專利名稱：利用獲取光的多發(fā)色團(tuán)檢測(cè)和分析多核苷酸的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)和分析樣品中多核苷酸的方法、物品和組合物。
背景技術(shù)：
可實(shí)現(xiàn)DNA序列實(shí)時(shí)檢測(cè)且靈敏度高的方法具有重大的學(xué)術(shù)和經(jīng)濟(jì)利益。1，2，3其應(yīng)用包括醫(yī)學(xué)診斷、遺傳突變的鑒定、基因送遞監(jiān)控和特定基因組技術(shù)。4陽(yáng)離子有機(jī)染料，如溴化乙錠和噻唑橙被插入雙鏈DNA(dsDNA)的溝槽中，并充當(dāng)直接DNA雜交探針時(shí)，便可激發(fā)，但缺乏序列特異性。5，6用于鏈特異性測(cè)定的能量/電子轉(zhuǎn)移發(fā)色團(tuán)對(duì)是存在的，但需要化學(xué)標(biāo)記兩個(gè)核酸，或雙重修飾相同的改變鏈(例如，分子信標(biāo))。7，8標(biāo)記兩個(gè)DNA位點(diǎn)的困難導(dǎo)致了低產(chǎn)率、高成本，并生成了單個(gè)標(biāo)記的雜質(zhì)，從而使檢測(cè)靈敏度較低。9最近，有關(guān)肽核酸(PNAs)的介紹提供了新的研究和診斷應(yīng)用方面的契機(jī)。10，11在PNA中，DNA中帶負(fù)電荷的磷酸鍵被肽模擬物中性酰胺鍵取代。與類似的DNA/DNA復(fù)合體相比，PNA/DNA復(fù)合體的形成更為快速，結(jié)合能更高，特異性也更高。12這些特性之所以被增強(qiáng)，是因?yàn)槿狈υ趲ж?fù)電荷的DNA雙鏈之間所存在的庫(kù)倫排斥。PNA復(fù)合體具有更高的熱穩(wěn)定性，這是因?yàn)槠渲麈湆?duì)核酸酶、蛋白酶和肽酶生物降解的敏感性降低了。13，14另外，PNA復(fù)合體在雜交期間對(duì)離子強(qiáng)度和pH通常不敏感，從而為DNA檢測(cè)提供了更為寬廣的平臺(tái)。18因此本領(lǐng)域需要檢測(cè)和分析樣品中特定多核苷酸的方法，以及在這些方法中有用的組合物和物品。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于檢測(cè)和分析樣品中目標(biāo)多核苷酸的方法、組合物和物品。將懷疑含有目標(biāo)多核苷酸的樣品與聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)和傳感肽核酸(PNA)接觸，其中傳感肽核酸與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)。使傳感PNA與信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)綴合。無(wú)需受理論約束，樣品中存在目標(biāo)多核苷酸時(shí)，認(rèn)為通過(guò)利用與目標(biāo)多核苷酸主鏈的靜電相互作用，信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)被帶入鄰近陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)的近程，其中目標(biāo)多核苷酸已與傳感PNA雜交(見(jiàn)

圖1)。隨后，信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)可從已激發(fā)的聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)獲得能量，并發(fā)射可檢測(cè)的光。目標(biāo)多核苷酸天然存在于樣品中時(shí)，可對(duì)其進(jìn)行分析，或者可以在分析之前或分析的同時(shí)將其擴(kuò)增。本發(fā)明提供了包含用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的試劑的溶液，也提供了含有該試劑的試劑盒。本發(fā)明方法可用于多路設(shè)置，其中采用了多種不同傳感PNA分析多種不同目標(biāo)多核苷酸。本發(fā)明方法可任選在特定表面上進(jìn)行，例如采用可與表面締合的聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)；該表面可以是傳感器。本發(fā)明方法也可以均相形式被提供。檢測(cè)多核苷酸的其它技術(shù)均可將此處所描述的方法和物品作為選擇方案。
附圖簡(jiǎn)述圖1表示了本發(fā)明方法，采用聚陽(yáng)離子聚合物作為獲取光的多發(fā)色團(tuán)。提供了傳感PNA(PNA-C*)，包含信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)，并具有與所關(guān)心目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的堿基序列。在與樣品中目標(biāo)多核苷酸接觸時(shí)，由于與目標(biāo)多核苷酸存在靜電相互作用，聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)被帶入鄰近信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)的近程。隨后，多發(fā)色團(tuán)的激發(fā)使信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)發(fā)射光。
圖2所示分別為聚合物1(見(jiàn)下文)和傳感肽核酸PNA-C*的吸收(綠色和橙色)和發(fā)射(藍(lán)色和紅色)光譜。對(duì)聚合物1和PNA-C*的激發(fā)分別在380和480nm處進(jìn)行。
圖3所示為通過(guò)聚合物1的激發(fā)，在互補(bǔ)(紅色)和非互補(bǔ)(黑色)DNA存在條件下的PNA-C*發(fā)射光譜。將PNA-C*和相應(yīng)的DNA一起加入pH＝5.5的水中。該光譜相對(duì)于聚合物1的發(fā)射被標(biāo)準(zhǔn)化。
圖4所示為通過(guò)寡聚體2的激發(fā)，在互補(bǔ)(紅色)和非互補(bǔ)(黑色)DNA存在條件下的PNA-C*發(fā)射光譜。將PNA-C*和相應(yīng)的DNA一起加入pH＝5.5的水中。該光譜相對(duì)于寡聚物2的發(fā)射被標(biāo)準(zhǔn)化。
發(fā)明詳述目前，有關(guān)DNA和RNA傳感器(包括“基因-芯片”和“DNA-芯片”)的技術(shù)均基于熒光標(biāo)記(發(fā)光團(tuán))與DNA單鏈的共價(jià)附著。這些傳感器中的大部分均不得不依賴于被分析樣品的標(biāo)記，由于樣品間標(biāo)記反應(yīng)的效率變化導(dǎo)致了若干不可避免的難題，因而需要復(fù)雜的交叉校準(zhǔn)。其它系統(tǒng)則依賴于“分子信標(biāo)”方法，需要附著發(fā)光團(tuán)并準(zhǔn)確對(duì)工程改造序列淬滅。
本發(fā)明的一種方法包括使樣品與主要為水性的溶液中的至少兩種組分接觸(a)獲取光、發(fā)光的多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)，例如共軛聚合物，半導(dǎo)體量子點(diǎn)或水溶性樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)；和(b)與發(fā)光信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)或“PNA-C*”綴合的傳感PNA。在多發(fā)色團(tuán)激發(fā)時(shí)，具有信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)-C*的特征性光波長(zhǎng)的發(fā)射說(shuō)明溶液中存在目標(biāo)多核苷酸。通過(guò)利用分別具有不同堿基序列和不同信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)(PNA1-C1*、PNA2-C2*、PNA3-C3*、PNA4-C4*等)的多種不同傳感PNA，可獨(dú)立檢測(cè)并分析多種不同多核苷酸。
本發(fā)明所選擇的獲取光的發(fā)色團(tuán)和信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)(C*)可使兩個(gè)發(fā)色團(tuán)的吸收條帶的重疊程度最小，并使兩種發(fā)色團(tuán)的發(fā)光發(fā)射光譜的波長(zhǎng)不同。當(dāng)在水性溶液中制備時(shí)，獲取光的發(fā)光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)帶正電荷或陽(yáng)離子，優(yōu)選聚陽(yáng)離子(例如與聚電解質(zhì)結(jié)合的聚陽(yáng)離子)。由于傳感PNA不帶電荷，因此，在傳感PNA與獲取光的陽(yáng)離子發(fā)光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)之間存在的庫(kù)倫相互作用最小。在加入與傳感PNA序列互補(bǔ)的目標(biāo)多核苷酸時(shí)，目標(biāo)多核苷酸與該傳感PNA雜交。由于目標(biāo)多核苷酸帶負(fù)電荷，傳感PNA與聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)締合，使能量從聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移至信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)，例如，經(jīng)由Frster能量轉(zhuǎn)移機(jī)制。當(dāng)加入堿基序列與傳感PNA的堿基序列不互補(bǔ)的多核苷酸時(shí)，堿基對(duì)雜交不發(fā)生，多發(fā)色團(tuán)與傳感PNA之間靜電介導(dǎo)的絡(luò)合作用也不出現(xiàn)。在不發(fā)生上述雜交的情況下，聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)與信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)之間的平均距離對(duì)有效能量轉(zhuǎn)移而言由于過(guò)大，使信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)很少或無(wú)發(fā)射。上述總體方案可用于檢測(cè)受檢溶液中目標(biāo)多核苷酸的存在。另外，PNA通過(guò)結(jié)合并插入dsDNA和置換相同序列的DNA鏈，從而具有了形成三重結(jié)構(gòu)的能力。15，16，17上述傳感PNA/聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)平臺(tái)可被摻入用于直接檢測(cè)dsDNA的系統(tǒng)中。18除已描述方法外，本發(fā)明也提供了一種包含至少兩種下述組分，且主要為水性的溶液；(a)陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)，和(b)“傳感PNA”(PNA-C*)，包括與信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)綴合的肽核酸。
如實(shí)施例所例證的，可利用由水溶性多發(fā)色團(tuán)，如共軛聚合物提供的光學(xué)放大，檢測(cè)與PNA傳感器雜交的多核苷酸。通過(guò)利用較高分子量的水溶性共軛聚合物或其它結(jié)構(gòu)，如此處所描述的聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)可增強(qiáng)上述放大。本發(fā)明可以均相形式被提供，即利用熒光檢測(cè)法提供的方便，并利用在PNA-DNA相互作用中發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)的雜交情況。本發(fā)明可被用于檢測(cè)擴(kuò)增的目標(biāo)多核苷酸，或者在獨(dú)立試驗(yàn)中由于信號(hào)放大程度大，從而無(wú)需擴(kuò)增多核苷酸。
因此，本發(fā)明超越現(xiàn)有基因芯片技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)包括，避免了在分析之前，通過(guò)將發(fā)光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)至樣品中所含或樣品來(lái)源的多核苷酸，對(duì)待分析各樣品進(jìn)行首次標(biāo)記的需要。上述偶聯(lián)方法在偶聯(lián)效率的再現(xiàn)性方面存在固有困難，因而需要樣品間的交叉校準(zhǔn)。
此處描述的本發(fā)明對(duì)可用于檢測(cè)樣品是否存在目標(biāo)多核苷酸的任何試驗(yàn)均有用。典型的試驗(yàn)包括測(cè)定樣品中目標(biāo)多核苷酸的存在或其相對(duì)量，或者該試驗(yàn)可定量或半定量。
本發(fā)明的方法均可以多路形式進(jìn)行?？刹捎枚喾N不同傳感PNA，并通過(guò)利用與相應(yīng)的傳感PNA綴合的不同信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)，檢測(cè)樣品中相應(yīng)的不同目標(biāo)多核苷酸。本發(fā)明提供的多路方法應(yīng)用了2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、200、400或更多的不同傳感PNA，這些傳感PNA均可被同時(shí)用于測(cè)定相應(yīng)的不同目標(biāo)多核苷酸。
本發(fā)明方法可在基質(zhì)上以及溶液中進(jìn)行，但溶液形式被認(rèn)為由于存在擴(kuò)散，因而更為快速。因此，試驗(yàn)可在例如，基質(zhì)上以陣列形式進(jìn)行，該基質(zhì)可以是傳感器。該試驗(yàn)可通過(guò)錨定或其它方式將試驗(yàn)組分，如傳感多核苷酸、聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)，或二者一起摻入上述基質(zhì)而得以實(shí)現(xiàn)。上述基質(zhì)可以為玻璃、硅、紙、塑料表面或作為光電傳導(dǎo)器應(yīng)用的光電半導(dǎo)體(例如，但不僅限于，摻銦氮化鎵或聚合聚苯胺等)的表面。特定傳感多核苷酸的定位可以是已知的，或者可以陣列形式被測(cè)定，該陣列形式可以是可微尋址或可毫微尋址的。
進(jìn)一步詳述本發(fā)明前，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明不僅限于已描述的特定方法、裝置、溶液或儀器，當(dāng)然還可對(duì)這些方法、裝置、溶液或儀器進(jìn)行改動(dòng)。也應(yīng)當(dāng)理解的是此處所用的術(shù)語(yǔ)僅被用于描述特定實(shí)施方案，對(duì)本發(fā)明范疇不構(gòu)成限制。
上下文如無(wú)另外指明，單數(shù)形式“一個(gè)”“一種”和“該”的應(yīng)用包括復(fù)數(shù)范圍。因此，例如“一種目標(biāo)多核苷酸”包括多個(gè)目標(biāo)多核苷酸，“一種信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)”包括多個(gè)這樣的發(fā)色團(tuán)，“一種傳感PNA”包括多個(gè)傳感PNA，等等。另外，上下文如無(wú)另外指明，特定復(fù)數(shù)形式，如“兩個(gè)”、“三個(gè)”等術(shù)語(yǔ)的應(yīng)用應(yīng)被解讀為較大數(shù)量的相同描述對(duì)象。
術(shù)語(yǔ)如“相連的”、“附著的”、“聯(lián)接的”和“綴合的”在此文中可互換使用，如上下文無(wú)另外指明，這些術(shù)語(yǔ)也包括直接和間接的相連、附著、聯(lián)接或綴合。本發(fā)明所列的數(shù)值范圍應(yīng)被理解為也具體公開(kāi)了所列上限與下限之間的各居間整數(shù)值及其各分?jǐn)?shù)值，以及這些數(shù)值之間的各子范圍。任何范圍的上限和下限均可獨(dú)立地被包括在該范圍內(nèi)或被該范圍排除在外，僅包括一個(gè)極限、兩個(gè)極限均不包括或兩個(gè)極限均包括的范圍也在本發(fā)明范疇內(nèi)。本發(fā)明所論述的某些數(shù)值具有固有極限，例如一種組分存在的濃度范圍是0-100％，或者水溶液的pH范圍是1-14，本文也特定公開(kāi)了這些固有極限。對(duì)本發(fā)明已明確列出的數(shù)值而言，應(yīng)當(dāng)理解的是與所列數(shù)值大約相同數(shù)和量的數(shù)值也在本發(fā)明范疇內(nèi)，可將其視為基于所列數(shù)值的范圍。對(duì)本發(fā)明所公開(kāi)的組合而言，本發(fā)明也具體公開(kāi)了該組合中組分的各種亞組合，這些亞組合也在本發(fā)明范疇內(nèi)。與之相反，對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的不同組分或組分群而言，本發(fā)明也公開(kāi)了其組合。本發(fā)明的任何組分若被公開(kāi)存在多種備選物，本發(fā)明也公開(kāi)了逐一排除各備選物或與其它備選物任意組合的發(fā)明實(shí)例；可如上排除超過(guò)一種的本發(fā)明組分，因此本發(fā)明也公開(kāi)了存在上述排除的組分的所有組合。
如無(wú)另外定義或上下文另外指明，此文所用的所有技術(shù)和學(xué)術(shù)術(shù)語(yǔ)均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)任何一位普通技術(shù)人員通常理解的意思相同。雖然與此文所描述方法和材料相似或等效的任何方法和材料均可應(yīng)用在本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，本文仍然僅描述了優(yōu)選方法和材料。
此文提及的所有出版物均被合并在此作為參考，用于公開(kāi)并描述所引用參考文獻(xiàn)中的特定材料和方法。此文所論述的出版物可被提供的原因僅因?yàn)槠涔_(kāi)早于本申請(qǐng)的提交日期。此文無(wú)任何內(nèi)容可以被認(rèn)為是承認(rèn)本發(fā)明不能由于發(fā)明在先而早于該公開(kāi)內(nèi)容。
定義描述本發(fā)明的過(guò)程中，應(yīng)用到下列術(shù)語(yǔ)，但這些術(shù)語(yǔ)并不僅限于下文所指的定義。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此文中可互換使用，指任意長(zhǎng)度核苷酸的聚合形式，可包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、其類似物，或其混合物。這些術(shù)語(yǔ)僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，這些術(shù)語(yǔ)包括三鏈、雙鏈和單鏈脫氧核糖核酸(“DNA”)，以及三鏈、雙鏈和單鏈核糖核酸(“RNA”)。也包括該多核苷酸的修飾形式，例如通過(guò)烷基化和/或加帽，和未修飾形式。
無(wú)論修飾或未修飾形式，聚合的目標(biāo)核苷酸均應(yīng)具有聚陰離子主鏈，優(yōu)選的聚陰離子主鏈以糖-磷酸為基礎(chǔ)，并攜帶足以與此文所描述方法中的聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)發(fā)生靜電相互作用的負(fù)電荷，不過(guò)，其它力也可能參與該相互作用。本發(fā)明中的傳感多核苷酸的實(shí)例是肽核酸，但也可采用其它不帶電荷，且在不存在目標(biāo)的情況下與多發(fā)色團(tuán)的相互作用程度最小的多核苷酸。針對(duì)特定試驗(yàn)形式的合適雜交條件可由本領(lǐng)域任何一位技術(shù)人員確定；可調(diào)節(jié)的非限制性參數(shù)包括試驗(yàn)組分的濃度、pH、所采用的鹽及其濃度、離子強(qiáng)度、溫度等。
更具體而言，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括已剪接或未剪接的tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，任何其它類型的多核苷酸，即嘌呤或嘧啶堿基的N-或C-糖苷，和含有磷酸或其它聚陰離子主鏈的其它聚合物，和其它合成的序列特異性核酸聚合物，前提是該聚合物包含了其構(gòu)型可實(shí)現(xiàn)堿基配對(duì)和堿基堆積的核酸堿基，例如在DNA和RNA中發(fā)現(xiàn)的情況。因此，上述術(shù)語(yǔ)包括，例如，3’-脫氧-2’，5’-DNA、寡脫氧核糖核苷酸N3’P5’氨基磷酸酯、2’-O-烷基-取代RNA、雙和單鏈DNA，以及雙和單鏈RNA，和它們的雜交體，包括例如DNA與RNA之間的雜交體，也包括已知類型的修飾，例如，標(biāo)記、烷基化、“帽”、由類似物對(duì)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代，核苷酸間的修飾例如，具有帶負(fù)電荷鍵的核苷酸間修飾(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有懸垂部分的核苷酸間修飾，例如蛋白質(zhì)(包括酶(如核酸酶)、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚L-賴氨酸等)、具有嵌入劑的核苷酸間修飾(如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)、含有(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等的)螯合物的核苷酸間修飾、含有烷化劑的核苷酸間修飾、具有修飾鍵的核苷酸間修飾(如α異頭核酸等)，以及多核苷酸或寡核苷酸的未修飾形式。
應(yīng)當(dāng)意識(shí)到的是，此處所用術(shù)語(yǔ)“核苷”和“核苷酸”均包括那些不僅含有已知嘌呤和嘧啶堿基，還含有其它已修飾雜環(huán)堿基的部分。上述修飾包括甲基化嘌呤或嘧啶、?；堰驶蜞奏?，或其它雜環(huán)。修飾的核苷或核苷酸也包括糖部分的修飾，例如，其中的一個(gè)或多個(gè)羥基被取代為鹵素、脂肪族基團(tuán)，或者被官能化為醚、胺等。術(shù)語(yǔ)“核苷酸單位”包括核苷和核苷酸。
此外，對(duì)核苷酸單位的修飾包括重排、添加、取代或以其它方式改變嘌呤或嘧啶堿基上的功能基團(tuán)，從而形成了連接相應(yīng)互補(bǔ)嘧啶或嘌呤的氫鍵。所獲的修飾核苷酸單位任選地可與其它所述修飾核苷酸單位配對(duì)，而不是與A、T、C、G或U形成堿基配對(duì)。無(wú)堿基位點(diǎn)可以被摻入，而不妨礙該多核苷酸的功能；優(yōu)選的多核苷酸不包括無(wú)堿基位點(diǎn)。該多核苷酸中的某些或所有殘基均可以一種或多種方式被任選修飾。
標(biāo)準(zhǔn)A-T和G-C堿基對(duì)可在特定條件下形成，該條件下，可使胸苷的N3-H和C4-O分別與腺苷的N1和C6-NH2之間形成氫鍵，使胞苷的C2-O、N3和C4-NH2分別與鳥(niǎo)苷的C2-NH2、N’-H和C6-O之間形成氫鍵。因此，例如，鳥(niǎo)苷(2-氨基-6-氧-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)可以被修飾，從而形成異鳥(niǎo)苷(2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。這樣的修飾可產(chǎn)生將不再與胞嘧啶有效形成標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)的核苷堿基。不過(guò)，使胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧-4-氨基-嘧啶)形成異胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧-嘧啶)的修飾可產(chǎn)生將不再與鳥(niǎo)苷有效堿基配對(duì)，而將與異鳥(niǎo)苷形成堿基配對(duì)的修飾核苷酸。異胞嘧啶可從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)獲得；異胞苷可通過(guò)Switzer et al.(1993)Biochemistry 3210489-10496及其所引用參考文獻(xiàn)中的描述方法制備；2’-脫氧-5-甲基-異胞苷可通過(guò)Tor et al.(1993)J.Am.Chem.Soc.1154461-4467及其所引用參考文獻(xiàn)中的描述方法制備；異鳥(niǎo)嘌呤核苷酸可采用上述Switzeret al.(1993)和Mantsch et al.(1993)Biochem.145593-5601描述的方法制備，或者通過(guò)Collins et al.的美國(guó)專利No.5,780,610描述的方法制備。其它非天然堿基配對(duì)可通過(guò)Piccirilli et al.(1990)Nature 34333-37針對(duì)2，6-二氨基嘧啶及其互補(bǔ)體(1-甲基吡唑-[4，3]嘧啶-5，7-(4H，6H)-二酮)描述的方法合成。其它類似可形成獨(dú)特堿基配對(duì)的修飾核苷酸單位是已知的，如Leach et al.(1992)J.Am.Chem.Soc.1143675-3683和上述Switzer et al.描述的修飾核苷酸單位。
“互補(bǔ)”或“基本互補(bǔ)”指核苷酸或核酸之間，例如傳感肽核酸與目標(biāo)多核苷酸之間雜交或堿基配對(duì)的能力?；パa(bǔ)核苷酸通常是A和T(或A和U)、或C和G。對(duì)兩個(gè)單鏈多核苷酸或PNA而言，當(dāng)經(jīng)過(guò)最優(yōu)比對(duì)和比較，且存在適當(dāng)插入或缺失的一條鏈上的堿基與另一條鏈上至少大約80％，通常至少大約90％-95％，更為優(yōu)選大約98-100％的堿基配對(duì)時(shí)，便可認(rèn)定這兩個(gè)單鏈多核苷酸或PNA基本上互補(bǔ)。
可選地，當(dāng)多核苷酸或PNA在選擇性雜交條件下與其補(bǔ)體雜交時(shí)，便存在基本互補(bǔ)性。典型地，當(dāng)在超過(guò)至少14-25個(gè)堿基的范圍內(nèi)存在至少大約65％互補(bǔ)，優(yōu)選至少大約75％，更為優(yōu)選至少大約90％互補(bǔ)時(shí)，便可發(fā)生選擇性雜交。見(jiàn)M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12203(1984)。
“優(yōu)先結(jié)合”或“優(yōu)先雜交”指一個(gè)多核苷酸或PNA與樣品中的其互補(bǔ)體結(jié)合的傾向要大于其結(jié)合該樣品中非互補(bǔ)聚合物的傾向。
雜交條件典型地包括低于大約1M，更為通常的是低于大約500mM，優(yōu)選低于大約200mM的鹽濃度。在肽核酸與聚陰離子多核苷酸雜交的情況中，該雜交可在含有極少或無(wú)鹽的溶液中實(shí)現(xiàn)。雜交溫度可低至5℃，但典型地高于22℃，更為典型地高于大約30℃，優(yōu)選地超過(guò)大約37℃。較長(zhǎng)的片段可能需要較高的雜交溫度以實(shí)現(xiàn)特異性雜交。可能影響雜交嚴(yán)格性的其它因素包括堿基組成和互補(bǔ)鏈長(zhǎng)度、有機(jī)溶劑的存在和堿基錯(cuò)配的程度，所采用參數(shù)的組合比任一獨(dú)立參數(shù)的絕對(duì)度量重要?？煽刂频钠渌s交條件包括緩沖劑類型和濃度、溶液pH、用于減少背景結(jié)合的封閉試劑，如重復(fù)序列或封閉蛋白質(zhì)溶液的存在和濃度、洗滌劑類型和濃度、可提高多核苷酸相對(duì)濃度的分子，諸如聚合物，還包括金屬離子及其濃度，螯合劑及其濃度，及本領(lǐng)域已知的其它條件。
此處所用的“多路”指可同時(shí)測(cè)定多個(gè)分析物的測(cè)定或其它分析方法。
“任選”或“任選地”指后續(xù)描述的事件或情況可能或不可能發(fā)生，且該描述包括上述事件或情況發(fā)生和不發(fā)生的實(shí)例。
樣品包含或懷疑包含目標(biāo)多核苷酸的樣品的一部分可以是任意來(lái)源的生物學(xué)材料，包括可直接或間接從活生物體，包括細(xì)胞、組織或流體中獲得的多核苷酸，以及從該生物遺留的沉積物，包括病毒、支原體和化石中獲得的多核苷酸。樣品可包含全部或部分地通過(guò)合成途徑制備的目標(biāo)多核苷酸。典型地，樣品以主要為水性的介質(zhì)的形式獲得，或者分散在該主要為水性的介質(zhì)中。樣品的非限制性實(shí)例包括血、尿、精液、乳汁、痰、粘液、口腔刮片、陰道刮片、直腸刮片、吸出物、穿刺活檢物、通過(guò)例如外科或尸體解剖獲得的組織切片、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌物、淚、唾液、腫瘤、器官、體外細(xì)胞培養(yǎng)成分的樣品(包括但不僅限于通過(guò)細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而獲得的條件培養(yǎng)基、被假定感染病毒的細(xì)胞、重組細(xì)胞和細(xì)胞組分)，以及包含多核苷酸序列的重組文庫(kù)。
樣品可以是陽(yáng)性對(duì)照樣品，即已知其含有目標(biāo)多核苷酸或其替代物。陰性對(duì)照樣品也可被采用，該陰性對(duì)照樣品雖然被預(yù)期不含目標(biāo)多核苷酸，但被懷疑含有該目標(biāo)多核苷酸(被一種或多種試劑污染)或其它可產(chǎn)生假陽(yáng)性的組分，經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)以證實(shí)其未被特定實(shí)驗(yàn)中所用試劑的目標(biāo)多核苷酸污染，也需測(cè)定是否一組特定試驗(yàn)條件產(chǎn)生了假陽(yáng)性(即使在樣品中不存在目標(biāo)多核苷酸的情況下也出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào))。
樣品可被稀釋、溶解、懸浮、提取或通過(guò)其它方式處理，從而使任何存在的目標(biāo)多核苷酸溶解和/或純化，或者使其更易受擴(kuò)增方案所用試劑或檢測(cè)試劑的影響。樣品含有細(xì)胞的情況中，該細(xì)胞可被裂解或透化，從而釋放出其中的多核苷酸。可采用一步通透化緩沖劑裂解細(xì)胞，從而可以在裂解后直接進(jìn)行進(jìn)一步的步驟，例如聚合酶鏈反應(yīng)。目標(biāo)多核苷酸及其產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物目標(biāo)多核苷酸可以是單鏈、雙鏈或更高級(jí)結(jié)構(gòu)，也可以是線型或環(huán)狀。單鏈目標(biāo)多核苷酸的實(shí)例包括mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、ssRNA或ssDNA病毒基因組，但這些多核苷酸也可含有固有互補(bǔ)序列和重要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。雙鏈目標(biāo)多核苷酸的實(shí)例包括基因組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、dsRNA或dsDNA病毒基因組、質(zhì)粒、噬菌體和類病毒。目標(biāo)多核苷酸可通過(guò)合成途徑制備，或由生物學(xué)來(lái)源純化獲得。目標(biāo)多核苷酸可被純化，從而除去或減少樣品中一種或多種不被希望含有的組分，或?qū)崿F(xiàn)濃縮該目標(biāo)多核苷酸的目的。與之相反，當(dāng)該目標(biāo)多核苷酸的濃度對(duì)特定試驗(yàn)而言過(guò)高時(shí)，可稀釋該目標(biāo)多核苷酸。
在樣品收集和任選的核酸提取之后，可使包含目標(biāo)多核苷酸的樣品中的核酸部分進(jìn)行一種或多種預(yù)備反應(yīng)。這些預(yù)備反應(yīng)可包括體外轉(zhuǎn)錄(IVT)、標(biāo)記、破碎、擴(kuò)增和其它反應(yīng)。mRNA可首先經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄酶和引物的處理，從而在檢測(cè)和/或擴(kuò)增之前生成cDNA；該處理可采用純化的mRNA于體外或原位實(shí)現(xiàn)，例如在固定于載玻片的細(xì)胞或組織中。核酸擴(kuò)增增加了所關(guān)心序列，如目標(biāo)多核苷酸的拷貝數(shù)量。有多種擴(kuò)增方法均適合應(yīng)用，包括聚合酶鏈反應(yīng)方法(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)、以核酸序列為基礎(chǔ)的擴(kuò)增(NASBA)、利用Qβ復(fù)制酶、逆轉(zhuǎn)錄、切口平移等。
目標(biāo)多核苷酸為單鏈時(shí)，第一輪擴(kuò)增形成了與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。如果該目標(biāo)多核苷酸為單鏈RNA，在首次擴(kuò)增中采用了具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶，以將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，可另外進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)以拷貝該引物延伸產(chǎn)物。用于PCR的引物必須且應(yīng)當(dāng)被設(shè)計(jì)為可與其相應(yīng)模板中的區(qū)域雜交，從而生成可擴(kuò)增的片段；因此，各引物必須雜交，以使其3’核苷酸與其互補(bǔ)模板鏈中位于從特定引物的3’核苷酸的3’側(cè)的核苷酸配對(duì)，該特定引物被用于在該P(yáng)CR中擴(kuò)增互補(bǔ)模板鏈。
目標(biāo)多核苷酸典型地通過(guò)下述步驟得以擴(kuò)增，即，使該目標(biāo)多核苷酸的一條或多條鏈與引物和特定聚合酶接觸，從而生成全長(zhǎng)互補(bǔ)多核苷酸或其較小片段，其中該特定聚合酶具有可延伸上述引物并拷貝目標(biāo)多核苷酸的合適活性。任何具有可拷貝目標(biāo)多核苷酸的聚合酶活性的酶均可被采用，包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、具有超過(guò)一種類型聚合酶活性的酶，且該酶可以是不耐熱或耐熱的。也可采用這些酶的混合物。這些酶的實(shí)例包括DNA聚合酶，諸如DNA聚合酶I(“Pol I”)、Pol I的克列諾片段、T4、T7、SequenaseT7、SequenaseVersion 2.0 T7、Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli和火球菌種GB-D DNA聚合酶；RNA聚合酶，諸如大腸桿菌、SP6、T3和T7 RNA聚合酶；逆轉(zhuǎn)錄酶，諸如AMV、M-MuLV、MMLV、RNAse H-MMLV(SuperScript)、SuperScriptII、ThermoScript、HIV-1和RAV2逆轉(zhuǎn)錄酶。上述所有酶均為商業(yè)可提供的。具有多特異性的聚合酶實(shí)例包括RAV2和Tli(exo-)聚合酶。耐熱聚合酶實(shí)例包括Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli和火球茵種GB-D DNA聚合酶。
選擇合適的反應(yīng)條件以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)多核苷酸的擴(kuò)增，這些條件包括pH、緩沖劑、離子強(qiáng)度、一種或多種鹽的存在及濃度、反應(yīng)物和輔因子，如核苷酸和鎂和/或其它金屬離子(如錳)的存在及濃度、任選的共溶劑、溫度、用于包括聚合酶鏈反應(yīng)在內(nèi)的擴(kuò)增方案的熱循環(huán)流程，合適的反應(yīng)條件可部分地根據(jù)所用聚合酶以及樣品的性質(zhì)選擇。共溶劑包括甲酰胺(典型地為大約2-大約10％)、甘油(典型地為大約5-大約10％)和DMSO(典型地為大約0.9-大約10％)。擴(kuò)增方案中可采用某些技術(shù)以使擴(kuò)增期間產(chǎn)生的假陽(yáng)性或偽跡的產(chǎn)生減至最少。這些技術(shù)包括“touchdown”PCR、熱啟動(dòng)技術(shù)、利用嵌套引物或設(shè)計(jì)PCR引物使其在形成引物-二聚體時(shí)可形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，并因而不被擴(kuò)增?？墒筆CR加速的技術(shù)也可被采用，例如離心PCR，可使樣品內(nèi)實(shí)現(xiàn)較高程度的對(duì)流，也包括紅外加熱步驟以快速加熱并冷卻樣品。可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增?？衫靡环N引物的過(guò)量以在PCR期間生成過(guò)量的引物延伸產(chǎn)物；優(yōu)選地，過(guò)量產(chǎn)生的該引物延伸產(chǎn)物是待檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物。有多種不同引物均可被用于擴(kuò)增不同的目標(biāo)多核苷酸或樣品內(nèi)特定目標(biāo)多核苷酸的不同區(qū)域。
可以對(duì)擴(kuò)增的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增后處理。例如，在某些情況中，為提供更易于接受的片段，在雜交之前將目標(biāo)多核苷酸片斷化是理想的。通過(guò)可產(chǎn)生有助于試驗(yàn)進(jìn)行的某一尺寸片段的任何方法，均可使核酸斷裂；合適的物理、化學(xué)和酶促方法是本領(lǐng)域已知的。
擴(kuò)增反應(yīng)可在特定條件下進(jìn)行，該特定條件可使傳感多核苷酸在至少一部分?jǐn)U增循環(huán)期間與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。當(dāng)試驗(yàn)以該方式進(jìn)行時(shí)，通過(guò)監(jiān)控信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)發(fā)射的光的變化便可實(shí)現(xiàn)對(duì)該雜交事件的實(shí)時(shí)檢測(cè)，其中信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)的光發(fā)射在擴(kuò)增方案期間的上述雜交時(shí)發(fā)生。
聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)獲取光的多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)已被證實(shí)由于包含了多個(gè)發(fā)色團(tuán)，從而成為有效的光吸收體。其實(shí)例包括但不僅限于，共軛聚合物、綴合分子的聚集物、經(jīng)由側(cè)鏈附著飽和聚合物、半導(dǎo)體量子點(diǎn)和樹(shù)突結(jié)構(gòu)的發(fā)光染料。例如，共軛聚合物上的各重復(fù)單元均可被認(rèn)為是起作用的發(fā)色團(tuán)，量子點(diǎn)由許多原子組成，飽和聚合物可被功能化，從而在側(cè)鏈上具有多個(gè)發(fā)光染料分子，樹(shù)枝狀聚合物則可以被合成，從而含有多個(gè)共價(jià)鍵合的各個(gè)發(fā)色團(tuán)。附著在固體支持物，如聚合物珠或表面上的發(fā)色團(tuán)集合也可被用于獲取光。
獲取光的多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)可有效地將能量轉(zhuǎn)移至鄰近的發(fā)光部分(如“信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)”)。能量轉(zhuǎn)移機(jī)制包括，例如共振能轉(zhuǎn)移(Frster(或熒光)共振能轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET)、量子電荷交換(Dexter能量轉(zhuǎn)移)等。不過(guò)，典型地，上述能量轉(zhuǎn)移機(jī)制的范圍相對(duì)窄；即需要獲取光的多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)與信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)鄰近，才可有效轉(zhuǎn)移能量。在能量有效轉(zhuǎn)移的條件下，當(dāng)獲取光的多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)中的各個(gè)發(fā)色團(tuán)數(shù)量大時(shí)，便可出現(xiàn)信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)發(fā)射的放大；即當(dāng)入射光(“泵光”)的波長(zhǎng)可被獲取光的多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)吸收時(shí)，信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)的發(fā)射比該泵光直接激發(fā)信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)時(shí)的發(fā)射更為強(qiáng)烈。
共軛聚合物(CP)的特征在于非域化電子結(jié)構(gòu)，并可針對(duì)化學(xué)和生物學(xué)目的被用作高度應(yīng)答光學(xué)報(bào)道分子。19，20由于有效共軛長(zhǎng)度基本上短于該聚合物鏈的長(zhǎng)度，主鏈包含了大量鄰近的共軛片段。因此，共軛聚合物可有效獲取光并可經(jīng)由Frster能量轉(zhuǎn)移機(jī)制實(shí)現(xiàn)光學(xué)放大。21水溶性CP在帶相反電荷受體的存在情況下顯示出異常的熒光猝滅功效，這對(duì)生物學(xué)識(shí)別活動(dòng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)而言具有特殊的益處。22，23陽(yáng)離子聚電解質(zhì)與DNA之間的自發(fā)聚合物間復(fù)合已得到描述，且該復(fù)合在很大程度上是靜電力協(xié)同的結(jié)果。24，25，26芳族聚合物單位與DNA堿基之間的疏水相互作用最近也獲得了公認(rèn)。27，28聚電解質(zhì)/DNA相互作用的自由能受參與部分的結(jié)構(gòu)，以及溶液變量，諸如pH、離子強(qiáng)度和溫度的控制。29上述相互作用的強(qiáng)度和特異性最近已被調(diào)整用于識(shí)別質(zhì)粒DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)。30本發(fā)明中所用的多發(fā)色團(tuán)為聚陽(yáng)離子，因此它們可通過(guò)靜電途徑與目標(biāo)多核苷酸相互作用，并通過(guò)傳感PNA與目標(biāo)多核苷酸之間的雜交，將無(wú)電荷傳感PNA上的信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)帶入能量接收近程。任何可吸收光并將能量轉(zhuǎn)移至傳感PNA上的信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)的聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)均可應(yīng)用在本文所描述的方法中?？刹捎玫亩喟l(fā)色團(tuán)實(shí)例包括共軛聚合物(包括寡聚體)、飽和聚合物或以任一可行方式摻入了多個(gè)發(fā)色團(tuán)而形成的樹(shù)枝狀聚合物，和半導(dǎo)體納米晶體(SCNC)。可制備共軛聚合物、飽和聚合物和樹(shù)枝狀聚合物，使其摻入多個(gè)陽(yáng)離子部分，或者將其衍生化，在合成后賦予其聚陽(yáng)離子；半導(dǎo)體納米晶體可通過(guò)在其表面加入陽(yáng)離子部分從而獲得聚陽(yáng)離子。
一種優(yōu)選實(shí)施方案中，采用共軛聚合物作為聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)。一種特定實(shí)例如結(jié)構(gòu)1所示，其中陽(yáng)離子水溶性共軛聚合物為具有碘化物反陰離子的聚(9，9-雙(6’-N，N，N-三甲銨)-己基)-芴亞苯基)(下文將其表示為聚合物1)。23該聚合物的具體尺寸不重要，只要其能夠吸收光并將能量轉(zhuǎn)移給被帶至近程的信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)即可?！皀”的典型數(shù)值落在2-大約100,000的范圍內(nèi)。其具體分子結(jié)構(gòu)不重要；任何具有相對(duì)高發(fā)光量子功效的水溶性陽(yáng)離子共軛聚合物均可被采用。
水溶性結(jié)合寡聚體也可被采用作為聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)。具有碘化物反離子的水溶性、陽(yáng)離子、發(fā)光結(jié)合寡聚體的一個(gè)實(shí)例如下所示(此處將其表示為寡聚物2) 盡管較小的寡聚物2未顯示出高分子量聚合物所具有的強(qiáng)信號(hào)放大特性，但該較小分子對(duì)去卷積結(jié)構(gòu)特性關(guān)系仍然有用，該關(guān)系被發(fā)現(xiàn)在聚合物內(nèi)，具有固有的多分散性和批次間變化，因此難以測(cè)定。此外，在水性介質(zhì)中，寡聚物如2比其聚合對(duì)應(yīng)物更易溶解，且其與中性PNA的疏水相互作用對(duì)2而言不如對(duì)聚合物結(jié)構(gòu)而言重要。因此，寡聚體的集合被寄予希望具有特殊應(yīng)用。
傳感PNA本發(fā)明所提供的傳感PNA與待檢測(cè)的目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)，并具有預(yù)定序列。該傳感PNA可以具有分枝、多聚或成環(huán)，但典型的是線型，并且可含有非天然堿基。PNA的分子結(jié)構(gòu)是被熟知的。可制備PNA，使其具有任意預(yù)期的堿基序列。使信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)附著至傳感PNA的化學(xué)方法是被熟知的。10包括被綴合至發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)在內(nèi)的特定傳感PNA結(jié)構(gòu)可通過(guò)利用商業(yè)來(lái)源或化學(xué)合成的方法定制。
信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)此處所描述可應(yīng)用于本發(fā)明的發(fā)色團(tuán)包括任何可在合適溶液中吸收來(lái)源自聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)的能量并發(fā)射光的物質(zhì)。對(duì)多路試驗(yàn)而言，可采用多種不同信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)，從而具有可檢測(cè)的不同發(fā)射光譜。該發(fā)色團(tuán)可以是發(fā)光團(tuán)或熒光團(tuán)。典型的熒光團(tuán)包括熒光染料、半導(dǎo)體納米晶體、鑭系元素螯合物和綠色熒光蛋白。
熒光染料的實(shí)例包括熒光素、6-FAM、羅丹明、得克薩斯紅、四甲基羅丹明、羥基羅丹明6G、羧基對(duì)甲氨基酚、羧基羅丹明110、CascadeBlue、Cascade Yellow、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy-鉻、藻紅蛋白、PerCP(多甲藻黃素葉綠素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基熒光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、OregonGreen 514、Alexa Fluor350、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor568、AlexaFluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、AlexaFluor660、Alexa Fluor680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPYFL、BODIPYFL-Br2、BODIPY530/550、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPYR6G、BODIPYTMR、BODIPYTR、上述染料的共軛物和它們的組合。鑭系元素螯合物的實(shí)例包括銪螯合物、鋱螯合物和釤螯合物。
廣泛多種的熒光半導(dǎo)體納米晶體(“SCNC”)均是本領(lǐng)域已知的；發(fā)明者為Bawendi等人的于1999年5月27日公開(kāi)的PCT Publ.No.WO99/26299；1999年11月23日授權(quán)于Weiss等人的USPN5,990,479；以及Bruchez等人的Science 2812013，1998均描述了制備和利用半導(dǎo)體納米晶體的方法。可以獲得發(fā)射譜帶非常狹窄，且峰值發(fā)射波長(zhǎng)清晰的半導(dǎo)體納米晶體，因而可以在同一試驗(yàn)中將大量的不同SCNC作為信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)應(yīng)用，并任選地結(jié)合其它非SCNC型的信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“綠色熒光蛋白”指天然的Aequorea綠色熒光蛋白及其突變形式，該突變形式已被鑒定為表現(xiàn)出了已更改的熒光特性，包括更改的激發(fā)和發(fā)射最大值，以及不同形態(tài)的激發(fā)和發(fā)射光譜(Delagrave，S.et al.(1995)Bio/Technology 13151-154；Heim，R.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112501-12504；Heim，R.et al.(1995)Nature 373663-664)。Delgrave等人分離了具有紅移激發(fā)光譜的克隆Aequorea victoria GFP突變體。Bio/Technology13151-154(1995)。Heim，R.等人報(bào)道了具有藍(lán)色熒光的突變體(Tyr66-His)(Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)USA 9112501-12504)。
基質(zhì)基質(zhì)可包括廣泛的生物學(xué)、非生物學(xué)、有機(jī)或無(wú)機(jī)材料，或這些材料的任意組合。例如，基質(zhì)可以是聚合的Langmuir Blodgett膠片、官能化玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅或廣泛多種凝膠或聚合物中的任意一種，如(聚)四氟乙烯、(聚)亞乙烯基二氟化物、聚苯乙烯、交聯(lián)聚苯乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(丙交酯-共乙交酯)、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚硅氧烷、聚合硅石、乳膠、葡聚糖聚合物、環(huán)氧樹(shù)脂、聚碳酸酯或上述材料的組合。傳導(dǎo)聚合物和光導(dǎo)材料也可被采用。
基質(zhì)可以是平面晶狀基質(zhì)，如硅基基質(zhì)(如玻璃、石英等)，或應(yīng)用在例如半導(dǎo)體和微處理機(jī)工業(yè)中的晶體，如硅、砷化鎵、摻銦GaN等，也包括半導(dǎo)體納米晶體。
基質(zhì)可采用的形式包括發(fā)光二極管、諸如光電半導(dǎo)體芯片或光電薄膜半導(dǎo)體的光電傳感器，或生物芯片。該基質(zhì)上各個(gè)傳感多核苷酸的定位可以是可尋址的；可以高度密集形式實(shí)現(xiàn)編址，且該定位可以是可微尋址或可毫微尋址的。
二氧化硅氣凝膠也可被采用作為基質(zhì)，并可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備。氣凝膠基質(zhì)可被采用作為獨(dú)立式基質(zhì)或作為表面被涂布于另一種基質(zhì)材料上。
該基質(zhì)可采用任何形態(tài)，典型的形態(tài)是平板、載玻片、珠、小球、圓片、顆粒、微粒、納米顆粒、鏈狀體、沉淀，任選的是多孔凝膠、薄片、管、球體、容器、毛細(xì)管、墊板、切片、膠片、芯片、多孔平板或皿、光學(xué)纖維等。該基質(zhì)可以是剛性或半剛性的任意形式。該基質(zhì)可含有凸起或凹陷的區(qū)域，且該區(qū)域上可定位傳感多核苷酸或其它試驗(yàn)組分。可采用熟知的技術(shù)蝕刻該基質(zhì)表面，從而提供理想的表面特征，例如溝槽、v形槽、臺(tái)面結(jié)構(gòu)等。
基質(zhì)表面可由與該基質(zhì)相同的材料組成，或者由與該基質(zhì)不同的材料制成，并通過(guò)化學(xué)或物理途徑與基質(zhì)偶聯(lián)。該偶聯(lián)表面可由任意廣泛多種材料組成，例如，聚合物、塑料、樹(shù)脂、多糖、硅石或硅基材料、碳、金屬、無(wú)機(jī)玻璃、膜或任意一種上述基質(zhì)材料。該表面可以是光學(xué)透明的，并可具有表面Si-OH功能，如同在硅石表面發(fā)現(xiàn)的情況那樣。
選擇基質(zhì)和/或其任選表面，可為所采用的合成和/或檢測(cè)方法提供合適的光學(xué)特性。基質(zhì)和/或表面可以是透明的，可使該基質(zhì)暴露于多個(gè)方向施加的光。基質(zhì)和/或表面也可具有反射“鏡”結(jié)構(gòu)，從而提高光的回收。
基質(zhì)和/或其表面通常對(duì)其暴露所處的條件具有抗性，或者在經(jīng)過(guò)處理后而具有該抗性，也可任選地經(jīng)過(guò)處理，以在其暴露于上述條件后除去抗性材料。
傳感多核苷酸可通過(guò)任何合適方法被裝配或附著至基質(zhì)上，這些方法例如美國(guó)專利No.5,143,854、PCT Publ.No.WO 92/10092、1990年12月6日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)Ser.No.07/624,120(現(xiàn)已放棄)、Fodor et al.，Science，251767-777(1991)以及PCT Publ.No.WO 90/15070中描述的方法。采用機(jī)械合成方案合成上述陣列的技術(shù)在例如PCT出版物No.WO 93/09668和美國(guó)專利No.5,384,261中有所描述。
還有更多的技術(shù)包括基于珠的技術(shù)，如PCT申請(qǐng)No.PCT/US93/04145所描述的技術(shù)，和基于針的方法，如美國(guó)專利No.5,288,514中所描述的方法。
1992年11月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)Ser.No.07/980,523和美國(guó)專利No.5,384,261中描述了可用于使傳感多核苷酸附著基質(zhì)的其它流動(dòng)通路或點(diǎn)樣方法。試劑通過(guò)(1)在預(yù)定區(qū)域上限定的通路內(nèi)流動(dòng)或(2)將其“點(diǎn)樣”在預(yù)定區(qū)域上而被送遞至基質(zhì)。保護(hù)性涂層，如親水或疏水涂層(取決于溶劑的性質(zhì))可被用于覆蓋需保護(hù)的基質(zhì)部分，某些情況下還結(jié)合應(yīng)用有助于反應(yīng)物溶液潤(rùn)濕其它區(qū)域的材料。通過(guò)該方式，可進(jìn)一步地避免流動(dòng)的溶液流出其已被設(shè)定的流程。
典型分液器包括微量加樣器，任選自動(dòng)控制的微量加樣器，噴墨打印機(jī)、一系列管子、集合管、移液管陣列等，從而可將多種試劑連續(xù)或同時(shí)送遞至反應(yīng)區(qū)域。
發(fā)色團(tuán)的激發(fā)和檢測(cè)任何可提供特定波長(zhǎng)的儀器均可被采用并用于激發(fā)，其中該特定波長(zhǎng)可激發(fā)聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)，且短于需檢測(cè)的發(fā)射波長(zhǎng)。優(yōu)選的激發(fā)源不顯著地直接激發(fā)信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)。該來(lái)源可以是寬帶UV光源，如具有合適濾光器的氘燈，白光源，如氙燈或氘燈在通過(guò)單色器并提取出預(yù)期波長(zhǎng)后的輸出、連續(xù)波(cw)氣體激光器、固態(tài)二極管激光器或任何脈沖激光器。信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)來(lái)源的發(fā)射光可借助于任何合適的裝置或技術(shù)得以檢測(cè)；本領(lǐng)域已知了多種合適方法。例如，可采用熒光計(jì)或分光光度計(jì)檢測(cè)試樣是否在多發(fā)色團(tuán)的激發(fā)基礎(chǔ)上發(fā)射具有信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)波長(zhǎng)特征的光。
試劑盒本發(fā)明也提供了包含有助于進(jìn)行本發(fā)明方法的試劑的試劑盒。一種實(shí)施方案中，試劑盒包含與所關(guān)心的目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的單鏈傳感PNA，和聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)。傳感PNA被綴合至信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)。在樣品中存在目標(biāo)多核苷酸的情況下，傳感PNA與目標(biāo)雜交后時(shí)帶至鄰近多發(fā)色團(tuán)的近程，從而與聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)靜電締合。
試劑盒的組分可保存在外殼內(nèi)。有關(guān)利用該試劑盒實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的說(shuō)明書可與外殼一起提供，也可被提供在任何固定介質(zhì)中。該說(shuō)明書可位于外殼內(nèi)或外，并且可被打印在形成該外殼的任何表面內(nèi)部或外部，從而使該說(shuō)明書易于閱讀。該試劑盒可以是多路形式，含有多份可與相應(yīng)的不同目標(biāo)多核苷酸雜交的一種或多種不同傳感PNA。
實(shí)施例下文所述實(shí)施例可向本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員提供有關(guān)如何進(jìn)行并利用本發(fā)明的完整描述，并對(duì)本發(fā)明的范疇不構(gòu)成限制。就所用的數(shù)字(如含量、溫度等)而言，本發(fā)明者已努力確保其準(zhǔn)確性，但仍應(yīng)考慮到某些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。如無(wú)另外指出，份為重量份，溫度為攝氏度，壓力為大氣壓或接近大氣壓，且所有材料均為商業(yè)可提供的。
實(shí)施例1.鑒定多發(fā)色團(tuán)/信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)對(duì)的FRET采用陽(yáng)離子水溶性共軛聚合物聚(9，9-雙(6’-N，N，N-三甲基銨)-己基)-芴亞苯基)、即如23所述制備的具有碘化物反陰離子的聚合物1，和具有序列5’-CAGTCCAGTGATACG-3’并與熒光素(C*)于5’位綴合的傳感肽核酸PNA-C*，驗(yàn)證將能量從獲取光的多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至傳感PNA上的信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)的能力。聚合物1和傳感肽核酸PNA-C*各自的吸收(綠色和橙色)和發(fā)射(藍(lán)色和紅色)光譜如圖2所示。1和PNA-C*分別于380和480nm處實(shí)現(xiàn)激發(fā)。數(shù)據(jù)顯示對(duì)聚合物1的特異性激發(fā)而言，存在一個(gè)光學(xué)窗。此外，在聚合物1的發(fā)射與C*的吸收之間存在極佳的重疊，從而可以實(shí)現(xiàn)FRET。31實(shí)施例2.目標(biāo)多核苷酸存在條件下FRET的驗(yàn)證無(wú)聚合物1時(shí)，在獨(dú)立容器內(nèi)，使PNA-C*探針([PNA-C*]＝2.5×10-8M)與等摩爾量的互補(bǔ)15堿基對(duì)ssDNA，即(5’-CGTATCACTGGACTG-3’)3接觸，并以相同方式使其與非互補(bǔ)15堿基ssDNA，即(5’-ACTGACGATAGACTG-3’)4接觸。退火步驟在無(wú)緩沖劑，即低離子強(qiáng)度，且在比PNA-C*的Tm低2℃的條件(72℃、10-8M、pH＝5.5)下進(jìn)行。32，33隨后進(jìn)行解鏈試驗(yàn)，并利用UV/Vis分光光度計(jì)于260nm處監(jiān)測(cè)吸光度。18提高溫度可導(dǎo)致含互補(bǔ)ssDNA樣品中的雜交雙鏈體解鏈時(shí)的吸光度升高，因?yàn)閮蓷l單鏈的吸收遠(yuǎn)高于雜交雙鏈體。與預(yù)期結(jié)果一致，含非互補(bǔ)ssDNA的樣品未顯示存在上述的吸光度升高，因?yàn)樵摌悠分形葱纬呻p鏈體。
在含有互補(bǔ)和非互補(bǔ)ssDNA以及聚合物1([1]＝2.3×10-7M)的退火樣品中測(cè)定FRET。在聚合物1的激發(fā)時(shí)，以及存在互補(bǔ)(紅色)和非互補(bǔ)(黑色)DNA的條件下，PNA-C*的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)射光譜如圖3所示。檢測(cè)到PNA/DNA雜交體的FRET比例比非互補(bǔ)對(duì)情況高11倍以上。34該FRET差異證實(shí)本發(fā)明公開(kāi)方法對(duì)特定目標(biāo)多核苷酸具有特異性。此外，熒光素發(fā)射比無(wú)聚合物1存在下直接C*激發(fā)所獲得的發(fā)射高8倍以上。35在含有傳感PNA、目標(biāo)多核苷酸和聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移復(fù)合體中，提高的C*發(fā)射說(shuō)明光學(xué)放大由多發(fā)色團(tuán)(聚合物1)提供。該敏化受體發(fā)射被證實(shí)僅發(fā)生在互補(bǔ)目標(biāo)多核苷酸存在條件下。
實(shí)施例3.能量轉(zhuǎn)移的最優(yōu)化通過(guò)改變化合物1與PNA-C*的比例最優(yōu)化能量轉(zhuǎn)移。在[PNA-C*]＝2.5×10-8的濃度條件下，最初加入化合物1可立即提高FRET比例。當(dāng)[1]遠(yuǎn)大于[PNA-C*]時(shí)，觀測(cè)到FRET降低。根據(jù)之前已公開(kāi)的分子量數(shù)據(jù)可知FRET比例的最大值相當(dāng)于聚合物鏈與PNA鏈大約1∶1的比例。23該關(guān)聯(lián)是被預(yù)期的，因?yàn)楫?dāng)[1]/[PNA-C*]＜1時(shí)，并非所有的ssDNA/PNA-C*雜交體鏈均可被有效地復(fù)合至獨(dú)立聚合物鏈上。與之相反，在[1]/[PNA-C*]＞1方案中，并非所有由1(供體)產(chǎn)生的光子均可被轉(zhuǎn)移至DNA/PNA-C*雜交體(受體)。應(yīng)當(dāng)指出的是，飽和點(diǎn)處的C*發(fā)射比通過(guò)直接C*激發(fā)(480nm)所獲的發(fā)射高25倍以上，從而進(jìn)一步證明信號(hào)放大由聚合物1的多發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)提供。
實(shí)施例4.有機(jī)溶劑在降低背景信號(hào)傳遞方面的應(yīng)用圖3的驗(yàn)證結(jié)果顯示了來(lái)源自未雜交PNA探針的微弱熒光素信號(hào)，該信號(hào)可能是1與PNA-C*之間疏水相互作用的結(jié)果。36將乙醇加入試驗(yàn)溶液，至最終濃度10％乙醇，在與實(shí)施例2所示實(shí)驗(yàn)一致的條件下，導(dǎo)致背景C*發(fā)射降低。有機(jī)溶劑的存在降低了疏水相互作用，并降低背景C*發(fā)射3個(gè)系數(shù)，在該點(diǎn)上的背景信號(hào)幾乎難以利用標(biāo)準(zhǔn)熒光計(jì)檢測(cè)。
實(shí)施例5.利用第二聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)對(duì)目標(biāo)多核苷酸的檢測(cè)采用如23所述方法制備平均n＝2的水溶性結(jié)合寡聚體2作為獲取光的發(fā)色團(tuán)。PNA-C*在寡聚物2激發(fā)時(shí)，在互補(bǔ)(紅色)和非互補(bǔ)(黑色)DNA存在條件下的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)射光譜如圖4所示。如實(shí)施例2所述方法進(jìn)行該試驗(yàn)，且[2]＝6.7×10-8M，[PNA-C*]＝2.5×10-8M。圖4顯示僅當(dāng)互補(bǔ)目標(biāo)多核苷酸存在的情況下才檢測(cè)到C*發(fā)射。圖3與4的比較證實(shí)利用具有較高分子量的共軛聚合物(寡聚物)可導(dǎo)致較高的FRET比例。因此，預(yù)計(jì)采用分子量高于上述實(shí)施例的聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)可獲得顯著更高的FRET比例和相應(yīng)更高的靈敏度。
盡管已根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明的某些細(xì)節(jié)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員仍應(yīng)理解的是，可以在不偏離本發(fā)明精神和范疇的前提下對(duì)此處所描述的方法進(jìn)行某些改動(dòng)和改進(jìn)。因此，本發(fā)明僅受權(quán)利要求的限定。
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33 An interactive version of reference 28 can be found at applied biosystema custom probe designer web sitewww.appliedbiosystems.com/cgi-bin/calculator/ab_conflgured/oligodesigner/designer.cgi34 The FRET ratio is defined as the integrated acceptor emission over the integrated emission of the donor.
35 Fluorcscein at pH＝5.5 is not in its high quantum yield dianionic form，thus we would expect higher C*emission at higher pH，but at theexpence of charge neutrality on the PNA-C*complex.
36 Gaylord，B.S.；Wang，S.；Heeger，A.J.；Bazan，G.C.J.Am.Chem.Soc.2001 123 6417.
37 PTI Quantum Master fluorimeter equipped with a Xenon lamp excitation source and a Hamamatsu PMT.
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定方法，包括提供被懷疑含有目標(biāo)多核苷酸的樣品；提供可與目標(biāo)多核苷酸發(fā)生靜電相互作用，并在激發(fā)可將能量轉(zhuǎn)移至信號(hào)傳遞傳遞發(fā)色團(tuán)的聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)；提供單鏈形式并與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的傳感肽核酸(PNA)，該傳感PNA與信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)綴合；使樣品在特定條件下與溶液中的傳感PNA和多發(fā)色團(tuán)接觸，其中在上述條件下，如果存在目標(biāo)多核苷酸，傳感PNA可與其雜交；向上述溶液施加可激發(fā)多發(fā)色團(tuán)的光源；并檢測(cè)是否由信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)發(fā)射光。
2.權(quán)利要求1的方法，其中多發(fā)色團(tuán)包括選自飽和聚合物、共軛聚合物、樹(shù)枝狀聚合物和半導(dǎo)體納米晶體的結(jié)構(gòu)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中多發(fā)色團(tuán)包括飽和聚合物。
4.權(quán)利要求2的方法，其中多發(fā)色團(tuán)包括樹(shù)枝狀聚合物。
5.權(quán)利要求2的方法，其中多發(fā)色團(tuán)包括半導(dǎo)體納米晶體。
6.權(quán)利要求2的方法，其中多發(fā)色團(tuán)包括共軛聚合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中共軛聚合物具有如下結(jié)構(gòu)
8.權(quán)利要求6的方法，其中共軛聚合物具有如下結(jié)構(gòu)
9.權(quán)利要求1的方法，其中樣品與配比大約為1∶1的傳感PNA和多發(fā)色團(tuán)接觸。
10.權(quán)利要求1的方法，其中樣品在足量有機(jī)溶劑的存在條件下，與傳感PNA和多發(fā)色團(tuán)接觸，上述有機(jī)溶劑的量足以降低傳感PNA與多發(fā)色團(tuán)之間的疏水相互作用。
11.權(quán)利要求1的方法，其中樣品與具有相應(yīng)不同序列的多種不同傳感PNA接觸，該不同傳感PNA包含相應(yīng)的不同信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)，其中上述不同傳感PNA中的每一個(gè)均可與相應(yīng)的不同目標(biāo)多核苷酸選擇性地雜交。
12.權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)色團(tuán)為熒光團(tuán)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中熒光團(tuán)選自半導(dǎo)體納米晶體、熒光染料和鑭系金屬螯合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中熒光團(tuán)為半導(dǎo)體納米晶體。
15.權(quán)利要求13的方法，其中熒光團(tuán)為熒光染料。
16.權(quán)利要求15的方法，其中熒光染料為熒光素。
17.權(quán)利要求13的方法，其中熒光團(tuán)為鑭系金屬螯合物。
18.權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)多核苷酸為DNA。
19.權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)多核苷酸為RNA。
20.權(quán)利要求1的方法，其中樣品包含單鏈目標(biāo)多核苷酸。
21.權(quán)利要求1的方法，其中樣品包含雙鏈目標(biāo)多核苷酸。
22.權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)多核苷酸是通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)而得以制備的。
23.一種多核苷酸感測(cè)液，包含一種單鏈形式，并與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的傳感肽核酸(PNA)，該傳感PNA與信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)結(jié)合；一種聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)，可與目標(biāo)多核苷酸的磷酸主鏈發(fā)生靜電相互作用，且當(dāng)其在傳感PNA與目標(biāo)多核苷酸雜交時(shí)被帶入近程時(shí)，可在激發(fā)時(shí)將能量轉(zhuǎn)移至信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)。
24.一種用于測(cè)定樣品中的目標(biāo)多核苷酸的試劑盒，包括一種單鏈形式，并與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的傳感肽核酸(PNA)，該傳感PNA與信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)結(jié)合；和一種聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)，可與目標(biāo)多核苷酸的磷酸主鏈發(fā)生靜電相互作用，且當(dāng)其在傳感PNA與目標(biāo)多核苷酸雜交時(shí)被帶入近程時(shí)，可在激發(fā)時(shí)將能量轉(zhuǎn)移至信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)。
25.權(quán)利要求1的方法，其中由信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)發(fā)射的超過(guò)閾值水平的光，說(shuō)明樣品中存在目標(biāo)多核苷酸。
26.權(quán)利要求1的方法，其中由信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)發(fā)射的光被定量，并用于測(cè)定樣品中目標(biāo)多核苷酸的量。
27.權(quán)利要求12的方法，其中熒光團(tuán)為綠色熒光蛋白。
28.權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)多核苷酸未被擴(kuò)增。
29.權(quán)利要求1的方法，其中該方法在基質(zhì)上進(jìn)行。
30.權(quán)利要求29的方法，其中基質(zhì)與多種不同的傳感PNA綴合。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于測(cè)定樣品中的目標(biāo)多核苷酸的方法、組合物和物品。使被懷疑含有目標(biāo)多核苷酸的樣品與聚陽(yáng)離子多發(fā)色團(tuán)和互補(bǔ)于目標(biāo)多核苷酸的傳感PNA接觸。該傳感PNA包含信號(hào)傳遞發(fā)色團(tuán)，可吸收來(lái)源自受激發(fā)多發(fā)色團(tuán)的能量，并在目標(biāo)多核苷酸的存在條件下發(fā)射光。本發(fā)明方法可以多路形式應(yīng)用。本發(fā)明也提供了包含可實(shí)現(xiàn)上述方法的試劑的試劑盒。
文檔編號(hào)C08G63/48GK1675377SQ03819836
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
發(fā)明者G·C·巴贊, B·S·蓋洛德 申請(qǐng)人:加州大學(xué)評(píng)議會(huì)