分濃縮，以水做沉淀劑沉淀 之，得白色絮狀物。真空干燥24小時，即可制得 MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)。經'HNMR峰面積積分，得PtMBA的聚合度 為13， PnBMA的聚合度為5。 實施例10
MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)-b-PSMA的制備將1. 9 g實施例9制 備的MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA), 47.4 mg CuBr, 4. 0 g SMA溶于3.0 mL環(huán)己酮中，在氮氣保護和攪拌下向體系中加入69jaL PMDETA，溶液 變?yōu)闇\綠色，繼續(xù)反應2小時后，取下反應并瓦，浸入已預熱到90'C的 油浴中，攪拌反應12小時。以丙酮溶解所得綠色聚合物，溶液過A1203 柱，收集濾液，為微黃色液體。旋蒸充分濃縮，以石油醚(30。C 60 'C )沉淀之，得微黃色粘稠物。真空干燥24小時，即可制得 MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)-b-PSMA。經^ NMR峰面積積分測定PSMA的 聚合度為25。
實施例11
MPEG-b-PMAA-b-PGMA的制備稱取0. 5 g實施例4中制得的 MPEG-b-PtBMA-b-PSMA溶于6 mL無水二氯甲烷中，然后加入2 mL三 氟乙酸，室溫攪拌4小時。然后向體系中再加入2 mL三氟乙酸，繼 續(xù)攪拌4小時。慢慢滴加蒸餾水0. 5 mL，滴加完水后完再于室溫下攪 拌2小時。旋轉蒸發(fā)，充分除去溶劑及過量的酸，得到粘稠液體。加 少量水溶解后轉移到透析袋中(分子量上限為3500 ),在去離子水中 反復透析至pH值接近7，得無色透明溶液。冷凍干燥得白色粉末狀固 體MPEG-b-PMAA-b-PGMA。
實施例12
分別用實施例6 、 8和10中所得MPEG-b-PtBA-b-PSA 、MPEG-b-PtBMA-b-PSMA和MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)-b-PSMA分別代替 實施例11中的MPEG-b-PtBMA-b-PSMA，其它操作同實施例11，得到相 應 的 MPEG-b-PAA-b-PGA 、 MPEG-b-PMAA-b-PGMA 和 MPEG-b- (PMAA-r-PnBMA) -b-PGMA。 實施例13
MPEG-b-PMAA-b-PGMA包裹Fe304納米粒子的復合納米粒子的制備 在圓底燒瓶中將0. 25 g實施例11制備的MPEG-b-PMAA-b-PGMA， 0. 1 g FeCl2 ' 4H20和0. 26 g FeCl3 . 6H20溶于10 mL去離子水中，在氮氣 保護下將燒瓶浸入已預熱80。C的油浴中。攪拌10分鐘后向燒瓶中注 射器滴加25%的氨水0. 2 mL?；旌弦涸?0'C下反應1小時后，自然冷 卻至室溫。將混合液離心(5000 rpm xlOmin)后，上清液轉移到透 析袋(分子量上限為14000 )中，用去離子水反復透析，得到 MPEG-b-PMAA-b-PGMA包裹Fe304》茲性納米粒子的復合納米粒子 (MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304)水溶液。
透射電鏡照片(TEM)表明，核心FeA納米粒子的平均直徑約為 8nm(圖l，由于電子透射Fe304和聚合物的能力的差別很大，照片中 只顯示FeA核，而聚合物殼是顯示不出來的)。圖2為分散于水中的 復合納米粒子的動態(tài)激光光散射測得的粒徑分布圖，粒子評價直徑為 23nm;圖3為復合納米粒子的磁滯回歸曲線，表明納米粒子具有超順 磁性。
實施例14
在圓底燒瓶中將0. 25 g實施例11制備的MPEG-b-PMAA-b-PGMA, 0. 1 g FeCl2 . 4H20和0. 26 g FeCl3 . 6H20 '溶于10 mL去離子水中， 在氮氣保護下室溫攪拌IO分鐘后向燒瓶中注射器滴加25%的氨水0. 2 mL,混合液在室溫下繼續(xù)攪拌24小時。將混合液離心(5000 rpm x 10 min)后，上清液轉移到透析袋(分子量上限為14000 )中，用去 離子水反復透析，得到MPEG-b-PMAA-b-PGMA包裹Fe30J茲性納米粒子 的復合納米粒子。TEM表明FeA核的平均直徑為11 nm。
實施例15用實施例12中得到的MPEG-b-PAA-b-PGA代替實施例13中的 MPEG-b-PMAA-b-PGMA，其它操作同實施例13，得到MPEG-b-PAA-b-PGA 包裹FeA納米粒子的復合納米粒子。TEM表明FeA核的平均直徑為 12 nm。
實施例16
用實施例12中得到的MPEG-b-PMAA-b-PGMA代替實施例13中的 MPEG-b-PMAA-b-PGMA ， 其它操作同實施例 13 ， 得到 MPEG-b-PMAA-b-PGMA包裹Fe304》茲性納米粒子的復合納米粒子。TEM 表明FeA核的平均直徑為9 nm。
實施例17
用實施例12中得到的MPEG-b-(PMAA-r-PnBMA)-b-PGMA代替實施 例13中的MPEG-b-PMAA-b-PGMA ，其它操作同實施例13，得到 MPEG-b-(PMAA-r-PnBMA)-b-PGMA包裹FeA磁性納米粒子的復合納米 粒子。TEM表明FeA核的平均直徑為7 nm。
實施例18
將2 g FeCl2 . 4H20溶于25 mL 1 mol/L HC1中的溶液和5. 4 g FeCl3 61120溶于25 mL去離子水中的溶液置于三口瓶內混合，通氮氣。 向三口瓶內滴加160 mL 1.5 mol/L氨水，溶液中產生黑色沉淀，室溫 下繼續(xù)攪拌反應24小時。通過磁鐵吸住沉淀傾去上層清液并用水洗滌3 次。在氮氣保護下向三口瓶內滴加2 mol/L HC104 50 mL，室溫攪拌15 分鐘。靜置10分鐘，按上法傾去上層清液，沉淀用水洗滌1次，將沉 淀迅速轉移到透析袋中，用去離子水反復透析到pH值6~7，得C104— 穩(wěn)定的FeA納米粒子水溶液，測得Fe304的濃度為22 mg/mL。將0. 23 mL制得的FeA納米粒子溶液與4. 77 mL水混合，在攪拌下向稀釋的Fe304 納米粒子溶液中滴加5 mL由實施例12中得到的MPEG-b-PAA-b-PGA的 水溶液(2 mg/mL )，室溫攪拌24小時。所得混合液離心(5000 rpm x lOmin)后，上清液轉移到透析袋(分子量上限為14000 )中，用去離 子水反復透析，得到MPEG-b-PAA-b-PGA包裹Fe30J茲性納米粒子的復合 納米粒子。TEM表明FeA核的平均直徑為9 nm。實施例19
復合納米粒子穩(wěn)定性的研究將一系列實施例13所得的 MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304水溶液用0. 1 mol/L HC1或0. 1 mol/L NaOH 分別調節(jié)pH值至l、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 13和14，使最終復合納 米粒子的濃度相同(1 mg/mL)，分別離心10分鐘(2000 rpm)，然 后分別測定340 nm處的吸光值。結果表明，pH值為1、 2、 13和14 的樣品的吸光值明顯降低，吸光值低于最大吸光值的80%。而pH值為 4、 6、 8、 10、和12的樣品的吸光值變化不大，變化范圍在10。/。之內。 說明復合納米粒子在pH 4 ~ 12的范圍內在水中可穩(wěn)定分散。
將一 系列實施例13中所得的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304水溶液用 NaCl溶液稀釋，使最終NaCl的濃度分別為0.5%、 1%、 2%和5%,而 復合納米粒子的濃度相同(lmg/mL)，分別離心10分鐘(2000 rpm)， 然后分別測定340 nm處的吸光值，結果表明，所有樣品的吸光值的變 化不大，變化范圍在5%之內。說明復合納米粒子在0. 5%~ 5% NaCl溶 液中可穩(wěn)定分散。
用實施例15、 16、 17和18所制備的聚合物包裹FeA納米粒子的 復合納米粒子做如上相同的實驗，結果表明這些復合納米粒子在pH 4~ 12的范圍內和在0. 5%~ 5% NaCl溶液中都能穩(wěn)定分散。
向一系列實施例13中所得的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304水溶液加 入不同量的乙酸鉛(Pb(Ac)2)水溶液，使最終復合納米粒子的濃度相 同(1 mg/mL),分別離心10分鐘(2000 rpm)，然后分別測定340 nm處的吸光值，結果如圖4所示。用二嵌段共聚物PMAA-b-PGMA(PAA 的聚合度為25, PGMA的聚合度為19)包裹的Fe^納米粒子 (PMAA-b-PGMA-Fe304 )代替MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3(M故相同的實驗， 如圖4所示。圖4表明，水介質中加入乙酸鉛對三嵌段共聚物包裹Fe^ 納米粒子的復合納米粒子的分散穩(wěn)定性影響不大，但當乙酸鉛濃度大 于~0. 04%后，二嵌段共聚物包裹Fe^納米粒子的復合納米粒子聚集 沉淀。其原因可做如下分析，二嵌段共聚物包裹Fe^納米粒子的復合 納米粒子由于聚陰離子處于粒子的表面，Pb"與聚陰離子的羧基絡合，使粒子間發(fā)生交聯(lián)而沉淀。但三嵌段共聚物包裹Fe304納米粒子的復合 納米粒子由于表面有聚乙二醇的保護作用，不發(fā)生粒子間的交聯(lián)，因 此未發(fā)生沉淀。 實施例20
復合納米粒子的細胞毒性的實驗將實施例13中所得的 MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304和實施例19中提到的PMAA-b-PGMA-Fe304 分別加入到培養(yǎng)液中進行細胞培養(yǎng)實驗，然后用MTS方法測定細胞的 相對存活率，具體實驗方法可參考S. Wan, J. Huang， M. Guo， H. Zhang, Y. Cao， H. Yan， K. Liu， J. Biomed. Mater. Res. A， 2007, 80， 946-954。圖5為MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304和PMAA-b-PGMA-Fe304 細胞毒性的比較?？梢钥闯?，最外層為MPEG的三嵌段共聚物包裹Fe304 納米粒子的復合納米粒子的細胞毒性明顯較小。
實施例21
阿霉素在復合納米粒子中的負載在攪拌下向實施例13中制備的 MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304 7jc溶液(10 mL， 2 rag/raL )中滴力口阿霉素 鹽酸鹽水溶液(2 mg/mL, Q. 4 mL ),攪拌反應過夜后將混合液透析(分 子量上限為14000 ) 48小時，得到負載阿霉素的復合納米粒子。經分 析透析外液中阿霉素的含量，換算出復合納米粒子中阿霉素的負載量 為21% (阿霉素的質量除以復合納米粒子干重的量)。
實施例22
用實施例15制得的復合納米粒子代替實施例21中的 MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304，其它操作條件同實施例21，得到負載阿 霉素的復合納米粒子，阿霉素的負載量為15%。
實施例23
用實施例17制得的復合納米粒子代替實施例21中的 MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe30"其它操作條件同實施例21,得到負載阿 霉素的復合納米粒子，阿霉素的負栽量為23%。
實施例24
表阿霉素在復合納米粒子中的負載在攪拌下向實施例13中制備
16的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304水溶液(10 mL, 2 mg/mL )中滴加表阿 霉素鹽酸鹽水溶液(2 mg/mL， 0. 4 mL ),攪拌反應過夜后將混合液透 析(分子量上限為14000 ) 48小時，得到負載表阿霉素的復合納米粒 子，負載量為20%。 實施例25
正定霉素在復合納米粒子中的負載在攪拌下向實施例13中制備 的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304水溶液(10 mL， 2 mg/mL)中滴加正定 霉素鹽酸鹽水溶液(2 mg/mL， 0. 4 mL )，攪拌反應過夜后將混合液透 析(分子量上限為14000 ) 48小時，得到負載正定霉素的復合納米粒 子，負載量為22%。
實施例26
絲裂霉素在復合納米粒子中的負載在攪拌下向實施例13中制備 的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304水溶液(10 mL， 2 mg/mL)中滴加絲裂 霉素水溶液(2 mg/mL, 0. 4 mL )，攪拌反應過夜后將混合液透析(分 子量上限為14000 ) 48小時，得到負栽絲裂霉素的復合納米粒子，負 載量為22%。
實施例27
米托蒽醌在復合納米粒子中的負載在攪拌下向實施例13中制備 的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe304水溶液(10 mL, 2 mg/mL)中滴加米托 蒽醌鹽酸鹽水溶液(2 mg/mL, Q. 4 mL ),攪拌反應過夜后將混合液透 析(分子量上限為14000 ) 48小時，得到負載米托蒽醌的復合納米粒 子，負載量為23%。
實施例28
負載阿霉素的復合納米粒子的控釋取4份各3mL實施例21中制備
的負載阿霉素的復合納米粒子溶液裝入透析袋(分子量上限為 14000 ),分別置于pH值分別為7. 4、 6. 5、 5. 5和4. 5的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L, 100 mL )中透析，在不同的時間測定透析外液中阿霉素的濃 度(通過紫外吸收檢測，檢測波長為2 34 nm)。換算出釋放率，不同 pH值下阿霉素的釋放率與釋放時間的關系見圖6。
權利要求
1.一種三嵌段共聚物包裹Fe3O4納米粒子的核-殼結構的復合納米粒子，其核為Fe3O4納米粒子，平均粒徑為5～20nm，三嵌段共聚物的結構可用下面通式表示上式中b表示嵌段共聚物，r表示無規(guī)共聚物，第一嵌段為甲氧基聚乙二醇，其平均聚合度x為10～230，第二嵌段為聚丙烯酸、或聚甲基丙烯酸、或丙烯酸與丙烯酸酯的無規(guī)共聚物、或甲基丙烯酸與甲基丙烯酸酯的無規(guī)共聚物，R＝H或CH3，m＝10～100，n＝0～30，R′＝CH3、C2H5、C3H7、C4H9或C6H13，第三嵌段為聚丙烯酸甘油單酯或聚甲基丙烯酸甘油單酯，z＝10～50，其中第三嵌段與Fe3O4納米粒子核表面結合，第一嵌段形成復合納米粒子的最外層。
2. 根據權利要求1所述的復合納米粒子的制備方法，其特征在于 二價鐵鹽、三價鐵鹽和三嵌段共聚物共溶于水中，用堿將溶液的pH值 調節(jié)到大于8，經反應而得到；或者先制備無機陰離子如高氯酸根離子 包裏Fe304納米粒子的磁^L體，然后向磁石充體中加入三嵌段共聚物水溶 液而得到。
3. 根據權利要求1和權利要求2所述的復合納米粒子及其制備方 法，其特征在于二價鐵鹽和三價鐵鹽的摩爾比1:2，鐵鹽的總濃度(以 Fe計)為0. 5%~5 / ,鐵鹽(以Fe計)與三嵌段共聚物的質量濃度比為 2: 1 ~ 1: 3。
4. 根據權利要求1和權利要求2所述的復合納米粒子及其制備方 法，其特征在于調節(jié)溶液pH值的堿可以是無機堿如氨水、NaOH、 KOH 等，或有機堿如甲胺、二甲胺、三曱胺或四甲基銨等。
5. 根據權利要求1和權利要求2所述的復合納米粒子及其制備方 法，其特征在于調節(jié)溶液pH值后的反應溫度為室溫到100。C，反應時間為10分鐘到24小時。
6. 根據權利要求1所述的復合納米粒子的用途，其特征在于復合 納米粒子可以作為含氨基藥物或含胺基藥物的載體。
7. 根據權利要求1和權利要求6所述的復合納米粒子作為藥物載 體的用途，其特征在于復合納米粒子可以作為阿霉素、表阿霉素、正定 霉素、絲裂霉素或米托蒽醌的載體。
8. 根據權利要求l、權利要求6和權利要求7所述的復合納米粒子作 為藥物載體的用途，其特征在于負栽藥物的復合納米粒子可用于pH感應 藥物釋放。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類由三嵌段共聚物包裹Fe₃O₄納米粒子的多層核-殼結構的磁性復合納米粒子及和該復合納米粒子作為藥物的載體的應用。三嵌段共聚物的第一嵌段為甲氧基聚乙二醇，第二嵌段為丙烯酸和丙烯酸酯的無規(guī)共聚物，或甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯的無規(guī)共聚物；第三嵌段為聚丙烯酸甘油單酯或聚甲基丙烯酸甘油單酯。其中第三嵌段聚合物與Fe₃O₄納米粒子的表面結合。帶有氨基或胺基的藥物如阿霉素可負載于復合納米粒子的次外層的聚陰離子層。負載的藥物在中性條件下不釋放，在pH 5.5以下時釋放。
文檔編號C08L53/00GK101649101SQ200910166438
公開日2010年2月17日 申請日期2009年8月17日 優(yōu)先權日2008年8月15日
發(fā)明者劉克良, 淼 郭, 宇 閻, 閻虎生 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所