專利名稱：：含有蘑菇多糖體的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蘑菇多糖體的制備方法及蘑菇多糖體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來有許多研究發(fā)現(xiàn)蘑菇菌絲體或子實體中含有相當多的生理活性成分，如多糖體(P-Glucan)、超氧化物岐化酶、三鵬類(Triterpenoids)等物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等作用。而其中以多糖體研究最為深入且為最具潛力的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。已知多糖體如13-葡聚糖，為一種良好的免疫促進劑，可有效剌激免疫細胞，不僅能增強生物體專一性免疫反應(yīng)，同時也提升了非專一性免疫反應(yīng)。此外，P-葡聚糖能使生物體抵抗細菌、真菌、病毒及寄生蟲的感染，以及抑制腫瘤的生長。近年來多糖體在傷口愈合的研究領(lǐng)域中備受矚目，許多研究指出多糖體可以通過活化巨噬細胞，進而剌激膠原蛋白再生作用，幫助傷口復(fù)原。2001年的研究中(KougiasP等人，Normalhumanfibroblastsexpresspatternrecognitionreceptorsforfungal(1—3)-P-D-glucans.Infectl匪nity69:3933-3938，2001)，發(fā)現(xiàn)除了在免疫細胞上具有多糖體受體外，第一次在人類纖維母細胞(normalhumandermalfibroblast)上也發(fā)現(xiàn)多糖體受體，可使纖維母細胞直接接收來自多糖體的分子信息；代表多糖體促進傷口愈合的機理不僅是通過活化巨噬細胞，可能也與纖維母細胞有相關(guān)機制。深入研究纖維母細胞與傷口愈合之間的機制，可發(fā)現(xiàn)纖維母細胞受到多糖體剌激后，通過活化纖維母細胞的兩種轉(zhuǎn)錄因子AP-l(活化子蛋白-1，Activatorprotein-1)、SPl(專一性蛋白-1，Specificprotein-1)，以及兩種信息傳導(dǎo)途徑NF-KB(Nuclearfactor-KB)、NF_1(Nuclearfactor-1)，可以強化傷口部位的免疫反應(yīng)，促使多種細胞激素的增生及膠原蛋白前驅(qū)物基因(Procollagengenes)的表現(xiàn)，進而生成膠原蛋白，達到傷口復(fù)原的效果。多糖體在傷口愈合的應(yīng)用上也有實際成效，不但可以降低病人在手術(shù)之后感染細菌的機率，使用多糖體與膠原蛋白基質(zhì)的合成物更可以促進局部深度燙傷皮膚的復(fù)原，對于減輕患者疼痛也有具有療效(DelatteSJ等人，Effectivenessofbeta-glucancollagenfortreatmentofpartial—thicknessburnsinchildren.JPediatrSurg36:113-118，2001)。因此，在傷口愈合方面，已漸漸朝向?qū)⒍嗵求w作為傷口敷料以及人工皮膚的領(lǐng)域發(fā)展。以往多糖體的研究多個著眼于酵母菌多糖體的生理活性，因此，在傷口愈合效用的研究領(lǐng)域大多使用酵母菌多糖體。近年來蘑菇多糖體(mushroomP-glucan)逐漸受到重視，主要原因在于蘑菇多糖體的分支度、分子量、水溶性以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性都比酵母菌多糖體高出許多，具有較高的免疫促進能力。因此，開發(fā)具有良好傷口愈合效力的蘑菇多糖體仍有其必要性。然而，蘑菇類含有的成分復(fù)雜，如多糖、蛋白質(zhì)、多肽類、三萜類、多種氨基酸、生物堿、酯類和有機酸等，所以萃取蘑菇多糖體物需經(jīng)繁瑣的步驟，如熱萃取、堿萃取、酸萃取等3方式，故易殘留有機溶劑、氨基酸與蛋白質(zhì)，這些殘留物遂可能對人體產(chǎn)生剌激性免疫反應(yīng)。為解決上述問題，本發(fā)明提供了新型的含蘑菇P-葡聚糖的組合物及其制備方法。
發(fā)明內(nèi)容鑒于上述現(xiàn)有技藝的缺陷，本發(fā)明的主要目的是提供一種能促進皮膚傷口愈合的蘑菇多糖體組合物。本發(fā)明的另一目的是提供一種能增進免疫活性的組合物。本發(fā)明的再一目的是提供一種蘑菇多糖體的制備方法，能利用簡單的培養(yǎng)基與簡單的分離純化步驟，獲得蘑菇多糖體供本發(fā)明的組合物所用。為達上述及其他目的，本發(fā)明提供促進皮膚傷口愈合的組合物，包含蘑菇多糖體及載體。磨過多糖體可選自所有食用蘑菇類與醫(yī)藥用蘑菇類的多糖體。蘑菇包括，舉例但非限制，裂褶菌(Schizophyll獄o匪e)、巴西蘑菇(Agaricsblaze)、冬蟲夏草(Cordyc印ssinensis)、靈芝(Ganodermalucidum)、云芝(Coriolusversicolor)、樟芝(Anthodiacamphorate)、桑黃(Phelli皿slinteus)、珊瑚燕(Pleurotuscitrinopileatus)、香燕(Xenti皿laedodes)、柳松燕(Agrocybeaegerita)、猴頭燕(Herici咖erinaceus)、杏鮑燕(Pleurotuseryngiig)、花辧葺(Sparrasiscrispa)、木葺(Auriculariaauricula)、金針燕(Flammulinavelutipes)或上述蘑燕的組合。本發(fā)明組合物的優(yōu)選實施例為含有萃取自多種蘑菇的多糖體。本發(fā)明組合物的更優(yōu)選實施例為，組合物包括20_35%萃取自裂褶菌與靈芝的多糖體；25-45%萃取自冬蟲夏草、樟芝、云芝與巴西蘑菇的多糖體；以及20-35%萃取自桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸與金針菇的多糖體。本發(fā)明的組合物作為外用藥物，可直接涂敷至傷口，可單獨使用或與其他藥物結(jié)合使用。組合物的載體可為液態(tài)、固態(tài)或半固態(tài)，且為藥學(xué)上可接受的載體。在優(yōu)選實施例中，載體為水。在另一優(yōu)選實施例中，載體為羥乙基纖維素(HEC)。本發(fā)明還提供一種增進細胞免疫活性的組合物，其包含蘑菇多糖體及載體。蕈菇多糖體可選自所有食用蘑菇類與醫(yī)藥用蘑菇類的多糖體。蘑菇包括，舉例但非限制，裂褶菌、巴西蘑燕、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚燕、香燕、田頭燕屬如柳松燕、猴頭燕、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇或上述蘑菇的組合。本發(fā)明組合物的優(yōu)選實施例為含有萃取自多種蘑菇的多糖體。本發(fā)明組合物的更優(yōu)選實施例為，組合物包括20_35%萃取自裂褶菌與靈芝的多糖體；25-45%萃取自冬蟲夏草、樟芝、云芝與巴西蘑菇的多糖體；以及20-35%萃取自桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸與金針菇的多糖體。本發(fā)明的組合物可提高目標對象體內(nèi)的自然殺傷細胞(naturalkillercell)、吞噬細胞、巨噬細胞及膠原纖維母細胞(fibroblast)的活性，達到增進免疫活性的效果。組合物可經(jīng)由口服和/或直接涂敷，以提供給有需要的對象，優(yōu)選方式為直接涂敷至皮膚，可單獨使用或與其他藥物結(jié)合使用。組合物的載體可為液態(tài)、固態(tài)或半固態(tài)，且為藥學(xué)上可接受的載體。在優(yōu)選實施例中，載體為水。在另一優(yōu)選實施例中，載體為羥乙基纖維素。本發(fā)明還提供一種蘑菇多糖體的制備方法，包括(a)將蘑菇菌絲體于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，而形成蘑菇菌液，(b)在高速下，以超聲波粉碎步驟(a)所得的蘑菇菌液，(c)將粉碎的蘑菇菌液高速離心并收取上清液，(d)以乙醇沉淀上清液，而得沉淀物，(e)以水溶解沉淀物，而得水溶液及(f)藉薄膜分離水溶液，以獲得蘑菇多糖體。且所得蘑菇多糖體可應(yīng)用于前述的本發(fā)明組合物。培養(yǎng)液包括葡萄糖、酵母菌萃取物與黃豆勝肽，其中各成分以重量百分比表示，培養(yǎng)液優(yōu)選為包含1_15%葡萄糖、0.1-1%酵母菌萃取物與1_10%黃豆勝肽；更優(yōu)選為包含5_10%葡萄糖、0.5%酵母菌萃取物與2_5%黃豆勝肽。根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)液與菌絲體中均含有蘑菇多糖體。根據(jù)本發(fā)明，步驟(d)所使用的乙醇為濃度95%的乙醇，而步驟(f)采用薄膜分離技術(shù)，用以將殘留的乙醇及其他低分子量物質(zhì)除去。本發(fā)明所使用蕈菇可選自所有食用蘑菇類與醫(yī)藥用蘑菇類，包括，舉例但非限制，裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、田頭菇屬如柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇或上述蘑菇的組合。圖1是本發(fā)明蘑菇多糖體制備方法的流程圖；圖2是條形圖，其根據(jù)本發(fā)明的實施例，顯示本發(fā)明多糖體組合物對于大白鼠背部全深度傷口愈合過程的面積變化圖(數(shù)量=5)。對照對照組的生理鹽水組；HEC:對照組的空白凝膠組；Glucan:蘑菇多糖體溶液組；HEC+Glucan:蘑菇多糖體凝膠組。圖3是根據(jù)本發(fā)明的實施例，顯示大白鼠背部全深度傷口的愈合過程記錄(第1天至第9天)。對照對照組的生理鹽水組；HEC:對照組的空白凝膠組；Glucan:蘑燕多糖體溶液組；HEC+Glucan:蘑菇多糖體凝膠組。圖4是根據(jù)本發(fā)明的實施例，顯示大白鼠背部全深度傷口的愈合過程記錄(第11天至第19天)。對照對照組的生理鹽水組；HEC:對照組的空白凝膠組；Glucan:蘑燕多糖體溶液組；HEC+Glucan:蘑菇多糖體凝膠組。圖5是根據(jù)本發(fā)明的實施例，顯示大白鼠背部全深度傷口的愈合過程記錄(第21天至第29天)。對照對照組的生理鹽水組；HEC:對照組的空白凝膠組；Glucan:蘑燕多糖體溶液組；HEC+Glucan:蘑菇多糖體凝膠組。圖6是根據(jù)本發(fā)明的實施例，顯示術(shù)后第3天大白鼠背部的傷口組織，以Masson染色的膠原纖維生長及分布情形(比例尺=100微米)。對照對照組的生理鹽水組；HEC:對照組的空白凝膠組；Glucan:蘑菇多糖體溶液組；HEC+Glucan:蘑菇多糖體凝膠組。C:膠原纖維；E:表皮層；F:纖維母細胞。圖7根據(jù)本發(fā)明的實施例，顯示術(shù)后第14天大白鼠背部的傷口組織，以Masson染色的膠原纖維生長及分布情形(比例尺=100微米)。對照對照組的生理鹽水組；HEC:對照組的空白凝膠組；Glucan:蘑菇多糖體溶液組；HEC+Glucan:蘑菇多糖體凝膠組。C:膠原纖維；E:表皮層；F:纖維母細胞。圖8根據(jù)本發(fā)明的實施例，顯示術(shù)后第29天大白鼠背部的傷口組織，以Masson染色的膠原纖維生長及分布情形(比例尺=100微米)。對照對照組的生理鹽水組；HEC:對照組的空白凝膠組；Glucan:蘑菇多糖體溶液組；HEC+Glucan:蘑菇多糖體凝膠組。C:膠原纖維；E:表皮層；F:纖維母細胞。圖9是條形圖，其根據(jù)本發(fā)明的實施例，顯示本發(fā)明的高分子多糖體對于大白鼠體內(nèi)自然殺傷細胞活性的影響。圖10是條形圖，其是根據(jù)本發(fā)明的實施例，顯示本發(fā)明的高分子多糖體對于小白鼠體內(nèi)巨噬細胞吞噬活性的影響。具體實施例方式以下通過特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭示的內(nèi)容了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。1.蘑菇菌種培養(yǎng)本發(fā)明可使用的蘑菇菌株如裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、田頭菇屬如柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇等，但不限于上述菌株。將菌種接種于預(yù)培養(yǎng)基(預(yù)培養(yǎng)基包含0.3%(w/w)酵母菌萃取物、0.3%麥芽抽出物、0.5%蛋白胨(p印tone)、1.0X葡萄糖、1.5X瓊脂)上，于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天。將培養(yǎng)于YM培養(yǎng)基上的菌絲接種于裝有液態(tài)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為5_10%葡萄糖、0.5-1%酵母菌萃取物與2-5%黃豆勝肽)的培養(yǎng)皿中，在2『C靜置約1-2星期。將上述液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)完成的菌絲體，轉(zhuǎn)接至含800毫升滅菌培養(yǎng)基的廣口瓶，在2『C下應(yīng)用振蕩培養(yǎng)法，發(fā)酵1-2星期，使菌絲體與高分子多糖體聚合完成。2.制備含蘑菇多糖體的組合物步驟如圖3所示，將上述發(fā)酵后含高分子多糖體及菌絲體的蘑菇菌液，以超高速均質(zhì)機及超聲波振蕩機分別處理10分鐘，以振碎菌絲體細胞壁。通過高速離心(每分鐘6，0008，000轉(zhuǎn))，收取上清液。加入與上清液等量的95%乙醇以萃取高分子多糖體并使之沉淀，然后收取沉淀物。將沉淀物均勻溶解于二次蒸餾水中，再利用分離膜系統(tǒng)(MembraneS印arationSystem)除去乙醇及剩余的小分子物質(zhì)，即獲得本發(fā)明的蘑燕多糖體組合物。本發(fā)明組合物可包含萃取自一種或多種蘑菇的多糖體。當本發(fā)明組合物包括兩種以上的蘑菇多糖體時，蘑菇培養(yǎng)液可個別制備為多糖體組合物后再混合；或可將蘑菇培養(yǎng)液先行混合再進行多糖體組合物的制備。依據(jù)本實施例所得的組合物包括約20_35%萃取自裂褶菌與靈芝的多糖體；約25-45%萃取自冬蟲夏草、樟芝、云芝與巴西蘑菇的多糖體；以及約20-35%萃取自桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸與金針菇的多糖體。依據(jù)本實施例所得的蘑菇多糖體組合物，萃取自不同蘑菇的多糖體所占多糖體總量之比例如下裂褶菌為16%、靈芝為16%、冬蟲夏草為14%、樟芝為13%、云芝為8%、巴西蘑菇為6%、桑黃為3%、珊瑚菇為3%、香菇為3%、柳松菇為3%、猴頭菇為3%、杏鮑菇為3%、6花瓣茸為3%、木茸為3%與金針菇為3%。組合物進一步應(yīng)用于下列實施例中。3.蘑菇多糖體組合物的分析多糖體分析以膠體滲透層析儀(GelPermeationChromatogr即hy;GPC)分析，顯示組合物含有五種不同分子量的多糖體分子，其分子量的范圍為8萬600萬不等，分別為80988、392520、1294489、2049436與6130521。再進行蛋白質(zhì)分析，證實組合物不包含氨基酸或蛋白質(zhì)。并且，多糖體的主要結(jié)構(gòu)式為(1—3)-P-D-葡聚糖(glucan)或(1—3)，(1—6)-|3-D-葡聚糖。組合物中蘑菇多糖體含量分析利用苯酚-硫酸法測量多糖體含量，方法及步驟如下在離心管中倒入l毫升蘑菇多糖體組合物，再加入4毫升95%乙醇，充分混合。在室溫下，以轉(zhuǎn)速750g離心15分鐘。保留沉淀物并烘干，以蒸餾水將體積調(diào)成1毫升溶液。取0.5毫升待測溶液和0.5毫升5%苯酚混合后，再加入2.5毫升濃硫酸，靜置10分鐘后振蕩，使其充分混合。靜置30分鐘后，以分光光度計(A=490nm)測量吸光值。結(jié)果顯示，組合物的多糖體濃度為5毫克/毫升。4.蘑菇多糖體的傷口愈合效力測試將蘑菇多糖體組合物制備成不同劑型，其使用如下所述蘑菇多糖體溶液(以下以Glucan表示)距離傷口5公分處噴灑本發(fā)明蘑菇多糖體組合物，噴灑量約為1.7毫升。蘑燕多糖體凝膠(以下以HEC+Glucan表示)將2克羥乙基纖維素(HEC)粉末加入ioo毫升的蘑菇多糖體組合物中，加熱攪拌均勻后，靜置冷卻即成凝膠狀。使用時將凝膠狀的蘑菇多糖體組合物覆蓋住整塊皮膚缺損的空間。并以生理鹽水作為對照組，如下所述生理鹽水(以下以Control表示)距離傷口5公分處噴灑生理鹽水，噴灑量約為1.7毫升?？瞻啄z(以下以HEC表示)將2克羥乙基纖維素(HEC)粉末加入100毫升的生理鹽水中，加熱攪拌均勻后，靜置冷卻即成凝膠狀，經(jīng)滅菌后保存于4t:冰箱。使用時將空白凝膠覆蓋住整塊皮膚缺損的空間。動物模式選用雄性Wistar大白鼠(來源臺灣大學(xué)動物中心)，重量為380450克。實驗前將大白鼠分別單獨飼養(yǎng)，室溫控制于25t:，光暗循環(huán)時間為12D:12L，待適應(yīng)兩星期后才開始進行實驗。將大白鼠分為兩組，A組5只，B組10只，總共15只。A組于手術(shù)后每兩天換藥一次，并觀察背部傷口的愈合情形直到完全愈合為止。B組于手術(shù)后每兩天換藥一次，并分別在第3、5、7、14天及傷口完全愈合后犧牲，進行傷口的組織切片采樣。實驗前先將大白鼠秤量體重并記錄，進行全身麻醉(Ketamine75150毫克/公斤)。以脊柱為中線，在第十二對肋骨及薦骨關(guān)節(jié)之間，左右兩側(cè)距離中線1公分處，使用2.4公分X2.4公分的印章，標示出4個對稱傷口的照相區(qū)域；再以1.5公分X1.5公分的印章標示出每個傷口的取皮范圍。消毒背部皮膚后切除取皮范圍內(nèi)的皮膚，深度達深肌膜層(Panniculuscarnosus)，制作出四個全深度傷口。清洗傷口后，將消毒過的透明塑料袋貼附于傷口，以簽字筆描繪原始傷口面積。分別使用蘑菇多糖體溶液、蘑菇多糖體凝膠、生理鹽水、與空白凝膠處理四個傷口，再將傷口覆蓋固定。手術(shù)后每兩天換藥一次，并描繪傷口面積大小，詳細記錄傷口復(fù)原情形，并拍照記錄。所有實驗數(shù)據(jù)皆以平均值±標準差(Mean士S.D.)表示，并以單因子變異分析(One-wayanalysisofvariance;A麗A)進行實驗結(jié)果的分析，再以LSD(Theleastsignificantdifferent)檢定差異顯著性。當p<0.01，視為具有統(tǒng)計上的顯著差異。1多糖體組合物對傷口愈合的效果手術(shù)后(第l天)起，每兩天觀察一次傷口的面積變化情形，直到傷口完全愈合為止，結(jié)果如表1所示。表1以原始傷口面積為100%，換算傷口愈合過程中各時期的面積百分比，其所得的數(shù)據(jù)皆以平均值±標準差表示。最后，再將傷口面積數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計分析之后，繪制成圖2。并將大白鼠背部傷口愈合的影像紀錄顯示于圖3至圖5。圖2顯示，HEC組和HEC+Glucan組的傷口面積在術(shù)后第3天起即明顯縮?。欢鳪lucan組則在術(shù)后第5天起有明顯差異。若比較各組傷口的面積變化，HEC+Glucan組在術(shù)后第7天起愈合速度較HEC組為佳，且在術(shù)后第3天起較Glucan組為佳，皆具顯著差異性(p<0.01)。如圖3至圖5所示，傷口完全愈合所需時間，對照組于術(shù)后第29天愈合，Glucan組和HEC組于術(shù)后第23天愈合，較對照組提早了6天。HEC+glucan組是愈合最迅速者，于術(shù)后第19天就已完全愈合，相比于對照組提早了10天，也較HEC組和HEC+Glucan組提早了4天。表1顯示不同處理對大白鼠背部全深度傷口愈合過程的面積變化表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2多糖體組合物對傷口的皮膚組織影響以膠原纖維母細胞為例，正常皮膚組織在受傷第三天后，傷口部位的巨噬細胞會分泌細胞激素吸引纖維母細胞聚集，剌激其分泌膠原蛋白沈積在肉芽組織組成的暫時性基質(zhì)中，當肉芽組織趨近成熟狀態(tài)后，膠原蛋白水解酶會分解此暫時性基質(zhì)，再由新生的膠原蛋白替補，形成新生皮膚組織的胞外基質(zhì)。經(jīng)過數(shù)周至數(shù)月不等的時間，新生的膠原蛋白會逐漸依照張力線的方向進行重新排列，使傷口愈合后的外觀接近原先的正常組織。因此，以Masson染色的病理組織切片，可觀察到呈藍色網(wǎng)狀波紋的膠原纖維，即為纖維母細胞所產(chǎn)生的膠原蛋白聚集成纖維束狀，其生長和分布情形可用以評估傷口愈合狀況。圖6為術(shù)后第3天的病理組織切片，顯示Glucan組和HEC+Glucan組的傷口部位皆出現(xiàn)纖維母細胞聚集，且HEC+Glucan組的膠原纖維生長情況較好。術(shù)后第14天，如圖7所示，四組傷口皆布滿新生膠原纖維。一般新生膠原纖維較細且排列較為緊密，需要一段時間才能接近正常皮膚的膠原纖維較粗且排列較為松散的狀態(tài)。HEC+Glucan組相比于其他三組，已可觀察到較粗的膠原纖維，顯示傷口的復(fù)原情形較好。術(shù)后第29天，如圖8所示，傷口外觀已愈合，但內(nèi)部膠原纖維仍持續(xù)排列中，Control組的膠原纖維較細，但排列較松散；HEC組及Glucan組的膠原纖維略粗，但排列較緊密；而HEC+Glucan組的膠原纖維最粗，排列密度最為適中，顯然為四組處理組中最接近正常皮膚組織的。3多糖體組合物對傷口愈后皮膚的影響觀察各組傷口愈后狀況，于術(shù)后第50天時，檢視大白鼠背部皮膚外觀，HEC+Glucan組除了傷口愈合最迅速之外，愈后外觀也與正常皮膚一致，沒有明顯疤痕。HEC組和Glucan組的傷口愈合時間無顯著差異，愈后外觀沒有明顯疤痕。對照組傷口恢復(fù)最為緩慢，且愈后外觀留下較明顯的疤痕。因此，證實本發(fā)明組合物除了可有效促進皮膚傷口的愈合作用之外，亦具有避免疤痕殘留的功效。5.蘑菇多糖體提高免疫細胞活性效力測試(1)自然殺傷細胞活性測試如上述實例的動物模式，以本發(fā)明多糖體組合物每天涂于大白鼠的背部兩次，并使用LIVE/DEADCell-MediatedCytotoxicity試劑盒(MolecularProbes)測定血液中自然殺傷細胞活性，實驗步驟如下將YAC-1細胞濃度調(diào)成1Xl()6細胞/毫升。依比例加入DI0C18(10iiLDI0C18/毫升YAC-1細胞懸浮液)并混和均勻。于37t:培養(yǎng)20分鐘。將細胞濃度調(diào)成1X106cell/以RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone)將淋巴球細胞調(diào)成細胞濃度2X106cell/毫升。將染色后的YAC-1細胞20微升加入的脾臟淋巴球懸浮液200微升中，并加入220微升的PI溶液(40微克/毫升)染色，以1000Xg離心30秒后，再于37t:培養(yǎng)2小時。以流式細胞儀測量淋巴球活性。實驗結(jié)果如圖9所示，顯示3天后自然殺傷細胞活性提高到20%，而未以組合物處理的大白鼠(對照組)的自然殺傷細胞活性則為7%;實驗持續(xù)進行，每天涂抹2次，至第6天時，大白鼠的自然殺傷細胞活性提升到24%，而控制組則僅為8%。故由本實驗可知，于大白鼠的表面涂抹本發(fā)明所制備的高分子多糖體可以有效提升體內(nèi)自然殺傷細胞的活性。(2)巨噬細胞活性測試如上述實例的動物模式，以本發(fā)明多糖體組合物每天涂于大白鼠的背部兩次，并使用PHAGO-TEST試劑盒(ORPEGEN，Phama，F(xiàn).R.G.)測定血液中吞噬細胞的活性，步驟如下取100微升含肝素的全血冰浴10分鐘，加入20微升目標細胞(FITC-labeledE.coli)，以37t:預(yù)熱水浴10分鐘；置于冰上終止吞噬作用，并加入100微升驟冷液(quenchingsolution)(錐蟲藍)，混勻后冰浴2分鐘。沖洗細胞后以離心除去上清液。加入2毫升的裂解液(lysingsolution)并混和均勻，于室溫下作用20分鐘，再以離心除去上清液。加入200微升DNA染色液，混和冰浴且避光10分鐘。利用流式細胞儀，分析顆粒球與單核球的吞噬能力。實驗結(jié)果如圖10所示，2天后小白鼠顆粒白血球的吞噬活性，多糖體組合物處理組為15%，而未經(jīng)組合物處理的對照組則為12%;以同樣處理進行至第5天后，組合物處理組的顆粒白血球吞噬活性為22%，而對照組僅為13%。故由本實驗的結(jié)果可知，應(yīng)用本發(fā)明所制備的多糖體組合物，可經(jīng)由皮膚的路徑，有效提升實驗動體內(nèi)顆粒白血球的吞噬能力。上述實例充分顯示，由蘑菇所萃取的多糖體制備的組合物可以有效提升使用動物的細胞免疫能力及促進皮膚的愈合能力，由此實驗可了解本發(fā)明的多糖體組合物確可有效應(yīng)用作為皮膚醫(yī)療或保養(yǎng)用品。上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的組合物與制備方法，而非用于限制本發(fā)明。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員均可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，本發(fā)明的權(quán)利保護范圍如權(quán)利要求所載。權(quán)利要求一種促進皮膚傷口愈合的組合物，其包含載體；和蘑菇多糖體，其中，蘑菇選自裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇或上述蘑菇的組合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，蘑菇多糖體包括20至35%萃取自裂褶菌與靈芝的多糖體；25至45%萃取自冬蟲夏草、樟芝、云芝與巴西蘑菇的多糖體；以及20至35%萃取自桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸與金針菇的多糖體。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的組合物，其作為外用藥物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，載體為液態(tài)、固態(tài)或半固態(tài)。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的組合物，其中，載體為水。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，載體為羥乙基纖維素。7.—種提高免疫細胞活性的組合物，其包含載體；和蘑菇多糖體，其中，蘑菇選自裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇或上述蘑菇的組合。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中，蘑菇多糖體包括20至35%萃取自裂褶菌與靈芝的多糖體；25至45%萃取自冬蟲夏草、樟芝、云芝與巴西蘑菇的多糖體；以及20至35%萃取自桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸與金針菇的多糖體。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其可經(jīng)由口服和/或直接涂敷的方式，向有需要的對象使用。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中載體為液態(tài)、固態(tài)或半固態(tài)。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中，載體為水。12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中，載體為羥乙基纖維素。13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其可提高自然殺傷細胞、吞噬細胞、巨噬細胞及膠原纖維母細胞的活性。14.一種制備蘑菇多糖體的方法，包括(a)將蘑菇菌絲體于培養(yǎng)液中培養(yǎng)；(b)在高速下，以超聲波粉碎步驟(a)所得的蘑菇菌液；(c)將步驟(b)粉碎的蘑菇菌液離心并取得上清液；(d)以乙醇沉淀上清液，而得沉淀物；(e)以水溶解沉淀物，而得水溶液；禾口(f)以薄膜分離水溶液，以獲得蘑菇多糖體。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中培養(yǎng)液包括葡萄糖、酵母菌萃取物與黃豆勝肽。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中培養(yǎng)液包括1至15%葡萄糖、0.1至1%酵母菌萃取物與1至10%黃豆勝肽。17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，蘑菇選自裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇或上述蘑菇的組合。18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，乙醇濃度為95%。全文摘要本發(fā)明提供一種含有蘑菇多糖體的組合物及其制備方法，組合物包含蘑菇多糖體和載體，其中，蘑菇選自裂褶菌(Schizophyllumcommue)、巴西蘑菇(Agaricsblaze)、冬蟲夏草(Cordycepssinensis)、靈芝(Ganodermalucidum)、云芝(Coriolusversicolor)、樟芝(Anthodiacamphorate)、桑黃(Phellinuslinteus)、珊瑚菇(Pleurotuscitrinopileatus)、香菇(Lentinulaedodes)、柳松菇(Agrocybeaegerita)、猴頭菇(Hericiumerinaceus)、杏鮑菇(Pleurotuseryngiig)、花瓣茸(Sparrasiscrispa)、木茸(Auriculariaauricula)、金針菇(Flammulinavelutipes)或上述蘑菇的組合。文檔編號C08B37/00GK101766656SQ20081018774公開日2010年7月7日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者陳秀男申請人:陳秀男