專利名稱：編碼野生型cop1基因及其螺旋結(jié)構(gòu)域的植物和植物細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上有關(guān)于幼苗的制備，該幼苗表現(xiàn)出更好的出芽特性和在低光條件下改善的生長(zhǎng)。本發(fā)明尤其有關(guān)于改變植物細(xì)胞的基因型以引入編碼COP1蛋白中螺旋結(jié)構(gòu)域的序列。
背景技術(shù)：
這里的所有出版物和專利申請(qǐng)都是以同樣的程度作為參考被引入，就像每一個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)均特定地單獨(dú)指出是參考引入的。
在光形態(tài)建成的過(guò)程中，光為植物提供能量來(lái)源并最終提供給所有的生物。光環(huán)境在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起到重要的作用。除了作為能量的來(lái)源，光提供信號(hào)用于調(diào)控許多復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程。至少有三個(gè)光受體家族涉及這些光調(diào)控發(fā)育過(guò)程，它們分別是光敏素(紅光和紅外光)，藍(lán)光受體和紫外光受體。由特定光受體接受的光信號(hào)通過(guò)信號(hào)成分傳導(dǎo)以產(chǎn)生多種下游生理反應(yīng)，包括種子發(fā)芽，莖伸長(zhǎng)、葉綠體和葉子發(fā)生，花誘導(dǎo)以及許多光調(diào)控核基因和葉綠體編碼基因的協(xié)同表達(dá)。
作為對(duì)于變化的環(huán)境的反應(yīng)，固定的植株必須能夠感受變化的光信號(hào)以優(yōu)化生長(zhǎng)和發(fā)育，高等植物具有復(fù)雜的光感受和信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)用于監(jiān)控光信號(hào)的方向、數(shù)量和性質(zhì)以調(diào)節(jié)自身的生長(zhǎng)和發(fā)育，這種調(diào)節(jié)是通過(guò)調(diào)控它們生活周期每一個(gè)階段的基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的、例如發(fā)芽，幼苗發(fā)生和開(kāi)花。這些光調(diào)控的發(fā)育過(guò)程總稱為光形態(tài)建成。
植物發(fā)育是一個(gè)高度可塑的過(guò)程，它受到環(huán)境因子，尤其是光的強(qiáng)烈影響，光對(duì)植物發(fā)育的影響在幼苗時(shí)期非常地顯著(Kendrickand Kronenberg，1994，McNellis and Deng，1995)。與生長(zhǎng)于光下的植株相比，那些在黑暗中生長(zhǎng)的植株顏色發(fā)白或發(fā)黃，結(jié)間部較長(zhǎng)，葉片變得很小，根系統(tǒng)發(fā)育不良。這種情況叫做黃萎現(xiàn)象。當(dāng)然，當(dāng)它們儲(chǔ)備的食物用盡時(shí)，黃萎的幼苗就會(huì)停止生長(zhǎng)。雖然效果沒(méi)有黑暗中生長(zhǎng)的植株那么明顯，在低光條件下生長(zhǎng)的植株同樣會(huì)出現(xiàn)黃萎現(xiàn)象。
自然情況下的光環(huán)境是復(fù)雜的。未經(jīng)阻擋的日光包含一個(gè)較寬的光子波長(zhǎng)連續(xù)譜，該譜很方便地分成三個(gè)大的光譜區(qū)域紫外(＜400nm)，可見(jiàn)(400到700nm)和紅外(＞700nm)光。根據(jù)地點(diǎn)和一天中時(shí)間的不同，光譜特性或相對(duì)光子不同波長(zhǎng)分布可以有很大的變化。例如，在天蓬內(nèi)，可見(jiàn)和紫外區(qū)域的光基本都被吸收，剩下的主要是紅外光。另外，黎明和黃昏時(shí)紅外光對(duì)紅光的比例一般比白天高。雖然高等植物僅僅有效利用可見(jiàn)光進(jìn)行光合作用，它們有能力對(duì)一個(gè)寬得多的光譜范圍產(chǎn)生感應(yīng)和應(yīng)答，包括紫外和紅外光。
在諸如光合作用的光化學(xué)過(guò)程中，最終產(chǎn)物主要決定于吸收量子的數(shù)目而不是吸收的總光能。例如，在光合作用中一個(gè)單獨(dú)的紅光子和一個(gè)單獨(dú)的藍(lán)光子效果一樣，雖然藍(lán)光子具有更多的能量。因此，在最近的著作中，提到單位時(shí)間單位面積上的光子數(shù)目成為很普通的事。經(jīng)常使用Einsteins(對(duì)光合作用)或micro Einstein(對(duì)低光反應(yīng))。仲夏白天的空地上每秒每平方米可接受多達(dá)2000micioEinstein，而在同一地區(qū)的熒光燈室內(nèi)每秒每平方米只能接受50到100micro Einstein。當(dāng)空地受到霧、云或雨的遮避，它可能比室內(nèi)單位時(shí)間單位面積接受的光子還要少。
一般情況下，無(wú)光會(huì)增快，有光會(huì)減慢莖伸長(zhǎng)的速率。在自然條件下，與黃萎現(xiàn)象相關(guān)的特點(diǎn)保證嫩枝盡快地伸向光。這樣一種對(duì)完全缺光的生理和形態(tài)建成反應(yīng)對(duì)于幼苗的生長(zhǎng)和最終出土非常重要，使其能夠從種子種植的土壤或其他生長(zhǎng)介質(zhì)中生長(zhǎng)出來(lái)。
一旦幼苗成功地從土壤或其他生長(zhǎng)介質(zhì)中長(zhǎng)出，黃萎過(guò)程不一定會(huì)停止。在很多種植物中，如果夜間溫度降得不是很低的話，嫩枝的生長(zhǎng)有一種夜間-白天的節(jié)奏-夜間生長(zhǎng)比白天快。在完全光下生長(zhǎng)的植株擁有比陰影下生長(zhǎng)的植株較短和較強(qiáng)壯的莖還有稍微密集的葉片。植物密集的一種結(jié)果是它們所處的光強(qiáng)減小。為了獲得更高的光水平，陰影中的植物生長(zhǎng)出相對(duì)較長(zhǎng)和較細(xì)的莖。這樣，在某些情況下，黃萎現(xiàn)象可以看作一種生存策略。
然而，在一些低自然光的條件下，如連續(xù)的霧、云或雨天或者溫室中無(wú)法提供高水平的人工光，黃萎可能導(dǎo)致耕種問(wèn)題。例如黃萎的幼苗容易倒伏，產(chǎn)生的植株較弱，易受害蟲侵害，如蚜蟲和蜘蛛螨蟲，容易受到環(huán)境干擾，如風(fēng)或被水浸透的盆或田地。在這樣的情況下，黃萎的幼苗可能發(fā)育成不太有活力的成年植株，產(chǎn)生較少的生殖結(jié)構(gòu)和后代，甚至不育。如果大量的幼苗和植株受到黃萎現(xiàn)象的不利影響，就可能會(huì)導(dǎo)致特定植物單產(chǎn)的降低。例如，如果幼苗黃萎最終形成細(xì)長(zhǎng)的蕃茄植株，每公頃或英畝的蕃茄果實(shí)產(chǎn)量可能會(huì)顯著地降低。由于嫩枝的倒伏導(dǎo)致光合作用活性的降低，進(jìn)而使果實(shí)變小。由于果實(shí)與土壤接觸，導(dǎo)致果實(shí)腐爛大量增多，使害蟲更易進(jìn)入，導(dǎo)致更嚴(yán)重的病蟲害。雖然細(xì)長(zhǎng)的蕃茄植株可以通過(guò)架設(shè)棚架、木柱或支架得到支撐，然而這些補(bǔ)救措施非常消耗勞力和昂貴。另外，這種增加的“人工處理”會(huì)導(dǎo)致植株的更一進(jìn)損害和果實(shí)墜落。
雖然貫穿植物的生活史，但植株對(duì)光的反應(yīng)在幼苗期尤為明顯。擬南芥(Arabiolopsis thaliana)早期幼苗形成提供了一個(gè)很好的模式系統(tǒng)用于研究植物中的光信號(hào)傳導(dǎo)通路。作為一種典型的雙子葉植物，擬南芥的幼苗有兩種不同的發(fā)育方式，即在黑暗下的暗形態(tài)建成和在光下的光形態(tài)建成。這樣，擬南芥在有光和無(wú)光的條件下表現(xiàn)出不同的發(fā)育方式。為了選擇和鑒定擬南芥的晚發(fā)芽突變體，Michelle Stopper和James J Campanella(Arabidopsis thalianaDatabase，http//genome.www.stanford.edu/Arabidopsis)使用了高密度的光條件，每秒每平方米大約450 mieroEinsteins和低密度的光條件，每秒每平方米大約100 mieroEinstein。
在正常的光條件下，幼苗遵循光形態(tài)建成發(fā)育，這種發(fā)育方式有如下特點(diǎn)下胚軸伸長(zhǎng)抑制，展開(kāi)的子葉形成，葉綠體的生物發(fā)生和光誘導(dǎo)的基因的表達(dá)。
而在黑暗中，幼苗黃萎，表現(xiàn)出伸長(zhǎng)的下胚軸，緊閉未展開(kāi)的子葉和頂端的鉤。同時(shí)，光誘導(dǎo)的基因受到抑制，在黑暗中質(zhì)體發(fā)育成非光合作用的病質(zhì)體。這一發(fā)育行為是可塑和可逆的；黃萎的植株可對(duì)新來(lái)的光刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈的反應(yīng)并且啟動(dòng)光形態(tài)建成(參見(jiàn)Chory1993，McNellis and Deng，1995)。
在黑暗中生長(zhǎng)典型的生理和形態(tài)建成反應(yīng)(即，伸長(zhǎng)的下胚軸，緊閉未展開(kāi)的子葉和頂端的鉤)有利于幼苗在土壤中生長(zhǎng)并穿過(guò)土壤表面。這種自然幼苗生長(zhǎng)對(duì)于深耕種子的幼苗則更為重要。如果子葉在土壤內(nèi)就打開(kāi)和伸展，增大的土壤阻力會(huì)阻礙幼苗進(jìn)一步向上生長(zhǎng)，需要幼苗提供更多的能量以繼續(xù)上長(zhǎng)，這種過(guò)早的子葉伸展和增加的物理阻力可能導(dǎo)致子葉損傷或者在幼苗出土之前，食物儲(chǔ)備已經(jīng)用盡。
如前所述，光形態(tài)建成發(fā)育取決于植物能夠探測(cè)光信號(hào)，至少存在三個(gè)光受體家族，光敏素(紅光和紅外光)，藍(lán)光受體，和紫外光受體，用于感受不同波長(zhǎng)的光。由這些受體傳導(dǎo)的信號(hào)協(xié)同調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄。
現(xiàn)在還不能完全了解光刺激被多種光受體接受后如何傳導(dǎo)并整合以影響發(fā)育程序。如果植物探測(cè)光信號(hào)的能力受到損害，如當(dāng)光受體因突變而被中斷，則生長(zhǎng)的幼苗采取一種有點(diǎn)黃萎的發(fā)育方式。依據(jù)對(duì)光條件下黃萎表現(xiàn)型幼苗或完全黑暗下光形態(tài)建成表現(xiàn)型擬南芥幼苗的遺傳篩選，鑒定出大量的參與控制幼苗發(fā)育的光信號(hào)傳導(dǎo)成分(參見(jiàn)McNellis and Deng，1995)。
第一類突變幼苗具降低的光反應(yīng)性，顯示特征性的長(zhǎng)下胚軸表現(xiàn)型，這類突變體提出了光形態(tài)建成包括光受體的正調(diào)節(jié)物(如phyA，phyB和hy4)，還提出了作用于特定光受體(如fhy1，fhy3和red1)或多個(gè)光受體(如hy5)下游的成分的正調(diào)節(jié)物。(Chory 1992；Whitelametal.，1993；Wagner et al.，1997)。例如，光敏素A基因(PHYA)基因的突變導(dǎo)致對(duì)紅外光信號(hào)反應(yīng)性的降低(Dehesh et al.，1993；Nagatani et al.，1993；Porks and Quail，1993；Whitelamet al.，1993)；光敏素B基因(PHYB)的突變會(huì)導(dǎo)致對(duì)紅光刺激反應(yīng)性的降低(Reed et al.，1993；Wester et al.，1994)；一種公認(rèn)的藍(lán)光受體基因，HY4的突變導(dǎo)致對(duì)藍(lán)光反應(yīng)性的降低(AhmadandCashmore，1993)。在一定的光條件下，這些帶有降低了光反應(yīng)性的phyA，phyB和hy4突變體表現(xiàn)癥狀為長(zhǎng)下胚軸和子葉伸展減少(Koornneeff et al.，1980；McNellis et al.，1994)。另一方面，光受體過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致對(duì)其主要吸收的光的光譜特性產(chǎn)生過(guò)敏。例如，PHYB的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致對(duì)紅光的過(guò)敏(Wagner et al.，1991；McCormac etal.，1993)；PHYA的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致對(duì)紅外光和紅光的過(guò)敏(Boylan andQuail，1991；McCormac et al.，1991，1992，1993；While lam etal.，1992)，由HY4編碼的藍(lán)光受體CRYDTOCHROME1(CRY1)的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致對(duì)藍(lán)光，UV-A和綠光的過(guò)敏(Lin et al.，1995)。因?yàn)楣鈱?duì)植物生存的重要性，植物形成的多種光受體具有部分重復(fù)的功能有一定意義。這些光受體共同工作以監(jiān)視光信號(hào)，任何一類光受體的刺激似乎都足以獨(dú)立誘導(dǎo)幼苗光形成建成的許多方面(Kendrick andKronenberg，1994；McNellis and Deng，1995)。
一些很好的綜述更廣泛地論述了光受體光敏素(Quail，1991；Furuya，1993；Viestra，1993)，基因表達(dá)的光調(diào)控(Gilmartin etal.，1990；Thompson and White，1991；Kar fman，1993)和光形態(tài)建成突變(Chory，1993)。
最近HY5的分子鑒定為一種bZIP轉(zhuǎn)錄因子也許能提供一種方法連結(jié)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和基因表達(dá)的調(diào)控(Oyama et al.，1997)。
第二類突變體為那些表現(xiàn)為組成型光形態(tài)建成的突變體，即組成型光形態(tài)建成的(cop)，去黃萎化的(det)和fusca(fus)突變體(綜述Wei and Deng，1996)。遺傳研究表明它們的基因產(chǎn)物的功能是作用于許多光受體包括phyA，phyB和藍(lán)光受體CRY1下游的負(fù)調(diào)節(jié)物(McNellis和Deng，1995)。這些突變體中的一部分似乎在植物激素信號(hào)中起作用(Chory and Li，1997；Kraepiel andMiginiac，1997)，多效性和基本的COP/DET/FUS位點(diǎn)中的十個(gè)被認(rèn)為促成對(duì)黑暗中光形態(tài)建成的幼苗發(fā)育的抑制(Wei and Deng，1996)。
多效性組成型的光形態(tài)建成的/去黃萎化的/FUSCA(COP/DET/FUS)位點(diǎn)定義一組重要的發(fā)育調(diào)節(jié)物，它們專門參與幼苗形態(tài)建成的光調(diào)控。在所有這些位點(diǎn)上的突變均會(huì)導(dǎo)致幼苗表現(xiàn)出幾乎所有黑暗中光形態(tài)建成發(fā)育的方面(Castle and MeinKe，1994；Miséra et al，1994；Pepper et al.1994；Wei et al.，1994；Kwoket al.，1996)。由于所有在多效性COP/DET/FUS位點(diǎn)上的突變都是隱性的并且導(dǎo)致組成型光形態(tài)建成發(fā)育，而不論實(shí)際的光條件，可以推出這些位點(diǎn)所編碼的蛋白是黑暗中光形態(tài)建成的阻遏物。被各種光受體所吸收的光信號(hào)被認(rèn)為是抵制COP/DET/FUS蛋白的抑制活性從而使得光形態(tài)建成發(fā)育繼續(xù)進(jìn)行(最近的綜述，參見(jiàn)McNellis andDeng，1995)。
在所有COP/DET/FUS位點(diǎn)上公認(rèn)的無(wú)效突變導(dǎo)致成年致死和種子成熟和幼苗發(fā)育時(shí)期嚴(yán)重的生理不正常。這就產(chǎn)生了有關(guān)這些基因在調(diào)控光介導(dǎo)的發(fā)育的特導(dǎo)性的問(wèn)題(Miséraetal.1994；CastleandMeinKe，1994)。就形式而言，多效性COP/DET/FUS蛋白可能是無(wú)所不在的細(xì)胞調(diào)節(jié)物，其功能主要是建立光調(diào)控級(jí)聯(lián)所必需的細(xì)胞環(huán)境。雖然，這一模型也與這些基因的突變表現(xiàn)型一致，它說(shuō)明這些基因的產(chǎn)物并不是光調(diào)控級(jí)聯(lián)不可缺少的部分。
對(duì)四種多效性COP/DET/FUS基因，即COP1、COP9、DET1和FUS6(COP11)進(jìn)行分子克隆提供了機(jī)會(huì)去了解光形態(tài)建成抑制分子機(jī)制(Deng et al.，1992；Castle and MeinKe，1994；Pepper et al.，1994；Wei et al.，1994)。COP9，DET1和FUS6編碼特異的富含α-螺旋的蛋白，這些蛋白組成型地分布于核內(nèi)(Pepper et al.，1994；Wei et al.，1994；Chamovitz et al.，1996；Staub et al.，1996)。COP9被發(fā)現(xiàn)是一種8亞基蛋白復(fù)合物的一部分，該蛋白含有COP9，F(xiàn)US6(COP11)，還可能含COP8和其他成分(Wei et al.，1994；Chamovitz et al.，1996；Wei and Deng，1996 and 1998；Wei etal.，1998)。另一方面，基于前面調(diào)整COP1細(xì)胞活性的實(shí)驗(yàn)，COP1好象是光形態(tài)建成的自主阻遏物。例如，全長(zhǎng)COP1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致光反應(yīng)性的降低(McNellis et al.，1994b)，而COP1顯著陰性突變體的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致對(duì)光的過(guò)敏和在黑暗中部分的去黃萎化(McNellis etal.，1996)。使用COP1和報(bào)告基因β-葡糖醛酸酶(GUS)蛋白的融合蛋白進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)光調(diào)控的COP1的核質(zhì)分配可能是光負(fù)調(diào)控光形態(tài)建成阻溫物的一種機(jī)制(Von Arnimand Deng，1994)。
擬南芥中COP1的溫和過(guò)量表達(dá)部分地阻礙了藍(lán)光和紅外光誘導(dǎo)的下胚軸伸長(zhǎng)抑制和藍(lán)光介導(dǎo)的子葉伸展(McNellis et al.，1994b)。因?yàn)檫@些效果是轉(zhuǎn)基因植株中唯一可見(jiàn)的表現(xiàn)型，因此可以理解為支持COP1直接參與光信號(hào)級(jí)聯(lián)的證據(jù)。然而，全長(zhǎng)COP1的過(guò)表達(dá)對(duì)光敏素B介導(dǎo)的紅光下胚軸伸長(zhǎng)抑制沒(méi)有任何可探測(cè)的效果(McNellis et al.，1994b)，這有可能是因?yàn)檫^(guò)表達(dá)的水平較低。另外，如果COP1直接在光調(diào)控級(jí)聯(lián)中發(fā)生作用，作為光激活的光形態(tài)建成發(fā)育阻遏物，理想的是COP1的過(guò)表達(dá)應(yīng)該還會(huì)影響光調(diào)控的質(zhì)體發(fā)育和基因表達(dá)。COP1蛋白的有限過(guò)量表達(dá)(4倍或小于4倍)明顯不能對(duì)光調(diào)控的基因表達(dá)和質(zhì)體發(fā)育產(chǎn)生可探知的影響(McNellis et al.，1994b)。因此前面的過(guò)表達(dá)研究不能精確排除以下可能性，可能COP1過(guò)表達(dá)在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，通過(guò)其他與光形態(tài)建成無(wú)關(guān)的機(jī)制巧合地影響了下胚軸細(xì)胞的伸長(zhǎng)和子葉細(xì)胞的伸展。
為了克服全長(zhǎng)COP1過(guò)量表達(dá)研究的限制，我們開(kāi)始過(guò)量表達(dá)COP1的特異突變型來(lái)尋找可能存在的顯著陰性效果。COP1是一種76.2KD的蛋白，N-末端是環(huán)指鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域，接下來(lái)是推測(cè)的α-螺旋結(jié)構(gòu)域，在C-末端的一半是與三聚體G-蛋白β亞基相似的許多WD-40重復(fù)(Deng et al.，1992；McNellis et al.，1994a)。COP1的完整核苷酸和氨基酸序列以前提供于Deng et al.，(1992b)并且可由NCBI Aceession Number L 24437獲得。
這樣，COP1編碼一種蛋白，該蛋白是三種可識(shí)別結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特組合，即N-末端鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域(下文叫做環(huán)指結(jié)構(gòu)域)，一段推測(cè)的卷曲螺旋區(qū)域(下文叫做螺旋或卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域)，和C-末端WD-40重復(fù)(Deng et al.，1992；McNellis et al.，1994a)。COP1的N-末端282個(gè)氨基酸的片段，包括環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域，表示為“N282”。
環(huán)指結(jié)構(gòu)域包含八個(gè)金屬配基，均為C3HC4，兩個(gè)鋅原子結(jié)合到一種獨(dú)特的四面體‘交叉-支架’內(nèi)，這樣形成一個(gè)完整的結(jié)構(gòu)亞基(Von Arnim and Deng，1993；綜述參見(jiàn)Bergand Shi，1996；Bordenand Freemont，1996；Saurin et al.，1996)。
螺旋區(qū)域被預(yù)測(cè)是一種α-螺旋結(jié)構(gòu)，可以形成超螺旋(Lupas，1996)。
WD-40基序長(zhǎng)度約為40個(gè)氨基酸，含有高度保守的色氨酸-天冬氨酸(WD)序列(綜述參見(jiàn)Near et al，.1994)。含有環(huán)指或WD重復(fù)的蛋白參與許多過(guò)程，包括基因抑制，瘤發(fā)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(綜述參見(jiàn)Necr et al.，1994；Borden and Frecmont，1996；Saurin etal.，1996)。其他系統(tǒng)中的研究暗示所有這三種組件在蛋白-蛋白相互作用中所扮演的角色，說(shuō)明COP1的多效性可能來(lái)自它與多種蛋白的相互作用。然而，COP1組件確切的功能角色還沒(méi)有報(bào)道。
為了理解這些結(jié)構(gòu)基元的結(jié)構(gòu)暗示，根據(jù)它們?cè)诤诎抵薪M成型形態(tài)建成幼苗發(fā)育分離出COP1基因的隱性突變(McNellis et al.，1994a)，所有的突變系都產(chǎn)生與光照條件下生長(zhǎng)的野生型幼苗相似的暗-生長(zhǎng)幼苗。這些暗-生長(zhǎng)突變幼苗的表現(xiàn)型包括短的下胚軸，打開(kāi)和變大的子葉，花色素苷的積累，細(xì)胞類型分化和葉綠體中似葉綠體的質(zhì)體分化。另外，在延長(zhǎng)黑暗生長(zhǎng)時(shí)間的條件下，突變體會(huì)出現(xiàn)與光-生長(zhǎng)幼苗相似的真葉發(fā)育。這四種突變等位基因代表二種類型的突變?nèi)N等位基因(cop1-1，cop1-2，cop1-3)有嚴(yán)重影響的表現(xiàn)型，另一種等位基因(cop1-4)有影響較小的表現(xiàn)型。與前三種等位基因相比，它的暗-生長(zhǎng)幼苗下胚軸略微長(zhǎng)一些，并且這種突變體不積累不正常水平的花色素苷。cop1純合突變體成年的光-生長(zhǎng)植株比野生型小許多(薔薇結(jié)直徑約0.5～1cm，野生型植株為大約5～10cm)，并且與同樣條件下生長(zhǎng)的野生型植株相比生育力低很多(Ceng and Quail，1992)。
cop 1-4突變等位基因產(chǎn)生的COP1蛋白只含有N-末端的282個(gè)氨基酸，包括鋅結(jié)合和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。cop1-4等位基因含一個(gè)C到T的突變使Glm-283 CAA密碼子變成了UAA終止密碼子。在cop1-4突變體的蛋白凝膠雜交分析中沒(méi)有觀察到野生型大小的COP1基因，表明越過(guò)新生成的終止密碼子的翻譯，如果存在的話，可以忽略不計(jì)。(McNellis et al.，1994a)。cop1-4突變體還能夠?qū)庥幸欢ǖ姆磻?yīng)。cop1-4的暗-生長(zhǎng)幼苗產(chǎn)生短下胚軸和伸展的子葉(Ang and Deng，1994)。雖然這種等位基因僅僅在幼苗期產(chǎn)生弱的表現(xiàn)型缺陷，它可以導(dǎo)致光-生長(zhǎng)植株大小嚴(yán)重減小和種子的大幅減少(Deng and Quail，1992)。
之前我們報(bào)道了使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的擬南芥植株研究COP1的過(guò)量表達(dá)，該植株含編碼COP1 N-末端一半的轉(zhuǎn)基因，只含環(huán)指結(jié)構(gòu)域(鋅-結(jié)合基序)和螺旋結(jié)構(gòu)域(推定的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域)，但不含COP1的C-末端的一半，不能編碼完整的WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域(McNellis etal.，1996)，轉(zhuǎn)化的植株包含編碼全長(zhǎng)COP1蛋白的DNA和另外單獨(dú)的編碼N282片段的DNA。COP1 N-末端282氨基酸片段(N282)的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致顯性的負(fù)干預(yù)，即負(fù)干預(yù)內(nèi)源野生型COP1阻礙多種光形態(tài)建成發(fā)育過(guò)程，包括細(xì)胞分化、質(zhì)體發(fā)育和基因表達(dá)的能力。N282過(guò)量表達(dá)的影響似乎是對(duì)光調(diào)控發(fā)育特異性的，因?yàn)樗鼘?duì)脅迫和病原-誘導(dǎo)的基因表達(dá)沒(méi)有影響。另外，所有轉(zhuǎn)基因N282系的表現(xiàn)型都限于幼苗發(fā)育的光調(diào)控，對(duì)于其他發(fā)育過(guò)程和正常成體發(fā)育幾乎沒(méi)有任何影響。
如上所述，N282片段的高水平表達(dá)導(dǎo)致與cop1功能喪失突變型類似的顯性-陰性表現(xiàn)型。表現(xiàn)型特征包括下胚軸伸長(zhǎng)對(duì)白光、藍(lán)光、紅光和紅外光刺激抑制的高度敏感。黑暗中，N282表達(dá)導(dǎo)致多效性光形態(tài)建成子葉發(fā)育，包括細(xì)胞分化，質(zhì)體發(fā)育和基因表達(dá)，雖然它對(duì)下胚軸的伸長(zhǎng)沒(méi)有重要影響。這些結(jié)果暗示了包含環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域的N282 COP1片段能夠與下游目標(biāo)或內(nèi)源野生型COP1相互作用，進(jìn)而干預(yù)正常的調(diào)控過(guò)程。我們作出的結(jié)論是COP1的N282參與蛋白-蛋白或蛋白-核酸相互作用，這種作用是對(duì)COP1光調(diào)控幼苗發(fā)育非常重要的(McNellis et al.，1996)。
使用擬南芥cop1基因開(kāi)展的工作對(duì)于其他植物的幼苗生長(zhǎng)具有直接的意義，包括那些在農(nóng)學(xué)或園藝方面很重要的植物。例如Frances et al.(1992)注意到一種不依賴光的光形態(tài)建成豌豆(PisumSativum)突變體，叫作lip1，與去黃萎化的擬南芥突變體det1，det2和cop1具有一些相同的特征。但研究人員也發(fā)現(xiàn)了某些重要差別，包括在光敏素水平、器官特異性基因表達(dá)、質(zhì)體發(fā)育和黑暗適應(yīng)反應(yīng)等方面。Zhao et al.(1998)從豌豆克隆并測(cè)序了cop1基因(NCBIAccession Namber Y09579)。對(duì)豌豆和擬南芥的COP1蛋白序列進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)這二種COP1蛋白在功能結(jié)構(gòu)域和C-末端具有高度的同源性。它們的氨基酸序列有77.5％相同，86.9％相似。由于豌豆植株表現(xiàn)高等植物典型的光形成建成，這一結(jié)果表明在擬南芥中的發(fā)現(xiàn)對(duì)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的高等植物有著直接的意義。
McNellis et al.(1994a)提到C-末端COP1序列與菠菜(Spinacia olereacea)和水稻(Oryza sativa)COP1同源物相應(yīng)區(qū)域相比具有高度的保守性。有關(guān)水稻的觀察尤其有趣，因?yàn)閱巫尤~植物的光形態(tài)建成發(fā)育與雙子葉的不同。例如，不像似南芥和菠菜這些雙子葉植物，諸如水稻的單子葉植物在黑暗中會(huì)表現(xiàn)出大量的葉片發(fā)育。Tsuge et al.(1997)指出一種COP1同源物以單挎貝基因存在于水稻基因組中而且擬南芥和水稻三個(gè)結(jié)構(gòu)域之間高度地保守。
擬南芥COP1基因的一種同源物也從蕃茄中得到克隆(TCOP1)(Frances et al.，1997)。推測(cè)出的蕃茄基因氨基酸序列與擬南芥基因高度相同，尤其在三個(gè)劃定的結(jié)構(gòu)基元內(nèi)。
如上所述，我們需要幼苗表現(xiàn)出在低光條件下改善的生長(zhǎng)特性，雖然擬南芥cop1-4突變體幼苗在低光條件下表現(xiàn)出稍微短一些的下胚軸，但這些幼苗最終變成不健康的，低產(chǎn)的成年植物。這些突變體不能產(chǎn)生任何COP1蛋白。
使用COP1 N282片段轉(zhuǎn)化的野生型植株的幼苗在低光條件下會(huì)產(chǎn)生比相同低光條件下野生型幼苗短的下胚軸(McNellis et al.，1996)。然而，如這里和McNellis et al.(1996)所述，N-282轉(zhuǎn)化的植株有著明顯的缺點(diǎn)，在黑暗中生長(zhǎng)時(shí)它同時(shí)會(huì)表現(xiàn)出不正常的子葉生長(zhǎng)和伸展。如前所述，這一點(diǎn)會(huì)對(duì)幼苗向上生長(zhǎng)及出土產(chǎn)生不利的影響。這樣，仍然存在對(duì)這樣一種幼苗的需要，它擁有在黑暗條件下，正?；蚪咏５某鐾撂匦圆⑶以诘凸鈼l件下的幼苗黃萎化現(xiàn)象減輕。在本發(fā)明之前，這樣的植物沒(méi)有實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明通過(guò)使用反向-遺傳的，生化的和細(xì)胞生物學(xué)的方法的結(jié)合對(duì)COP1結(jié)構(gòu)域進(jìn)行功能解析。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了COP1結(jié)構(gòu)域在幼苗發(fā)育光調(diào)控中區(qū)別的但又有重疊的功能并且提供了COP1作為分子開(kāi)關(guān)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
我們的數(shù)據(jù)表明COP1主要作為一種同源二聚體發(fā)揮作用，而且很可能是通過(guò)卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)域進(jìn)行二聚化。本發(fā)明基于以下偶然發(fā)現(xiàn)環(huán)指和卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)域能夠獨(dú)立地作為光反應(yīng)組件用于介導(dǎo)COP1的光調(diào)控核質(zhì)分配。C-末端的WD-40結(jié)構(gòu)域作為一種自主的阻遏組件是因?yàn)楹型暾腤D-40重復(fù)的COP1突變蛋白的過(guò)表達(dá)能抑制光形態(tài)建成發(fā)育。這種WD-40結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的抑制可至少部分地由以下描述作出解釋COP1直接與HY5相互作用并對(duì)其進(jìn)行負(fù)調(diào)控，HY5是一種bZIP轉(zhuǎn)錄因子，能夠正調(diào)控光形態(tài)建成。然而COP1的自身聯(lián)合是觀察到COP1 WD-40重復(fù)與HY5相互作用的前提。這些工作為COP1作為分子開(kāi)關(guān)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
使用本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠制得植株，在低光條件下它表現(xiàn)出更好的出芽特性和改善的幼苗生長(zhǎng)。
發(fā)明概述本發(fā)明包括在極端低光或黑暗的條件下改變幼苗發(fā)芽及其隨后在低光條件下生長(zhǎng)的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了帶有如下生理和形態(tài)特征的植株1)在極端低光或完全黑暗條件下植株幼苗的表現(xiàn)型具有與相同條件下野生型幼苗相似的特征-葉片伸展不足；2)在低光條件下植株幼苗的表現(xiàn)型與相同低光條件下生長(zhǎng)的野生型幼苗相比具有較短的下胚軸。再具體一些，本發(fā)明通過(guò)引入編碼COP1基因的螺旋結(jié)構(gòu)域氨基酸的核苷酸序列從而改變黑暗中幼苗的發(fā)芽特征及隨后幼苗在低光條件下的生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供植物細(xì)胞，它們包含COP1基因并且另外含有一段編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。這樣，本發(fā)明所提供的植物細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白和野生型COP1蛋白。本發(fā)明還提供由本發(fā)明的植物細(xì)胞產(chǎn)生的植株。
本發(fā)明還包括用COP1核苷酸序列轉(zhuǎn)化植株，其中WD-40和環(huán)指結(jié)構(gòu)域被去除活性。有許多方法可以有效地使WD-40重復(fù)和環(huán)指失活，即降低或消除它們的表達(dá)和作用。這樣，本發(fā)明提供植物細(xì)胞，它們包含COP1基因并且另外含有一段編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，但不含分離的可表達(dá)的核苷酸序列用于編碼COP1基因的環(huán)指結(jié)構(gòu)域或者與該螺旋結(jié)構(gòu)域核苷酸序列相關(guān)的COP1基因WD-40結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明提供了一種植株，該植株包含一段編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，該植株發(fā)芽時(shí)幼苗表現(xiàn)型的特點(diǎn)為未展開(kāi)的葉片，隨后在低光條件下的幼苗的生長(zhǎng)與相同低光條件下的野生型幼苗相比具有稍短的下胚軸。本發(fā)明方法生產(chǎn)出的成年植株與相同條件下的野生型成年植株具有大致相同的嫩枝大小和種子(seed set)。
本發(fā)明還提供了編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域的分離的DNA分子。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含分離的編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域的DNA分子的載體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了這樣的載體，該載體包括一種與分離的DNA序列可操作連接的啟動(dòng)子。
本發(fā)明還提供了由這種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，真菌細(xì)胞或光合作用的真核細(xì)胞。這樣，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因的原核，真菌或光合作用真核生物，其中編碼螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的DNA序列被導(dǎo)入生物的基因組內(nèi)并由此產(chǎn)生含有螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的轉(zhuǎn)基因生物。更具體一些，由本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化的光合作用真核生物宿主細(xì)胞包括單子葉和雙子葉植物。甚至更具體一些，這些由本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化的單子葉和雙子葉植物包括擬南芥、菠菜、蕃茄、豌豆和水稻。
本發(fā)明包括由這些轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生得到的植株，還有這些轉(zhuǎn)化的植株的后代，這些后代也產(chǎn)生螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白。
本發(fā)明更一步提供了改變內(nèi)源野生型COP1基因正常的功能的方法，這些方法包括1)制備載體，該載體包含編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域氨基酸的分離的DNA序列；2)把該載體插入細(xì)胞以制得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，該細(xì)胞選自原核細(xì)胞，真菌細(xì)胞和光合真核細(xì)胞。本發(fā)明的方法更一進(jìn)提供了由轉(zhuǎn)化的光合作用真核細(xì)胞再生得到轉(zhuǎn)化植株。本發(fā)明的方法甚至更進(jìn)一步提供由轉(zhuǎn)化再生植株產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的后代植株。另外，本發(fā)明進(jìn)一步提供了方法用于把再生的轉(zhuǎn)化植株與其它植物雜交；收集得到的種子；在極端低光水平條件下由得到的種子生長(zhǎng)出幼苗并挑選那些葉片沒(méi)有或幾乎沒(méi)有展開(kāi)的幼苗；在低光條件下培養(yǎng)從步驟c挑選出來(lái)的幼苗并選擇那些下胚軸比相同低光條件下得到的野生型幼苗短的轉(zhuǎn)化的幼苗。
本發(fā)明還提供了制備轉(zhuǎn)化的幼苗的方法，這些幼苗在黑暗中出芽和在低光條件下生長(zhǎng)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出變化的表現(xiàn)型，制備這種幼苗的方法包括1)制備載體，該載體含有編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域氨基酸的分離的DNA序列；2)把該載體插入植物細(xì)胞；3)從這些轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中制備可存活的轉(zhuǎn)化親本植株；4)從該親本植株的種子生長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化的幼苗。依照這里列出的步驟，一位在植物育種領(lǐng)域的一般技術(shù)人員能夠制得改變的幼苗表現(xiàn)型，這些幼苗在黑暗中出芽時(shí)具有基本未打開(kāi)的、緊密的野生型葉片并且在低光水平下與相同低光條件的非轉(zhuǎn)化野生型幼苗相比黃萎化降低。本發(fā)明的方法還提供了改變的幼苗表現(xiàn)型，這些幼苗在黑暗中出芽時(shí)基本上具有野生型葉片發(fā)育并且與相同低光條件下生長(zhǎng)的未轉(zhuǎn)化野生型幼苗相比，這些幼苗有更短、更強(qiáng)壯的莖和更綠，發(fā)育更好的葉片。
本發(fā)明還提供了種植農(nóng)作物的方法，農(nóng)作物包括一種或多種含有編碼螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的DNA序列的植物，這些植物同時(shí)含有天生的野生型COP1基因。用作作物的含有螺旋結(jié)構(gòu)域的植株，包括再生轉(zhuǎn)化植株，再生轉(zhuǎn)化植株的后代，或者把轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株有性雜交后產(chǎn)生的植株。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠依據(jù)具體情況的需要很容易地做出必要的調(diào)整。
本發(fā)明進(jìn)一步的目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將在以下描述中逐漸明晰。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.COP1通過(guò)螺旋結(jié)構(gòu)域在體外和體內(nèi)二聚化。(A)COP1的體外交聯(lián)分析。通過(guò)使用化學(xué)交聯(lián)劑EGS和Dsub對(duì)放射性標(biāo)記的flag-COP1(由每組實(shí)驗(yàn)對(duì)象右側(cè)的線指明)的寡聚物性質(zhì)進(jìn)行了分析。每組對(duì)象右側(cè)的方括弧指明了相應(yīng)于二聚物的交聯(lián)產(chǎn)物的位置。體外翻譯的flag-COP1產(chǎn)生兩條分子量大小接近的條帶。分子量低一些的條帶可能是由于從COP1內(nèi)部甲硫氨酸開(kāi)始的不正確的翻譯。(B)從連續(xù)白光或黑暗下生長(zhǎng)6天的幼苗中提取COP1蛋白進(jìn)行凝膠過(guò)濾得到的分布圖。組分中的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離再通過(guò)蛋白凝膠免疫印跡檢查。通過(guò)蛋白標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)的分子量大小(千道爾頓)列在相應(yīng)組分的上方。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)參見(jiàn)材料與方法。(C)使用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)COP1自身連結(jié)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定界，對(duì)于baits(Bait)，COP1結(jié)構(gòu)域片段與LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LexA)融合。對(duì)于preys(Prey)，COP1結(jié)構(gòu)域片段與合成轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)融合。每行左邊的數(shù)字和名稱代表成對(duì)的bait和prey構(gòu)建體。右邊的圖指明酵母細(xì)胞相應(yīng)于每行bait和prey構(gòu)建體組合的相對(duì)LacZ報(bào)告基因活性。對(duì)于每對(duì)組合，至少測(cè)量8個(gè)轉(zhuǎn)化子以確定LacZ活性。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)方差。組合1(LexAN282)和2(N282AD)作為陰性對(duì)照。圖2.使用的COP1蛋白N-末端片段及其在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)。(A)用于過(guò)量表達(dá)分析的構(gòu)建體圖示。N282(同時(shí)包含環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域)(McNellis et al.，1996)，NΔRING(缺乏環(huán)指結(jié)構(gòu)域，包含螺旋結(jié)構(gòu)域)，NΔCoil(缺乏螺旋結(jié)構(gòu)域，包含環(huán)指結(jié)構(gòu)域)，環(huán)指(RING)和螺旋(Coil)位置被強(qiáng)調(diào)。注aa＝氨基酸。(B)對(duì)三個(gè)代表性NΔRING和NΔCoil的轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行蛋白凝膠印跡分析并與野生型和N282轉(zhuǎn)基因系作比較(L2McNellis et al.，1996)。每個(gè)泳道加的總蛋白量約為12.5μg。蛋白雜交用抗-COP1抗體作為探針。過(guò)量表達(dá)的N282，NΔRING和NΔCoil蛋白條帶用點(diǎn)作了標(biāo)記。相應(yīng)于內(nèi)源COP1的蛋白條帶和一個(gè)30kDa的非特異性反應(yīng)條帶用星號(hào)標(biāo)記于凝膠的右側(cè)。分子量大小標(biāo)記(千道爾頓)位于左側(cè)。圖3.N282，NΔRING和NΔCoil轉(zhuǎn)基因幼苗的表現(xiàn)型比較。(A-E)6天大的幼苗的形態(tài)建成比較。幼苗圖示(A)在持續(xù)的白光條件下(50μmole m-2sec-1)，(B)在持續(xù)的紅外光條件下，(C)在持續(xù)的紅光條件下(40μmole m-2sec-1)，(D)在持續(xù)的藍(lán)光條件下(40μmole m-2sec-1)，和(E)在完全黑暗的條件下。在每組實(shí)驗(yàn)中，從左到右依次為野生型(Columbia)，N282(L2)，NΔRING(L2)和NΔCoil(L3)。比例線代表1mm。(F-J)6天大的幼苗根部(大約在下胚軸接合處以下約5mm)葉綠體自發(fā)熒光。(F)野生型(Columbia)，(G)cop1-4，(H)N282(L2)，(I)NΔRING(L2)，和(J)NΔCoil(L3)。幼苗生長(zhǎng)于持續(xù)的白光條件下(25μmole m-2sec-1)。圖4.表示轉(zhuǎn)基因擬南芥下胚軸中代表性細(xì)胞GUS染色情況。五天大的轉(zhuǎn)基因幼苗(A)GUS-ΔRING，(B)GUS-ΔCoil，(C)GUS-ΔRΔC，(D)GUS-ΔRΔG4生長(zhǎng)于完全黑暗(左側(cè)實(shí)驗(yàn)組)或在持續(xù)的高強(qiáng)度白光下(150μmole m-2sec-1，右側(cè)的實(shí)驗(yàn)組)，GUS活性測(cè)定染色之前沒(méi)有進(jìn)行預(yù)先的固定和在DAPI存在的條件下完全上樣。對(duì)于GUS細(xì)胞化學(xué)染色(上面的實(shí)驗(yàn)組)和DAPI染色(下面的實(shí)驗(yàn)組)，細(xì)胞核的位置都是用箭頭指示的。實(shí)驗(yàn)組A中的比例線表示10μm。其他實(shí)驗(yàn)組也一樣。圖5.設(shè)計(jì)的COP1結(jié)構(gòu)域-缺失構(gòu)建體用于分析COP1C-末端在體內(nèi)的功能及其在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)。(A)ΔRING，ΔCoil，ΔRΔC和ΔRΔG4與全長(zhǎng)COP1蛋白的比較圖示。推定的核定位信號(hào)(NLS)的位置用++指出。這一套COP1突變體同時(shí)用于亞細(xì)胞定位研究(圖4)和表現(xiàn)型研究中進(jìn)行GUS融合(分別為GUS-ΔRING，GUS-ΔCoil，GUS-ΔRΔC和GUS-ΔRΔG4)。aa，氨基酸。(B)表達(dá)保留完整C-末端的COP1結(jié)構(gòu)域-缺失片斷的轉(zhuǎn)基因擬南芥的蛋白凝膠印跡分析。使用ΔRING、ΔCoil、ΔRΔC和ΔRΔG4的二個(gè)代表轉(zhuǎn)基因系與野生型Columbia作比較。每次泳道加的總蛋白量約為12.5μg，蛋白印跡以抗COP1的抗體作為探針。過(guò)量表達(dá)的ΔRING、ΔCoil、ΔRΔC和ΔRΔG4蛋白條帶用點(diǎn)作了標(biāo)記。相對(duì)于內(nèi)源COP1和一個(gè)非特異性反應(yīng)的蛋白條帶分別用線或星號(hào)標(biāo)記于凝膠的右側(cè)。分子大小標(biāo)記(千道爾頓)標(biāo)于左側(cè)。圖6.6天大的野生型和表達(dá)COP1結(jié)構(gòu)域缺失片段的轉(zhuǎn)基因幼苗的形態(tài)建成比較。它們的GUS融合見(jiàn)圖5。野生型(生態(tài)型Columbia)和過(guò)量表達(dá)全長(zhǎng)COP1(COP1；McNellis et al.，1994b)，ΔRING，ΔCoil，ΔRΔC，ΔRΔG4，GUS-ΔRING，GUS-ΔCoil，GUS-ΔRΔC和GUS-ΔRΔG4的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗生長(zhǎng)于(A)持續(xù)白光條件(25μmole m-2sec-1)，(B)持續(xù)藍(lán)光條件(12.5μmole m-2sec-1)，和(C)持續(xù)紅外光條件，每組實(shí)驗(yàn)的所有幼苗都用同樣的放大率。比例線代表1mm。圖7.野生型和過(guò)量表達(dá)全長(zhǎng)COP1及COP1結(jié)構(gòu)域-缺失片段轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的下胚軸長(zhǎng)度比較。野生型Columbia，COP1過(guò)量表達(dá)型、ΔRING，ΔCoil，ΔRΔC，ΔRΔG4，GUS-ΔRING，GUS-ΔCoil，GUS-ΔRΔC和GUS-ΔRΔG4的二個(gè)代表系過(guò)量表達(dá)型幼苗如圖6所示生長(zhǎng)于(A)持續(xù)的白光，(B)持續(xù)的藍(lán)光，和(C)持續(xù)的紅外光條件6天時(shí)間。每個(gè)系至少測(cè)量20個(gè)幼苗的下胚軸，表上顯示的為算術(shù)平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)方差。圖8.酵母雙雜交系統(tǒng)中HY5與COP1結(jié)構(gòu)域缺失突變體之間的相互作用。左側(cè)的數(shù)字代表bait，LexA-HY5(沒(méi)有顯示)和不同的prey構(gòu)建體1，AD-COP1；2，AD-ΔRING；3，AD-ΔCoil；4，AD-ΔRΔG4；5，AD-ΔRΔC；6，AD-GUS-ΔRΔC和7，只有AD的成對(duì)組合。組合7代表陰性對(duì)照。右側(cè)的柱形圖顯示了相應(yīng)行成對(duì)組合的相對(duì)LacZ活性。對(duì)于每對(duì)組合，要單獨(dú)測(cè)量10個(gè)轉(zhuǎn)化體以確定相對(duì)LacZ活性。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤。圖9.在光調(diào)控?cái)M南芥幼苗發(fā)育中COP1結(jié)構(gòu)域功能的工作模型。COP1NLS位于螺旋和WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域之間。光信號(hào)被多種光受體感受經(jīng)信號(hào)媒介物傳導(dǎo)，通過(guò)環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域的作用減少COP1在核內(nèi)的積累。環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域的組合對(duì)COP1的自身聯(lián)結(jié)是必要的，后者是在體內(nèi)抑制COP1活性的前提。HY5是一種目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子，其活性受到COP1的抑制。圖10.從cop1-4突變體中分離得到的N282的核苷酸序列(SEQ IDNO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。2段有下劃線的序列分別代表環(huán)指和卷曲螺旋同源物結(jié)構(gòu)域。螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(SEQ IDNO3)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)為圖10中N282序列的最后一個(gè)下劃線部分。
發(fā)明詳述除非另外加以限定，這里所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員的理解是相同的。雖然任何相似或等價(jià)于這里所描述的方法和材料均可用于實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明。但這里只描述優(yōu)選的方法和材料。本發(fā)明概覽如前所述，我們前面的工作表明N282的表達(dá)導(dǎo)致在光和暗-生長(zhǎng)幼苗中顯性-陰性表現(xiàn)型。N282的表達(dá)干擾了內(nèi)源COP1蛋白抑制光形態(tài)建成的能力，導(dǎo)致幼苗對(duì)多種光信號(hào)敏感性的增強(qiáng)和在完全黑暗中部分的去黃萎化。在N282轉(zhuǎn)基因幼苗中野生型COP1蛋白積累水平作為總蛋白的一個(gè)部分并沒(méi)有降低，這一事實(shí)明確地排除了內(nèi)源野生型COP1基因的共抑制是產(chǎn)生所觀察到的表現(xiàn)型的原因這一可能性。這些表現(xiàn)型的特征不僅確證了COP1在光調(diào)控級(jí)聯(lián)中的具體參與，還使我們能夠深入地了解存在于COP1分子N-末端部分的結(jié)構(gòu)域的功能角色。
在本發(fā)明中，我們研究了三種已知COP1結(jié)構(gòu)域在光調(diào)控?cái)M南芥幼苗發(fā)育中所扮演的功能角色。我們的結(jié)果揭示出COP1功能組件不同但又協(xié)作的性質(zhì)。如圖9中所概括的，螺旋結(jié)構(gòu)域很可能是二聚化結(jié)構(gòu)域，同時(shí)N-末端環(huán)指在分子間相互作用中起到支持作用。環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮閷?dǎo)光引起的COP1從細(xì)胞核中耗盡都是關(guān)鍵的。正常的自身聯(lián)結(jié)后，C-末端WD-40重復(fù)對(duì)于介導(dǎo)光形態(tài)建成的抑制非常重要，可能是通過(guò)與HY5相互作用并負(fù)調(diào)控HY5。
如上面所提出的，本發(fā)明的目的是制得包含編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域氨基酸的核酸序列的植物細(xì)胞，幼苗和成年植株。我們意外地發(fā)現(xiàn)包含編碼螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的植株在黑暗中出芽和在低光條件下幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出有一定改善的農(nóng)學(xué)/園藝特性。在我們的發(fā)現(xiàn)之前，還沒(méi)有方法能夠制備把這些重要的性狀結(jié)合起來(lái)的植株。定義擬南芥的COP1基因包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域WD-40重復(fù)，環(huán)指結(jié)構(gòu)域(也叫鋅-結(jié)合基序)和螺旋結(jié)構(gòu)域(也叫卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域)。如前所述，完整的擬南芥COP1核苷酸和氨基酸序列由Deng et al.(1992b)提供并可由NCBI Accession Number L24437獲得。
如前所述，編碼COP1前282個(gè)氨基酸的部分或片段為‘N282’。N282僅僅包括COP1三個(gè)結(jié)構(gòu)域中的二個(gè)環(huán)指和螺旋同源結(jié)構(gòu)域。N282的核苷酸序列(SEQ ID NO1)包括COP1的1至888堿基，相應(yīng)的N282氨基酸序列(SEQ ID NO2)包括COP1的1到282位氨基酸。圖10中列出了N282的序列，二個(gè)結(jié)構(gòu)域都有下劃線。N282的螺旋結(jié)構(gòu)域核苷酸序列(SEQ ID NO3)包含堿基424至669，相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO4)包含氨基酸128至209。
本發(fā)明分離得到的核酸分子包括編碼螺旋結(jié)構(gòu)域的核酸序列，(SEQ ID NO3)和進(jìn)一步包含N282非環(huán)指序列的核酸序列。例如，在本發(fā)明中特別有用的核酸包括編碼N282序列氨基酸1～38和104～282的核酸分子(即，由N282構(gòu)建的一種核酸分子，它不包含編碼N282氨基酸39-103的堿基)。這樣的核酸包括編碼螺旋結(jié)構(gòu)域的序列和不編碼環(huán)指結(jié)構(gòu)域及其片段的附加N282核酸。
正如這里所使用的，螺旋結(jié)構(gòu)域基因包括明確發(fā)現(xiàn)和鑒定了的變異體，以及可依據(jù)以下方法無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)即可分離/制備和鑒定得到的等位基因變異體，保守替換變異體同源染色體。本發(fā)明所使用的螺旋結(jié)構(gòu)域核苷酸序列可以包含N282的附加核苷酸，其中該附加核苷酸不包含環(huán)指結(jié)構(gòu)域及其片段的序列。為方便起見(jiàn)，所有螺旋結(jié)構(gòu)域或卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域基因被統(tǒng)稱為COP1的螺旋結(jié)構(gòu)域基因或螺旋結(jié)構(gòu)域基因或者叫做本發(fā)明的COP1螺旋結(jié)構(gòu)域基因或本發(fā)明的螺旋結(jié)構(gòu)域基因。
術(shù)語(yǔ)“COP1的螺旋結(jié)構(gòu)域基因”或“螺旋結(jié)構(gòu)域基因”包括所有天然的擬南芥螺旋結(jié)構(gòu)域基因的等位基因變異體，它們具有和COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域一樣的正常的螺旋結(jié)構(gòu)域活性。一般情況下，等位基因變異體和擬南芥的COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域在氨基酸序列上會(huì)略有不同。
相應(yīng)的，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，它包括一段編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域或其片段的核苷酸序列，其中該螺旋結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)一步地包括N282的非環(huán)指結(jié)構(gòu)域堿基。本發(fā)明還包括DNA的簡(jiǎn)并序列和基本同源的序列。本發(fā)明舉例的螺旋結(jié)構(gòu)域來(lái)自擬南芥，雖然任何來(lái)源都屬于本發(fā)明的一部分。這樣，本發(fā)明包括任何其他單子葉或雙子葉植物種類中編碼螺旋結(jié)構(gòu)域的核酸，包括蕃茄、菠菜、碗豆和水稻。由于已在許多植物種類中發(fā)現(xiàn)COP1基因，它很可能是植物界中廣泛存在的。另外，COP1基因的三結(jié)構(gòu)域性質(zhì)也似乎廣泛存在于植物界中。
這些核酸分子及其片段也可以本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進(jìn)行合成。也可以通過(guò)遺傳工程技術(shù)制備用合適的技術(shù)構(gòu)建DNA，把該DNA克隆到表達(dá)載體上并把該載體轉(zhuǎn)入可以表達(dá)復(fù)合物的細(xì)胞中。實(shí)例參見(jiàn)Sambrook et al.，Molecular-CloningA Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1985。
應(yīng)該理解這里包括編碼全部或部分螺旋結(jié)構(gòu)域的所有多核苷酸，只要它們所編碼的多肽具有這里提出的螺旋結(jié)構(gòu)域的功能活性。本發(fā)明的多核苷酸序列包括編碼螺旋區(qū)域的DNA，cDNA，合成DNA和RNA序列。這樣的多核苷酸還包括天然存在的，人工制造的和有意操作的多核苷酸。例如，這種多核苷酸序列可能包括基因組DNA，該DNA可以包括或不包括天然存在的內(nèi)含子。并且這種基因組DNA可同啟動(dòng)子區(qū)域或polyA序列一起獲得。作為另一個(gè)例子，mRNA序列的部分可能會(huì)由于可變RNA剪接方式或者使用了RNA轉(zhuǎn)錄的不同啟動(dòng)子而發(fā)生改變。另一個(gè)例子，螺旋結(jié)構(gòu)域多核苷酸可能會(huì)發(fā)生定點(diǎn)突變。
本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)一步包含由于遺傳密碼是簡(jiǎn)并的序列。遺傳密碼是簡(jiǎn)并的是由于不止一種核苷酸三聯(lián)體編碼同一氨基酸，一共有20種天然氨基酸，其中的大部分都包含不止一種密碼子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果是使本發(fā)明可以產(chǎn)生很多多核苷酸序列，其中的一些與SEQ ID NO3中的核苷酸序列有著最低限度的同源性。因此，所有的簡(jiǎn)并核苷酸序列都包含于本發(fā)明中，只要它所編碼的螺旋結(jié)構(gòu)域多肽氨基酸序列在功能上沒(méi)有變化或基本相似。本發(fā)明明確地預(yù)期了肽或核苷酸序列每一種可能的變異體，這些序列根據(jù)應(yīng)用于本發(fā)明COP1的螺旋結(jié)構(gòu)域序列即SEQ ID NO3的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體密碼子，選擇基于可能的氨基酸和密碼子選擇的組合，并且所有這些變異體都被認(rèn)為是在這里被明確公開(kāi)的。
本發(fā)明還包括這里發(fā)現(xiàn)的序列的片段(部分)，它們能夠選擇性地與COP1螺旋結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行雜交。這里所說(shuō)的選擇性雜交是指嚴(yán)格條件下雜交(實(shí)例參見(jiàn)Mamatis et al.，Molecular CloringALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，它能夠區(qū)別相關(guān)的和不相關(guān)的核苷酸序列。本發(fā)明的活性片段，與mRNA和DNA的編碼鏈互補(bǔ)，一般至少約15個(gè)核苷酸，更多情況下是至少20個(gè)核苷酸，優(yōu)選30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選50個(gè)核苷酸或更多。
這里所說(shuō)的“嚴(yán)格條件”可使雜交產(chǎn)生明顯的可讀的雜交信號(hào)。嚴(yán)格條件包括(1)洗脫時(shí)使用低離子強(qiáng)度和高溫度，如0.015MNaCl，0.0015M檸檬酸鈉，0.1％SDS緩沖液，50℃，或者(2)雜交過(guò)程中使用諸如甲酰胺的變性劑，例如50％的甲酰胺配0.1％的牛血清蛋白，0.1％的Ficoll，0.1％的聚乙烯吡咯烷酮，50mM的磷酸鈉緩沖液，pH6.5配750mM NaCl，75mM的檸檬酸鈉，40℃。另一個(gè)實(shí)例是使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1％的焦磷酸鈉，5×Denhardt溶液，超聲處理的鮭魚精子DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，40℃，洗脫在40℃下0.2×SSC和0.1％SDS下完成。熟練的技術(shù)人員能容易地確定或改變嚴(yán)格條件以獲得明顯的可探測(cè)的雜交信號(hào)。
本發(fā)明提供編碼螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的核酸分子，該分子可以在足夠嚴(yán)格的條件下與包含COP1螺旋結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)序列的核酸雜交而產(chǎn)生明顯的信號(hào)。這里所說(shuō)的“核酸”的范圍是編碼螺旋結(jié)構(gòu)域多肽的RNA或DNA，或者與編碼該肽的核酸互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與這樣的核酸雜交且能穩(wěn)固結(jié)合，或者編碼的多肽與螺旋結(jié)構(gòu)域多肽序列有至少60％的序列同一性，優(yōu)選在70％以上，更優(yōu)選達(dá)到80％以上。
植物天生包含野生型COP1基因編碼野生型COP1蛋白。核酸序列或蛋白序列的野生型是指生物體的遺傳組成，在突變程序開(kāi)始時(shí)和進(jìn)一步變化引入之前，生物體內(nèi)已存在許多突變(標(biāo)記)。這樣，野生型COP1蛋白是指在編碼野生型COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列轉(zhuǎn)入之前，自然條件下發(fā)現(xiàn)的各種形式的COP1蛋白。
這里所說(shuō)的螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白是指含有由以下多核苷酸序列編碼的氨基酸的蛋白COP1螺旋結(jié)構(gòu)域多核苷酸，該多核苷酸的等位基因變異體和具有螺旋結(jié)構(gòu)域活性的該多核苷酸的保守替換。本發(fā)明的螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白可以包含附加的N282非環(huán)指結(jié)構(gòu)域序列。另外，本發(fā)明的多肽包括螺旋結(jié)構(gòu)域序列SEQ ID NO4所編碼的蛋白，還包括多肽和片段，尤其是那些具有螺旋結(jié)構(gòu)域生物活性的，還有那些與COP1螺旋結(jié)構(gòu)域編碼的多肽或有關(guān)部分具有至少70％的序列同一性，優(yōu)選與COP1螺旋結(jié)構(gòu)域編碼的多肽具有至少80％同一性，更優(yōu)選與COP1螺旋結(jié)構(gòu)域編碼的多肽具有至少90％相似性(更優(yōu)選至少90％同一性)，更優(yōu)選至少與COP1螺旋結(jié)構(gòu)域編碼的多肽具有至少95％相似性(更優(yōu)選至少95％同一性)，本發(fā)明的多肽還包括這些多肽的部分。
本發(fā)明的螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白包括本文中明確發(fā)現(xiàn)和鑒定的變異體，以及等位基因變異體，保守替換變異體還有同源物，它們都可以通過(guò)以下的方法無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分離/制備和鑒定。
為了方便起見(jiàn)，所有螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白或卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白將被統(tǒng)稱為COP1螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白或螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白或者也可叫作本發(fā)明的COP1螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白或本發(fā)明的螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白。
術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白”或“螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白”包括所有自然產(chǎn)生的擬南芥螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的等位基因變異體，它們具有正常的螺旋結(jié)構(gòu)域活性，該活性以COP1螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的活性為典型。一般情況下，COP1螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的等位基因變異體與擬南芥COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域所明確編碼的蛋白在氨基酸序列上有略微的不同。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了基本純凈的螺旋結(jié)構(gòu)域多肽。術(shù)語(yǔ)“基本純凈”這里用來(lái)指螺旋多肽基本上不含與其自然相聯(lián)的其他蛋白、脂、碳水化合物或者其他物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用蛋白純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)純化螺旋結(jié)構(gòu)域多肽(Matsumoto et al.，1997；Self etal.，1995)。
本發(fā)明還提供了編碼分離的擬南芥COP1螺旋結(jié)構(gòu)域多肽的氨基酸序列。本發(fā)明的多肽包括那些由于保守變異而產(chǎn)生的與例舉的螺旋結(jié)構(gòu)域(如，SEQ ID NO4)不同的多肽。術(shù)語(yǔ)“保守變異”或者“保守替換”在這里用來(lái)指氨基酸殘基由另一個(gè)生物相似殘基替代。保守變異或替換不會(huì)改變多肽鏈的形狀。保守變異或替換的例子包括疏水殘基，如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸之間的替換或極性殘基之間的替換，如賴氨酸替換精氨酸，天冬氨酸替換谷氨酸或者天冬酰胺替換谷酰胺等等。因此，本發(fā)明包括所有的保守替換，只要由該核苷酸序列所編碼的螺旋結(jié)構(gòu)域多肽在功能上沒(méi)有改變或相似。
正如這里所使用的，分離的螺旋蛋白可以是全長(zhǎng)的螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白或是該蛋白的任何同源物，如螺旋蛋白中的氨基酸發(fā)生缺失(例如，該蛋白的截短形式，如肽)，插入，顛倒，替換和/或衍生化(如，糖基化、磷酸化、乙?；⑹耐轷；?、異戊二烯化、十六烷酰化，酰胺化和/或加入糖基磷脂酰肌醇)，其中改變的蛋白保持天然螺旋結(jié)構(gòu)域的生理特性。螺旋蛋白的同源物是一種蛋白，其氨基酸序列與天然螺旋蛋白氨基酸序列足夠相似以至它們分別對(duì)應(yīng)的核酸序列在嚴(yán)格條件下能夠雜交。合適的嚴(yán)格條件上文已有討論。
螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白同源物可以是編碼螺旋蛋白的天然基因的等位基因變異體。天然基因又叫做“野生型基因”。一種天然的或野生型基因是指自然界經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的基因形式。螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白同源物可使用本領(lǐng)域的技術(shù)制備，包括但不限于使用經(jīng)典或重組DNA技術(shù)對(duì)編碼蛋白的基因進(jìn)行直接改變以形成隨機(jī)或定點(diǎn)的突變。
螺旋氨基酸序列的微小改變產(chǎn)生的蛋白與SEQ ID NO4的螺旋多肽相比有基本相同的活性。正如這里所說(shuō)的，一種螺旋蛋白的“功能等價(jià)物”是指一種蛋白，它具有與非重組或天然螺旋基本相似的生物學(xué)活性或免疫特性。術(shù)語(yǔ)“功能等價(jià)物”包括具有本發(fā)明螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白生物學(xué)功能的片段，變異體，類似物，同源物或化學(xué)衍生物。
術(shù)語(yǔ)“螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白”包括所有天然產(chǎn)生的擬南芥螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的等位基因變異體，它們具有正常螺旋結(jié)構(gòu)域活性。一般情況下，螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的等位基因變異體與SEQ ID NO4明確編碼的氨基酸序列有略微的不同，但能夠在低光條件下產(chǎn)生示例的幼苗表現(xiàn)型。雖然具有與以上敘述略有不同的氨基酸序列，等位基因變異體有能力產(chǎn)生具有以下特征的幼苗表現(xiàn)型1)在極度低光或完全黑暗條件下幼苗生長(zhǎng)時(shí)具緊密的未伸展的葉片；和2)在低光條件下生長(zhǎng)，與缺乏編碼螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的特定序列的野生型幼苗相比具有更短，更強(qiáng)壯的莖，更綠、發(fā)育更完善的葉片。通常地，螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的等位基因變異體會(huì)含有位于這里敘述的螺旋結(jié)構(gòu)域序列中的保守氨基酸替換或者含有位于螺旋結(jié)構(gòu)域同源物(從擬南芥之外的生物中分離得到的螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白，如水稻，蕃茄，豌豆或菠菜)相應(yīng)位置的氨基酸替換。
在植物育種和耕種領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用本發(fā)明的方法制備農(nóng)作物，它在出芽和早期幼苗生長(zhǎng)階段具有改善的特性。正如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“農(nóng)作物”的意思是任何為經(jīng)濟(jì)目的而種植的植物。這些目的包括但不僅限于種子生產(chǎn)，飼養(yǎng)生產(chǎn)，裝飾用途，水果生產(chǎn)，漿果生產(chǎn)，蔬菜生產(chǎn)，油生產(chǎn)，蛋白生產(chǎn)，糧草生產(chǎn)，放牧動(dòng)物，高爾夫場(chǎng)地，草地，花卉生產(chǎn)，風(fēng)景美化，侵蝕控制，綠色肥料，改善土壤耕種/狀態(tài)，生產(chǎn)藥品/藥物，生產(chǎn)食物添加劑，煙草生產(chǎn)和木頭生產(chǎn)。
申請(qǐng)者進(jìn)一步提供了識(shí)別擬南芥COP1螺旋結(jié)構(gòu)域DNA序列變異的方法。一種方法是在足以雜交的條件下引入一種核酸分子(也叫探針)，該分子有一段序列與本發(fā)明的螺旋結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)，這一方法本領(lǐng)域的人能夠理解。另一種方法是通過(guò)許多本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法直接對(duì)DNA序列進(jìn)行分析(Ott，1991)，另一種方案涉及檢測(cè)由不同植物屬、種、株系、品種或培育品種所代表的螺旋結(jié)構(gòu)域DNA序列變異。用于探針的螺旋結(jié)構(gòu)域可來(lái)自任何確定螺旋結(jié)構(gòu)域的植物。用于雙子葉植物非常好的探針應(yīng)為編碼擬南芥螺旋結(jié)構(gòu)域的探針，用于單子葉植物非常好的探針應(yīng)為編碼水稻螺旋結(jié)構(gòu)域的探針。如前所述，擬南芥和水稻的COP1序列已被確定而且很容易被本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員獲得。在一種方案中，該序列會(huì)特異性地結(jié)合到螺旋結(jié)構(gòu)域的一個(gè)等位基因上，在另一方案中就會(huì)結(jié)合到多個(gè)等位基因上，這樣的探測(cè)方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析和單鏈確認(rèn)分析。
鑒定本發(fā)明的有用的診斷探針包括COP1螺旋結(jié)構(gòu)域的抗體。該抗體可以是單克隆的或多克隆的，使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備(參見(jiàn)Harlow&Lane’s AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988)。它們可通過(guò)與蛋白結(jié)合用于探測(cè)螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白并且通過(guò)ELISA，蛋白印跡等進(jìn)一步檢測(cè)抗體-蛋白復(fù)合物。用于誘發(fā)抗體的螺旋結(jié)構(gòu)域序列可以是任何以上討論的螺旋結(jié)構(gòu)域變異體?？贵w還可以使用本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見(jiàn)Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，1994)由螺旋結(jié)構(gòu)域的肽序列制備。還可以制備含免疫原性顯著部分的單克隆或多克隆抗血清片段。
使用抗體探針對(duì)生物樣品中的螺旋結(jié)構(gòu)域多肽進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量的分析可以基于許多可以使用的形式。例如，在免疫分析中，其中螺旋結(jié)構(gòu)域多肽是分析物，測(cè)試樣品，一般是生物樣品，與抗螺旋結(jié)構(gòu)域抗體共同培養(yǎng)于允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下?？梢允褂迷S多不同的方式，如“夾心”分析，其中結(jié)合到固相支持物上的抗體與測(cè)試樣品共同培養(yǎng)；洗脫，往分析物中加入二次標(biāo)記抗體；再次洗脫支持物。通過(guò)確定二次抗體是否連接到支撐物上來(lái)檢測(cè)分析物。在一種競(jìng)爭(zhēng)形式中，這種形式可以是異源的或者同源的，測(cè)試樣品通常與抗體以及一種標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抗原一起按順序或同時(shí)培養(yǎng)。這些和其他的一些形式都是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。COP1二聚化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)我們的結(jié)果表明COP1在體內(nèi)以二聚化的形式發(fā)生作用。COP1二聚體也可以在體外通過(guò)化學(xué)交聯(lián)分析檢測(cè)(圖1A和1B)，使用酵母雙雜交分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定COP1的螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑OP1自身相互作用是必要的和充分的(圖1C)。環(huán)指結(jié)構(gòu)域在二聚化中有著次要作用的證據(jù)在酵母中同樣被觀察到，這一點(diǎn)與最近的觀點(diǎn)-環(huán)指是一個(gè)蛋白-蛋白相互作用的基元相一致(綜述參見(jiàn)Berg and shi，1996；Borden and Freemont；1996；Saurinetal.，1996)。事實(shí)上，環(huán)指結(jié)構(gòu)域參與二聚化最近已有暗示。例如，一種V(D)J重組-激活蛋白R(shí)AG1二聚化結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)的解析說(shuō)明了環(huán)指結(jié)構(gòu)域在二聚化中的參與(Bellon et al.，1997)。
環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域各自在COP1二聚化中的作用與包含這些結(jié)構(gòu)域且過(guò)量表達(dá)COP1的突變體轉(zhuǎn)基因幼苗的顯性陰性表現(xiàn)型相一致。N282片段(包含環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域)過(guò)量表達(dá)型在無(wú)論黑暗還是光照條件下均表現(xiàn)出對(duì)光形態(tài)建成反應(yīng)的過(guò)敏(圖3EMcNellis et al.，1996)，而ΔRING過(guò)量表達(dá)型在黑暗中沒(méi)有表現(xiàn)出幼苗的去黃萎化(圖3E)。一個(gè)可能的解釋是相鄰的環(huán)指對(duì)于體內(nèi)有效的COP1自身聯(lián)結(jié)是必需的。這也能很好地解釋最近報(bào)道的GUS-COP1-9突變蛋白過(guò)表達(dá)所引起的嚴(yán)重顯性陰性表現(xiàn)型(Zhou et al.，1998)。在COP1-9突變蛋白中，丟失1.5個(gè)WD-40重復(fù)但存在完整的環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域(McNeUis et al.，1994b)。COP1細(xì)胞核積累的光調(diào)控結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)COP1表現(xiàn)出一種依賴光的核-質(zhì)分配(von Arnim and Deng，1994)。光照下COP1在細(xì)胞核內(nèi)量的降低很可能是阻止COP1抑制光形態(tài)建成發(fā)育的一種方式，以穩(wěn)定地維持光形態(tài)建成發(fā)育行為。對(duì)于GUS與COP1結(jié)構(gòu)域缺失融合突變體系列的分析表明，環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)光誘導(dǎo)的COP1從核中耗盡的過(guò)程中可能是多余的。雖然機(jī)制仍不清楚，光可以通過(guò)二種一般的方式耗盡核內(nèi)的COP1阻止進(jìn)入結(jié)合核內(nèi)COP1降解；或者主動(dòng)的COP1送出。因?yàn)闆](méi)有一個(gè)單獨(dú)的蛋白通過(guò)二個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)核運(yùn)出這樣一個(gè)過(guò)程，認(rèn)為光導(dǎo)致對(duì)COP1核進(jìn)入的阻止可能更有道理一些。環(huán)指結(jié)構(gòu)域是一種蛋白-蛋白相互作用基元這一觀點(diǎn)(綜述參見(jiàn)Berg and shi，1996；Borden andFreemont；1996；Saurin et al.，1996)也與本假設(shè)一致。最近，鑒定出特定的與COP1相互作用的蛋白，它與環(huán)指結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)(K.U.Torii and X.W.Deng，unpublish)或與螺旋結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)(Matsui et al.，1995；Yamamoto et al.，1998)。這樣的一種蛋白，CIP1，表現(xiàn)出與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)共同存在于一個(gè)地方(McNelliset al.，1995)。這些相互作用的蛋白很可能參與COP1保留在細(xì)胞質(zhì)中。然而，我們的結(jié)果不能排除以下可能性，即環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域可能各自促成結(jié)構(gòu)完整性，這種完整性對(duì)COP1的細(xì)胞質(zhì)保留是必需的，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的全部缺失會(huì)消除正確細(xì)胞定位所必需的構(gòu)象或結(jié)構(gòu)。
以前的研究表明多效性位點(diǎn)COP/DET/FUS對(duì)于黑暗中COP1的正常細(xì)胞核定位是必需的(Chamovitz et al.，1996；von Arnim et al.，1997)。我們的結(jié)果表明環(huán)指、螺旋和WD-40重復(fù)這些組件沒(méi)有一個(gè)特異性與其他COP/DET/FUS蛋白相聯(lián)系。因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)域的任一缺失能不能損害COP1在黑暗中的細(xì)胞核定位(圖4)?？赡苁瞧渌腃OP/DET/FUS蛋白通過(guò)COP1的其他區(qū)域發(fā)生作用，如NLS或特定的一個(gè)WD-40重復(fù)。例如，酵母TUP1的每一個(gè)WD-40重復(fù)都可與不同的對(duì)象相互作用(Komachi et al.，1994)。COP1與其他COP/DET/FUS蛋白間直接或間接相互作用的分子基礎(chǔ)將在今后的工作中得以解決。WD-40重復(fù)通過(guò)與一種光形態(tài)建成的正調(diào)節(jié)物HY5的相互作用介導(dǎo)對(duì)光形態(tài)建成發(fā)育的抑制保留完整WD-40重復(fù)的COP1突變體過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致幼苗對(duì)光反應(yīng)降低(圖6和7)。對(duì)于這一現(xiàn)象至少有二種解釋。第一，WD-40重復(fù)區(qū)域是一個(gè)自主組件，介導(dǎo)光形態(tài)建成的抑制。這樣，這種結(jié)構(gòu)域越多，對(duì)光形態(tài)建成的抑制就越強(qiáng)。第二，突變COP1形式中完整的WD-40重復(fù)區(qū)域以某種方式干擾介導(dǎo)COP1光失活的上游因子。COP1結(jié)構(gòu)域缺失過(guò)量表達(dá)型所具有的下胚軸長(zhǎng)度表現(xiàn)型在酵母雙雜交系統(tǒng)中表現(xiàn)出與相應(yīng)COP1片段和HY5相互作用的能力相關(guān)，這一事實(shí)與第一種解釋非常符合。雖然與第二種可能性不存在互相排斥的關(guān)系。這一現(xiàn)象暗示COP1的WD-40重復(fù)對(duì)于在體內(nèi)通過(guò)直接相互作用抑制HY5活性是必需的(Ang et al.，1998)。另外，COP1的二聚化是COP1 WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域與HY5功能互作的前提。這一點(diǎn)非常明顯，因?yàn)镚US-ΔRΔC過(guò)量表達(dá)型的幼苗由于GUS賦予的自身聯(lián)結(jié)并且恢復(fù)與HY5相互作用的能力(圖8)而表現(xiàn)出伸長(zhǎng)的下胚軸這一表現(xiàn)型(圖6和7；Jefferson et al.，1987)。綜上，結(jié)果表明C-末端WD-40重復(fù)對(duì)產(chǎn)生光形態(tài)建成幼苗發(fā)育的抑制很為重要，至少部分地通過(guò)直接與HY5相互作用并對(duì)其進(jìn)行負(fù)調(diào)控。應(yīng)該注意到我們所有的實(shí)驗(yàn)都是以野生型為背景而進(jìn)行的。我們初步的觀察表明，ΔRING和ΔCoil突變體蛋白均不能挽救COP1無(wú)效-等位基因的致死性(C.D.Stoop-Myer and X.W.Deng，unpublihed)。這一點(diǎn)與環(huán)指和卷曲螺旋的多功能性是相互一致的。
WD-40重復(fù)已在幾種核蛋白中發(fā)現(xiàn)并起到轉(zhuǎn)錄抑制子的作用，如果蠅extra sex comb(Esc)，酵母Tup1，Hirl和Met30(Keleheret al.，1992；Sherwood et al.，1993；Gutjahr et al.，1995；Thomas et al.，1995)。這些WD-40蛋白好像并不直接與DNA結(jié)合，而是通過(guò)與序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的相互作用來(lái)獲得抑制活性。兩種不同的抑制機(jī)制被提出。其中一種是WD-40蛋白通過(guò)干擾基本轉(zhuǎn)錄機(jī)件而抑制轉(zhuǎn)錄，如為Tup1和Hir1所提出的(Tzamariasand Struhl，1994；Komachi et al.，1994；Spector et al.，1997)。方法之一是直接替代TFIID復(fù)合物中的成分，如為Esc所提出的(Gutjahr，et al.，1995)。在這些情況下，也許僅僅需要序列特異性DNA結(jié)合蛋白以使WD-40蛋白恢復(fù)到目標(biāo)啟動(dòng)子(Tzamaris andStruhl，1994；Spector et al.，1997)。第二種機(jī)制是WD-40蛋白使序列特異性轉(zhuǎn)錄激活子隔絕。一個(gè)例子就是酵母Met30，它可以通過(guò)聯(lián)合并抑制bZIP轉(zhuǎn)錄激活子Met4來(lái)抑制硫代謝基因的轉(zhuǎn)錄(Kuras et al.，1995；Thomas et al.，1995；Kuras et al.，1996)。COP1能夠以與Met30類似的機(jī)制隔絕HY5或者隱敝HY5激活轉(zhuǎn)錄的能力。
結(jié)論，我們這里描述的工作使我們能夠?qū)θ齻€(gè)保守COP1結(jié)構(gòu)域在幼苗發(fā)育光調(diào)控過(guò)程中給予特定的功能角色。說(shuō)明調(diào)控COP1結(jié)構(gòu)域或組件的活性能夠改變幼苗發(fā)育的命運(yùn)，或者甚至光形態(tài)建成，如N282和螺旋過(guò)量表達(dá)型，或者還有暗形態(tài)建成，如ΔRINGTΔCoil過(guò)量表達(dá)型。因此，我們的研究為COP1作為一個(gè)自主的分子開(kāi)關(guān)而發(fā)揮功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
實(shí)例材料與方法誘導(dǎo)的突變依據(jù)上下文，術(shù)語(yǔ)“突變”有多種含義基因結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的過(guò)程，由這樣的變化而產(chǎn)生的一個(gè)改變的基因或者延伸一下，指表現(xiàn)該突變的生物個(gè)體。對(duì)于植物育種領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，突變育種是非常熟知的一種方法，通過(guò)誘變劑誘導(dǎo)突變以獲得可增加農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的新的作物品種，誘變劑可以是物理的(如，離子輻射)或是化學(xué)的(如，乙基甲磺酸酯)，它可提高突變頻率，使之高于自然條件下的突變。
植物中突變育種的概觀，參見(jiàn)，如，Neal F Jensen，PlantBreeding Methodology，Chapter 19，pp 249～255，John Wiley&Sons(1988)；N.W.Simmonds，Principles of Crop Improvement，pp.297～314，Long man(1979)；和R.W.Allard，Principles ofPlant Breeding，Chapter 35，pp444～454，John Wiley&Sons(1960)。植物轉(zhuǎn)化的價(jià)值傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)入一種或一套目標(biāo)基因需要在兩系間進(jìn)行有性雜交，然后在雜交后代和親本中的一種之間進(jìn)行重復(fù)的回交，直到獲得帶有所需特性的植株。然而，這一方法受限于植株必須能夠有性雜交；另外，目標(biāo)基因以外的基因也會(huì)被轉(zhuǎn)入。
重組DNA技術(shù)使得植物研究者能夠避開(kāi)這些限制，它使植物遺傳學(xué)者能夠發(fā)現(xiàn)和克隆目標(biāo)性狀的特定基因，如對(duì)昆蟲害蟲的抗性，然后把這些基因轉(zhuǎn)到多種有用的植物中。外源基因一旦被轉(zhuǎn)入植株，就可以使用傳統(tǒng)植物育種的方法(如，譜系育種，單種血統(tǒng)育種方法，互相反復(fù)選擇)以獲得同樣包含目標(biāo)基因的后代。
可以使用同源重組的方法使基因以定點(diǎn)方式轉(zhuǎn)入。同源重組允許內(nèi)源基因中的特異位點(diǎn)修飾。這樣，遺傳或獲得的突變可被修復(fù)，而且/或者新的變化可以轉(zhuǎn)入基因組。
植物的同源重組和定位整合討論于U.S.PatentNos.5,451,513,5,507,967和5,527,695。轉(zhuǎn)化方法制備轉(zhuǎn)基因植物的方法是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。轉(zhuǎn)基因植物可以通過(guò)許多不同的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行制備，這些方法包括但不限于電穿孔法；微注射法；微粒轟擊法，又叫微粒加速或biolistic轟擊；病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，US PatentNos.5,405,765,5,472,869,5,538,877,5,538,880,5,550,318,5,641,664,5,736,369和5,736,369；Watson et al.，Recombinant DNA，Scientific American Books(1992)；Hinchec et al.，Bio/Tech。6915～922(1988)；McCabe et al.，Bio/Tech.6923～926(1988)；Toriyama et al.，Bio/Tech.61072～1074(1988)；Fromm et al.，Bio/Tech.8833～839(1990)；Mullins et al.，Bio/Tech.8833～839(1990)；和Raineri et al.，Bio/Tech.833～38(1990))。轉(zhuǎn)基因使用重組DNA方法成功轉(zhuǎn)入植物的基因包括但不僅僅限于那些編碼以下性狀的基因種子存儲(chǔ)蛋白，包括修飾的7S豆莢種子存儲(chǔ)蛋白(U.S.Patent Nos.5,508,468，5,559,223和5,576,203)；除草劑耐受或抗性(U.S.Patent Nos.5,498,544和5,554,798；Powellet al.，Science 232738～743(1986)；KaniewsKi et al.，Bio/Tech.8750～754(1990)；Day et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA886721～6725(1991))；Phytase(U.S.Patent No.5,593,963)；對(duì)細(xì)菌、真菌、線蟲和昆蟲害蟲的抗性，包括由Bt基因賦予的對(duì)鱗翅類昆蟲的抗性(U.S.Patent Nos.5,597,945和5,597,946；Hidderet al.，Nature 330160～163；Johnson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，869871～9875(1989)；Perlak et al.，Bio/Tech.8939～943(1990))；凝集素(US.PatentNo.5,276,269)；和花顏色(Meyer et al.，Nature 330677～678(1987)；Napoli et al.，Plant Cell 2279～289(1990)；van derKrol et al.，Plant Cell 2291～299(1990))。用于在植物中表達(dá)外源DNA的表達(dá)單元正如上文提供的，本發(fā)明的幾個(gè)方案使用表達(dá)單元(或者表達(dá)載體或系統(tǒng))去表達(dá)一種外源補(bǔ)充的核酸序列，如植物中編碼N282蛋白的序列。用于制備表達(dá)單元/系統(tǒng)/載體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)為人們熟知而且很容易經(jīng)調(diào)整而適用于在植物細(xì)胞中表達(dá)N282蛋白。一位技術(shù)人員能夠容易地按照這里提供的簡(jiǎn)述使用本方法中任何適合的植物/載體/表達(dá)系統(tǒng)。
用于調(diào)控蛋白表達(dá)的表達(dá)控制元件可以是通常與編碼序列相聯(lián)系的表達(dá)控制元件(同源表達(dá)元件)也可以是異源表達(dá)調(diào)控元件。多種同源和異源表達(dá)調(diào)控元件在本領(lǐng)域內(nèi)已知并且容易用于本發(fā)明制備表達(dá)單元。例如，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域可包含任何不同的冠癭堿起始區(qū)域，如在根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中就發(fā)現(xiàn)了章魚堿、甘露堿、胭脂氨酸等。另外，還可以使用植物病毒啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控植物中的基因表達(dá)。最后，植物啟動(dòng)子，諸如prolifera啟動(dòng)子，果實(shí)特異性啟動(dòng)子，Ap3啟動(dòng)子，熱激啟動(dòng)子，種子特異性啟動(dòng)子等都可使用。最好的啟動(dòng)子應(yīng)為在幼苗中最活躍的。
一般使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)把一種組成型啟動(dòng)子(如CaMV或Nos啟動(dòng)子)，一種器官-特異性啟動(dòng)子(如來(lái)自蕃茄的E8啟動(dòng)子)或是一種可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子連接到蛋白或反義編碼區(qū)域。表達(dá)單元可以進(jìn)一步通過(guò)使用補(bǔ)充元件進(jìn)行優(yōu)化，如轉(zhuǎn)錄終止子和或增強(qiáng)元件。
這樣，為了在植物中得以表達(dá)，表達(dá)單元除了含有蛋白序列以外，一般還包括一種植物啟動(dòng)子區(qū)域，一種轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和一種轉(zhuǎn)錄終止序列。一般在表達(dá)單元的5’和3’端均含有特定的特異性酶切位點(diǎn)以使其方便插入預(yù)先存在的載體中。在構(gòu)建異源啟動(dòng)子/結(jié)構(gòu)基因或反義組合時(shí)，啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離最好與自然條件下的相同。雖然本領(lǐng)域中已知這種距離的一些變化可能不會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)子功能的喪失。
除了啟動(dòng)子序列，表達(dá)盒還可以在結(jié)構(gòu)基因的下游包含一段轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域以提供有效的終止。終止區(qū)域可以由與啟動(dòng)子相同的基因獲得，也可由不同的基因獲得。如果要對(duì)結(jié)構(gòu)基因所編碼的mRNA進(jìn)行有效的加工，一般應(yīng)往載體構(gòu)建體中加入指導(dǎo)RNA聚腺苷化的DNA。聚腺苷化序列包括但不限于農(nóng)桿菌章魚堿合成酶信號(hào)(Gielen et al.，EMBO J 3835～846(1984))或者胭脂氨酸合成酶信號(hào)(Depicker etal.，Mol.and Appl.Genet.1561～573(1982))。
最后的表達(dá)單元連接或者構(gòu)建到適合高等植物轉(zhuǎn)化的載體上。該載體一般包含一種選擇性標(biāo)記基因借此在培養(yǎng)物中鑒定轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞。一般情況下，標(biāo)記基因會(huì)編碼抗生素的抗性。這些標(biāo)記包括對(duì)G418，潮霉素、博萊霉素、卡那霉素和慶大霉素的抗性。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后，那些含有載體的細(xì)胞可以通過(guò)它們能夠在含有某種抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而鑒定出來(lái)。細(xì)菌和病毒復(fù)制原點(diǎn)的序列一般也被引入載體使其能夠在細(xì)菌或噬菌體宿主中進(jìn)行克隆。這種原核復(fù)制原點(diǎn)最好適于廣泛的宿主范圍。還應(yīng)包括一種細(xì)菌的選擇性標(biāo)記以便對(duì)帶有目的構(gòu)建體的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行篩選。合適的原核選擇性標(biāo)記也包括對(duì)抗生素，如卡那霉素或四環(huán)素的抗性。
其他編碼附加功能的DNA序列也可存在于載體中，這在本領(lǐng)域是已知的。例如，以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化為例，還包括T-DNA序列以便接下來(lái)往植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的螺旋結(jié)構(gòu)域序列也可以融合到多種其他的核酸分子中，如表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，表位或熒光蛋白標(biāo)記。
EST是基因片段，一般長(zhǎng)度為300至400個(gè)核苷酸，從互補(bǔ)DNA(cDNA)克隆的3’或5’末端進(jìn)行排序。將近30,000擬南芥ESTs由一個(gè)法國(guó)和一個(gè)美國(guó)的聯(lián)合機(jī)構(gòu)產(chǎn)生(Delseny et al.，F(xiàn)EBSLett.405(2)129～132(1997)；擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)，http//genome.www.seanford.edu/Arabidopsis)。源于大EST數(shù)據(jù)庫(kù)的基因表達(dá)方式分析的討論參見(jiàn)M.R.Fannon，TIBTECH 14294～298(1996)。
生物相容的熒光蛋白探針，尤其是來(lái)源于水母Aeguoreavictoria的自我組裝綠色熒光蛋白(GFP)使細(xì)胞、分子和發(fā)育生物學(xué)的研究發(fā)生了革命性的變化，因?yàn)樗鼈兪谷藗兡軌蛴^察到活體細(xì)胞中的生化過(guò)程(Murphy et al.，Curr.Biol.7(11)870～876(1997)；Grebenok et al.，Plant J.11(3)573～586(1997)；Pang et al.，Plant Phsiol.112(3)(1996)；Chiu et al.，Curr.Biol.6(3)325～330(1996)；Plautz et al.，Gene 173(1)83～87(1996)；Sheen et al.，Plant J.8(5)777～784(1995))。
使用定點(diǎn)突變可以產(chǎn)生溶解性更強(qiáng)的密碼子-修飾GFP，稱為可溶性修飾GFP(smGFP)。當(dāng)轉(zhuǎn)入擬南芥以后，與密碼子修飾GFP相比可以觀察到更強(qiáng)的熒光，表明smGFP“更加明亮”，因?yàn)樗母蟛糠忠钥扇芎蛨?zhí)行功能的形態(tài)存在(Dayis et al.，Plant Mol.Biol36(4)521～528(1998))。通過(guò)融合編碼GFP和beta-葡萄糖醛酸酶(GUS)的基因，研究者能夠創(chuàng)造一套雙功能報(bào)告基因構(gòu)建體，可優(yōu)化用于在包括擬南芥的植物中瞬時(shí)和穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)(Quaedvlieget al.，Plant Mol.Biol.37(4)715～727(1998))。
Berger et al.，(Dev.Biol.194(2)226～234(1998))報(bào)道了用于擬南芥下胚軸上皮細(xì)胞的GFP標(biāo)記系的分離。GFP-融合蛋白被用于定位和鑒定許多種擬南芥基因，包括牻牛兒焦磷酸(GGPP)(Zhuet al.，Plant Mol.Biol.35(3)331～341(1997))。基因失效一個(gè)有效的失效修飾的例子是發(fā)生在基因起始處的一個(gè)單個(gè)核苷酸的缺失，它將造成翻譯閱讀框架位移。這種框架位移會(huì)使基因失效，產(chǎn)生不表達(dá)的基因產(chǎn)物并借此干擾該基因產(chǎn)生功能蛋白。如果蛋白酶基因的調(diào)控區(qū)或編碼區(qū)被中斷，則該基因的蛋白酶產(chǎn)物也可能被中斷。
除了通過(guò)缺失核苷酸導(dǎo)致翻譯閱讀框架位移來(lái)使基因失效，失效修飾還可能通過(guò)其他技術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括基因內(nèi)部核苷核的插入，替換，倒位或顛換，這些都可能有效地阻止DNA編碼的蛋白的形成。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以通過(guò)使用特異性稍差的方法來(lái)使基因失效，例如使用諸如羥胺或亞硝基胍的化學(xué)變性劑或使用諸如伽馬輻射或紫外輻射變性劑對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)突變，如COP1基因，這些突變的菌株可能碰巧包含失效的COP1基因，它們不能產(chǎn)生含有一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能蛋白。目標(biāo)失效基因的存在可以通過(guò)常規(guī)篩選技術(shù)得到檢測(cè)。進(jìn)一步指導(dǎo)參見(jiàn)U.S.Patent No.5,759,538。反義編碼載體使用反義構(gòu)建體，包括在原位產(chǎn)生反義序列以抑制植物中表達(dá)的方法，參見(jiàn)U.S.Patents 5,107,065和5,254,800。
其他可用于抑制植物內(nèi)源基因表達(dá)的方法也可應(yīng)用于本發(fā)明。例如，在雙螺旋基因的關(guān)鍵區(qū)域產(chǎn)生三螺旋就可完成這一目的。這種三螺旋密碼，允許適合的單鏈參與者的設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域內(nèi)已知(參見(jiàn)H.E.Moser et al.，Science 238645～650(1987)和M.Cooney，etal.，Science 241456～459(1988))。調(diào)控序列中包含連續(xù)的嘌呤堿基的區(qū)域是尤其引人注意的目標(biāo)。三螺旋伴隨光交聯(lián)形成參見(jiàn)如，D.Praseuth，et al.，Proc Nat’l Acad.Sci.USA 851,349～1,353(1998)。育種方法1.開(kāi)放授粉種群。農(nóng)作物如黑麥，許多玉米和甜菜，牧草，豆科植物如紫花苜蓿，熱帶樹(shù)農(nóng)作物如可可樹(shù)，椰子果，油棕櫚樹(shù)和一些橡膠樹(shù)，這些開(kāi)放授粉種群的改良主要決定于改變基因頻率，固定優(yōu)良等位基因的同時(shí)保持高的(但遠(yuǎn)低于最大值)雜合程度。這些種群的一致是不可能的，一種開(kāi)放授粉種類的種類可靠性只是這一種群作為整體的一個(gè)統(tǒng)計(jì)特征，而不是單個(gè)植株的一種特點(diǎn)。這樣，開(kāi)放授粉種群的異質(zhì)性與近交系、克隆和雜種的純合性(或基本上這樣)形成對(duì)比。
種群改良方法自然分為二類。一類基于純粹的表現(xiàn)型選擇，一般叫做混合選擇，另一類基于后代測(cè)試的選擇。種群間改良利用開(kāi)放授粉種群的觀念，使基因能夠從一種種群流動(dòng)到另一種群。一種種群(品種、株系生態(tài)型或任何種質(zhì)來(lái)源)中的植株可以自然地(如，通過(guò)風(fēng))或人工地或通過(guò)蜜蜂(一般為Apis melliferaL.或Megachilerotundata F.)與其他種群的植株進(jìn)行雜交。通過(guò)分離帶有來(lái)源于兩者的優(yōu)良性狀的植株的選擇過(guò)程可以改良一種(或有時(shí)兩種)種群。
改良開(kāi)放授粉種群主要有兩種方法。第一，通過(guò)一種選定的選擇流程，對(duì)一種種群從總體上進(jìn)行改變。結(jié)果是一種改良的種群，用它通過(guò)自身的隨機(jī)交配無(wú)限繁殖。第二，合成的品種作為種群改良達(dá)到同一最終目的，但它的自身繁殖能力不強(qiáng)，必須從親本系或克隆重新構(gòu)建。這些改良開(kāi)放授粉種群的植物育種方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，有大量的有關(guān)常規(guī)育種方法的綜述，參見(jiàn)許多文獻(xiàn)和文章，包括Simmonds，Principles of Crop improvement Longman GroupLimited(1979)；Allard，Principles of Plant Breeding，JohnWiley&Sons，Inc.(1960)；Hallauer and Miranda，QuatitativeGenetics in Maize Breeding，Iowa State UniuersityPress(1981)；和Jensen，Plant Breeding Methodology，John Wiley&Sons，Inc(1988)。
2.混合選擇。在混合選擇中，選擇、收集優(yōu)良的單個(gè)植株，種子不經(jīng)后測(cè)試直接產(chǎn)生下一代。由于選擇僅基于母本并且對(duì)授粉沒(méi)有控制，混合選擇相當(dāng)于隨機(jī)交配并選擇的一種方式。如上所述，混合選擇的目的是為了增加種群中優(yōu)等基因型所占的比例。
3.合成法。一種合成品種是通過(guò)大量基因型之間雜交產(chǎn)生的。這些基因型是從所有可能的雜交組合中選出具有好的結(jié)合能力的組合，然后通過(guò)開(kāi)放性授粉維持該品種。親本是否是種子繁殖系(或多或少近交的)原則上沒(méi)有什么關(guān)系，如在一些甜菜和豆類植物(Vicia)或克隆中，如在收草，苜蓿和紫花苜蓿中。親本按照一般結(jié)合能力進(jìn)行選擇，有時(shí)通過(guò)測(cè)試雜交或頂交，更多情況下是通過(guò)多雜交，親本的種子系可以是有意近交的(如通過(guò)自交或近親雜交)。然而，即使親本不是故意近交的，在系維持過(guò)程中的選擇會(huì)保證一些近交發(fā)生克隆的親本當(dāng)然將保持不變和高度的雜種性。
是否合成品種能夠直接從親本種子產(chǎn)生的小塊土地提供給農(nóng)民或者還需經(jīng)過(guò)1或2個(gè)循環(huán)的增殖取決于種子的產(chǎn)量和需要種子的規(guī)模。在實(shí)際操作中，草和苜蓿一般增殖一次或兩次然后從原先的合成品種大量地取走。
雖然有時(shí)也使用混合選擇，對(duì)于多雜交后代測(cè)試一般是優(yōu)選，因?yàn)椴僮鞯暮?jiǎn)便性和與目標(biāo)，即利用合成品種的一般結(jié)合能力的明顯相關(guān)性。
進(jìn)入合成品種的親本系或克隆的數(shù)目變化很大。實(shí)際中，親本系的數(shù)目從10到幾百，平均為100～200。從100或更多克隆形成的寬基合成品種在種子增殖過(guò)程中應(yīng)比窄基合成品種更加穩(wěn)定。
4.雜種。雜種是由兩種不同基因型的親本雜交而產(chǎn)生的單一植株。商業(yè)雜種現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于很多農(nóng)作物，包括玉米、高梁、甜菜、向日葵和花椰菜。雜種可由許多不同的方法形成，包括兩親本直接雜交(單雜交雜種)，單雜交雜種與另一親本雜交(三-路或三雜交雜種)或者兩種不同的雜種之間雜交(四-路或雙雜交雜種)。
嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，大多數(shù)遠(yuǎn)交種群(即開(kāi)放授放)的個(gè)體都是雜種，但這一名詞被保留用來(lái)指親本個(gè)體的基因組足夠不同使它們可以被看作不同的種或亞種、雜種可以是可育的或是不育的。這一點(diǎn)取決于兩親本基因組質(zhì)量和/或數(shù)量的差異。雜種優(yōu)勢(shì)一般與雜合性的增加相關(guān)，與用于形成雜種的親本相比，雜種的生長(zhǎng)活力、生命力和生殖力提高。最大的雜種優(yōu)勢(shì)一般是通過(guò)兩遺傳不同、高度近交的系之間雜交獲得的。
雜種的生產(chǎn)是一項(xiàng)高度發(fā)達(dá)的工業(yè)，涉及分離生產(chǎn)親本系及由其雜交而產(chǎn)生的雜種。雜種生產(chǎn)過(guò)程的詳細(xì)討論參見(jiàn)，例如Wright，Commercial Hybrid Seed Production 8161～176，InHybridization of Corp Plants，Supra.Plant Materials andGrowth Conditions。
植物生長(zhǎng)條件明確描述于McNellis et al.，(1994a)，除非原文中有其他敘述。全長(zhǎng)COPl、N282和ΔRING過(guò)量表達(dá)型是No-0生態(tài)型，所有其他轉(zhuǎn)基因植株都是Columbia生態(tài)型。兩種生態(tài)型的野生型幼苗都被用作對(duì)照，大多數(shù)圖中只顯示其中的一種(Columbia，除非有其他說(shuō)明)。
盡管不想受不同光強(qiáng)明確界限的限制，低光一般指光強(qiáng)大約為50至200mE/m-1/sec2；高光一般指光強(qiáng)高于400或450mE/m-1/sec2；極端低光一般指光強(qiáng)小于1mE/m-1/sec2。為了優(yōu)化表現(xiàn)型檢查，如原文所述在一些實(shí)驗(yàn)中光強(qiáng)作了改變。COP1結(jié)構(gòu)域盒的構(gòu)建為了簡(jiǎn)化進(jìn)一步的克隆過(guò)程，所有的COP1結(jié)構(gòu)域缺失構(gòu)建體首先克隆到修飾的pBluescript KS載體上(pKSm；Deng etal.，1992)。pKS-ΔRING通過(guò)使用pMALΔZn(Von Arnim and Deng，1993)的BamHI-XbalI片段替換pKS-COP1中相應(yīng)的片段得到構(gòu)建。pKS-ΔRING使用BamHI和MscI酶切，然后插入pKS-N282(McNelliset al.，1996)產(chǎn)生pKS-NΔRING。為了產(chǎn)生pKS-NΔCoil，使用兩套引物T7和CCNT3(5’-CCGCTC GAG CCGAAA CTG ATC CAA GGG CGA3’)(SEQ ID NO5)和CCCT5(5’-CCG CTC GAG AAG TTG CGG ATG CTC GGAGA-3’)(SEQ ID NO6)和T3分別擴(kuò)增螺旋結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域N-末端(氨基酸1至127)和C-末端(氨基酸216～282)。兩片段都克隆到pKSm載體上分別產(chǎn)生pKS-ΔC.nt和pKS-ΔC.ct.pKS-ΔC.nt插入用XhoI酶切，插入用XhoI酶切的pKSΔC.ct中產(chǎn)生pKS-NΔCoil。為了制備pKS-NΔΔ，使用NΔRING作為模板進(jìn)行PCR，引物組合為T7和NT-Sal3(5’A CGC GTC GAC CCC AAA CTG ATC CAAGGG CGA3’)(SEQ ID NO7)。擴(kuò)增得到的片段克隆到pKSm載體上產(chǎn)生pKS-ΔΔ.nt。pKS-ΔΔ.nt用SalI酶切，得到的片段插入xhoI切割的pKSΔC.ct產(chǎn)生pKS-NΔΔ。pKS-NΔCoil和pKS-NΔΔ的BamHI-MscI片段用pKS-COP1中相應(yīng)片段替換分別產(chǎn)生pKS-ΔCoil和pKSΔΔ。為了制得pKS-Coil和pKS-PING，以pKS-N282作為模板進(jìn)行PCR，引物組合物分別為Coil5(5’-CAT GCC ATGGAT AAG CTA TTG AAG AAA ACT3’)(SEQ ID NO8)和Coil3(5’CCGCTC GAG TTA GTC CCT AGC TCG GTA TAA ATC 3’)(SEQ ID NO9)，或者RING 5(5’CATGCC ATG GTT GGT GAA GGT GCT AAT CGT 3’)(SEQ ID NO10)和RING 3(5’-CCG CTC GAA TTA TGA CAC ATG CCGAGC TGA AGT 3’)(SEQ ID NO11)。擴(kuò)增得到的片段用NcoI和XhoI酶解然后插入pKSm。對(duì)pKS-Coil和pKS-RING，分別用甲硫氨酸替換aa104的亮氨酸和aa21的絲氨酸。使用PCR方法構(gòu)建的所有克隆序列都通過(guò)對(duì)最終克隆的測(cè)序得以確定。通過(guò)用PTA-fusl-4的XbaI和XhoI酶解的片段替換相應(yīng)的片段得到pKS-cop1-10(McNellis et al.，1994a)。然后用pKS-ΔRING的BumHI-XbalI片段替換pKS-cop1-10的相應(yīng)片段產(chǎn)生pKS-ΔRΔG4，pKS-ΔRΔG4缺少環(huán)指和WD-40的最后一個(gè)重復(fù)。構(gòu)建表達(dá)盒并穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥為了構(gòu)建35S-ΔRING表達(dá)盒，用EagI和Hind III酶解pMALΔZn，然后用Klenow酶平端化，用于替換pRTL2-GUS中的GUS基因(Restrepo et al.，1990)。使用NcoI和BamHI把GUS基因從質(zhì)粒pRTL2-GUS上切除然后用Klenow削平末端。35S-ΔRING表達(dá)構(gòu)建體作為HindIII片段連接到雙元植物轉(zhuǎn)化載體pBIN19上。利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)No-0生態(tài)型的擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，參見(jiàn)McNellis et al.，(1994b)。
對(duì)于35S-ΔCoil，35S-ΔRΔC和35S-ΔRΔG4，相應(yīng)的pKSm盒用NcoI和BglII酶切，然后連接到由NcoI和BamHI酶切的pRTL2-GUS上。對(duì)于35S-NΔRING和35SΔCoil，相應(yīng)的pKSm盒用NcoI和EcoRV酶切，然后連接到pRTL2-GUS載體上，后者先用BamHI酶切，削平末端后再用NcoI酶切，對(duì)于35S-GUS-ΔRING，35S-GUS-ΔCoil，35S-GUS-ΔΔ，35S-GUS-ΔRΔG4，相應(yīng)的pKSm盒用BglII酶切，然后連接到BglII和BamHI酶切的pRTL2-GUS NIaΔBam上。這些pRTL盒然后用HindIII或者PstI酶切，然后連接到pPZP222上(Hajdakiewics et al.，1994)。得到的克隆用電穿孔法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101(pMP90)。使用真空滲透法轉(zhuǎn)化Columbia生態(tài)型的擬南芥植株(Bechtold et al.，1993)。ΔRING轉(zhuǎn)基因幼苗用卡那霉素(40μg/ml，Sigma)進(jìn)行篩選，其余轉(zhuǎn)基因幼苗用慶大霉素(100μg/ml；Sigma)篩選。
35S∷NΔRING，35S∷ΔRING，35S∷NΔCoil，35SΔCoil，35S∷ΔRΔC和35S∷ΔRΔG4的分別5個(gè)，5個(gè)，7個(gè)，9個(gè)，7個(gè)和5個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因系被確認(rèn)含有單一T-DNA插入并積累了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。為了對(duì)COP1作定位分析，GUS-ΔRING，GUS-ΔCoil，GUS-ΔRΔC和GUS-ΔRΔG4的分別4個(gè)，5個(gè)，3個(gè)和3個(gè)獨(dú)立的系被確認(rèn)含有單一T-DNA插入，GUS活性和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的積累(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。對(duì)于那些伴隨著表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)基因系，使用以前的方法對(duì)表現(xiàn)型和轉(zhuǎn)基因進(jìn)行共分離(McNellis et al.，1996)。純合轉(zhuǎn)基因的T3幼苗或表現(xiàn)出抗生素抗性的T2幼苗被用來(lái)分析。一個(gè)GUS-ΔCoil(系8)和3個(gè)GUS-ΔRΔC系的T2種子分離四分之一的fusca表現(xiàn)型幼苗(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。它們表現(xiàn)出花色素苷的極端積累，就像COP1強(qiáng)烈或致命等位基因，并經(jīng)常不能存活(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。所有的fusca幼苗都有慶大霉素抗性、極大降低的GUS活性和轉(zhuǎn)基因積累(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。這樣，估計(jì)這些fusca幼苗中出現(xiàn)了共抑制過(guò)程。在T2和T3代，慶大霉素敏感(野生型)慶大霉素抗性(過(guò)表達(dá)型)慶大霉素抗性(共抑制型)保持不變的1∶2∶1分離，這一點(diǎn)說(shuō)明的共抑制的劑量依賴機(jī)制(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。然而，這一現(xiàn)象沒(méi)有進(jìn)一步地研究，因?yàn)樗皇潜狙芯恐饕繕?biāo)。對(duì)于GUS-ΔRΔC系，占有T2數(shù)量一半的過(guò)量表達(dá)型被用來(lái)作進(jìn)一步的分析。酵母雙雜交分析pKS-RING和pKS-Coil用EcoRI和XhoI酶切，pKSm載體上的其他COP1結(jié)構(gòu)域盒用EcoRI酶切。然后片段連接到pEG202和pJG4-5以產(chǎn)生分別與LexA DNA結(jié)合蛋白或合成激活結(jié)構(gòu)域融合的COP1結(jié)構(gòu)域(Golemis et al.，1995)。pEG-N282，pJG-N282，pJG-COP1和pJG-ΔRING的產(chǎn)生敘述于其他地方(McNellis et al.，1996；Ang et al.，1998)。為制得pJG-GUS-ΔRΔC，用NcoI和XbaI酶切pRTL-GUS-ΔRΔC，然后連接到NcoI/XbaI酶切的pKS-COP1上。得到的質(zhì)粒用EcoRI酶切然后插入pJG4-5。用bait、prey和報(bào)告質(zhì)粒(pSH18-34)轉(zhuǎn)化酵母菌株EGY48-0(Golemis et al.，1995)，接下來(lái)進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性分析，參見(jiàn)McNellis et al.，(1996)。不知是何原因，我們無(wú)法穩(wěn)定表達(dá)LexA-COP1蛋白，不管是在ADH還是在誘導(dǎo)GAL1啟動(dòng)子下(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)；因此，我們不能測(cè)試酵母中全長(zhǎng)COP1-COP1相互作用。GUS細(xì)胞化學(xué)染色和共聚焦激光掃描顯微鏡擬南芥重組子GUS細(xì)胞化學(xué)染色參見(jiàn)von Arnim and Deng(1994)，對(duì)于共聚焦激光掃描顯微，收集GM平板的持續(xù)白光下新鮮生長(zhǎng)的幼苗，使用Biorad 1024共聚焦顯微鏡和Rhodomin濾鏡直接進(jìn)行觀察。蛋白凝膠印跡，體外翻譯，化學(xué)交聯(lián)和凝膠過(guò)濾色譜蛋白免疫雜交分析嚴(yán)格按照(McNellis et al.，1994a)以前描述的進(jìn)行。pAR-COP1是一種FLAG-標(biāo)簽COP1，在N端有一段附加的肽DDADTKDDDDK(Matsui et al.，1995)，使用TNT偶聯(lián)網(wǎng)狀細(xì)胞裂解系統(tǒng)(Promega)使其在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯并用[35S]甲硫氨酸(AmerSham)進(jìn)行放射性標(biāo)記。對(duì)于化學(xué)交聯(lián)，把2μl的翻譯混和物(含放射性標(biāo)記的蛋白)稀釋到18μl，使用反應(yīng)緩沖液(100mM磷酸鉀[pH7.7]；100mM NaCl；0.1mM ZnSO4；10％甘油；0.1％NonidentP-40；4mM DTT)。使用2μl剛剛稀釋的二甲基亞砜中的Dsub或EGS與之交聯(lián)。作為陰性對(duì)照，反應(yīng)物中加入2μl二甲基亞砜。在室溫下培養(yǎng)20分鐘后，通過(guò)加入2μl 1M氨基乙酸(對(duì)于Dsub)或200mM的賴氨酸(對(duì)于EGS)和22μl的2X Laemmli SDS-PAGE緩沖液來(lái)終止反應(yīng)。樣品煮沸5分鐘，用6％的SDS-PAGE分離，用Amplify(Amersham)處理后進(jìn)行熒光顯影。
對(duì)于凝膠過(guò)濾色譜，8天大的光或暗生長(zhǎng)幼苗與2X膠凝過(guò)濾緩沖液勻漿，在4℃離心5分鐘，緩沖液中含50mM Tris-HCl(pH7.5)，440mM NaCl，2mM MgCl2，2μM ZnSO40.5mM PMSF。使用25ml Superdex-200 FPLC柱(Pharmacia)和1×凝膠過(guò)濾緩沖液以0.5ml/min的速率使完全可溶的蛋白分開(kāi)。所有的過(guò)程都在4℃下進(jìn)行，對(duì)于暗樣品，還要在微綠安全光下。在無(wú)效體積(7.5ml)后，連續(xù)的每0.5ml部分被收集、濃縮并經(jīng)過(guò)10％的SDS-PAGE，接著進(jìn)行蛋白免疫雜交分析。用于估計(jì)天然COP1蛋白大小的分子量標(biāo)準(zhǔn)如下藍(lán)色葡聚糖(無(wú)效的)；甲狀腺球蛋白(669kDa)；鐵蛋白(440kDa)；過(guò)氧化氫酶(232kDa)；醛縮酶(158kDa)；BSA(67kDa)；卵清蛋白(43kDa)和核糖核酸酶A(13.7kDa)(Sigma)。實(shí)例1.COP1在體內(nèi)和體外形成二聚體我們已經(jīng)報(bào)道COP1的N282片段，包括環(huán)指和螺旋區(qū)域，具有在酵母雙雜交系統(tǒng)中與全長(zhǎng)COP1相互作用的能力，這暗示著COP1可能作為同源二聚體或多聚體發(fā)生作用(McNellis et al.，1996)。為了更好地理解COP1的自身聯(lián)結(jié)，我們對(duì)溶液中體外翻譯的COP1蛋白進(jìn)行了化學(xué)交聯(lián)分析。一種FLAG-COP1表位標(biāo)簽蛋白在體外翻譯然后與DSub或者EGS進(jìn)行交聯(lián)。圖1A顯示了單體FLAG-COP1(78kDa)和交聯(lián)產(chǎn)物，用SDS-PAGE分離并熒光顯影檢測(cè)。與Dsub或EGS交聯(lián)產(chǎn)生一條帶，表觀分子大小為大約160kDa，明顯表明了體外二聚體的形成。(圖1A)為了確證體內(nèi)COP1二聚體的存在，使用來(lái)自光或暗生長(zhǎng)擬南芥野生型幼苗的蛋白提取物進(jìn)行凝膠過(guò)濾分析。如圖1B所示，內(nèi)源擬南芥COP1蛋白部分在大約160kDa區(qū)域達(dá)到峰值，特別接近體外交聯(lián)二聚物的大小。然而，這一COP1峰很寬并包含有更大分子的部分(圖1B)。因此，可能，一部分的COP1以同源寡聚體的形式存在或者在體內(nèi)與其他分子異源聯(lián)合。另外，凝膠過(guò)濾法有限的分辨率不能排除存在少量單體COP1的可能因?yàn)榉宓男》肿恿恳粋?cè)向70kDa的區(qū)域延伸。雖然COP1二聚體條帶的相對(duì)量和分布在各次實(shí)驗(yàn)之間有所變化(由于提取物中的部分降解)，但光和暗生長(zhǎng)幼苗的凝膠過(guò)濾分布圖是基本相同的(圖1B)，表明光不影響體內(nèi)COP1的自身聯(lián)結(jié)。實(shí)例2.COP1通過(guò)螺旋結(jié)構(gòu)域二聚化為了進(jìn)一步在COP1 N282片段的內(nèi)部限定COP1二聚化結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了一系列N282的缺失突變體并使用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行了分析(圖1C)。結(jié)果表明COP1的螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)τ谧陨磉B結(jié)既是必要的。也是充分的(圖1C3，1C4，1C7至12C10)。然而N282片段上缺乏螺旋結(jié)構(gòu)域仍能產(chǎn)生弱的可重復(fù)的相互作用，這種作用比陰性對(duì)照稍強(qiáng)(參見(jiàn)圖1C1至1C4)，表明在N末端的其他區(qū)域存在殘余的COP1自身聯(lián)結(jié)，似乎是環(huán)指結(jié)構(gòu)域?qū)е铝诉@一殘余活性，因?yàn)檫@一結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出與其自身微弱的相互作用(圖1C5)。以下結(jié)果使COP1中環(huán)指對(duì)分子內(nèi)聯(lián)結(jié)的支持作用變得明顯。在C末端完整的構(gòu)建體中(圖1C11到1C14)，螺旋結(jié)構(gòu)域缺失仍保持微弱的相互作用(圖1C13)而環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域同時(shí)缺失則完全消除了相互作用(圖1C14)。WD-40重復(fù)的中斷也會(huì)擾亂分子內(nèi)相互作用(圖1C15)，很可能是由于錯(cuò)誤折疊的WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域?qū)е铝藰?gòu)象阻礙。蛋白凝膠免疫印跡分析沒(méi)有顯示出結(jié)構(gòu)域缺失構(gòu)建體表達(dá)水平上有明顯的差異(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。這樣就可以排除以下可能性-酵母雙雜交相互作用分析的不同活性是由蛋白的不同表達(dá)水平所引起的。實(shí)例3.螺旋區(qū)域的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致幼苗極度光形態(tài)建成發(fā)育如果螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑OP1二聚化起到主要的作用，這可能說(shuō)明螺旋結(jié)構(gòu)域是導(dǎo)致N282過(guò)表達(dá)植株觀察到的顯性陰性表現(xiàn)型的主要因素(McNellis et al.，1996)。為檢測(cè)這一推斷，制備了二種表達(dá)N-末端COP1突變型的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，以強(qiáng)大的CaMV35S作為啟動(dòng)子。如圖2A所示，NΔRING和NΔCoil分別表示COP1的N282片段缺失環(huán)指或螺旋結(jié)構(gòu)域。用抗一COP1抗體對(duì)NΔRING和NΔCoil轉(zhuǎn)基因系的三個(gè)代表作蛋白凝膠免疫印跡分析表明所有系都積累了與N282過(guò)量表達(dá)型表達(dá)水平相當(dāng)或更高的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物(圖2B，McNellis et al.，1996)。在所有檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因系中，內(nèi)源COP1蛋白的表達(dá)水平好像沒(méi)有變化(圖2B)。
轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗在不同的光條件和黑暗中進(jìn)行了檢測(cè)(圖3)。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)于持續(xù)的白光、紅外光、紅光和藍(lán)光條件下，NΔRING的表達(dá)導(dǎo)致了下胚軸明顯的縮短(圖3A至3D)。另外，NΔRING幼苗在下胚軸上部表現(xiàn)出花色素苷的過(guò)量積累(參見(jiàn)圖3B)。另外，NΔRING和N282的過(guò)量表達(dá)都導(dǎo)致在幼苗根部葉綠體的異位分化(圖3F到3J)。因此，NΔRING的過(guò)量表達(dá)足以損害內(nèi)源COP1的功能并能增強(qiáng)通過(guò)多種光受體介導(dǎo)的光信號(hào)。與NΔRING過(guò)量表達(dá)型不同，NΔCoil過(guò)量表達(dá)型不會(huì)導(dǎo)致任何可見(jiàn)的表現(xiàn)型，表明環(huán)指結(jié)構(gòu)域自身不足以導(dǎo)致任何顯性-陰性效果(圖3A-E and J)。雖然一些NΔCoil過(guò)量表達(dá)型(系2和3，圖2B)包含部分的降解形式(圖2B)，但這不能作為其缺乏表現(xiàn)型的理由，因?yàn)槠渌?如系1)沒(méi)有相同的部分降解也沒(méi)有表現(xiàn)型。
NΔRING過(guò)量表達(dá)型在黑暗中沒(méi)有任何去黃萎化的表現(xiàn)型(圖3E)。因?yàn)镹282的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致了黑暗中的部分去黃萎化(McNelliset al.，1996)，這似乎表明黑暗中有效地對(duì)內(nèi)源COP1進(jìn)行功能干預(yù)需要額外的環(huán)指結(jié)構(gòu)域。環(huán)指在COP1二聚化中的支持作用(圖1C)與本觀察一致。實(shí)例4.環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)COP1從核中光誘導(dǎo)耗盡過(guò)程中作用冗余光信號(hào)負(fù)調(diào)控COP1在細(xì)胞核中的豐度(yon Arnim and Deng，1994；von Arnim et al.，1997)。在黑暗中，GUS-COP1，融合到報(bào)告基因β-葡糖醛酸酶上的全長(zhǎng)COP1，絕大部分定在細(xì)胞核中，但把幼苗從黑暗中轉(zhuǎn)移到光下則降低了GUS-COP1的核豐度(von Arnimand Deng，1994)。為了鑒定介導(dǎo)COP1光反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域，對(duì)于GUS與COP1缺失突變的融合蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了檢測(cè)。為了這一目的，GUS蛋白融合到COP1片段的N-末端，后者缺失環(huán)指(GUS-ΔRING)，或者螺旋(GUS-ΔCoil)，或者缺失環(huán)指和螺旋(GUS-ΔRΔC)，或者環(huán)指和WD-40基序的最后一個(gè)重復(fù)(GUS-ΔRΔG4)。以CaMV35S為啟動(dòng)子表達(dá)這四種構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株被制備并檢測(cè)。
圖4顯示了在光或暗生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因擬南芥下胚軸細(xì)胞中的代表GUS染色圖式。在黑暗中，所有的GUS融合構(gòu)建體都位于核中，這與GUS-COP1的描述相似(von Arnim and Deng，1994)，表明在所有COP1的突變體中NLS仍保持功能。這一結(jié)果與定點(diǎn)突變研究一致，后者揭示了COP1 NLS包含于氨基酸293～314中(A.G.von Arnim，個(gè)人通訊)。當(dāng)幼苗在高強(qiáng)持續(xù)白光下生長(zhǎng)時(shí)(150μmolem-2sec-1)，嵌合體蛋白GUS-ΔRING，GUS-ΔCoil和GUS-ΔRΔG4從細(xì)胞核中排出(圖4A，4B和4D)，而GUS-ΔRΔC的光生長(zhǎng)幼苗卻表現(xiàn)出在下胚軸細(xì)胞和子葉上皮和葉肉細(xì)胞中的組成型核內(nèi)定位(圖4C)(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。這些數(shù)據(jù)表明，單獨(dú)缺失環(huán)指或螺旋不能嚴(yán)重影響COP1的光激活核內(nèi)耗盡，但兩結(jié)構(gòu)域同時(shí)缺失明顯損害了COP1的光調(diào)控核質(zhì)分布。實(shí)例5.C-末端WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域在下胚軸伸長(zhǎng)阻礙光抑制中起到必要但不充分的作用。
為了揭示W(wǎng)D-40重復(fù)的功能，我們制備了僅僅過(guò)量表達(dá)COP1C末端區(qū)域(氨基酸283～675)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，該區(qū)域包含完整的WD-40重復(fù)。所有含有這一構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因系都不能積累任何可被檢測(cè)的突變COP1(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。因此，我們制備一套新的COP1結(jié)構(gòu)域缺失構(gòu)建體，它們特異地缺失全長(zhǎng)COP1中的環(huán)指(ΔRING)或者螺旋(ΔCoil)或者兩者(ΔRΔC)，并且以CaMV35S作為啟動(dòng)子(圖5A)。作為陰性對(duì)照，我們還構(gòu)建了一種除了缺失環(huán)指還缺失WD-40基元最后一個(gè)重復(fù)的構(gòu)建體(ΔRΔG4)。環(huán)指沒(méi)有包含于這一對(duì)照構(gòu)建體是由于它的缺失不會(huì)影響WD-40重復(fù)介導(dǎo)的效果(見(jiàn)后文)。如圖5B所示，對(duì)于ΔRING、ΔCoil，ΔRΔC和ΔRΔG4過(guò)量表達(dá)型作蛋白凝膠免疫印跡分析表明所有的COP1突變型均積累到相似的水平并且它們的表達(dá)不影響內(nèi)源COP1的表達(dá)水平。因此，嚴(yán)重的表現(xiàn)型很可能是由于COP1的突變型有效性造成的。
ΔRING，ΔCoil，ΔRΔC和ΔRΔG4過(guò)量表達(dá)型的幼苗被置于持續(xù)的白光、藍(lán)光和紅外光條件下以觀察其表現(xiàn)型。如圖6和7所示，ΔRING與全長(zhǎng)COP1的過(guò)量表達(dá)型相似，表現(xiàn)出在任何光條件下都伸長(zhǎng)的下胚軸(McNellis et al.，1994b)。ΔCoil幼苗僅在藍(lán)光下才會(huì)表現(xiàn)出輕微得在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的hy表現(xiàn)型(圖6B和7B)，ΔCoil系中這一微弱卻可以重現(xiàn)的表現(xiàn)型與以下情況一致缺失螺旋結(jié)構(gòu)域在酵母中仍能維持微弱的自身聯(lián)結(jié)(圖1C11至1C14)。因此，在我們的轉(zhuǎn)基因分析中，對(duì)于阻礙幼苗光形態(tài)建成發(fā)育，環(huán)指似乎是可有可無(wú)的，而螺旋是重要但非必要的。ΔRING過(guò)量表達(dá)的影響由于額外中斷的WD-40重復(fù)(ΔRΔG4)而被徹底破壞，說(shuō)明了完整的WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域在阻礙光形態(tài)建成發(fā)育中的關(guān)鍵作用。ΔRΔC在任何被測(cè)光條件下都不能表現(xiàn)出任何可檢測(cè)到的表現(xiàn)型(圖6和7)。因此，單獨(dú)的C末端WD-40結(jié)構(gòu)域不足以賦予阻礙光形態(tài)建成的活性。實(shí)例6.ΔCoil缺陷可以通過(guò)加入異源自身聯(lián)結(jié)蛋白基元得到大部分補(bǔ)償由于螺旋結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)COP1自身聯(lián)結(jié)，它參與抑制幼苗光形態(tài)建成可能僅僅是因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)功能。如果是這樣的話，往COP1ΔCoil突變型上加入一種新的自身聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)域可能能夠補(bǔ)償螺旋結(jié)構(gòu)域缺失導(dǎo)致的缺陷。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們檢測(cè)了GUS與COP1及其突變型融合系列的表現(xiàn)型影響，因?yàn)镚US蛋白能夠自身四聚體化(Jefferson et al.，1987)。如前所示，GUS-COP1過(guò)量表達(dá)與全長(zhǎng)COP1過(guò)量表達(dá)型同樣表現(xiàn)了長(zhǎng)下胚軸表現(xiàn)型(von Arnimanol Deng，1994；yon Arnim et al.，1997)。GUS-ΔRING和ΔRING過(guò)量表達(dá)型產(chǎn)生了相似程度的下胚軸伸長(zhǎng)表現(xiàn)型，而GUS-ΔCoil和GUS-ΔRΔC過(guò)量表達(dá)型與ΔCoil和ΔRΔC過(guò)量表達(dá)型相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的下胚軸伸長(zhǎng)表現(xiàn)型(圖6和7)。蛋白凝膠印跡分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)GUS-ΔCoil、GUS-ΔRΔC、ΔCoil和ΔRΔC轉(zhuǎn)基因系轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物積累有明顯的不同(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。因此，我們的結(jié)果表明融合GUS蛋白能夠?qū)Ζoil和ΔRΔC阻礙光形態(tài)建成的缺陷起到一定的恢復(fù)作用，這很可能是通過(guò)提供了替代螺旋基元的新的自身聯(lián)結(jié)功能而實(shí)現(xiàn)的。不同的是，GUS-ΔRΔG4過(guò)量表達(dá)型沒(méi)能恢復(fù)長(zhǎng)下胚軸表現(xiàn)型(圖6和7)，表明WD-40重復(fù)的功能不能通過(guò)GUS融合得到補(bǔ)償。因此，我們提出WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)阻礙光形態(tài)建成起到了直接作用，而螺旋結(jié)構(gòu)域提供了COP1的二聚化功能，這種二聚化是WD-40重復(fù)行使正常功能的前提。實(shí)例7.WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)COP1和HY5之間的功能相互作用，HY5是光形態(tài)建成的正調(diào)節(jié)物。
COP1通過(guò)直接互作和負(fù)調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)啟動(dòng)光形態(tài)建成發(fā)育的特異轉(zhuǎn)錄因子來(lái)阻礙光形態(tài)建成發(fā)育(Ang.et al.，1998；Yamamoto et al.，1998)。由于HY5在光調(diào)控下胚軸伸長(zhǎng)中起到一定作用，我們檢測(cè)了COP1的阻礙效果是否是通過(guò)HY5介導(dǎo)，還檢測(cè)了COP1的WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域是否是調(diào)控蛋白-蛋白相互作用的原因。如圖8所示，在酵母雙雜交分析中HY5與一系列COP1結(jié)構(gòu)域缺失突變相互作用的強(qiáng)度與相應(yīng)COP1突變型過(guò)量表達(dá)所引起的下胚軸長(zhǎng)度直接相關(guān)(圖6和7)。例如，HY5與全長(zhǎng)COP1和ΔRING相互作用的程度相似，與ΔCoil的相互作用減弱，與ΔRΔC和ΔRΔG4沒(méi)有相互作用(圖8)。
為了檢測(cè)WD-40重復(fù)和螺旋結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)COP1和HY5相互作用中所起的特定作用，我們進(jìn)一步分析了HY5與GUS-ΔRΔC突變體的相互作用。與GUS-ΔRΔC和ΔRΔC轉(zhuǎn)基因幼苗中觀察到的表現(xiàn)型效果相似(圖6和7)，GUS-ΔRΔC融合蛋白恢復(fù)了COP1突變型與HY5相互作用的能力(圖8)。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了以下觀點(diǎn)COP1的C末端WD-40重復(fù)在介導(dǎo)與HY5的相互作用中起直接作用，而由螺旋結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的COP1的二聚化則是這一相互作用所必需的。實(shí)例8.野生型和轉(zhuǎn)化植株幼苗特征的比較使用以上提出的方法，用編碼COP1基因完整N282片段的序列，包括環(huán)指和螺旋結(jié)構(gòu)域，或者使用編碼COP1基因的氨基酸位置1-38和104～282的核苷酸(即N282序列除去編碼環(huán)指的核苷酸)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥植株。野生型植株及2種轉(zhuǎn)化基因型分別在強(qiáng)光、弱光和黑暗中進(jìn)行檢測(cè)獲得莖伸長(zhǎng)的相對(duì)程序和葉伸展的相對(duì)量，結(jié)果見(jiàn)下表
如上顯示，在生長(zhǎng)于強(qiáng)光或黑暗條件下時(shí)，三種植株均表現(xiàn)出野生型的莖伸長(zhǎng)。然而，在弱光條件下生長(zhǎng)時(shí)意外地發(fā)現(xiàn)二種轉(zhuǎn)化植株(N282和NΔRING)的莖伸長(zhǎng)比野生型植株的要短。當(dāng)生長(zhǎng)于強(qiáng)光和弱光條件下時(shí)，三種植株類型的葉片伸展均與野生型相同。然而，意外發(fā)現(xiàn)在黑暗中生長(zhǎng)時(shí)，N282-轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)出非自然的葉片伸展，而野生型和NΔRING轉(zhuǎn)化型在相同條件下則沒(méi)有葉片伸展。
這些結(jié)果顯示用N282序列減去環(huán)指結(jié)構(gòu)域(NΔRING)轉(zhuǎn)化的野生型植株意外地表現(xiàn)出1)弱光下一定程度的莖伸長(zhǎng)，這一點(diǎn)與N282轉(zhuǎn)化的植株相似。2)在極端弱光或黑暗條件下一定程度的葉伸展，這一點(diǎn)與野生型植株相似。這樣NΔRING-轉(zhuǎn)化植株(即，該轉(zhuǎn)化植株包含天然COP1基因，另外還包含一段編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸，其中該植株不含單獨(dú)可表達(dá)的編碼COP1基因環(huán)指結(jié)構(gòu)域或WD-40結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，其中WD-40結(jié)構(gòu)域與該螺旋結(jié)構(gòu)域核苷酸序列相關(guān)聯(lián))意外地結(jié)合了兩種高度優(yōu)良的特性，即在極度低光或黑暗中減少的葉片伸展和在弱光下較短的下胚軸。
正如以前在背景部分所討論的，幼苗能夠結(jié)合在黑暗中無(wú)葉片伸展，如當(dāng)處于出芽前生長(zhǎng)期，和出芽后在弱光水平下較短的莖伸長(zhǎng)這兩種特性是農(nóng)業(yè)和園藝所期待的。在這里，用編碼螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植株是唯一能夠結(jié)合這些優(yōu)良特性的植株。實(shí)例9.使用螺旋結(jié)構(gòu)域序列制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因蕃茄系如上所述，F(xiàn)rances et al.，(1998)建立了遺傳上包含擬南芥COP1基因同源物的蕃茄植株，命名為TCOP1。
擬南芥螺旋結(jié)構(gòu)域表達(dá)構(gòu)建體以HindIII片段形式連接到雙元植物轉(zhuǎn)化載體pBIN19上，如在材料和方法中所提出的。蕃茄植株(Lycopersicon esculentum，var Better BOY)用得到的載體根據(jù)發(fā)表的流程(參見(jiàn)如McNellis et al.，1994，Proc Natl.Acad.Sci.USA 91(21)9799～9802；McGarvey et al.，1995Biotechnology 13(13)1484～1487)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
使用以前描述(McNellis et al.，1994b)和以上討論的植物發(fā)芽、生長(zhǎng)條件和光源對(duì)幼苗進(jìn)行評(píng)估。蛋白免疫印跡分析按以前的描述(McNellis et al.，1994a)和以上材料和方法中所提出的進(jìn)行。
轉(zhuǎn)化的蕃茄植株幼苗既包含野生型TCOP1基因還包含編碼螺旋結(jié)構(gòu)域擬南芥蛋白的轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因植株在黑暗中生長(zhǎng)時(shí)不會(huì)產(chǎn)生打開(kāi)的伸展的葉片。另外，與生長(zhǎng)于相同弱光條件下的非轉(zhuǎn)化BigBoy蕃茄幼苗相比，轉(zhuǎn)基因蕃茄幼苗有更短，更強(qiáng)壯的莖和更綠更完善的葉片。在相同條件下生長(zhǎng)至成熟，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(即野生型)蕃茄植株在地上莖生長(zhǎng)和蕃茄果實(shí)(植物學(xué)上的漿果)生產(chǎn)方面沒(méi)有顯著的差別。實(shí)例10.使用傳統(tǒng)植物育種制備轉(zhuǎn)化的蕃茄植株實(shí)例9中制備的轉(zhuǎn)基因BigBoy蕃茄植株與非轉(zhuǎn)基因BigBoy蕃茄植株(或蕃茄的另一種系、栽培種或品種)進(jìn)行有性雜交并收集得到的種子。種植收集的種子，幼苗首先在黑暗中生長(zhǎng)然后在弱光條件下生長(zhǎng)，篩選轉(zhuǎn)化的幼苗。轉(zhuǎn)化的幼苗生長(zhǎng)至成熟。收集自花授粉得到的種子得到大量用于蕃茄農(nóng)作物種植的種子。
另外，成熟的轉(zhuǎn)化植物與一種不同的蕃茄系(一種姐妹系或不同的品種)進(jìn)行雜交產(chǎn)生雜交種子，得到的雜交種子被混合并用于制備雜交蕃茄。
正如以上在材料與方法中所討論的，這些育種方法可能存在許多變化。例如，在用于生產(chǎn)自交或雜交種子之前，最初得到的轉(zhuǎn)化幼苗可能已經(jīng)自交一代或若干代。對(duì)于蕃茄生產(chǎn)方法的討論，參見(jiàn)Langeret al.，1991，Agriculture Plants，Second Edition，CambridgeUniversity Press。實(shí)例11.使用螺旋結(jié)構(gòu)或序列制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻系如上討論，Tsuge et al.，(1998)證實(shí)水稻植株內(nèi)部包含擬南芥CoPl基因的同源物。
正如在材料與方法中提出的，擬南芥螺旋結(jié)構(gòu)域表達(dá)構(gòu)建體以Hind III片段的方式連接到雙元植物轉(zhuǎn)化載體pBIN19上。使用得到的載體根據(jù)發(fā)表的方法(參見(jiàn)，例如，McElroy et al.，1991，PlantCell 3(11)1155～1165；Nakayama et al.，1995，Plant Mol.Biol.27(1)17～26；Su et al.，1998，Plont Physiol.117(3)913～922；Cornejo et al.，1993，Plant Mol.Biol.23(3)567～581；Xu et al.，1993，Plant Mol.Biol.22(4)573～588)對(duì)水稻植株(Oryza satva w.Taiper 309)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
使用以前描述的(McNellis et al.，1994b)和這里討論的植株發(fā)芽，生長(zhǎng)條件和來(lái)源對(duì)幼苗進(jìn)行評(píng)估。蛋白免疫印跡按照以前的描述(McNellis et al.，1994a)和上文材料與方法中提出的進(jìn)行。
轉(zhuǎn)化的水稻幼苗既包含野生水稻CoP1基因還包括編碼螺旋結(jié)構(gòu)域擬南芥蛋白的轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因植株在黑暗中不產(chǎn)生打開(kāi)的伸展的葉片。另外，轉(zhuǎn)基因水稻幼苗與相同弱光條件下生長(zhǎng)的非轉(zhuǎn)化水稻幼苗相比具有更短更強(qiáng)壯的莖和更綠更完善的葉片。在相同環(huán)境條件下生長(zhǎng)至成熟，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(即野生型)水稻植株在地上莖生長(zhǎng)和谷物產(chǎn)量方面沒(méi)有顯著差異。實(shí)例12.使用傳統(tǒng)植物育種制備轉(zhuǎn)化的水稻植株實(shí)例11中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因水稻植株與非轉(zhuǎn)基因水稻植株(或另一水稻植株系、栽培種或品種)進(jìn)行有性雜交并收集得到的種子。種植該種子，幼苗首先在黑暗中生長(zhǎng)然后在弱光條件下生長(zhǎng)，篩選轉(zhuǎn)化的幼苗。轉(zhuǎn)化的幼苗長(zhǎng)至成熟，收集自交得到的種子，產(chǎn)生大量用于水稻農(nóng)作物種植的轉(zhuǎn)基因種子。
另外，成熟的轉(zhuǎn)化植株與不同的水稻系(一種姐妹系或不同的品種)進(jìn)行雜交產(chǎn)生雜交種子，得到的雜交種子混合并用于產(chǎn)生雜種水稻農(nóng)作物。
如在以上材料與方法中所討論的，這些育種方法可能存在許多變化。例如，在用于生產(chǎn)自交或雜交的種子之前，最初得到的轉(zhuǎn)化幼苗可能已經(jīng)過(guò)一代或若干代的自交。有關(guān)水稻生產(chǎn)方法的討論，參見(jiàn)Langer et al.，1991，Agricultrual Plants，Second Edition，Oambridge University Press and Coffman et al.，1980，Chapter36，In Hybridization of Crop Plants，The American Society ofAgronomy，Inc.Madison，WI。實(shí)例13.使用TCOP1基因的螺旋結(jié)構(gòu)域制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因蕃茄如上面所討論的，F(xiàn)rances et al.，(1998)已從蕃茄中克隆了擬南芥COP1基因的同源物，命名為TCOP1。根據(jù)這里描述的方法，把TCOP1基因的螺旋結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)入載體。得到的載體用于制備轉(zhuǎn)化的蕃茄植株并用實(shí)例9和10中的方法對(duì)這些植株進(jìn)行鑒定和/或使用。實(shí)例14.使用水稻COP1基因的N-末端序列制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻系如以上的討論，Tsuge et al.，(1998)從水稻中克隆了擬南芥COP1基因的同源物。根據(jù)這里描述的方法把水稻COP1基因的螺旋結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)入載體，得到的載體用于制備轉(zhuǎn)化的水稻植株并用實(shí)例11和12中的方法對(duì)這些植株進(jìn)行鑒定和/或使用。實(shí)例15.使用COP1的螺旋結(jié)構(gòu)域，HY5和GFP制備轉(zhuǎn)化的擬南芥植株這一實(shí)例涉及對(duì)轉(zhuǎn)化的擬南芥細(xì)胞中螺旋結(jié)構(gòu)域定位的分析，它把COP1的螺旋結(jié)構(gòu)域和HY5同一種示范標(biāo)記基因，綠色熒光蛋白(GFP)進(jìn)行融合。HY5是一種bZIP蛋白，它是光形態(tài)建成發(fā)育的正調(diào)節(jié)物，由Ang et al.，(1998)描述。
對(duì)于制備轉(zhuǎn)基因擬南芥細(xì)胞適用的構(gòu)建體、載體和轉(zhuǎn)化方法在上文提出。對(duì)于包含GFP編碼序列的構(gòu)建體的更具體的進(jìn)一步指導(dǎo)可參見(jiàn)U.S.Patent Nos.5,783,393和5,783,431，兩者在這里均作為參考引入。
對(duì)于擬南芥細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)分析將表明融合蛋白的細(xì)胞定位，該融合蛋白包含與GFP相連接的螺旋結(jié)構(gòu)域和HY5。通過(guò)熒光顯微鏡和亞細(xì)胞分級(jí)分離能夠確定融合蛋白的細(xì)胞位置。
前面的詳細(xì)描述僅用來(lái)促進(jìn)理解的清晰而不應(yīng)把它們看作不必要的限制，因?yàn)樽兓瘜?duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員非常明顯。
本發(fā)明雖然是以其特定的方案進(jìn)行描述，應(yīng)該理解它可以進(jìn)一步改變。本申請(qǐng)旨在包含本發(fā)明的任何變化，應(yīng)用或改裝，這些變化遵循本發(fā)明的原則，包含本說(shuō)明書的這樣一些變更本領(lǐng)域內(nèi)本發(fā)明的已知或常規(guī)應(yīng)用；可能被應(yīng)用于這之前提出的主要特性；處于所附權(quán)利要求的范疇。
參考文獻(xiàn)以上和以下引用的所有文獻(xiàn)，文章、教科書和專利在此全文引入作為參考。Ahmad，M.and Cashmore，A.R.(1993)。參與擬南芥藍(lán)光感受的HY4基因編碼具有藍(lán)光光受體特征的蛋白。Nature 366，162-166。Ang，L.-H.and Deng，X.-W.(1994).光形態(tài)發(fā)生基因座的調(diào)控等級(jí)等位基因特異性和HY5與COP1基因座的光依賴相互作用。PlantCell 6，613-628.Ang，L.-H.，Chattoadhyay，S.，Wei，N.，Oyama，T.，Okada，K.，Batshauer，A.and Deng，X.-W.(1998)COP1和HY5間的分子相互作用限定了幼苗發(fā)育光控制的調(diào)控開(kāi)光。Molecular Cell，1，213-222.Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，andStruhl，K.eds(1994).釀酒酵母，《當(dāng)代分子生物學(xué)方法增補(bǔ)本》。(New YorkJohn Wiley&Sons).Bechtold，N.，Ellis，J.and Pelletier，G.(1993)植物中通過(guò)擬南芥成年植株浸滲進(jìn)行的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。C，R.Acad.Sci.Ser.III Sci.yi，316，1194-1199.Bellon，S.F.，Rodgers K.K.，Schatz，D.G.，Coleman，J.E.and Steitz，T.A.(1997)RAG1二聚體結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)表明了多個(gè)包含新的鋅雙核簇的鋅結(jié)合基序。Nature Struc.Biol.，4，586-591.Berg，J.and 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Yale University<120>在弱光環(huán)境下更好的出芽特性和改善的幼苗生長(zhǎng)<130>44574-5042-WO<140><141><150>US60/101,992<151>1998-09-28<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>888<212>DNA<213>擬南芥<220><221>CDS<222>(43)..(888)<223>COP1基因的N282區(qū)<400>1caaaaaccaa aatcacaatc gaagaaatct tttgaaagca aa atg gaa gag att54Met Glu Glu Ile1tcg acg gat ccg gtt gtt cca gcg gtg aaa cct gac ccg aga aca tct 102Ser Thr Asp Pro Val Val Pro Ala Val Lys Pro Asp Pro Arg Thr Ser5 10 15 20tca gtt ggt gaa ggt gct aat cgt cat gaa aat gac gac gga gga agc 150Ser Val Gly Glu Gly Ala Asn Arg His Glu Asn Asp Asp Gly Gly Ser25 30 35ggc ggt tct gag att gga gca ccg gat ctg gat aaa gac ttg ctt tgt 198Gly Gly Ser Glu Ile Gly Ala Pro Asp Leu Asp Lys Asp Leu Leu Cys40 45 50ccg att tgt atg cag att att aaa gat gct ttc ctc acg gct tgt ggt 246Pro Ile Cys Met Gln Ile Ile Lys Asp Ala Phe Leu Thr Ala Cys Gly55 60 65cat agt ttc tgc tat atg tgt atc atc aca cat ctt agg aac aag agt 294His Ser Phe Cys Tyr Met Cys Ile Ile Thr His Leu Arg Asn Lys Ser70 75 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權(quán)利要求
1.一種植物細(xì)胞，包括一種COP1基因并且另外包含一段編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，其中該植物細(xì)胞不含另外可表達(dá)的編碼COP1基因環(huán)指結(jié)構(gòu)域或WD-40結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，它們與該螺旋結(jié)構(gòu)域核苷酸序列相連系。
2.權(quán)利要求1中的植物細(xì)胞，其中編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列是SEQ ID NO3。
3.權(quán)利要求1中的植物細(xì)胞，其中編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列是編碼SEQ ID NO4的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1中的植物細(xì)胞，其中編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列由編碼COP1基因氨基酸位置128至209的堿基組成。
5.權(quán)利要求1中的植物細(xì)胞，其中編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列由編碼COP1基因氨基酸位置1～38和104～282的堿基組成。
6.一種植物，包含一種或多種選自權(quán)利要求1，2，3，4，和5中的植物細(xì)胞。
7.一種植物，包含一段編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域氨基酸的核苷酸序列，其中a.在極端弱光條件或完全黑暗條件下該植株幼苗的表現(xiàn)型以沒(méi)有葉片伸展為特點(diǎn)，這一點(diǎn)與相同條件下的野生型幼苗相似；和b.在弱光條件下該植株的幼苗的表現(xiàn)型的特點(diǎn)是與相同弱光條件下生長(zhǎng)的野生型幼苗相比具有較短的下胚軸。
8.一種純化的和分離的DNA分子，包含一段編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域或其功能等價(jià)片段的核苷酸序列。
9.一種化學(xué)合成的DNA分子，包含一段編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域或其功能等價(jià)片段的核苷酸序列。
10.一種純化和分離的RNA分子，包含一段編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域或其功能等價(jià)片段的核苷酸序列。
11.一種化學(xué)合成的RNA分子，包含一段編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域或其功能等價(jià)片段的核苷酸序列。
12.一種純化和分離的多肽，包含一段含有COP1螺旋結(jié)構(gòu)域或其功能等價(jià)片段的氨基酸序列。
13.一種改變幼苗出芽和生長(zhǎng)特性的方法，其特征在于把一種DNA分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，該分子含有一段編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域或其功能等價(jià)片段的核苷酸序列。
14.一種改變幼苗出芽和生長(zhǎng)特性的方法，其特征在于把一種RNA分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，該分子含有一段編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域或其功能等價(jià)片段的核苷酸序列。
15.一種載體，包含權(quán)利要求8或9中的DNA分子。
16.一種用權(quán)利要求15中的載體轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞選自原核細(xì)胞，真菌細(xì)胞和光合作用真核細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的光合作用真核宿主細(xì)胞，其中光合作用真核宿主選自單子葉和雙子葉植物。
18.權(quán)利要求16的光合作用真核宿主細(xì)胞，其中光合作用真核宿主選自擬南芥、菠菜、蕃茄、豌豆和水稻。
19.一種從權(quán)利16，17或18的光合作用真核宿主細(xì)胞再生得到的植株。
20.權(quán)利要求19中植株的后代，其中該后代產(chǎn)生螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白。
21.一種轉(zhuǎn)基因原核、真菌或光合作用真核生物，其中 8或9中的DNA序列被引入該生物的基因組DNA并借此產(chǎn)生生產(chǎn)螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白的轉(zhuǎn)基因生物。
22.一種改變內(nèi)源野生型COP1基因正常功能的方法，其中該方法包括a.制備包含編碼COP1基因螺旋結(jié)構(gòu)域核苷酸序列的載體，其中該載體不含另外可表達(dá)的編碼COP1基因環(huán)指結(jié)構(gòu)域或WD-40結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，它們與該螺旋結(jié)構(gòu)域核苷核序列相連系；和b.把該載體插入到選自原核細(xì)胞、真菌細(xì)胞和光合作用真核細(xì)胞的細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括從轉(zhuǎn)化的光合作用真核細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植株。
24.權(quán)利要求23的方法，進(jìn)一步包括從轉(zhuǎn)化再生植株產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的后代。
25.權(quán)利要求24的方法，進(jìn)一步包括a.把再生轉(zhuǎn)化植株與其它植株有性雜交；b.收集得到的種子；c.在極度弱光水平下從得到的種子生長(zhǎng)出幼苗并篩選出那些很少或沒(méi)有葉伸展的幼苗；和d.在低光水平下生長(zhǎng)選自步驟C的幼苗并篩選轉(zhuǎn)化的幼苗，它們與相同低光條件下生長(zhǎng)的野生型幼苗相比具有較短的下胚軸。
26.一種制備轉(zhuǎn)化幼苗的方法，該幼苗在黑暗中出芽和在弱光條件下生長(zhǎng)時(shí)具有改變了的表現(xiàn)型，其中這一方法包括a.制備包含一種分離的DNA序列的載體，該序列編碼COP1螺旋結(jié)構(gòu)域的氨基酸；b.把該載體插入植物細(xì)胞；c.從轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞生產(chǎn)能存活的轉(zhuǎn)化親本植株；和d.從可存活轉(zhuǎn)化親本植株的種子生長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化的幼苗。
27.權(quán)利要求26的方法，其中改變的幼苗表現(xiàn)型的特征在于在黑暗中幼苗出芽時(shí)轉(zhuǎn)化的幼苗具有基本上沒(méi)有打開(kāi)的，緊密的野生型葉片；在低光水平下生長(zhǎng)時(shí)轉(zhuǎn)化的幼苗與相同低光條件下生長(zhǎng)的非轉(zhuǎn)化野生型幼苗相比黃萎現(xiàn)象減弱。
28.權(quán)利要求26的方法，其中改變的幼苗表現(xiàn)型的特征在于在黑暗中幼苗出芽時(shí)轉(zhuǎn)化的幼苗具有基本上野生型的葉片發(fā)育；在弱光水平下生長(zhǎng)時(shí)轉(zhuǎn)化的幼苗與相同弱光條件下生長(zhǎng)的非轉(zhuǎn)化野生型幼苗相比具有更短更強(qiáng)壯的莖和更綠更完善的葉片。
29.權(quán)利要求15，22和26中的載體，其中該載體進(jìn)一步包含與分離的DNA序列可操作連接的啟動(dòng)子。
30.一種種植農(nóng)作物的方法，其中該農(nóng)作物包括至少一種選自權(quán)利要求6，7，19和23中的植物。
31.一種種植農(nóng)作物的方法，其中該農(nóng)作物包括至少一種選自權(quán)利要求20和24的后代的植物。
32.權(quán)利要求25和26的方法，其中該方法進(jìn)一步包括種植農(nóng)作物，其中該農(nóng)作物包括至少一種轉(zhuǎn)化的幼苗。
33.一種純化和分離的DNA分子，由SEQ ID NO3的序列組成。
34.一種分離的核酸分子，它在嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO3雜交。
35.一種分離的多肽，它由權(quán)利要求34中的核酸分子編碼。
36.一種純化和分離的DNA分子，它所編碼的蛋白與SEQ ID NO4序列所編碼的多肽有至少70％序列同一性。
37.一種純化和分離的DNA分子，它所編碼的蛋白與SEQ ID NO4序列所編碼的多肽有至少80％序列同一性。
38.一種具有以下生理和形態(tài)特征的植株a.在極度弱光條件或完全黑暗中該植株幼苗表現(xiàn)型以葉片沒(méi)有伸展為特點(diǎn)，這一點(diǎn)與相同條件下的野生型幼苗相似；和b.在弱光條件下該植株幼苗表現(xiàn)型的特征在于與相同弱光條件下生長(zhǎng)的野生型幼苗相比具有較短的下胚軸。
全文摘要
本發(fā)明有關(guān)一種幼苗,該幼苗當(dāng)在黑暗中生長(zhǎng)時(shí),能表現(xiàn)出更好的出芽特性并且在低光水平條件下該幼苗的生長(zhǎng)得到改善。更具體一些,本發(fā)明有關(guān)于制備植物細(xì)胞和整個(gè)植株,它們含有編碼螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列,同時(shí)含有編碼野生型COP1基因的序列。本發(fā)明的植株在黑暗中幼苗出芽時(shí)會(huì)形成未打開(kāi)的,緊密的葉子,出芽后在低光條件下生長(zhǎng)幼苗的黃萎現(xiàn)象會(huì)減弱。本發(fā)明還有關(guān)于使這些優(yōu)良的性狀能夠轉(zhuǎn)入野生型植株的育種方法。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1329670SQ99813828
公開(kāi)日2002年1月2日 申請(qǐng)日期1999年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月28日
發(fā)明者X·W·鄧, T·麥內(nèi)利斯, K·托里 申請(qǐng)人:耶魯大學(xué)