專利名稱:一種基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置的制造方法
【專利摘要】一種基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置，屬于單細胞取樣技術(shù)領(lǐng)域。解決了現(xiàn)有技術(shù)中基于毛細管探針的單細胞取樣裝置，成本高、重復(fù)性差、過程繁瑣的問題。該取樣裝置，包括線性控制器、多孔金屬富集探針和顯微鏡；其中，線性控制器由底座、支桿、夾持裝置、微分頭和固定座組成，多孔金屬富集探針具有三維連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)且一端為尖端，另一端固定在固定座上，多孔金屬富集探針隨微分頭的測桿沿微分頭軸線方向移動，顯微鏡用于觀察待取樣組織中的細胞。該單細胞取樣裝置操作簡單方便、重復(fù)性好、成本低、效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)動植物組織單細胞取樣，進而實現(xiàn)單細胞代謝物的快速分析，發(fā)現(xiàn)不同細胞間代謝物的差異。
【專利說明】
一種基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本實用新型涉及一種基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置，屬于單細胞取樣技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]單細胞分析技術(shù)是通過高靈敏度和高專一性的方法檢測單個細胞內(nèi)痕量代謝物的技術(shù)。對于新鮮動植物組織而言，同一塊組織中的不同細胞往往具有類似的基因和生長環(huán)境。然而，近年來科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，同一塊組織的不同細胞，對同一信號的應(yīng)激反應(yīng)也可能顯著不同，導(dǎo)致細胞內(nèi)代謝物也可能存在明顯的差異。這種單細胞水平的變化與生長、分化、異質(zhì)性、應(yīng)激反應(yīng)、衰老、凋亡、癌變等多種生物學(xué)現(xiàn)象相關(guān)。因此，研究新鮮動植物組織中單細胞水平的代謝物種類和含量的變化，對于在細胞水平了解多種生物學(xué)現(xiàn)象的機制具有重要意義。應(yīng)用于新鮮動植物組織的單細胞分析技術(shù)，通常包含單細胞取樣技術(shù)和單細胞檢測技術(shù)。單細胞取樣技術(shù)是指通過特殊的方法從微米級直徑的單個細胞內(nèi)獲取微量細胞溶液或目標(biāo)代謝物的技術(shù)。
[0003]現(xiàn)有的應(yīng)用于新鮮動植物組織的單細胞取樣裝置主要是基于毛細管探針，取樣時主要通過將極細的毛細管探針插入單個細胞內(nèi)的方法來吸取細胞溶液。這不光需要高超的毛細管探針制備技術(shù)，還需要可以三維移動的控制器來控制毛細管探針插入細胞內(nèi)。并使用皮升級的氣栗來控制細胞溶液的吸入及排出。復(fù)雜的取樣過程和探針制備技術(shù)增加了單細胞取樣的成本和難度。且毛細管探針取樣過程中容易發(fā)生堵塞。探針重復(fù)利用時清洗不便。
[0004]綜上所述，開發(fā)更加方便、快速、廉價、易行的單細胞取樣裝置是目前本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。
【實用新型內(nèi)容】
[0005]本實用新型的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中基于毛細管探針的單細胞取樣裝置，成本高、探針不易清洗，取樣過程繁瑣的技術(shù)問題，提供一種基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本實用新型采用的技術(shù)方案如下。
[0007]基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置，包括線性控制器、多孔金屬富集探針和顯微鏡；
[0008]所述線性控制器由底座、支桿、夾持裝置、微分頭和固定座組成，所述支桿固定在底座上，所述夾持裝置的一端固定在支桿上，另一端夾持微分頭，夾持裝置用于調(diào)整多孔金屬富集探針與載玻片的角度，所述微分頭用于控制多孔金屬富集探針插入目標(biāo)細胞的深度和時間，所述固定座與微分頭的測桿連接；
[0009]所述多孔金屬富集探針具有三維連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)且一端為尖端，另一端固定在固定座上，多孔金屬富集探針隨微分頭的測桿沿微分頭軸線方向移動，多孔金屬富集探針的直徑為30-3000μπι，尖端的直徑為1-20μπι;
[0010]所述顯微鏡用于觀察待取樣組織中的細胞，待取樣組織置于顯微鏡的載玻片上。[0011 ]進一步的，所述夾持裝置夾持微分頭的安裝套。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型的有益效果為:
[0013]本實用新型的單細胞取樣裝置可以直接對新鮮動植物組織取樣，操作簡單方便、重復(fù)性好，且成本低，僅需數(shù)百元即可完成裝置的搭建，遠低于三維控制器和皮升栗萬元以上的價格，效率高，完成一次單細胞分析僅需數(shù)分鐘。其中，多孔金屬富集探針可通過腐蝕廉價的合金金屬絲制備，相比于微米級別尖端的毛細管探針具備制備工藝簡單，造價低廉的優(yōu)點，成本遠低于現(xiàn)有裝置;多孔金屬富集探針表面具有三維連續(xù)多孔結(jié)構(gòu)，可增強探針對代謝物的富集作用，多孔金屬富集探針比處理前富集能力增加25-60倍，大幅度提高了單細胞分析的靈敏度，解決了實心探針(金屬絲探針)在單細胞分析時取樣量不足的問題，且不存在毛細管探針的堵塞問題；多孔金屬富集探針在使用后，可以依次在稀硫酸、甲醇、水中洗滌后，真空干燥，重復(fù)使用，相比于毛細管探針需要依靠皮升栗栗入和栗出洗滌液的方式來清洗，簡便快捷。夾具控制微分頭與載玻片的夾角，微分頭控制探針插入目標(biāo)細胞的深度和時間，兩者配合既能夠控制探針插入目標(biāo)細胞，又不需要毛細管探針的三維控制器，進一步節(jié)省了裝置成本。該裝置大大降低了動植物組織單細胞分析的門檻，能夠?qū)崿F(xiàn)動植物組織單細胞取樣，進而實現(xiàn)單細胞代謝物的快速分析，發(fā)現(xiàn)不同細胞間代謝物的差異。
【附圖說明】

[0014]圖1為本實用新型多孔金屬富集探針的制備流程圖；
[0015]圖2中，(a)為本實用新型的單細胞取樣裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，(b)為(a)的局部放大圖；
[0016]圖3中，(a)-(c)分別為實施例1的鋅銅合金金屬絲未腐蝕前的不同倍率的電鏡圖，(d)-(f)分別為實施例1的鋅銅合金金屬絲在腐蝕液中腐蝕15h后的不同倍率的電鏡圖；
[0017]圖4中，(a)為實施例1的鋅銅合金金屬絲插入寡糖溶液后的洗滌液的質(zhì)譜圖，(b)為實施例1的多孔金屬富集探針插入濃度為鋅銅合金金屬絲插入的寡糖溶液的濃度的1/25后的洗滌液的質(zhì)譜圖；
[0018]圖5為本實用新型實施例2的洋蔥內(nèi)表皮取樣的質(zhì)譜圖；
[0019]圖6為本實用新型實施例3的洋蔥外表皮取樣的質(zhì)譜圖；
[0020]圖中，1、線性控制器，2、多孔金屬富集探針，11、底座，12、支桿，13、夾持裝置，14、微分頭，15、固定座，3、顯微鏡，31、載玻片，32、物鏡。
【具體實施方式】
[0021]為了進一步了解本實用新型，下面結(jié)合【具體實施方式】對本實用新型的優(yōu)選實施方案進行描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進一步說明本實用新型的特征和優(yōu)點而不是對本實用新型專利要求的限制。
[0022]如圖1-3所示，本實用新型的基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置，包括線性控制器1、多孔金屬富集探針2和顯微鏡3。其中，線性控制器I主要由底座11、支桿12、夾持裝置13、微分頭14和固定座15組成;底座11放置在取樣臺上，結(jié)構(gòu)沒有特殊限制;支桿12的底端固定在底座11上;夾持裝置13—端固定在支桿12上，另一端夾持微分頭14的安裝套，夾持裝置13控制多孔金屬富集探針2插入目標(biāo)細胞(待取樣組織的單細胞)的角度，為操作簡便，夾持裝置13可以為普通夾具;微分頭14沒有特殊限制，現(xiàn)有技術(shù)中的微分頭14都能使用，微分頭14控制多孔金屬富集探針2插入目標(biāo)細胞的深度和時間，固定座15用于固定多孔金屬富集探針2，固定座15與微分頭14的測桿連接，能夠安裝在測桿上，也能夠從測桿上拆下。多孔金屬富集探針2具有為三維連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)且一端為尖端，另一端固定在固定座15上，多孔金屬富集探針2隨測桿沿微分頭14軸線方向移動，多孔金屬富集探針2的直徑為30-3000μm，尖端的直徑為1-20μπι，長度沒有特殊限制，依據(jù)實際使用需要設(shè)置即可，一般可以為1-3cm，具備機械強度，保證在取樣過程中不會彎曲。顯微鏡3用于觀察待取樣組織中的細胞。待取樣組織置于顯微鏡3的載玻片31上。
[0023]上述多孔金屬富集探針2可以通過以下方法制備:
[0024]步驟一、取由活潑金屬和不活潑金屬組成且直徑為30-3000μπι的合金金屬絲；
[0025]其中，活潑金屬與不活潑金屬是相對而言的，待腐蝕掉的金屬即為活潑金屬，形成多孔金屬富集探針2的金屬為不活潑金屬，沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)需要進行選擇?；顫娊饘倥c不活潑金屬都可以為一種也可以為多種，通常，不活潑金屬采用單一種類，如不活潑金屬選擇鉑、金、鈀中的一種，活潑金屬選擇銀、銅、鋅、鎳、錳、鋁中的一種或多種按任意比例混合；
[0026]或者，不活潑金屬選擇鈦，活潑金屬選擇銅、鋅、鎳、錳、鋁中的一種或多種按任意比例混合;或者，不活潑金屬選擇銅，活潑金屬選擇鋅、鎳、錳、鋁中的一種或多種按任意比例混合。不活潑金屬的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)需要達到20-60%。
[0027]步驟二、在合金金屬絲的一端切割出直徑為1-20μπι尖端；
[0028]步驟三、采用化學(xué)腐蝕的方法腐蝕掉合金金屬絲中的活潑金屬，剩余的不活潑金屬會自發(fā)形成三維連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)，得到多孔金屬富集探針2;
[0029]本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)需要腐蝕的活潑金屬選擇化學(xué)腐蝕的腐蝕液;如當(dāng)活潑金屬為銀或銅時，腐蝕可以選擇在氧化性酸中進行；當(dāng)活潑金屬為鋅、鎳、錳時，腐蝕可以選擇在強酸溶液中進行;當(dāng)活潑金屬為鋁時，腐蝕可一選擇在強酸或強堿中進行；
[0030]優(yōu)選在腐蝕過程中，在合金金屬絲上施加電壓，進行電化學(xué)輔助腐蝕，既能保護不活潑金屬，又能夠輔助活潑金屬組分分解使探針獲得更佳的富集能力。
[0031]以多孔銅富集探針的制備為例，描述探針的制備過程。先取銅合金金屬絲，銅合金金屬絲中，銅元素含20-60%，活潑金屬為鋅、鋁、鎂、錳、銀等活潑金屬，可以是一種也可以是多種的混合，將直徑約30-3000μπι的銅合金金屬絲切割成數(shù)厘米的小段，再在每小段金屬絲的一端切割出一個直徑1_20μπι的尖端。將切割好的金屬絲在強酸溶液中腐蝕，活潑組分會選擇性分解，剩余的銅元素可自發(fā)形成三維連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)，再用超純水和/或甲醇沖洗后真空干燥，即得多孔銅探針。
[0032]上述基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置在使用時，包括以下步驟:
[0033]步驟一、調(diào)整夾持裝置12使多孔金屬富集探針2與載玻片31成30-60度夾角，如果角度小于30度，取樣時探針會與多個細胞接觸，影響檢測的準(zhǔn)確性，如果角度過大，探針在空間上受顯微鏡阻礙，無法在微分頭14的控制下插入細胞，通常角度越小，探針的比表面積越大，富集能力越好；
[0034]步驟二、將待取樣組織置于顯微鏡3的載玻片上，通過顯微鏡3的物鏡32觀察待取樣組織的細胞，選取一個目標(biāo)細胞，即確定待取樣的單細胞；
[0035]其中，待取樣的組織來源于具有細胞結(jié)構(gòu)的生物，尤其是多細胞生物，如動物，植物等，待取樣的組織一般為薄片，具體厚度沒有限制，能夠通過顯微鏡3觀察到其細胞就可以；
[0036]如果多孔金屬富集探針2距離待取樣組織的距離較遠，可以在顯微鏡3物鏡32的視野范圍內(nèi)，保證多孔金屬富集探針2與載玻片31成30-60度夾角下，移動顯微鏡3的載物臺，使多孔金屬富集探針2靠近待取樣組織；
[0037]步驟三、旋轉(zhuǎn)微分頭14使多孔金屬富集探針2插入待取樣的單細胞，停留至多孔金屬富集探針2達到富集平衡，一般時間為20s以上，優(yōu)選20-180S，再次旋轉(zhuǎn)微分頭14拔出多孔金屬富集探針2，完成單細胞取樣。
[0038]還可以繼續(xù)對上述取樣方法得到的單細胞樣品進行分析，分析過程是將固定座15從微分頭14的側(cè)桿上取下，使用體積為0.l-2yL，優(yōu)選0.5-lyL的基質(zhì)溶液清洗多孔金屬富集探針2的尖端后，采用MALD1-MS或者nano ESI對洗滌液進行分析，具體分析過程為現(xiàn)有技術(shù)，本實用新型不再贅述。其中，基質(zhì)溶液為本領(lǐng)域常用試劑，一般可采用濃度為10mg/ml的2,5-二羥基苯甲酸(DHB)。
[0039]本實用新型中評價多孔金屬富集探針2的富集效率時，使用腐蝕前、后的探針在相同的條件下分別對一份寡糖溶液的m和η倍稀釋液進行取樣，獲得相似質(zhì)譜圖時的n/m值即為富集倍數(shù)。探針孔隙率越高，則富集倍數(shù)越大，富集能力越強。
[0040]以下結(jié)合實施例進一步說明本實用新型。
[0041 ] 實施例1
[0042]基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置，由線性控制器1、多孔金屬富集探針2和顯微鏡3組成;線性控制器I由底座11、支桿12、夾持裝置13、微分頭14和固定座15組成，支桿12固定在底座11上，夾持裝置13的一端固定在支桿12上，另一端夾持微分頭14的安裝套，固定座15與微分頭14的測桿連接，夾持裝置12用于調(diào)整多孔金屬富集探針2與載玻片31的角度，微分頭14用于多孔金屬富集探針2插入目標(biāo)細胞的深度和時間；
[0043]多孔金屬富集探針2為三維連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)且一端為尖端，另一端固定在固定座上，多孔金屬富集探針隨微分頭的測桿沿微分頭軸線方向移動，多孔金屬富集探針2通過以下方法制備:將直徑為0.1mm的鋅銅合金金屬絲(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的銅和40%的鋅)切成3cm的小段，取其中一段并在該段的尖端切割出一個直徑約為20μπι的尖端;將切割好的金屬絲置于腐蝕液(含有0.95Μ鹽酸和0.05Μ硝酸)中，在37°C的條件下腐蝕15h ；
[0044]顯微鏡3用于觀察待取樣組織中的細胞，待取樣組織置于顯微鏡3的載玻片31上。
[0045]圖3中，(a)-(c)分別為不同倍率的鋅銅合金金屬絲未腐蝕前的電鏡圖，(d)-(f)分別為不同倍率的鋅銅合金金屬絲在腐蝕液中腐蝕15h后的電鏡圖。從圖3可以看出，在腐蝕前鋅銅合金金屬絲表面光滑，在腐蝕后，鋅銅合金金屬絲表面形成了大量三維連續(xù)的孔隙。
[0046]將鋅銅合金金屬絲和多孔金屬富集探針插入不同濃度寡糖溶液中，停留120s后取出探針，用0.5yL，10mg/ml的DHB基質(zhì)溶液清洗探針尖端，將洗滌液進行質(zhì)譜分析。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)多孔金屬富集探針2插入的寡糖溶液的濃度是鋅銅合金金屬絲插入的寡糖溶液的濃度的1/25時，兩種探針獲得了相似的質(zhì)譜圖，說明多孔金屬富集探針2富集的樣品量是鋅銅合金金屬富集的樣品量的25倍。
[0047]實施例2
[0048]采用實施例1的單細胞取樣裝置對洋蔥內(nèi)表皮取樣的方法:
[0049]步驟一、調(diào)整夾持裝置13使多孔金屬富集探針2與載玻片31成30度夾角；
[0050]步驟二、將洋蔥內(nèi)表皮切片置于載玻片31上，通過顯微鏡3的物鏡32觀察洋蔥內(nèi)表皮細胞，選取一個細胞作為目標(biāo)細胞；
[0051]步驟三、旋轉(zhuǎn)微分頭14使多孔金屬富集探針2插入目標(biāo)細胞，停留120s，再次旋轉(zhuǎn)微分頭14拔出多孔金屬富集探針2，完成單細胞取樣；
[0052]將富集了樣品的多孔金屬富集探針2尖端在IyL10mg/ml DHB溶液中洗滌后，然后將洗滌液點板后用MALD1-TOF-MS進行分析，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，洋蔥內(nèi)表皮細胞中則主要含有寡糖類化合物。
[0053]實施例3
[0054]采用實施例1的單細胞取樣裝置對洋蔥外表皮取樣的方法:
[0055]步驟一、調(diào)整夾持裝置13使多孔金屬富集探針2與載玻片31成60度夾角；
[0056]步驟二、將洋蔥外表皮切片置于載玻片31上，通過顯微鏡3的物鏡32觀察洋蔥外表皮細胞，選取一個細胞；
[0057]步驟三、旋轉(zhuǎn)微分頭14使多孔金屬富集探針2插入選取的細胞，停留120s，再次旋轉(zhuǎn)微分頭14拔出多孔金屬富集探針2，完成單細胞取樣。
[0058]將富集了樣品的多孔金屬富集探針2尖端在IyL10mg/ml DHB溶液中洗滌后，然后將洗滌液點板后用MALD1-TOF-MS進行分析，結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，洋蔥外表皮細胞中寡糖類化合物含量較低，但花青素衍生物含量較高。綜合圖5和圖6，說明本方法可以有效用于單細胞取樣和分析，并可發(fā)現(xiàn)不同細胞間代謝物的差異。
[0059]實施例4
[0060]基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置，結(jié)構(gòu)與實施例1相同，只是其多孔金屬富集探針2通過以下方法制備:將直徑為0.03mm的鉑銅合金金屬絲(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的鉑和80%的銅)切成3cm的小段，取其中一段并在該段的尖端切割出一個直徑約為Ιμπι的尖端;將切割好的金屬絲置于IM硫酸中并在探針上施加1.2V的電壓，在室溫條件下腐蝕2.4h。
[0061]將實施例2的鉑銅合金金屬絲和多孔金屬富集探針插入不同濃度寡糖溶液中，停留60s后取出探針，用0.2yL，10mg/ml的DHB基質(zhì)溶液清洗探針尖端，將洗滌液進行質(zhì)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多孔金屬富集探針2插入的寡糖溶液的濃度是鉑銅合金金屬絲插入的寡糖溶液的濃度的1/60時，兩種探針獲得了相似的質(zhì)譜圖，說明多孔金屬富集探針2富集的樣品量是鋅銅合金金屬富集的樣品量的60倍。
[0062]實施例5
[0063]采用實施例4的單細胞取樣裝置對洋蔥外表皮取樣的方法:
[0064]步驟一、將多孔金屬富集探針2安裝在固定座15上，調(diào)整夾持裝置13使多孔金屬富集探針2與載玻片31成45度夾角；
[0065]步驟二、將洋蔥外表皮切片置于載玻片31上，通過顯微鏡3的物鏡2觀察洋蔥外表皮細胞，選取一個細胞；
[0066]步驟三、旋轉(zhuǎn)微分頭14使多孔金屬富集探針2插入選取的細胞，停留20s，再次旋轉(zhuǎn)微分頭14拔出多孔金屬富集探針2，完成單細胞取樣。
[0067]顯然，以上實施例的說明只是用于幫助理解本實用新型的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本實用新型原理的前提下，還可以對本實用新型進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本實用新型權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置，其特征在于，包括線性控制器、多孔金屬富集探針和顯微鏡； 所述線性控制器由底座、支桿、夾持裝置、微分頭和固定座組成，所述支桿固定在底座上，所述夾持裝置的一端固定在支桿上，另一端夾持微分頭，夾持裝置用于調(diào)整多孔金屬富集探針與載玻片的角度，所述微分頭用于控制多孔金屬富集探針插入目標(biāo)細胞的深度和時間，所述固定座與微分頭的測桿連接； 所述多孔金屬富集探針具有三維連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)且一端為尖端，另一端固定在固定座上，多孔金屬富集探針隨微分頭的測桿沿微分頭軸線方向移動，多孔金屬富集探針的直徑為30-3000μπι，尖端的直徑為1-20μ?? ； 所述顯微鏡用于觀察待取樣組織中的細胞，待取樣組織置于顯微鏡的載玻片上。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多孔金屬富集探針的單細胞取樣裝置，其特征在于，所述夾持裝置夾持微分頭的安裝套。
【文檔編號】C12M1/26GK205710741SQ201620211427
【公開日】2016年11月23日
【申請日】2016年3月18日
【發(fā)明人】崔勐, 付強, 唐君, 劉歡
【申請人】中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所