專利名稱：：熟地黃多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種熟地黃多糖的制備方法。二、
背景技術(shù)：
地黃來源于玄參科植物地黃(RehmanniagLutinosaLibosch)新鮮或干燥根莖，為常用中藥。熟地黃是地黃的炮制品，具有益精填髓，滋陰補(bǔ)血的功，效，用于肝腎陰虛、目昏耳鳴、腰虛酸軟、骨蒸潮熱、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、心悸怔仲、月經(jīng)不調(diào)、崩漏下血、眩暈耳鳴、須發(fā)早白等癥。經(jīng)現(xiàn)代研究表明，熟地黃中含苷類、糖類、氨基酸等成分，通過藥理實(shí)驗(yàn)已經(jīng)獲得熟地黃多糖有抗焦慮活性。為了生產(chǎn)抗焦慮藥物，需將多糖從熟地黃中提取出來(稱熟地黃多糖)，近年來，植物多糖作為藥效物質(zhì)日受人們重視，關(guān)于多糖的工藝、藥理方面研究取得較大進(jìn)展。熟地黃多糖的藥理作用、含量測(cè)定研究也較多，現(xiàn)雖有多種提取方法，均是實(shí)驗(yàn)室研究，不能投入生產(chǎn)。故為了生產(chǎn)需要，對(duì)熟地黃多糖制備工藝進(jìn)行改造，形成新的大生產(chǎn)工藝勢(shì)在必行。三、
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種熟地黃多糖的制備方法，可有效解決從熟地黃中提取熟地黃多糖的問題，其解決的技術(shù)方案是，將熟地黃加8倍體積重量(體積重量是指熟地黃用g計(jì)，水用ml計(jì))的水，在9810(TC浸提4h，過濾，藥渣再加8倍原藥物體積重量的水在9810(TC浸提4h，擠盡藥渣水分，過濾，合并濾液，濃縮至相當(dāng)于原藥材0.5g/mL，加乙醇攪拌使含醇量達(dá)80%，緩加快攪，醇沉24h，抽濾，用4倍藥材體積重量的95%乙醇洗滌沉淀，揮至無醇味，加水溶解至藥材體積重量的2倍，調(diào)PH至89，加入無水氯化鈣，使W/V達(dá)7。/。，溶解，放置室溫，離心，取上清液濃縮至稠膏，95'C減壓干燥即得熟地黃多糖，本發(fā)明采用無水氯化鈣對(duì)熟地黃多糖進(jìn)行蛋白脫除，操作簡(jiǎn)便，避免使用有毒試劑，價(jià)廉易得，脫蛋白效率達(dá)50.54%，熟地黃多糖保存率達(dá)77.15%，是從熟地黃中制備熟地黃多糖的優(yōu)良方法，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益巨大。四具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)際情況和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。將熟地黃100g加水800ml，在98100'C浸提4h，過濾，藥渣再加水800ml在9810(TC浸提4h，擠盡藥渣水分，過濾，合并濾液，濃縮至相當(dāng)于原藥材0.5g/mL，加乙醇攪拌使含醇量達(dá)80%，緩加快攪，醇沉24h，抽濾，用400mL質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌沉淀，揮至無醇味，加水溶解至200mL，調(diào)TO至89，加入無水氯化鈣，使W/V達(dá)7。/。，溶解，放置室溫，離心，取上清液濃縮至稠膏，95'C減壓干燥即得熟地黃多糖，脫蛋白效率達(dá)50.54%，熟地黃多糖保存率達(dá)77.15%。將熟地黃1000g加水8000ml，在98100°C浸提4h，過濾，藥渣再加水8000ml在9810(TC浸提4h,擠盡藥渣水分，過濾，合并濾液，濃縮至相當(dāng)于原藥材0.5g/mL，加乙醇攪拌使含醇量達(dá)80%，緩加快攪，醇沉24h，抽濾，用棚mL質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌沉淀，揮至無醇味，加水溶解至2000mL，調(diào)PH至89，加入無水氯化鈣，使W/V達(dá)7。/。，溶解，放置室溫，離心，取上清液濃縮至稠膏，95-C減壓干燥即得熟地黃多糖，脫蛋白效率達(dá)50.54%，熟地黃多糖保存率達(dá)77.15%。將熟地黃200g加水1600ml，在98100。C浸提4h，過濾，藥渣再加水1600ml在9810(TC浸提4h，擠盡藥渣水分，過濾，合并濾液，濃縮至相當(dāng)于原藥材0.5g/mL，加乙醇攪拌使含醇量達(dá)80%，緩加快攪，醇沉24h，抽濾，用800mL質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌沉淀，揮至無醇味，加水溶解至400mL，調(diào)PH至89，加入無水氯化鈣，使W/V達(dá)79&，溶解，放置室溫，離心，取上清液濃縮至稠膏，95。C減壓干燥即得熟地黃多糖，脫蛋白效率達(dá)50.54%，熟地黃多糖保存率達(dá)77.15%。本發(fā)明工藝新穎、脫蛋白效果好，操作簡(jiǎn)便，避免有毒試劑，價(jià)廉，安全，易制備熟地黃多糖，與其它制備方法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，是制備熟地黃多糖的一個(gè)創(chuàng)造，并為試驗(yàn)所證實(shí).1正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選熟地黃水提工藝試驗(yàn)以加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，每因素設(shè)三個(gè)水平，以干膏收率(％)，多糖含量(以葡萄糖計(jì))為指標(biāo)，綜合評(píng)分y=0.4a+0.6b(a為干膏收率，b為多糖含量)，因素水平表見表l:表1熟地多糖提取工藝正交因素和水平<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>1.2多糖含量和干膏收率測(cè)定將正交九份溶液稀釋合適倍數(shù)，測(cè)定方法按4.l項(xiàng)和4.2項(xiàng)。2單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選醇沉濃度2.1方法稱取熟地黃藥材適量，加10倍量水，于水浴9810(TC提取2次，每次4h，合并濾液，減壓濃縮至相當(dāng)于生藥0.5g/ml。分別吸取五份10ml藥液，加質(zhì)量濃度為95%的乙醇使醇沉濃度分別達(dá)到30%、50%、70%、80%、90%，靜置24h，抽濾，得粗多糖，用質(zhì)量濃度為95%的乙醇反復(fù)洗滌沉淀，揮至無醇味，定容。2.2多糖含量和干膏收率測(cè)定將以上五份溶液稀釋相同倍數(shù)，測(cè)定方法同4.1項(xiàng)和4.2項(xiàng)。3單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選脫蛋白工藝3.1無水氯化鈣法稱取熟地黃飲片50.0g,按優(yōu)選的水提醇沉工藝，藥液定容至相當(dāng)于原藥材0.5g/ml。分別吸取四份，均為10ml，至已經(jīng)干燥的小燒杯中，加lmol/L的Na0H調(diào)PH至89。水浴加熱至85°C，加入無水氯化鈣使?jié)舛?w/v)分別達(dá)到3%、5%、7%、10%。攪拌溶解，取出，放至室溫，離心15min，3000轉(zhuǎn)/分，棄沉淀，定容。3.2三氯乙酸法取按優(yōu)選水提醇沉工藝所得藥液四份置干燥燒杯中，冰浴中加入等體積濃度為3%、5%、7%、10%三氯乙酸液，攪拌10分鐘，4-C放置4h，調(diào)PH至中性，離心，取上清液定容。3.3多糖保存率和蛋白脫除率測(cè)定用4.1項(xiàng)方法測(cè)得多糖含量，計(jì)算多糖保存率。按4.3項(xiàng)測(cè)定蛋白含量，計(jì)算多糖保存率和蛋白脫除率計(jì)算公式如下多糖保存率,^旨H::y^Mx腿蛋白脫除率二脫蛋白m蛋量白后含量x腿4含量測(cè)定及干膏收率測(cè)定4.1多糖含量測(cè)定4.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取P20s干燥器干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25.02mg，加水溶解定容，配制成0.10008mg/ml對(duì)照溶液備用。精密吸取葡萄糖對(duì)照溶液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ml置于10ml的干燥具塞刻度試管中，依次加水使體積均為l.Oml，另取l.Oml蒸熘水作空白對(duì)照.再分別加入5%苯酚溶液l.Oml，搖勻，迅速用酸式滴定管滴加濃H2S045.0ml，充分搖勻，室溫放置30min，在最大吸收波長(zhǎng)488nm處測(cè)定吸光度值，數(shù)據(jù)處理得回歸方程A=0.0621C-O.0151(R=0.9974)。葡萄糖濃度在20.01670.056wg范圍內(nèi)線性良好。4.1.2樣品含量測(cè)定將定容好的多糖液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線下方法操作，測(cè)得吸收度，代入回歸方程，計(jì)算多糖含量。結(jié)果見"(3)4表2:4.2干膏收率的測(cè)定將定容的多糖液，吸取25ml至己干燥稱重的蒸發(fā)皿中，干燥至恒重。計(jì)算收膏率。收膏率(％)=(稱得干膏重量X稀釋倍數(shù)/藥材重量)X100%。4.3蛋白質(zhì)含量測(cè)定4.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取牛血清白蛋白10.68mg，加超純水定容至100mL。精密稱取考馬斯亮藍(lán)G25010.52mg，溶于5ml90%(v/v)的乙醇(藍(lán)色)中，再加入85%(m/v)的磷酸(血紅色)10ml，最后用超純水定容至100ml(褐色)，備用。精密吸取對(duì)照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.OmL置干燥具塞試管中依次加水至lmL，加入考馬斯亮藍(lán)G250試劑5ml，搖勻，在最大吸收波長(zhǎng)594nm處測(cè)定吸收度，以吸收度對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得A=0.0331C+0.0066，r2=0.9993，線性范圍21.36106.8ug/mL4.3.2樣品含量測(cè)定將脫過蛋白溶液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，在594nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算含量。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1熟地多糖水提工藝結(jié)果見表2和結(jié)果分析表3:表2水提工藝研究結(jié)果因素評(píng)價(jià)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD(空白)收膏率(%)多糖含量綜合評(píng)分1111142.3630.5335.272122236.5824.6129.403133330.4323.8926.514212337.7128.8632.405223131.0923.4826.526231238.3927.5731.907313230.8222.7025.958321342.7930.2535.279332140.7929.2533.87總和ABCD277.09Kl91.1893.62102.4495.66K290.8291.1995.6787.25K395.0992.2878.9894.18Sj3.740.9997.2013.44表3熟地多糖提取工藝綜合評(píng)分方差分析結(jié)果方差來源離差平方和自由度均方F值顯著性A3.73895921.8694783.79P>0.05B97.195922248.59781198.41P<0.05C13.43815626.71907813.61P>0.05D0.0020.00注F卜u(2，2)二9.00F\—0.05,(2，2)=19.00F\-0.0l(2，2)=99.00由直觀分析可知，影響水提因素順序?yàn)锽〉C〉A(chǔ)，即提取時(shí)間〉提取次數(shù)〉加水量。根據(jù)正交結(jié)果表，B選擇Bi，C、A因素影響不顯著，又根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際考慮，可選擇C3A3，綜合選擇最優(yōu)方案為AAC3。即加8倍量水，提取2次，每次4h。5.2醇沉濃度優(yōu)選結(jié)果結(jié)果見表4:表4不同醇沉濃度對(duì)干膏收率和多糖吸收度的影響乙醇濃度30%50%70%80%90%干膏收率(％)0.547.9630.7438.9837.44吸光度值0.0540.0730.3750.5120.413從結(jié)果可以看出熟地多糖最佳醇沉濃度為80%。5.3脫蛋白工藝優(yōu)選結(jié)果結(jié)果見表5、6:表5不同無水氯化鈣濃度對(duì)多糖保存率和蛋白脫除率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由上述結(jié)果看出，從蛋脫除率來看，7%較好，多糖保存率尚可，選擇7%較佳。_表6不同濃度三氯乙酸對(duì)多糖保存率和蛋白脫除率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由上可以看出，三氯乙酸脫蛋白效果較好，但多糖損失嚴(yán)重，且難以適應(yīng)生產(chǎn)，綜合經(jīng)濟(jì)考慮，選用7%濃度無水氯化鈣較合適。6.結(jié)論由上述情況清楚的表明，本發(fā)明方法制備熟地黃多糖優(yōu)于其它方法，制備方法新穎、科學(xué)、安全，經(jīng)濟(jì)、采用無水氯化鈣對(duì)熟地黃多糖進(jìn)行蛋白脫除，操作簡(jiǎn)便，避免有毒試劑，價(jià)廉易得，脫蛋白效率高，多糖保存率高，不失為工業(yè)生產(chǎn)中的一種較好脫蛋白制備熟地黃多糖的制備方法，是制備熟地黃多糖上的一個(gè)創(chuàng)造，必為制備熟地黃多糖造福人類做出創(chuàng)造性的貢獻(xiàn)。權(quán)利要求1、一種熟地黃多糖的制備方法，其特征在于，將熟地黃加8倍體積重量的水，在98～100℃浸提4h，過濾，藥渣再加8倍原藥物體積重量的水在98～100℃浸提4h，擠盡藥渣水分，過濾，合并濾液，濃縮至相當(dāng)于原藥材0.5g/mL，加乙醇攪拌使含醇量達(dá)80％，緩加快攪，醇沉24h，抽濾，用4倍藥材體積重量的95％乙醇洗滌沉淀，揮至無醇味，加水溶解至藥材體積重量的2倍，調(diào)PH至8～9，加入無水氯化鈣，使W/V達(dá)7％，溶解，放置室溫，離心，取上清液濃縮至稠膏，95℃減壓干燥即得熟地黃多糖。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的熟地黃多糖的制備方法，其特征在于，將熟地黃100g加水800ml，在9810(TC浸提4h，過濾，藥渣再加水800ml在98100'C浸提4h，擠盡藥渣水分，過濾，合并濾液，濃縮至相當(dāng)于原藥材0.5g/mL，加乙醇攪拌使含醇量達(dá)80%，緩加快攪，醇沉24h，抽濾，用400mL質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌沉淀，揮至無醇味，加水溶解至200mL，調(diào)PH至89，加入無水氯化鈣，使W/V達(dá)7。/。，溶解，放置室溫，離心，取上清液濃縮至稠膏，95°C減壓干燥即得熟地黃多糖。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的熟地黃多糖的制備方法，其特征在于，將熟地黃1000g加水8000ml，在9810(TC浸提4h，過濾，藥渣再加水8000ml在98100'C浸提4h，擠盡藥渣水分，過濾，合并濾液，濃縮至相當(dāng)于原藥材0.5g/mL，加乙醇攪拌使含醇量達(dá)80%，緩加快攪，醇沉24h，抽濾，用4000mL質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌沉淀，揮至無醇味，加水溶解至2000mL，調(diào)PH至89，加入無水氯化鈣，使W/V達(dá)7。/。，溶解，放置室溫，離心，取上清液濃縮至稠膏，95"C減壓干燥即得熟地黃多糖。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的熟地黃多糖的制備方法，其特征在于，將熟地黃200g加水1600ml，在98100。C浸提4h,過濾，藥渣再加水1600ml在98100'C浸提4h，擠盡藥渣水分，過濾，合并濾液，濃縮至相當(dāng)于原藥材0.5g/mL，加乙醇攪拌使含醇量達(dá)80%，緩加快攪，醇沉24h，抽濾，用800mL質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌沉淀，揮至無醇味，加水溶解至400mL，調(diào)PH至89，加入無水氯化鈣，使W/V達(dá)7。/。，溶解，放置室溫，離心，取上清液濃縮至稠膏，95°C減壓干燥即得熟地黃多糖。全文摘要本發(fā)明涉及熟地黃多糖的制備方法，有效解決從熟地黃中提取熟地黃多糖的問題，其解決的技術(shù)方案是，將熟地黃加8倍體積重量的水，在98～100℃浸提4h，過濾，藥渣再加8倍原藥物體積重量的水在98～100℃浸提4h，擠盡藥渣水分，過濾，合并濾液，濃縮至相當(dāng)于原藥材0.5g/mL，加乙醇攪拌使含醇量達(dá)80％，緩加快攪，醇沉24h，抽濾，用4倍藥材體積重量的95％乙醇洗滌沉淀，揮至無醇味，加水溶解至藥材體積重量的2倍，調(diào)pH至8～9，加入無水氯化鈣，使W/V達(dá)7％，溶解，放置室溫，離心，取上清液濃縮至稠膏，95℃減壓干燥即得，本發(fā)明用無水氯化鈣對(duì)熟地黃多糖進(jìn)行蛋白脫除，避免使用有毒試劑，脫蛋白效率達(dá)50.54％，熟地黃多糖保存率達(dá)77.15％，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益巨大。文檔編號(hào)C08B37/00GK101402691SQ200810230919公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月17日優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日發(fā)明者菊劉,瑛崔申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院