專利名稱：：葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬化合物合成方法，涉及葉酸修飾殼寡糖-硬脂酸嫁接物及其膠團(tuán)的制備方法，以及殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)作為葉酸配體靶向載體在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。技術(shù)背景腫瘤一直是直接威脅人類健康的重大疾病，腫瘤化療由于藥物本身缺乏分子靶向性，因而出現(xiàn)治愈率低、毒副作用巨大等重大治療問(wèn)題。通過(guò)合適的載體技術(shù)，將藥物直接靶向病變組織(器官)、細(xì)胞是解決癌癥化療治愈率低和毒副作用的重要手段之一。目前國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家通過(guò)載體技術(shù)在腫瘤藥物的組織(器官)和細(xì)胞耙向上取得了一定的進(jìn)展，但并沒(méi)有取得突破性的療效，其本質(zhì)在于絕大多數(shù)抗腫瘤藥物的分子作用靶點(diǎn)位于細(xì)胞內(nèi)，因此腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物分子作用靶點(diǎn)(亞細(xì)胞器)靶向性載體材料技術(shù)的研究開(kāi)發(fā)是突破癌癥化療瓶頸的關(guān)鍵。靶向載體的設(shè)計(jì)主要包括載體的病灶臟器靶向性，以及在此基礎(chǔ)上穿越病灶臟器內(nèi)的病灶細(xì)胞耙向，從而完成針對(duì)藥物分子耙標(biāo)的亞細(xì)胞器耙向。早期的組織器官靶向，利用微粒的小粒徑被動(dòng)靶向到肝等組織，通過(guò)"增強(qiáng)的透過(guò)及滯留效應(yīng)"(enhancedpermeabilityandretentioneffect)聚集到腫瘤組織等。當(dāng)前，研究者利用腫瘤細(xì)胞表面某些受體(如葉酸受體)過(guò)度表達(dá)的特性，將配體修飾載體材料成功應(yīng)用于腫瘤的靶向治療。從而達(dá)到腫瘤細(xì)胞的耙向，提高細(xì)胞內(nèi)的抗腫瘤藥物濃度，增強(qiáng)抗腫瘤藥物本身的療效。近年來(lái)，聚合物膠團(tuán)在藥物制劑學(xué)、生物醫(yī)學(xué)及高分子領(lǐng)域已經(jīng)引起了人們廣泛的重視。聚合物膠團(tuán)是由兩親性的嵌段或接枝共聚物在水性介質(zhì)中自聚形成，具有核-殼結(jié)構(gòu)。其疏水性鏈段構(gòu)成膠團(tuán)的內(nèi)核，親水性鏈段形成膠團(tuán)的外殼。疏水核可為難溶性藥物提供儲(chǔ)庫(kù)的作用；親水性外膜保持膠團(tuán)在水性環(huán)境中的穩(wěn)定性，并可進(jìn)行理化性質(zhì)修飾以達(dá)到特定的目的，如膠團(tuán)的主動(dòng)靶向等。聚合物膠團(tuán)作為一種藥物傳輸系統(tǒng)，有許多優(yōu)勢(shì)通過(guò)調(diào)整材料的溶解性、pH值、Zeta電位等可以控制藥物在生物體內(nèi)的釋放；由于膠團(tuán)粒徑很小，故可穿過(guò)血腦屏障、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)，也可促進(jìn)腸胃黏膜等的良好吸收，到達(dá)大尺寸粒子無(wú)法通過(guò)的部位，達(dá)到被動(dòng)靶向的目的；聚合物膠團(tuán)骨架對(duì)藥物的保護(hù)和屏蔽作用，可在一定程度上避免藥物的分解，保持藥物的穩(wěn)定性，降低藥物的毒性；與脂質(zhì)體相比，聚合物膠團(tuán)的載藥量較高；聚合物材料的多樣性，使得以聚合物為載體的藥物制劑亦多樣化，能滿足各種使用需求。有報(bào)道指出，葉酸受體在腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)，而正常細(xì)胞的表面葉酸受體則很少?；诖嗽诰酆衔锬z團(tuán)的親水外殼上進(jìn)行葉酸修飾，就可以使其耙向具有較多葉酸受體的腫瘤細(xì)胞表面，從而大大增加其抗腫瘤能力，減少毒副作用。本發(fā)明在我們前期的研究工作基礎(chǔ)上，利用殼寡糖_硬脂酸嫁接物形成的膠團(tuán)，進(jìn)行表面葉酸修飾，合成了具有細(xì)胞表面葉酸受體過(guò)表達(dá)癌細(xì)胞靶向性的殼寡糖一硬脂酸嫁接物，并應(yīng)用于細(xì)胞水平的抗腫瘤治療。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物，其具有代表性的結(jié)構(gòu)通式為其中x,y為聚合度；采用的脂肪酸為硬脂酸(n=16);殼寡糖的分子量為1100kDa，脫乙酰度為70-100%;殼寡糖鏈上的部分自由氨基被葉酸取代，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的葉酸修飾方法，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)分別稱取殼寡糖-硬脂酸嫁接物200mg和葉酸20mg，加入200ml蒸餾水后探頭超聲20次使溶解(400w，工作2s，間歇3s)，然后加入碳二亞胺20mg，維持9(TC水浴加熱，400r■min'1攪拌5小時(shí)后停止加熱，待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后將其置于透析袋中(截留分子量為7000Da，杭州華東醫(yī)藥集團(tuán))透析48h，以除去水溶性的小分子副產(chǎn)物，然后將透析液經(jīng)10，000rpm，5min離心后取上清液冷凍干燥，得葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸聚合物固體粉末。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)作為葉酸配體靶向載體在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，采用葉酸嫁接的殼寡糖一硬脂酸嫁接物，能對(duì)細(xì)胞表面葉酸受體表達(dá)較多的癌細(xì)胞進(jìn)行選擇性地吸附，短時(shí)間內(nèi)大大提高嫁接物進(jìn)入癌細(xì)胞的數(shù)量(圖2)，而未葉酸嫁接的殼寡糖一硬脂酸嫁接物則表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞表面葉酸受體的多與少無(wú)選擇性識(shí)別能力(圖3)。在細(xì)胞抗腫瘤藥效學(xué)研究結(jié)果表明，以葉酸嫁接的殼寡糖一硬脂酸嫁接物為載體包封的抗腫瘤藥物，能對(duì)細(xì)胞表面葉酸受體表達(dá)較多的癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力(圖5)，其原因?yàn)樵鰪?qiáng)的葉酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。為了更好的比較葉酸嫁接的殼寡糖一硬脂酸嫁接物載抗腫瘤藥物膠團(tuán)的抗腫瘤效果，我們將其與該抗腫瘤藥臨床用制劑進(jìn)行比較，結(jié)果表明，我們的載藥膠團(tuán)能產(chǎn)生更強(qiáng)的癌細(xì)胞殺傷能力(圖6)，分析原因?yàn)檩d藥膠團(tuán)較臨床用制劑更能顯著增強(qiáng)抗腫瘤藥物的細(xì)胞內(nèi)在化(圖7)。由于大多數(shù)抗腫瘤藥物的作用位點(diǎn)位于細(xì)胞內(nèi)，因此增加抗腫瘤藥物的細(xì)胞內(nèi)在化將能顯著提高其抗腫瘤功效。本發(fā)明所制備得到的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物，具有在水性介質(zhì)中通過(guò)自聚集形成膠團(tuán)的特性，1mg/ml的殼寡糖-脂肪酸嫁接物水溶液，可形成粒徑為51000nm、zeta電位為580mV的膠團(tuán)。葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度位于0.0010.1mg/ml之間，明顯低于一般表面活性劑的臨界膠團(tuán)濃度，當(dāng)膠團(tuán)遇到體液被稀釋時(shí)，可以繼續(xù)保持膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)，表明葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)適宜作為藥物的載體使用。該嫁接物膠團(tuán)，具有主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體的功能，大大提高了膠團(tuán)被細(xì)胞攝取的速度和載藥膠團(tuán)的抗腫瘤活性。圖l:Hda和A549細(xì)胞在同一孔中混合培養(yǎng)的示意圖。圖2:FITC標(biāo)記的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)與A549和Hela細(xì)胞共孵育2小時(shí)后的熒光倒置顯微鏡照片。圖3:FITC標(biāo)記的未采用葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)與A549和Hda細(xì)胞共孵育2小時(shí)后的熒光倒置顯微鏡照片。圖4:FITC標(biāo)記的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)與A549和Hela細(xì)胞共孵育6小時(shí)后的熒光倒置顯微鏡照片。圖5:膠團(tuán)的原子力顯微鏡照片。圖6:藥物從膠團(tuán)中的釋放行為。圖7，載藥膠團(tuán)對(duì)不同細(xì)胞的抑制率研究。圖8，Taxol的不同細(xì)胞藥效學(xué)研究。圖9:載藥膠團(tuán)與Taxol處理的Hela細(xì)胞內(nèi)藥物的累積。具體實(shí)施方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施里作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)例一1、低分子量殼聚糖(殼寡糖)制備取市售分子量為550kDa的殼聚糖(70%脫乙酰度)，在55。C和pH5.0條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5:100(w/w)加入纖維素酶，降解殼聚糖。以粘度法控制殼聚糖的降解程度。所得殼聚糖的降解液，經(jīng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，使用分子量為10kDa和30kDa的超濾膜進(jìn)行超濾分級(jí)。取分子量介于10kDa和30kDa的超濾液冷凍干燥，得脫乙酰度為70%、分子量54.0kDa的殼寡糖。2、殼寡糖-脂肪酸嫁接物制備取上述0.0001mol殼寡糖，溶于100ml蒸餾水中，制備殼寡糖的水溶液，加入0.OlmolN-羥基琥珀酰亞胺溶解后，在室溫和磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)；另分別稱取0.002mol的硬脂酸，在40。C的條件下，溶于20ml的無(wú)水乙醇，加入O.Olmol的碳二亞胺，在50。C磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)。在上述兩反應(yīng)液各反應(yīng)l小時(shí)后，分別將殼寡糖的反應(yīng)液與硬脂酸的反應(yīng)液混合，繼續(xù)在室溫、磁力攪拌的條件下反應(yīng)48小時(shí)。終反應(yīng)液經(jīng)透析后，冷凍干燥，干燥產(chǎn)物經(jīng)40°C的無(wú)水乙醇洗滌后得到殼寡糖-硬脂酸嫁接物。采用三硝基苯磺酸法，測(cè)定所得殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量的殼寡糖(0.5~9mg)，精密稱定，分別溶于2ml的蒸餾水中，加入4%(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1%(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37。C孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-脂肪酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度為22.1%。3、殼寡糖-硬脂酸聚合物膠團(tuán)的葉酸修飾及理化性質(zhì)的測(cè)定分別稱取殼寡糖-硬脂酸嫁接物200mg和葉酸10mg，加入200ml蒸餾水后探頭超聲20次使溶解(400w，工作2s，間歇3s)，然后加入碳二亞胺10mg，維持90'C水浴加熱,400rmin.1攪拌5小時(shí)后停止加熱，待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后將其置于透析袋中(截留分子量為7000Da，杭州華東醫(yī)藥集團(tuán))透析48h，以除去水溶性的小分子副產(chǎn)物，然后將透析液經(jīng)10,000rpm，5min離心后取上清液冷凍干燥，得葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸聚合物固體粉末。采用芘熒光法測(cè)定，葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度。取葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。將1mg/ml的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物溶液稀釋成不同濃度的溶液各10mL，分別加入定量的芘(芘的終濃度為7x10—mol，L'1)，水浴超聲(400w，30min)。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠團(tuán)濃度，CMC值為0.017mg/ml。另取葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w,工作2s停3s)，定容至10ml，制備1mg/ml的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液。Zetasizer3000HS分析儀測(cè)定葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑為106.7nm及Zeta電位為50.5。采用原子力顯微鏡觀察粒子大小與形態(tài)(圖5)。4、葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在兩種腫瘤細(xì)胞中的攝取比較取O.lg異硫氰基熒光素和0.5g葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定后分別溶解于60。/。乙醇溶液中。在冰浴、避光與磁力攪拌(400。min—1)條件下，將葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物乙醇溶液，滴加到異硫氰基熒光素溶液中，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)10h。終反應(yīng)液置透析袋，重蒸水透析24h，除去未反應(yīng)異硫氰基熒光素。透析液冷凍干燥，得異硫氰基熒光素標(biāo)記葉酸修飾殼寡糖-硬脂酸嫁接物。取異硫氰基熒光素標(biāo)記葉酸修飾殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱定。加適量重蒸水，水浴超聲10min分散，定容至1000ml，得異硫氰基熒光素標(biāo)記葉酸修飾殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液。以人II型肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞和人子宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞為模型細(xì)胞，在含有約10。/。小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)(5%C02，37'C孵箱)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，即可進(jìn)行接種。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS潤(rùn)洗后，加入胰酶消化并用培養(yǎng)液稀釋，按每孔lxl()S個(gè)細(xì)胞的密度將兩種細(xì)胞接種于同一個(gè)孔中(中間用一個(gè)薄板擋住，參見(jiàn)圖l)，孵箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)液中加入異硫氰基熒光素標(biāo)記的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液孵育。膠團(tuán)濃度控制為100]Lig/ml。培養(yǎng)2h、6h后，用熒光倒置顯微鏡觀察(參見(jiàn)圖24)。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，在短時(shí)間內(nèi)(2h)，中的熒光要比A549細(xì)胞中的熒光亮很多，而且Hela細(xì)胞中攝取膠團(tuán)的細(xì)胞數(shù)也要比A549細(xì)胞多(參見(jiàn)圖2)，這主要是因?yàn)镠ela細(xì)胞膜表面的葉酸受體遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于A549細(xì)胞膜表面的葉酸受體。當(dāng)載體沒(méi)有進(jìn)行葉酸修飾時(shí)，載體在兩者細(xì)胞攝取的數(shù)量沒(méi)有顯著性差別(參見(jiàn)圖3)。但是由于殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)自身就具有快速被細(xì)胞所攝取的能力，所以在作用長(zhǎng)時(shí)間后，葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在兩種細(xì)胞上的攝取量不會(huì)因?yàn)榧?xì)胞表面的葉酸受體的密度不同而現(xiàn)出明顯的差異，參見(jiàn)圖4。5、負(fù)載紫杉醇的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的制備分別精密稱取葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物100mg和紫杉醇10mg，溶解在DMSO和水(9:1)混合溶劑中，室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后放入透析袋(截留分子量為7000Da，美國(guó)波譜實(shí)驗(yàn)室有限公司)內(nèi)，純水透析4小時(shí)。取出后，5000rpm離心5min，凍干。藥物的釋放研究結(jié)果表明，由于膠團(tuán)對(duì)藥物的包裹作用，藥物的釋放速率較臨床用制劑緩慢，參見(jiàn)圖6，圖中O:Taxol;載藥膠團(tuán)。6、負(fù)載紫杉醇的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的抗腫瘤活性以肺癌A549細(xì)胞和Hda細(xì)胞為模型細(xì)胞，負(fù)載紫杉醇的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的抗腫瘤療效通過(guò)給藥系統(tǒng)與細(xì)胞共孵育后的IC50值(細(xì)胞的半數(shù)致死率)來(lái)評(píng)價(jià)。細(xì)胞存活率試驗(yàn)采用四唑鹽比色法(MTTAssay)測(cè)定。兩種細(xì)胞分別于24孔板預(yù)培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，分別加入不同濃度的紫杉醇溶液(溶劑為Cremophor:無(wú)水乙醇l:1(W/W))和不同濃度的負(fù)載紫杉醇的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，并設(shè)對(duì)照L,每組重復(fù)3次；孵育48h后，每孔加入MTT溶液60nL孵育4h后棄去上清液，PBS溶液沖洗2次，每孔加入DMSO500pL,終止反應(yīng)。將培養(yǎng)板水平振蕩10min，用酶聯(lián)檢測(cè)儀在570nm處測(cè)定吸收度，按(1)式計(jì)算細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率(％)=八57()(樣品)/A570(對(duì)照)X100X(1)其中A57。(樣品)為加入混懸液后的細(xì)胞的吸收度，八57()(對(duì)照)為空白對(duì)照的細(xì)胞的吸收度。所測(cè)定的紫杉醇溶液和負(fù)載紫杉醇的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在A549和Hale細(xì)胞中的IC50值結(jié)果見(jiàn)表1和圖7、圖8，圖7中Hela;□:A549;圖8中Hela;A549。表1:紫杉醇溶液和負(fù)載紫杉醇的膠團(tuán)溶液在Hda和A549細(xì)胞中的IC50值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>負(fù)載紫杉醇的膠團(tuán)與紫杉醇溶液(Taxol)在Hela細(xì)胞內(nèi)隨時(shí)間的累積量參見(jiàn)圖9，圖中O:Taxol;載藥膠團(tuán)。實(shí)例二-1、低分子量殼聚糖(殼寡糖)制備取市售分子量為550kDa的殼聚糖(70%脫乙酰度)，在55。C和pH5.0條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5:100(w/w)加入纖維素酶，降解殼聚糖。以粘度法控制殼聚糖的降解程度。所得殼聚糖的降解液，經(jīng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，使用分子量為10kDa和30kDa的超濾膜進(jìn)行超濾分級(jí)。取分子量介于10kDa和30kDa的超濾液冷凍干燥，得脫乙酰度為70%、分子量54.0kDa的殼寡糖。2、殼寡糖-脂肪酸嫁接物制備取上述0.0001mol殼寡糖，溶于100ml蒸餾水中，制備殼寡糖的水溶液，加入0.OlmolN-羥基琥珀酰亞胺溶解后，在室溫和磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)；另分別稱取0.002mol的硬脂酸，在40。C的條件下，溶于20ml的無(wú)水乙醇，加入0.01mol的碳二亞胺，在5(TC磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)。在上述兩反應(yīng)液各反應(yīng)l小時(shí)后，分別將殼寡糖的反應(yīng)液與硬脂酸的反應(yīng)液混合，繼續(xù)在室溫、磁力攪拌的條件下反應(yīng)48小時(shí)。終反應(yīng)液經(jīng)透析后，冷凍干燥，干燥產(chǎn)物經(jīng)40。C的無(wú)水乙醇洗滌后得到殼寡糖-硬脂酸嫁接物。采用三硝基苯磺酸法，測(cè)定所得殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量的殼寡糖(0.59mg)，精密稱定，分別溶于2ml的蒸餾水中，加入4%(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1%(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37°。孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-脂肪酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度為22.1%。3、殼寡糖-硬脂酸聚合物膠團(tuán)的葉酸修飾及理化性質(zhì)的測(cè)定分別稱取殼寡糖-硬脂酸嫁接物200mg和葉酸20mg，加入200ml蒸餾水后探頭超聲20次使溶解(400w，工作2s，間歇3s)，然后加入碳二亞胺20mg，維持9(TC水浴加熱,400rmin—1攪拌5小時(shí)后停止加熱，待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后將其置于透析袋中(截留分子量為7000Da，美國(guó)波譜實(shí)驗(yàn)室有限公司)透析48h，以除去水溶性的小分子副產(chǎn)物，然后將透析液經(jīng)10，000rpm，5min離心后取上清液冷凍干燥，得葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸聚合物固體粉末。采用芘熒光法測(cè)定，葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度。取葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。將1mg/ml的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物溶液稀釋成不同濃度的溶液各10mL，分別加入定量的芘(芘的終濃度為7xlO々mobU1)，水浴超聲(400w，30min)。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠團(tuán)濃度，CMC值為0.017mg/ml。另取葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制備1mg/ml的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液。Zetasizer3000HS分析儀測(cè)定葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑為117.2nm及Zeta電位為39.8。實(shí)例三1、低分子量殼聚糖(殼寡糖)制備取市售分子量為550kDa的殼聚糖(70%脫乙酰度)，在55。C和pH5.0條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5:100(w/w)加入纖維素酶，降解殼聚糖。以粘度法控制殼聚糖的降解程度。所得殼聚糖的降解液，經(jīng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，使用分子量為10kDa和30kDa的超濾膜進(jìn)行超濾分級(jí)。取分子量介于10kDa和30kDa的超濾液冷凍干燥，得脫乙酰度為70%、分子量54.0kDa的殼寡糖。2、殼寡糖-脂肪酸嫁接物制備取上述0.0001mol殼寡糖，溶于100ml蒸餾水中，制備殼寡糖的水溶液，加入0.OlmolN-羥基琥珀酰亞胺溶解后，在室溫和磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)；另分別稱取0.002mol的硬脂酸，在40'C的條件下，溶于20ml的無(wú)水乙醇，加入0.01mol的碳二亞胺，在5(TC磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)。在上述兩反應(yīng)液各反應(yīng)l小時(shí)后，分別將殼寡糖的反應(yīng)液與硬脂酸的反應(yīng)液混合，繼續(xù)在室溫、磁力攪拌的條件下反應(yīng)48小時(shí)。終反應(yīng)液經(jīng)透析后，冷凍干燥，干燥產(chǎn)物經(jīng)4(TC的無(wú)水乙醇洗滌后得到殼寡糖-硬脂酸嫁接物。采用三硝基苯磺酸法，測(cè)定所得殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量的殼寡糖(0.5~9mg)，精密稱定，分別溶于2ml的蒸餾水中，加入4%(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1%(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37。C孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-脂肪酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度為22.1%。3、殼寡糖-硬脂酸聚合物膠團(tuán)的葉酸修飾及理化性質(zhì)的測(cè)定分別稱取殼寡糖-硬脂酸嫁接物200mg和葉酸30mg，加入200ml蒸餾水后探頭超聲20次使溶解(400w，工作2s，間歇3s)，然后加入碳二亞胺30mg，維持90"C水浴加熱，400rmin—1攪拌5小時(shí)后停止加熱，待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后將其置于透析袋中(截留分子量為7000Da，美國(guó)波譜實(shí)驗(yàn)室有限公司)透析48h,以除去水溶性的小分子副產(chǎn)物，然后將透析液經(jīng)10,000rpm，5min離心后取上清液冷凍干燥，得葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸聚合物固體粉末。采用芘熒光法測(cè)定，葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度。取葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。將1mg/ml的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物溶液稀釋成不同濃度的溶液各10mL，分別加入定量的芘(芘的終濃度為7xl(T711101，1/1)，水浴超聲(400w，30min)。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠團(tuán)濃度，CMC值為0.017mg/ml。另取葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制備1mg/ml的葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液。Zetasizer3000HS分析儀測(cè)定葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑為124.9nm及Zeta電位為25.2。權(quán)利要求1.一種葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物，其特征是具有代表性的結(jié)構(gòu)通式為其中x，y為聚合度，采用的脂肪酸為n＝16的硬脂酸，殼寡糖的分子量為1～100kDa，脫乙酰度為70-100％，殼寡糖鏈上的部分自由氨基被葉酸取代。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述葉酸修飾的殼寡糖-脂肪酸嫁接物，其特征是具有在水性介質(zhì)中通過(guò)自聚集形成膠團(tuán)的特性，1mg/ml的殼寡糖-脂肪酸嫁接物水溶液可形成粒徑為51000nm、zeta電位為580mV的膠團(tuán)。葉酸修飾的殼寡糖-脂肪酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度位于0.0010.1mg/ml之間。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的制備方法，其特征是由葉酸的羧基與殼寡糖的氨基的耦合反應(yīng)合成得到，具體制備方法為分別稱取殼寡糖-硬脂酸嫁接物200mg和葉酸20mg，加入200ml蒸餾水后探頭超聲20次使溶解，超聲條件為400w、工作2秒、間歇3秒，然后加入碳二亞胺20mg，維持9(TC水浴加熱，400r.min"攪拌5小時(shí)后停止加熱，待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后將其置于透析袋中，透析48小時(shí)，然后將透析液經(jīng)10,000rpm，5分鐘離心后取上清液冷凍干燥，得葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物固體粉末。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述葉酸修飾的殼寡糖-脂肪酸嫁接物作為葉酸配體靶向載體在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物，具有在水性介質(zhì)中通過(guò)自聚集形成膠團(tuán)的特性，1mg/ml的殼寡糖-脂肪酸嫁接物水溶液，可形成粒徑為5～1000nm、zeta電位為5～80mV的膠團(tuán)。葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度位于0.001～0.1mg/ml之間，明顯低于一般表面活性劑的臨界膠團(tuán)濃度，當(dāng)膠團(tuán)遇到體液被稀釋時(shí)，可以繼續(xù)保持膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)，表明葉酸修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)適宜作為藥物的載體使用。本發(fā)明提供的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)作為葉酸配體靶向載體在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C08B37/00GK101148483SQ200710156549公開(kāi)日2008年3月26日申請(qǐng)日期2007年11月8日優(yōu)先權(quán)日2007年11月8日發(fā)明者杜永忠,劍游,胡富強(qiáng),弘袁申請(qǐng)人:浙江大學(xué)