專(zhuān)利名稱(chēng)：同源性犬埃里希體28千道爾頓免疫優(yōu)勢(shì)蛋白質(zhì)基因及其用途的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體說(shuō)，本發(fā)明涉及犬埃里希體中同源性28-kDa蛋白質(zhì)基因和編碼犬埃里希體28-kDa同源性蛋白質(zhì)的多基因基因座的分子克隆和特征確定及它們的用途。
相關(guān)領(lǐng)域描述犬埃里希病，即犬熱帶全血細(xì)胞減少癥，是1935年在非洲和1963年在美國(guó)首先報(bào)道的犬蜱傳立克次氏體病(Donatien和Lestoquard，1935；Ewing，1963)。自越南戰(zhàn)爭(zhēng)期間在美國(guó)軍犬中流行性發(fā)作后，對(duì)這種疾病有了更好的認(rèn)識(shí)(Walker等人，1970)。
犬埃里希病的病原微生物是犬埃里希體(Ehrlichia canis)，一種小型、革蘭氏陰性、專(zhuān)性胞內(nèi)菌，對(duì)單核吞噬細(xì)胞表現(xiàn)出向性(Nyindo等人，1971)，由一種棕色犬虱(Rhipicephalus sanguineus)傳播(Groves等人，1975)。犬埃里希病的發(fā)病有三個(gè)階段，急性、亞臨床性和慢性。急性階段的特征是發(fā)燒、厭食、抑郁、淋巴結(jié)病和血小板輕度減少(Troy和Forrester，1990)。犬類(lèi)通?？梢詮募毙噪A段恢復(fù)，但會(huì)在幾個(gè)月或幾年中成為該微生物持續(xù)感染攜帶者而無(wú)疾病的臨床征象(Harrus等人，1998)。一些病犬中慢性期發(fā)展的特征是血小板減少、血球蛋白過(guò)多、厭食、憔悴和出血，尤其是出鼻血，隨后死亡(Troy和Forrester，1990)。
根據(jù)對(duì)16S rRNA基因的分子分類(lèi)分析已確定犬埃里希體和恰菲埃里希體(E.chaffeensis)(一種人單核細(xì)胞埃里希病(HME)的病原微生物)密切相關(guān)(Anderson等人，1991；Anderson等人，1992；Dawson等人，1991；Chen等人，1994)。已報(bào)道了犬埃里希體和恰菲埃里希體之間64、47、40、30、29和23-kDa抗原的相當(dāng)程度的交叉反應(yīng)性(Chen等人，1994；Chen等人，1997；Rikihisa等人，1994；Rikihisa等人，1992)。用免疫印跡分析了與人和犬恢復(fù)期血清起免疫反應(yīng)的抗原，鑒定了犬埃里希體多個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)蛋白，包括30-kDa蛋白質(zhì)(Chen等人，1997)。另外，犬埃里希體的30-kDa蛋白也被視為在免疫應(yīng)答中被早期識(shí)別的主要免疫優(yōu)勢(shì)抗原，這與恰菲埃里希體的30-kDa蛋白的抗原性不同(Rikihisa等人，1992；Rikihisa等人，1994)。還鑒定了分子量范圍20到30-kDa的犬埃里希體的其他免疫優(yōu)勢(shì)蛋白(Brouqui等人，1992；Nyindo等人，1991；Chen等人，1994；Chen等人，1997)。
最近，已有恰菲埃里希體編碼23到28-kDa蛋白的多基因家族(omp-1)的克隆和測(cè)序的描述(Ohashi等人，1998)?？寺×饲》瓢＠锵ｓw的28-kDa免疫優(yōu)勢(shì)外膜蛋白質(zhì)基因(p28)，該基因與反芻類(lèi)考德里氏體(Cowdriaruminantium)map-1基因同源。用重組p28免疫接種的小鼠受到保護(hù)能抵抗同源菌株的感染攻擊，這是依據(jù)攻擊后第5天外周血的PCR分析結(jié)果(Ohashi等人，1998)。還報(bào)道了分子克隆了犬埃里希體的兩種類(lèi)似的、但不相同的串聯(lián)排列的28-kDa基因，它們與恰菲埃里希體的omp-1基因家族和反芻類(lèi)考德里氏體的map-1基因同源(Reddy等人，1998)。
現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于，沒(méi)有對(duì)犬埃里希體的新的同源性28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)基因和含同源28-kDa蛋白質(zhì)基因的單個(gè)多基因基因座進(jìn)行克隆并確定特征。另外，現(xiàn)有技術(shù)的缺陷還在于，沒(méi)有這些犬埃里希體免疫反應(yīng)性基因的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明填補(bǔ)了本領(lǐng)域該長(zhǎng)期以來(lái)的需要和愿望。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了犬埃里希體的同源性成熟28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)基因(命名為Eca28-1、ECa28SA3和ECa28SA2)的分子克隆、測(cè)序、特性分析和表達(dá)，以及含5個(gè)犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因(ECa28SA1、ECa28SA2、ECa28SA3、ECa28-1和ECa28-2)的單基因座(5.592-kb)的鑒定。與恰菲埃里希體相比，在犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因中，ECa28-1具有與恰菲埃里希體omp-1多基因家族最大的氨基酸同源性，且在犬埃里希體分離物中高度保守。預(yù)計(jì)這5個(gè)28-kDa蛋白含有形成成熟蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和同源范圍51-72％的氨基酸?；蜷g隔區(qū)分析揭示了各基因的假設(shè)啟動(dòng)子區(qū)，提示這些基因獨(dú)立和差異性表達(dá)?；蜷g非編碼區(qū)域的大小范圍為229到335-bp，且48-71％同源。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了DNA序列，它們編碼犬埃里希體的30-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，該蛋白質(zhì)具有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的氨基酸序列。該基因具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的核酸序列，而且是多態(tài)基因家族的成員。通常，該蛋白質(zhì)的N端信號(hào)序列在翻譯后加工后被切下，從而產(chǎn)生成熟的28-kDa蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，在一個(gè)多基因基因座中包含編碼諸28-kDa蛋白質(zhì)的DNA，該基因座的大小為5.592kb，且編碼所有這5種犬埃里希體同源性28-kDa蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了一種表達(dá)載體，該載體含有一個(gè)基因，它編碼犬埃里希體的28kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)，而且當(dāng)該載體被引入細(xì)胞時(shí)，能表達(dá)該基因。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種重組蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有一個(gè)選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的氨基酸序列。優(yōu)選氨基酸序列是由一個(gè)選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的核酸序列編碼的。優(yōu)選地，該重組蛋白質(zhì)含有4個(gè)表面外露的、親水性和抗原性可變區(qū)。該重組蛋白質(zhì)可用作抗原。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了一種產(chǎn)生該重組蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟獲得含有一表達(dá)區(qū)的載體，該表達(dá)區(qū)含有編碼選自SEQ ID NO2、SEQ IDNO4和SEQ ID NO6的氨基酸序列的序列，該序列和一啟動(dòng)子可操縱性連接；將該載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞；并在有效表達(dá)該表達(dá)區(qū)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
在某些實(shí)施例中，還描述了本發(fā)明抑制個(gè)體內(nèi)犬埃里希體感染的方法，包括如下步驟鑒定懷疑接觸過(guò)或被犬埃里希體感染的個(gè)體；并給予劑量能有效抑制犬埃里希體感染的、含有犬埃里希體28-kDa抗原的組合物。該抑制可通過(guò)任何方法，如刺激個(gè)體的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，或用其它方法，如抑制28-kDa抗原的正常功能，或甚至與該抗原競(jìng)爭(zhēng)和個(gè)體內(nèi)某些(傳染)因子相互作用。
本發(fā)明的其它和進(jìn)一步的方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將經(jīng)過(guò)下面為了公開(kāi)的目的給出的本發(fā)明的優(yōu)選例的描述而變得明白。
附圖簡(jiǎn)述因此，將獲得并詳細(xì)理解本發(fā)明上述特征、優(yōu)點(diǎn)和目的中的內(nèi)容，以及其它將變得清楚的內(nèi)容，更具體的、對(duì)本發(fā)明上面簡(jiǎn)述的內(nèi)容將參考某些帶


的實(shí)施例。這些圖是說(shuō)明書(shū)的一部分。然而要注意的是，

了本發(fā)明的優(yōu)選例，而不應(yīng)認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
圖1顯示了包括相鄰5’和3’非編碼區(qū)域的ECa28-1基因的核酸序列(SEQID NO1)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。粗體顯示了ATG起始密碼子和TAA終止子，對(duì)23氨基酸前導(dǎo)信號(hào)序列加下劃線。
圖2顯示表達(dá)的50-kDa重組ECa28-1-硫氧還蛋白融合蛋白(泳道1，箭頭)和16-kDa硫氧還蛋白對(duì)照(泳道2，箭頭)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，和由恢復(fù)期犬埃里希體犬類(lèi)抗血清識(shí)別的重組ECa28-1-硫氧還蛋白融合蛋白的相應(yīng)免疫印跡(泳道3)。未用犬埃里希體抗血清檢測(cè)硫氧還蛋白對(duì)照(沒(méi)有顯示)。
圖3顯示了ECa28-1蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)、ECa28SA2(部分序列，SEQID NO7)和ECa28SA1(SEQ ID NO8)、恰菲埃里希體P28(SEQ ID NO9)、恰菲埃里希體OMP-1家族(SEQ ID NO10-14)和反芻類(lèi)考德里氏體MAP-1(SEQ ID NO15)的氨基酸序列的排列對(duì)比。Eca28-1氨基酸序列作為共有序列。沒(méi)有顯示出字母的是與ECa28-1相同的氨基酸，用點(diǎn)表示。用相應(yīng)的單字母縮寫(xiě)顯示趨異的氨基酸。用劃線指出為最大程度進(jìn)行氨基酸序列的排列對(duì)比而引入的空隙。可變區(qū)加下劃線，且命名為VR1、VR2、VR3和VR4。箭頭指出信號(hào)肽的預(yù)計(jì)的信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)。
圖4用不平衡的樹(shù)結(jié)構(gòu)顯示了犬埃里希體ECa28-1與ECa28SA2(部分序列)和ECa28SA1、恰菲埃里希體omp-1多基因家族的6個(gè)成員、和反芻類(lèi)考德里氏體map-1(演繹出的氨基酸序列)的系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)性。每對(duì)樹(shù)枝的長(zhǎng)度代表各對(duì)氨基酸序列之間的差異距離。由比例尺確定序列間的差異距離。
圖5顯示了用6種獨(dú)立的限制性?xún)?nèi)切酶完全消化、與ECa28-1 DIG-標(biāo)記的探針雜交(泳道2-7)；DIG-標(biāo)記的分子量標(biāo)記(泳道1和8)對(duì)犬埃里希體基因組DNA進(jìn)行的Southern印跡分析。
圖6顯示了ECa28-1(Jake菌株)和恰菲埃里希體P28(Arkansas菌株)預(yù)計(jì)的蛋白質(zhì)特征的比較。用六肽作為窗口，表面可能性預(yù)測(cè)表面殘基。表面殘基是任何帶有水可接進(jìn)的表面區(qū)域＞2.0nm2的殘基。此值大于1的六肽被視為表面區(qū)?？乖灾笖?shù)可預(yù)測(cè)潛在的抗原性決定簇。此值大于0的區(qū)域是潛在的抗原性決定簇。通過(guò)用具有殘基1-甘氨酸或極性氨基酸、殘基2-疏水氨基酸、殘基3-疏水氨基酸、殘基4-疏水氨基酸或脯氨酸，和殘基5-極性氨基酸或甘氨酸的一種5氨基酸基序，T細(xì)胞基序定位了潛在的T細(xì)胞抗原性決定簇。這些比例尺表明氨基酸的位置。
圖7顯示了犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因ECa28SA2(核苷酸1-849；SEQID NO3；氨基酸序列SEQ ID NO4)和ECa28SA3(核苷酸1195-2031；SEQ IDNO5；氨基酸序列SEQ ID NO6)的核酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列，包括基因間非編碼序列(NC2，核苷酸850-1194；SEQ ID NO31)。以粗體顯示ATG起始密碼子和終止密碼子。
圖8顯示了5個(gè)犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因的基因座(5.59-Kb)的圖解，表明基因組取向和基因間非編碼區(qū)(28NC1-4)?；蜃?和2(陰影)中所顯示的28-kDa蛋白質(zhì)基因已有人描述過(guò)(McBride等人，1999；Reddy等人，1998；Ohashi等人，1998)。命名和測(cè)定了ECaSA2和新型28-kDa蛋白質(zhì)基因(命名為ECa28SA3-無(wú)陰影)的完整序列。ECaSA2、ECa28SA3和ECa28-1之間的非編碼基因間區(qū)(28NC2-3)完成了對(duì)上述不連接的基因座1和2的連接。
圖9用不平衡的樹(shù)結(jié)構(gòu)，根據(jù)氨基酸序列顯示了五個(gè)犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因成員的系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)性。每對(duì)樹(shù)枝的長(zhǎng)度代表各對(duì)氨基酸序列間的差異距離。由比例尺確定序列間的差異距離。
圖10顯示了犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因的基因間非編碼核酸序列(SEQID NO30-33)的排列對(duì)比。沒(méi)有顯示的、用點(diǎn)(.)表示的核酸是與非編碼區(qū)1(28NC1)相同的。用相應(yīng)的單字母縮寫(xiě)顯示趨異。用劃線(-)指出為最大程度進(jìn)行氨基酸序列的排列對(duì)比而引入的空隙。推定的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域(-10和-35)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)加框。
發(fā)明詳述本發(fā)明描述了犬埃里希體的編碼30-千道爾頓(kDa)蛋白質(zhì)的同源基因的克隆、測(cè)序和表達(dá)。還進(jìn)行了七種犬埃里希體分離物和恰菲埃里希體omp-1多基因家族中同源基因的分子比較分析。鑒定出兩種新型28-kDa蛋白質(zhì)基因，ECa28-1和ECa28SA3。ECa28-1含有編碼278個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)834-bp的開(kāi)放讀框，該蛋白質(zhì)預(yù)計(jì)分子量為30.5-kDa。鑒定了N端信號(hào)序列表明該蛋白在翻譯后被修飾成27.7-kDa的成熟蛋白質(zhì)。ECa28SA3含有編碼280氨基酸蛋白質(zhì)(SEQ ID NO6)的840-bp開(kāi)放讀框。
用PCR完成了對(duì)犬埃里希體的28-kDa蛋白質(zhì)基因(一種ECa28SA2先前未測(cè)序過(guò)的區(qū)域)的擴(kuò)增。測(cè)序分析ECa28SA2表明849-bp開(kāi)放讀框編碼283氨基酸蛋白質(zhì)(SEQ ID NO4)。用對(duì)28-kDa蛋白質(zhì)基因的基因間非編碼區(qū)域特異性的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將兩個(gè)上述分開(kāi)的基因座連接起來(lái)，鑒定了含有所有5個(gè)28-kDa蛋白質(zhì)基因的單個(gè)基因座(5.592kb)。預(yù)計(jì)這5個(gè)28-kDa蛋白質(zhì)具有形成成熟蛋白質(zhì)的信號(hào)肽，且氨基酸的同源性范圍為51-72％?；蜷g隔區(qū)分析顯示了各基因的假定啟動(dòng)子區(qū)域，提示這些基因可能是獨(dú)自和差異性表達(dá)的?；蜷g非編碼區(qū)域(28NCl-4)的大小范圍為299到355bp，且48-71％同源。
本發(fā)明涉及犬埃里希體中的兩種新型同源28-kDa蛋白質(zhì)基因(ECa28-1和ECa28SA3)，和上述部分測(cè)序的ECa28SA2的完整序列。還公開(kāi)了編碼犬埃里希體所有5個(gè)同源性28-kDa外膜蛋白質(zhì)的多基因基因座。
在本發(fā)明的一實(shí)例中，提供了編碼一種犬埃里希體30-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的DNA序列。較佳地，該蛋白具有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ IDNO6的氨基酸序列，該基因具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的核酸序列，且是多態(tài)性多基因家族的成員。更優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)具有的N端信號(hào)序列在翻譯后加工后被切除，從而產(chǎn)生成熟的28-kDa蛋白質(zhì)。還優(yōu)選地，在單個(gè)多基因基因座中含有編碼28-kDa蛋白質(zhì)的DNA，該基因座的大小為5.592kb，編碼所有五種犬埃里希體的同源28-kDa蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了一種表達(dá)載體，它含有編碼犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的基因，能在該載體被引入細(xì)胞時(shí)，表達(dá)該基因。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種重組蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有一個(gè)選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的氨基酸序列。優(yōu)選氨基酸序列是由一個(gè)選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的核酸序列編碼的。優(yōu)選地，該重組蛋白質(zhì)含有4個(gè)表面外露的、親水性和抗原性可變區(qū)。還優(yōu)選地，該重組蛋白質(zhì)是一種抗原。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了一種產(chǎn)生該重組蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟獲得含有一表達(dá)區(qū)的載體，該表達(dá)區(qū)含有編碼選自SEQ ID NO2、SEQ IDNO4和SEQ ID NO6的氨基酸序列的序列，該序列和一啟動(dòng)子可操縱性連接；將載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞；并在有效表達(dá)該表達(dá)區(qū)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
在某些實(shí)施例中，還描述本發(fā)明抑制個(gè)體內(nèi)犬埃里希體感染的方法，包括如下步驟鑒定懷疑接觸過(guò)或被犬埃里希體感染的個(gè)體；并給予劑量能有效抑制犬埃里希體感染的、含有犬埃里希體28-kDa抗原的組合物。該抑制可通過(guò)任何方法，如刺激個(gè)體的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，或用其它方法，如抑制28-kDa抗原的正常功能，或甚至與該抗原競(jìng)爭(zhēng)和個(gè)體內(nèi)某些(轉(zhuǎn)染)因子相互作用。
根據(jù)本發(fā)明，使用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充分解釋。見(jiàn)例如，Maniatis，F(xiàn)ritsch & Sambrook，“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”(1982)；“DNA克隆實(shí)踐方法”，卷I和II(D.N.Glover編，1985)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait編，1984)；“核酸雜交”[B.D.Hames& S.J.Higgins編(1985)]；“轉(zhuǎn)錄和翻譯”[B.D.Hames & S.J.Higgins編(1984)]；“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)”[R.I.Freshney編(1986)]；“固定化細(xì)胞和酶”[IRLPress(1986)]；B.Perbal，“分子克隆實(shí)踐指南”(1984)。
因此，如果在本文中出現(xiàn)，下列術(shù)語(yǔ)具有以下定義。
“復(fù)制子”是一種基因元件(如質(zhì)粒、染色體、病毒)在體內(nèi)起到DNA復(fù)制的自發(fā)單位作用；即能在其自身的控制下復(fù)制。
“載體”是一種復(fù)制子，如質(zhì)粒、噬菌體和粘粒，另一條DNA節(jié)段可與其結(jié)合，從而引起該結(jié)合節(jié)段的復(fù)制。
“DNA分子”指脫氧核糖核酸(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)的聚合形式，不論單鏈形式還是雙鏈螺旋。該術(shù)語(yǔ)僅指分子的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，不將其限于任何特定的三級(jí)形式。因此，該術(shù)語(yǔ)尤其包括在線性DNA分子(如限制性片段)、病毒、質(zhì)粒和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA。在討論結(jié)構(gòu)時(shí)，根據(jù)常規(guī)，本文僅給出沿DNA非轉(zhuǎn)錄鏈(即與mRNA序列同源的鏈)5’到3’方向的序列。
DNA“編碼序列”是雙鏈DNA序列，當(dāng)其置于合適的調(diào)控序列的控制下時(shí)，在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽。5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定了編碼序列的邊界。編碼序列可包括，但不限于原核序列、來(lái)自真核生物mRNA的cDNA、真核生物(如哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’端。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸信號(hào)、終止子等，提供了宿主細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)。
“啟動(dòng)子序列”是能在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶，并引發(fā)下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。為了本發(fā)明的定義，啟動(dòng)子序列的邊界在其3’端為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并向上游(5’方向)延伸包括引發(fā)的超過(guò)背景的可檢測(cè)水平的轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目的堿基或元件。在啟動(dòng)子序列中，可找到一轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，和蛋白結(jié)合域(共有序列)，負(fù)責(zé)RNA聚合酶的結(jié)合。真核啟動(dòng)子常常，但不是總是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核啟動(dòng)子含有Shine-Dalgarno序列和-10和-35共有序列。
“表達(dá)控制序列”是控制和調(diào)節(jié)另一DNA序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。當(dāng)編碼序列在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制下”，RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后翻譯成編碼序列所編碼的蛋白質(zhì)。
“信號(hào)序列”可包括在編碼序列附近。該序列編碼信號(hào)肽，該多肽的N-末端，與宿主細(xì)胞聯(lián)系，指引該多肽到細(xì)胞表面或?qū)⒃摱嚯姆置诘浇橘|(zhì)中，而且在蛋白離開(kāi)細(xì)胞前，宿主細(xì)胞將信號(hào)肽切下。可發(fā)現(xiàn)信號(hào)序列與各種原核和真核生物天然的蛋白有關(guān)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指本發(fā)明的探針，定義為含有兩和多個(gè)，優(yōu)選三個(gè)以上脫氧核糖核苷酸的分子。它的確切大小取決于許多因素，這些因素進(jìn)而又取決于該寡核苷酸最終的功能和用途。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“引物”指一條寡核苷酸，不論是天然的純化的限制性消化物，或是合成產(chǎn)生的，當(dāng)其置于引物延伸產(chǎn)物合成的條件下，能作為合成起始點(diǎn)。在存在核苷酸和誘導(dǎo)劑，如DNA聚合酶和合適溫度和pH下合成的引物延伸產(chǎn)物與一核酸鏈互補(bǔ)。引物可以是單鏈或雙鏈，而且必須足夠長(zhǎng)，以在誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)所需延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度將取決于許多因素，包括溫度、引物來(lái)源和使用的方法。例如，為了診斷用途，由靶序列的復(fù)雜程度而定，寡核苷酸引物通常含有15-25個(gè)或更多的核苷酸，雖然它可含有較少的核苷酸。
本文選擇的引物與具體靶DNA序列的不同鏈“充分”互補(bǔ)。這意味著引物必須是充分互補(bǔ)，與它們各自鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的確切序列。例如，可將非互補(bǔ)的核苷酸片段與引物的5’末端結(jié)合，而引物剩余的序列和該鏈互補(bǔ)。另外，可將非互補(bǔ)堿基或較長(zhǎng)的序列分散在引物中，只要引物序列與該序列充分互補(bǔ)或與其雜交，從而形成延伸產(chǎn)物合成的模板。
用外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞，當(dāng)這樣的DNA被引入細(xì)胞時(shí)。轉(zhuǎn)化的DNA可以或可以不整合(共價(jià)連接)入細(xì)胞基因組。在例如原核生物、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化的DNA可維持在附加型元件，如質(zhì)粒上。對(duì)于真核細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是一種其中轉(zhuǎn)化DNA整合在染色體內(nèi)，從而通過(guò)染色體復(fù)制被子代細(xì)胞繼承的細(xì)胞。該穩(wěn)定性可由真核細(xì)胞建立一群含有轉(zhuǎn)化DNA的子代細(xì)胞的細(xì)胞系或克隆的能力所證實(shí)。“克隆”是由一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)祖先通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的一群細(xì)胞。“細(xì)胞系”是能在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)許多代的一原代細(xì)胞的克隆。
兩條DNA序列當(dāng)在其確定的長(zhǎng)度中至少約75％(較佳至少約80％，和最佳至少約90％或95％)核苷酸匹配時(shí)，這兩條DNA序列是“充分同源的”?？捎迷谛蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)中得到的標(biāo)準(zhǔn)軟件，或在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中(該實(shí)驗(yàn)在該特定系統(tǒng)確定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行)，比較二序列來(lái)鑒定充分同源的序列。確定合適的雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。見(jiàn)例如Maniatis等，見(jiàn)上；DNA克隆，卷I&II見(jiàn)上；核酸雜交，見(jiàn)上。
DNA構(gòu)建物的“異源”區(qū)是較大DNA分子中一種可鑒定的DNA節(jié)段，發(fā)現(xiàn)它與自然中的較大分子無(wú)關(guān)。因此，當(dāng)異源區(qū)編碼一哺乳動(dòng)物基因時(shí)，該基因兩側(cè)的DNA常常不是來(lái)源生物體基因組中該哺乳動(dòng)物基因組兩側(cè)的DNA。在另一個(gè)例子中，編碼序列是一種構(gòu)建物，其中該編碼序列本身在自然中未發(fā)現(xiàn)(如基因組編碼序列含有內(nèi)含子或具有與天然基因不同的密碼子的合成序列)。等位變體或天然發(fā)生的突變不會(huì)產(chǎn)生本文定義的DNA異源區(qū)域。
這些研究最常用的標(biāo)記是放射性元素、酶、在暴露于紫外光時(shí)會(huì)發(fā)熒光的化學(xué)物質(zhì)等。許多熒光物質(zhì)是已知的，可用作標(biāo)記。這些物質(zhì)包括例如熒光素、羅丹明、金胺、Texas Red、AMCA藍(lán)和Lucifer Yellow。特別的檢測(cè)材料是在山羊中制備的抗-兔抗體，并和熒光素通過(guò)異硫氰酸偶聯(lián)。
還可用放射性元素或酶標(biāo)記蛋白質(zhì)?？捎萌魏维F(xiàn)有計(jì)數(shù)程序檢測(cè)放射性標(biāo)記。優(yōu)選同位素可選自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re.
同樣可使用酶標(biāo)記，并可用任何現(xiàn)在使用的比色、分光光度、熒光分光光度、電流量分析或氣量分析技術(shù)檢測(cè)。酶和所選顆粒通過(guò)與橋聯(lián)分子，如碳二亞胺、二硫氰酸、戊二醛等反應(yīng)而偶聯(lián)。可用于這些過(guò)程的許多酶是已知的。優(yōu)選的是過(guò)氧化物酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿酶、葡萄糖氧化酶加過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,654,090，3,850,752和4,016,043所公開(kāi)的其它標(biāo)記物質(zhì)和方法。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“宿主”指不僅包括原核生物，還包括真核生物，如酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞?？捎镁幋a本發(fā)明犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白的重組DNA分子或基因，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)來(lái)轉(zhuǎn)化宿主。尤其優(yōu)選的是采用載體(該載體含有編碼本發(fā)明犬埃里希體28-kDa的免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的基因的編碼序列)轉(zhuǎn)化原核生物。
原核宿主可包括大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.tymphimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcesens)和枯草桿菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母如巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞。
一般與宿主聯(lián)用含有啟動(dòng)子序列(促進(jìn)插入的DNA片段有效轉(zhuǎn)錄)的表達(dá)載體。表達(dá)載體通常含有一復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子和能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇性的特異性基因?？砂凑毡绢I(lǐng)域已知方法發(fā)酵或培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主，以實(shí)現(xiàn)最佳細(xì)胞生長(zhǎng)。
本發(fā)明包括一種足夠純的、編碼犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的DNA，該DNA的一條鏈在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，將與含有SEQ ID NO1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸序列的探針雜交。本發(fā)明的DNA編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中列出的氨基酸具有至少80％(較佳85％，更佳90％，最佳95％)相同的序列。更優(yōu)選的，該DNA包括SEQ ID NO1或SEQ IDNO3或SEQ ID NO5的核苷酸編碼序列或該序列的簡(jiǎn)并變體。
與本發(fā)明的DNA雜交的探針優(yōu)選包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或SEQ IDNO5中列出的核苷酸編碼序列或其互補(bǔ)序列的至少20個(gè)，較佳40個(gè)，更佳50個(gè)，最佳100個(gè)或更多(多達(dá)100％編碼序列)連續(xù)核苷酸的序列。這樣的探針可用于檢測(cè)人細(xì)胞中犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的表達(dá)，使用的方法包括步驟(a)使獲自人細(xì)胞的mRNA與標(biāo)記的雜交探針接觸；和(b)檢測(cè)探針與mRNA的雜交。
本發(fā)明還包括一種足夠純的DNA，它含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或SEQ ID NO5中列出的核苷酸區(qū)域的至少15個(gè)(較佳20個(gè)，更佳30個(gè)，再更佳50個(gè)，最佳全部)連續(xù)核苷酸的序列。
“高度嚴(yán)謹(jǐn)性”指以高溫和低鹽濃度為特征的DNA雜交和洗滌條件，如65℃，鹽濃度約0.1×SSC的洗滌條件，或作用相當(dāng)?shù)臈l件。例如，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件可包括在約50％甲酰胺的存在下，約42℃雜交；用含有1％SDS的約2×SSC在約65℃第一次洗滌；然后用約0.1×SSC在約65℃第二次洗滌。
“基本純的DNA”指沒(méi)有該DNA天然存在環(huán)境伴隨部分的DNA，可通過(guò)分離(部分或完全純化)該環(huán)境中的某些或所有分子，或通過(guò)改變所稱(chēng)DNA的旁側(cè)序列而得到。因此該術(shù)語(yǔ)包括例如摻入載體、自身會(huì)復(fù)制的質(zhì)?；虿《局械?、或摻入原核或真核生物的基因組DNA中的；或作為分離分子(如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或限制性?xún)?nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA或基因組或cDNA片段)存在的，獨(dú)立于其它序列之外的重組DNA。它還包括如下重組DNA，即編碼其它多肽序列，如融合蛋白的雜交基因的一部分。還包括如下重組DNA，它包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或SEQ ID NO5中列出的核苷酸的一部分，它編碼一種編碼犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的基因的另一種剪接變體。
該DNA可具有與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或SEQ ID NO5中列出的核苷酸編碼序列至少約70％，較佳至少75％(如，至少80％)；和最佳至少90％相同的序列。兩條序列之間的相同性是相匹配或相同位置數(shù)的直接函數(shù)。當(dāng)兩條序列中的一個(gè)亞基位置為相同單體亞基占據(jù)時(shí)，例如，如果兩條DNA分子中的某給定位置都為腺苷酸占據(jù)，那么它們?cè)谠撐恢檬窍嗤?。例如，如果在長(zhǎng)度為10個(gè)核苷酸的序列中，有7個(gè)位置和第二條10個(gè)核苷酸序列中相應(yīng)位置是相同的，那么這兩條序列具有70％相同的序列。比較序列的長(zhǎng)度一般至少是50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少75個(gè)核苷酸，最優(yōu)選100個(gè)核苷酸。通常用序列分析軟件(如Genetics Computer Group，University ofWisconsin Biotechnology Center，1710 Unversity Avenue，Madison，WI 53705的序列分析軟件包)測(cè)量序列相同性。
本發(fā)明包括一個(gè)載體，它含有一條編碼一基因的DNA序列，該基因編碼犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)，所述載體能在宿主中復(fù)制，它包括可操縱連接的；a)復(fù)制起始點(diǎn)；b)啟動(dòng)子；和c)編碼所述蛋白質(zhì)的DNA序列。優(yōu)選的，本發(fā)明的載體含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或SEQ ID NO5中所示DNA序列的一部分。
“載體”可定義為可復(fù)制性核酸構(gòu)建物，如質(zhì)?；虿《竞怂?。可用載體擴(kuò)增和/或表達(dá)編碼犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的核酸。表達(dá)載體是一種可復(fù)制性構(gòu)建物，其中編碼多肽的核酸序列與能影響該多肽在細(xì)胞中表達(dá)的合適的控制序列可操縱性連接。對(duì)控制序列的需要視所選的細(xì)胞和所選的轉(zhuǎn)化方法而不同。一般，控制序列包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。見(jiàn)例如，Sambrook等人，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第二版)Cold Spring，Harbor Press，N.Y.所述的技術(shù)。如果轉(zhuǎn)錄控制序列有效控制某基因的轉(zhuǎn)錄，該基因及其轉(zhuǎn)錄控制序列就定義為已被“可操縱性連接”。本發(fā)明的載體包括但不限于，質(zhì)粒載體和病毒載體。本發(fā)明優(yōu)選的病毒載體是衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、SV40病毒或皰疹病毒的載體。
“基本純的蛋白質(zhì)”指與至少一部分天然伴隨成分相分離的蛋白質(zhì)。通常，當(dāng)某蛋白質(zhì)從與其在體內(nèi)天然相伴的蛋白質(zhì)或其它天然存在的有機(jī)分子中分離出至少60％重量時(shí)，它是基本純的。較佳的，制備物的純度至少是75％，更佳至少90％，最佳至少99％(重量)?？赏ㄟ^(guò)從天然來(lái)源抽提；通過(guò)編碼犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的重組核酸的表達(dá)；或通過(guò)化學(xué)合成蛋白質(zhì)，獲得足夠純的犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)?？捎萌魏魏线m的方法，如柱層析(例如，使用對(duì)犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)特異性的抗體進(jìn)行免疫親和層析)，聚丙烯酰胺凝膠電泳，或HPLC分析測(cè)定純度。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與其天然狀態(tài)時(shí)伴隨的至少某些污染物相分離時(shí)，它是基本無(wú)天然伴隨成分的?；瘜W(xué)合成的、或在不同于天然起源細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，從定義上講，是基本沒(méi)有其天然伴隨成分的。因此，足夠純的蛋白質(zhì)包括在大腸桿菌、其它原核生物中或其它該蛋白質(zhì)天然不存在的生物體中合成的真核蛋白質(zhì)。
除了基本上全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)外，本發(fā)明還包括犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2或SEQ ID NO4或SEQ ID NO6)的片段(如抗原性片段)。本文所用的“片段”用于多肽時(shí)，一般是長(zhǎng)度至少10個(gè)殘基，更常至少20個(gè)殘基，和優(yōu)選至少30個(gè)(如50個(gè))殘基，但小于全長(zhǎng)的完整序列?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的片段，例如通過(guò)酶促消化天然存在的或重組的犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)，通過(guò)使用編碼犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的確定片段的表達(dá)載體的重組DNA技術(shù)，或通過(guò)化學(xué)合成?？捎帽疚乃龅姆椒ㄔu(píng)價(jià)候選片段顯示犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)特性(如與犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)特異性抗體結(jié)合)的能力?？捎眉兓娜＠锵ｓw28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)或犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的抗原性片段來(lái)產(chǎn)生新的抗體，或測(cè)試已存在的抗體(如在診斷試驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法。本發(fā)明包括用犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)或犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的片段作為免疫原在例如兔中，產(chǎn)生多克隆抗血清?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的產(chǎn)生單克隆和多克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法?？珊Y選該方法產(chǎn)生的單克隆抗體識(shí)別重組犬埃里希體cDNA克隆，和將它們和已知cDNA克隆相鑒別的能力。
本發(fā)明還包括犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的片段，它是由至少一部分SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或SEQ ID NO5(如可變mRNA剪接或可變蛋白質(zhì)加工的產(chǎn)物，或其中序列的一個(gè)節(jié)段已缺失的)所編碼的?？蓪⒃撈位蛲暾娜＠锵ｓw28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)與另一多肽如(如作為標(biāo)記、配體的多肽或能提高免疫原性的蛋白)共價(jià)連接。
詞組“藥物學(xué)上可接受的”指當(dāng)給予人時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏或類(lèi)似不良反應(yīng)的分子或組合物。含有作為活性成分的蛋白質(zhì)的水性組合物的制劑是本領(lǐng)域熟知的。通常，將這些組合物制備成可注射的溶液或懸液；還可制備成可在注射前適于溶解或懸浮于液體中的固態(tài)形式。也可乳化該制備物。
可將蛋白以中性或鹽形式配制在組合物中。藥物學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(由蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，并和無(wú)機(jī)酸，如鹽酸或磷酸，或乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等有機(jī)酸形成的鹽。還可與無(wú)機(jī)堿，如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物，和有機(jī)堿，如異丙基胺、三甲基胺、組氨酸、普魯卡因等衍生的游離羧基形成鹽。
配制后，以與劑量配方相容的方式，和治療有效量給予這些溶液。易以各種劑型，如可注射溶液給予這些制劑。
對(duì)于水溶液腸胃外給藥，如需要可將該溶液制成適當(dāng)?shù)木彌_液，首先用足夠的鹽水或葡萄糖將稀釋液變成等滲。這些具體水溶液特別適合靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥。就此而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)本文公開(kāi)內(nèi)容將了解可使用的無(wú)菌水相介質(zhì)。例如，可將一劑量溶于1毫升等滲NaCl溶液中，加到1000毫升皮下灌注液中或注射到預(yù)定輸液位點(diǎn)(見(jiàn)例如“Remington藥物科學(xué)”15版，1035-1038頁(yè)和1570-1580)。根據(jù)待治療個(gè)體的情況，必須對(duì)劑量作某些改動(dòng)。負(fù)責(zé)給藥的人員將在任何情況下確定該個(gè)體的合適劑量。
如本領(lǐng)域熟知的，某給定多肽的免疫原性可能變化。因此，常必須將免疫原(如本發(fā)明的多肽)與一載體偶聯(lián)。示范性和優(yōu)選的載體包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和人血清白蛋白。其它載體可包括各種淋巴因子和佐劑，如IL2、IL4、IL8等。
偶聯(lián)多肽與載體蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括戊二醛、m-馬來(lái)酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯、碳二亞胺和雙-二氮雜二氨基聯(lián)苯。還可理解的是，該肽可與一蛋白質(zhì)通過(guò)本領(lǐng)域熟知的基因工程技術(shù)偶聯(lián)。
如本領(lǐng)域還熟知的，可使用非特異性的免疫應(yīng)答刺激劑(稱(chēng)為佐劑)來(lái)增強(qiáng)對(duì)具體免疫原的免疫原性。示范性和優(yōu)選的佐劑包括完整的BCG、Detox(RIBI，Imminochem Research Inc.)ISCOMS和氫氧化鋁佐劑(Superphos，Biosector)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)序列”是指能和第一核酸序列雜交，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下形成雙鏈分子的核酸鏈。嚴(yán)謹(jǐn)條件是使兩條高度同源的核酸序列雜交，但排除隨機(jī)序列雜交的條件。例如，低溫和/或高離子強(qiáng)度的雜交被稱(chēng)為低嚴(yán)謹(jǐn)度，而高溫和/或低離子強(qiáng)度的雜交稱(chēng)為高嚴(yán)謹(jǐn)度。可理解可將所需嚴(yán)謹(jǐn)度的溫度和離子強(qiáng)度應(yīng)用于特定長(zhǎng)度探針，序列的長(zhǎng)度和堿基成分和雜交混合物中甲酰胺的存在。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“工程改造的”或“重組的”細(xì)胞將指在其中已引入重組基因如編碼恰菲埃里希體抗原的基因的細(xì)胞。因此，工程改造的細(xì)胞與不含重組引入的基因的天然細(xì)胞不同。因此，工程改造的細(xì)胞是具有通過(guò)人工引入的一個(gè)或多個(gè)基因的細(xì)胞。重組引入的基因可以是cDNA基因或基因組基因拷貝的形式，或可包括位于啟動(dòng)子毗鄰，但天然不伴隨所引入基因的基因。另外，可將該重組基因整合入宿主基因組，或可將其包含于載體、或細(xì)菌基因組中，轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞。
給出下列例子，用于說(shuō)明本發(fā)明的各種實(shí)施例，而不意味以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1埃里希體和純化Dr.Edward B.Breitschwerdt(College of Veterinary Medicine，NorthCalorina State University，Raleigh，NC)提供了犬埃里希體(Florida株和分離物Demon、DJ、Jake和Fuzzy)。Dr.Richard.Corstvet(School ofVeterinary Medicine，Louisiana State University，Baton Rouge，LA)提供了犬埃里希體(Louisiana株)，Dr.Jacqueline Dawson(Centers of DiseaseControl and Prevention，Atlanta，GA)提供了犬埃里希體(Oklahoma菌株)。用補(bǔ)充有10％小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM，37℃在DH82細(xì)胞中繁殖埃里希體。用一般細(xì)胞染色方法，通過(guò)存在埃里希體桑椹胚，監(jiān)測(cè)其在DH82細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)。當(dāng)100％細(xì)胞受埃里希體感染時(shí)，收集細(xì)胞，17,000xg離心20分鐘沉淀細(xì)胞。用Braun-Sonic 2000超聲發(fā)生器以40W，在冰上粉碎細(xì)胞沉淀30秒2次。如上所述，純化埃里希體(Weiss等人，1975)。將細(xì)胞裂解液加到42％-36％-30％腎造影劑(renografin)的不連續(xù)梯度上，然后80,000xg離心1小時(shí)。收集含埃里希體的重帶和輕帶，并用蔗糖-磷酸-谷氨酰胺緩沖液(SPG，218mM蔗糖、3.8mM KH2PO4、7.2mM K2HPO4、4.9mM谷氨酰胺，pH7.0)洗滌，離心沉淀。
實(shí)施例2制備核酸將腎造影劑-純化的埃里希體重懸在含有1％十二烷基硫酸鈉(SDS，w/v)和100ng/ml蛋白酶的600μl 10mMTris-HCl緩沖液(pH 7.5)中，來(lái)制備犬埃里希體基因組DNA，如上所述(McBride等人，1996)。56℃培養(yǎng)此混合物1小時(shí)，然后用苯酚/氯仿/異戊醇(24∶24∶1)混合物提取核酸2次。用無(wú)水乙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗1次，干燥，重懸在10mM Tris(pH7.5)中。用高純度質(zhì)粒分離試劑盒(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN)純化了質(zhì)粒DNA，并用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN Inc.，Santa Clarita，CA)純化了PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例3犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)從恰菲埃里希體p28和反芻類(lèi)考德里氏體map-1基因的Jotun-Hein法排列對(duì)比產(chǎn)生的共有序列中觀察到的同源性(＞90％)，選擇了用于PCR擴(kuò)增的犬埃里希體ECa28-1基因的區(qū)域。正向引物793(5’-GCAGGAGCTGTTGGTTACTC-3’)(SEQ ID NO16)和反向引物1330(5’-CCTTCCTCCAAGTTCTATGCC-3’)(SEQ ID NO17)相應(yīng)于反芻類(lèi)考德里氏體MAP-1的核苷酸313-332和823-843以及恰菲埃里希體P28的核苷酸307-326和834-814。用引物793和1330，以95℃2分鐘熱循環(huán)，經(jīng)30輪，95℃30秒，62℃1分鐘，72℃2分鐘，然后72℃延伸10分鐘，4℃保持，來(lái)擴(kuò)增犬埃里希體(一種North Carolina分離物，Jake)的DNA。在1％瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。直接用引物793和1330對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物測(cè)序。
將ECa28SA2基因特異性的引物，命名為46f(5’-ATATACTTCCTACCTAATGTCTCA-3’，SEQ ID NO18)和引物1330(SEQ ID NO17)用來(lái)擴(kuò)增靶向區(qū)域。凝膠純化擴(kuò)增的產(chǎn)物，并克隆入TA克隆載體中(Invitrogen，Santa Clarita，CA)。用引物與該載體反向的M13，46f，Eca28SA2(5’-AGTGCAGAGTCTTCGGTTTC-3’，SEQ ID NO19)、ECa5.3(5’-GTTACTTGCGGAGGACAT-3’，SEQ ID NO20)，進(jìn)行該克隆的雙向測(cè)序。以95℃2分鐘熱循環(huán)，經(jīng)30輪，95℃30秒，48℃1分鐘，72℃1分鐘，然后72℃延伸10分鐘，4℃保持，來(lái)擴(kuò)增DNA。
實(shí)施例4測(cè)定ECa28-1基因未知5’和3’區(qū)域的序列按制造商提供的方法用Universal GenomeWalker試劑盒(CLONTECH，PlaoAlto，CA)測(cè)定ECa28-1的全長(zhǎng)序列。用五種限制性?xún)?nèi)切酶(DraI、EcoRV、PvuII、ScaI、StuI)完全消化基因組犬埃里希體(Jake分離物)的DNA，產(chǎn)生平端DNA。使試劑盒中提供的銜接子(AP1)連接犬埃里希體DNA的各端。以基因組文庫(kù)為模板，用互補(bǔ)于ECa28-1序列已知部分的引物和對(duì)銜接子AP1特異性的引物，作PCR發(fā)現(xiàn)ECa28-1基因的未知DNA序列。由衍生PCR擴(kuò)增的ECa28-1(用引物793(SEQ ID NO16)和1330(SEQ ID NO17))的已知DNA序列設(shè)計(jì)了用于基因組漫步(walk)的ECa28-1特異性引物。引物394(5’-GCATTTCCACAGGATCATAGGTAA-3’；核苷酸687-710；SEQ ID NO21)和394C(5’-TTACCTATGATCCTGTGGAAATGC-3’；核苷酸710-687，SEQ ID NO22)與提供的引物AP1一起用于PCR擴(kuò)增ECa28-1基因的未知的5’和3’區(qū)域。用引物793C(5’-GAGTAACCAACAGCTCCTGC-3’，SEQ ID NO23)單向測(cè)定了對(duì)應(yīng)于引物PCR394C和AP1(2000-bp)所擴(kuò)增的ECa28-1基因5’區(qū)域的PCR產(chǎn)物的序列。用相同的引物雙向測(cè)定了對(duì)應(yīng)于ECa28-1基因3’區(qū)域的PCR產(chǎn)物(用引物394和AP1(580-bp)擴(kuò)增的)的序列。測(cè)定5’和3’結(jié)構(gòu)域上毗鄰于開(kāi)放讀框的非編碼區(qū)域的序列，并且設(shè)計(jì)了互補(bǔ)于這些區(qū)域的引物EC28OM-F(5’-TCTACTTTGCACTTCCACTATTGT-3’，SEQ ID NO24)和EC28OM-R(5’-ATTCTTTTGCCACTATTTTTCTTT-3’，SEQ ID NO25)，以擴(kuò)增整個(gè)ECa28-1基因。
實(shí)施例5犬埃里希體分離物的測(cè)序用ABI Prism377 DNA測(cè)序儀(Perkin-Elmer Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA)對(duì)DNA測(cè)序。用引物EC28OM-F(SEQ ID NO24)和EC28OM-R(SEQID NO25)，以95℃5分鐘熱循環(huán)，經(jīng)30輪，95℃30秒，62℃1分鐘，72℃2分鐘，然后72℃延伸10分鐘，PCR擴(kuò)增了7種犬埃里希體分離物(North Carolina四種，Oklahoma、Florida和Louisiana各一種)的整個(gè)ECa28-1基因。用相同的引物對(duì)得到的PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序。
實(shí)施例6犬埃里希體ECa28-1的克隆和表達(dá)用引物EC28OM-F和EC28OM-R對(duì)整個(gè)犬埃里希體ECa28-1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并克隆入pCR2.1-TOPO TA克隆載體，以得到所需的一組限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用BstX1從pCR2.1-TOPO中切下插入物，并連接入pcDNA3.1真核細(xì)胞表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，命名為pcDNA3.1/EC28，進(jìn)行后續(xù)研究。擴(kuò)增pcDNA3.1/EC28質(zhì)粒，用KpnI-XbaI雙消化切割此基因，直接連接入pThioHis原核細(xì)胞表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。該克隆(命名為pThioHis/EC28)在大腸桿菌BL21中產(chǎn)生重組硫氧還蛋白融合蛋白。離心在不溶相中粗純的此重組融合蛋白。在天然條件下，用鎳-NTA自旋柱(Qiagen，Santa Clarita，CA)，從溶解的細(xì)胞裂解液中純化了對(duì)照硫氧還蛋白融合蛋白。
實(shí)施例7Western免疫印跡分析將重組犬埃里希體ECa28-1融合蛋白在4-15％Tris-HCl梯度凝膠(Bio-Rad，Hercules，CA)上進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并用半干轉(zhuǎn)移槽(Bio-Rad，Hercules，CA)轉(zhuǎn)移到純硝化纖維(Schleicher &Schuell，Keene，NH)上。該膜與1∶5000稀釋的犬埃里希體感染犬的恢復(fù)期抗血清培育1小時(shí)，洗滌，然后與1∶1000的抗犬IgG(H & L)堿性磷酸酶偶聯(lián)的親和純化的第二抗體(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)培育1小時(shí)。用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)底物(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)顯色觀察結(jié)合的抗體。
實(shí)施例8Southern印跡分析為了確定犬埃里希體基因組中是否存在與ECa28-1基因同源的多種基因，用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，1989)進(jìn)行基因組Southern印跡分析。用各限制性?xún)?nèi)切酶BanII、EcoRV、HaeII、KpnI和SpeI(不切割ECa28-1基因)和AseI(切割ECa28-1中的核苷酸34、43和656)來(lái)完全消化犬埃里希體DNA。用引物EC28OM-F和EC28OM-R以及洋地黃毒苷(BIG)標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸(dNTPs)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)生探針，并用AseI消化。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、凝膠純化分離出此消化的探針(566-bp)，然后用于雜交。將完全消化的基因組犬埃里希體DNA跑電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)上，40℃按制造商方法在DIG Easy Hyb緩沖液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)中與ECa28-1基因DIG-標(biāo)記的探針雜交16小時(shí)。用抗DIG堿性磷酸酶-偶聯(lián)抗體和發(fā)光底物(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)探測(cè)結(jié)合的探針，并曝光BioMax科學(xué)成像膠片(Eastman Kodak，Rochester，NY)。
實(shí)施例9測(cè)序分析和比較從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)(World Wide Web site atURLhttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)獲得恰菲埃里希體p28和反芻類(lèi)考德里氏體map-1的DNA序列。用LASERGENE軟件(DNASTAR，Inc.，Madison.WI)進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列、蛋白質(zhì)和系統(tǒng)發(fā)生分析。用McGeoch和von Heijine的信號(hào)序列識(shí)別方法用PSORT程序(McGeoch，1985；vonHeijine，1986)，進(jìn)行翻譯后加工的分析(World Wide Web site atURLPRIVATEHREF＝http//www.imcb.osaka-u.ac.jp/nakai/form.htm，MACROBUTTONHtmlResAnchor http//www.imcb.osaka-u.ac.jp/nakai/form.htm)。
在本研究中描述的犬埃里希體ECa28-1基因的氨基酸序列和核酸序列的GenBank登錄號(hào)為Jake，AF082744；Louisiana，AF082745；Oklahoma，AF082746；Demon，AF082747；DJ，AF082748；Fuzzy，AF082749；FLorida，AF082750。
用為擴(kuò)增全基因設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行7株不同犬埃里希體ECa28-1的序列分析。分析表明在North Carolina(四種)、Louisiana、Florida和Oklahoma的分離物中該基因的序列是保守的。
實(shí)施例10ECa28-1的PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序和表達(dá)用Jotun-Hein算法，從恰菲埃里希體p28和反芻類(lèi)考德里氏體map-1的核酸序列排列對(duì)比產(chǎn)生了高度同源性(＞90％)區(qū)域的共有序列。靶向這些同源性區(qū)域(反芻類(lèi)考德里氏體map-1的核苷酸313-332和823-843；恰菲埃里希體p28的核苷酸307-326和814-834)作為PCR擴(kuò)增的引物退火部位。用引物793和1330實(shí)施犬埃里希體ECa28-1和恰菲埃里希體p28基因的PCR擴(kuò)增，得到518-bp的PCR產(chǎn)物。直接用引物793和1330測(cè)定產(chǎn)物的序列，得到犬埃里希體PCR產(chǎn)物的核酸序列。對(duì)該序列分析表明一開(kāi)放讀框編碼一170個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，將犬埃里希體PCR擴(kuò)增得到的518-bp序列與恰菲埃里希體p28基因的DNA序列排列對(duì)比，表明相似性大于70％，表明這些基因是同源性的。用銜接子PCR和引物394和793C進(jìn)行全基因序列的5’和3’節(jié)段的測(cè)定。引物394產(chǎn)生四種PCR產(chǎn)物(3-kb、2-kb、1-kb和0.8-kb)，用引物394和AP1對(duì)0.8-bp的產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。推導(dǎo)出的序列與518-bp產(chǎn)物的3’端重疊，將開(kāi)放讀框12-bp延伸至終止密碼子。還對(duì)ECa28-1基因的3’端非表明序列的另外625-bp進(jìn)行了測(cè)序。用引物394C和添加的引物AP1擴(kuò)增ECa28-1基因的5’端，得到三種PCR產(chǎn)物(3.3-kb、3-kb和2-kb)。用引物793C對(duì)2-kb片段單向測(cè)序。該測(cè)序提供了推定的ECa28-1起始密碼子，且完成了編碼278個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的834-bp開(kāi)放讀框。在ECa28-1基因的5’非編碼區(qū)域中產(chǎn)生了另外一個(gè)144-bp的可讀序列。從毗鄰于ECa28-1基因的互補(bǔ)非編碼區(qū)域設(shè)計(jì)了引物EC28OM-F和EC28OM-R。
對(duì)用這些引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物直接用相同的引物進(jìn)行測(cè)序。圖1顯示了犬埃里希體ECa28-1基因的全DNA序列(SEQ ID NO1)。用這些引物擴(kuò)增的ECa28-1PCR片段含有完整的開(kāi)放讀框和17個(gè)其他氨基酸(來(lái)自5’非編碼引物區(qū)域)。將該基因直接亞克隆入pThioHis表達(dá)載體，用此構(gòu)建物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)。表達(dá)的ECa28-1-硫氧還蛋白融合蛋白是不溶的。該表達(dá)蛋白質(zhì)含有與硫氧還蛋白相結(jié)合的114個(gè)附加氨基酸，5個(gè)為腸激酶識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸，和32個(gè)來(lái)自多克隆位點(diǎn)和N’端5’非編碼引物區(qū)域的氨基酸。受犬埃里希體感染的狗的恢復(fù)期抗血清識(shí)別了該表達(dá)的重組融合蛋白，但不與硫氧還蛋白對(duì)照反應(yīng)(圖2)。
實(shí)施例11序列同源性用Clustal方法對(duì)比了含有信號(hào)序列(ECa28-1、omp-1A、B、C、D、E和F)的恰菲埃里希體omp-1家族的基因和ECa28-1(834-bp)的核酸序列，以檢驗(yàn)這些基因間的同源性(沒(méi)有顯示排列對(duì)比)。ECa28-1和恰菲埃里希體p28和omp-1F之間的核酸同源性同等保守(68.9％)。恰菲埃里希體omp-1家族中的其他推定的外膜蛋白質(zhì)基因也與ECa28-1是同源性的，omp-1D(68.2％)、omp-1E(66.7％)、omp-1C(64.1％)、反芻類(lèi)考德里氏體map-1(61.8％)、犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)1基因(60％)和28-kDa蛋白質(zhì)2基因(部分)(59.5％)。恰菲埃里希體omp-1B與ECa28-1的核酸同源性最小(45.1％)。
ECa28-1(SEQ ID NO2)與恰菲埃里希體預(yù)計(jì)的氨基酸序列的對(duì)比表明氨基酸取代導(dǎo)致產(chǎn)生四個(gè)可變區(qū)(VR)。鑒定了氨基酸序列的取代或缺失以及ECa28-1和恰菲埃里希體OMP-1家族的可變區(qū)的位置(圖3)。包括信號(hào)肽的氨基酸比較表明ECa28-1具有與恰菲埃里希體OMP-1家族的OMP-1F最大的同源性(68％)，隨后是恰菲埃里希體P28(65.5％)、OMP-1E(65.1％)、OMP-1D(62.9％)、OMP-1C(62.9％)、反芻類(lèi)考德里氏體MAP-1(59.4)、犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)1(55.6％)和28-kDa蛋白質(zhì)2(部分)(53.6％)以及OMP-1B(43.2％)?；诎被嵝蛄械南到y(tǒng)發(fā)生關(guān)系表明ECa28-1和反芻類(lèi)考德里氏體MAP-1、恰菲埃里希體OMP-1蛋白質(zhì)和犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)1和2(部分)是相關(guān)的(圖4)。
實(shí)施例12預(yù)計(jì)的表面可能性和免疫反應(yīng)性用親水性和親水性分布圖分析犬埃里希體ECa28-1，預(yù)測(cè)了ECa28-1上表面暴露區(qū)域(圖6)。在ECa28-1上鑒定到由3-9個(gè)氨基酸組成的8個(gè)主要外露區(qū)域，它們與恰菲埃里希體P28上外露區(qū)域的分布相似(圖6)。ECa28-1上較大的5個(gè)外露區(qū)域位于該蛋白質(zhì)的N-端區(qū)域。在ECa28-1的所有4個(gè)可變區(qū)中都發(fā)現(xiàn)外露親水性區(qū)域。用Rothbard-Taylor算法(Rothbard和Taylor，1988)預(yù)測(cè)了ECa28-1中的10個(gè)T-細(xì)胞基序，并由Jameson-Wolf抗原性算法預(yù)測(cè)了ECa28-1的高抗原性(圖6)(Jameson和Wolf，1988)。在ECa28-1和恰菲埃里希體P28之間觀察到抗原性和T-細(xì)胞基序的相似性。
實(shí)施例13檢測(cè)ECa28-1基因的同源性基因組拷貝用限制性?xún)?nèi)切酶BanII、EcorV、HaeII、KpnI、SpeI(它們?cè)贓Ca28-1基于中無(wú)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn))和AseI(在核苷酸34、43和656上有內(nèi)在的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn))各自完全消化犬埃里希體DNA作基因組Southern印跡分析表明存在至少三種同源性ECa28-1基因拷貝(圖5)。雖然ECa28-1含有內(nèi)在AseI內(nèi)在限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，用于雜交實(shí)驗(yàn)的DIG-標(biāo)記探針靶向由AseI消化該基因產(chǎn)生的一個(gè)DNA片段中的基因區(qū)域。用AseI消化產(chǎn)生了三個(gè)與ECa28-1DNA探針雜交的條帶(約566-bp、850-bp和3-kb)表明在該基因組中存在與ECa28-1同源的多個(gè)基因。用EcoRV和SpeI消化產(chǎn)生了兩個(gè)與ECa28-1基因探針雜交的條帶。
實(shí)施例14鑒定28-kDa蛋白質(zhì)基因座用相應(yīng)于ECa28SA3中諸區(qū)域的特異性引物，命名為ECaSA3-2(5’-CTAGGATTAGGTTATAGTATAAGTT-3’，SEQ ID NO26)，和與ECa28-1一區(qū)域退火的引物793C(SEQ ID NO23)，來(lái)擴(kuò)增基因SA3和ECa28-1之間的基因間區(qū)。用相同的引物對(duì)800-bp產(chǎn)物測(cè)序。用95℃2分鐘熱循環(huán)，經(jīng)30輪，95℃30秒，50℃1分鐘，72℃1分鐘，然后72℃延伸10分鐘，4℃保持，來(lái)擴(kuò)增DNA。
實(shí)施例15PCR擴(kuò)增28-kDa蛋白質(zhì)基因和鑒定多基因基因座為了特異性擴(kuò)增ECa28SA2下游可能未知的基因，用對(duì)ECa28SA2特異性的引物46f和靶向ECa28-1基因3’端保守區(qū)域的引物1330來(lái)擴(kuò)增。用這些含有2個(gè)開(kāi)放讀框的引物來(lái)擴(kuò)增了2-kb PCR產(chǎn)物。第一個(gè)開(kāi)放讀框含有基因的已知區(qū)域ECaSA2和該基因上述未測(cè)序的3’部分。在ECsSA2的下游發(fā)現(xiàn)一未鑒定的但同源性的28-kDa蛋白質(zhì)基因，命名為ECa28SA3。用對(duì)ECa28SA3基因3’端特異性的引物SA3-2，結(jié)合在ECa28-1的5’端退火的反向引物793C一起擴(kuò)增，將此兩個(gè)已知的基因座連接。擴(kuò)增了一800-bpPCR產(chǎn)物，其含有ECa28SA3的3’端、ECa28SA3和ECa28-1(28NC3)之間的基因間區(qū)，和ECa28-1的5’端，連接上述分開(kāi)的基因座(圖8)。ECa28SA2的849-bp開(kāi)放讀框編碼283個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，且ECa28SA3含有編碼280個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)的840-bp開(kāi)放讀框。ECa28SA3和ECa28-1之間的基因間非編碼區(qū)域的長(zhǎng)度為345-bp(圖7和8)。
實(shí)施例16核酸和氨基酸的同源性用Clustal方法對(duì)比了5種犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因的核酸和氨基酸序列，以檢驗(yàn)這些基因之間的同源性。核酸的同源性范圍為58-75％，且在犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因成員中觀察到類(lèi)似的氨基酸同源性范圍為67-72％(圖9)。
實(shí)施例17轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域通過(guò)與大腸桿菌啟動(dòng)子區(qū)域和恰菲埃里希體啟動(dòng)子的共有序列比較，分析了28-kDa蛋白質(zhì)基因之間基因間區(qū)的啟動(dòng)子序列(Yu等人，1997；McClure.1985)。
在4種相應(yīng)于基因ECa28SA2、ECa28SA3、ECa28-1和ECa28-2的基因間序列中鑒定到含有RBS、-10和-35區(qū)域的推定啟動(dòng)子序列(圖10)。ECa28SA1的上游非編碼區(qū)域是未知的，沒(méi)有作分析。
實(shí)施例18N-端信號(hào)序列氨基酸序列分析表明全犬埃里希體ECa28-1的推導(dǎo)分子量為30.5-kDa，全Eca28SA3的推導(dǎo)分子量為30.7-kDa。這兩種蛋白質(zhì)都含有預(yù)計(jì)的23個(gè)氨基酸的N-端信號(hào)肽(MNCKKILITTALMSLMYYAPSIS，SEQ ID NO27)，這與預(yù)計(jì)的恰菲埃里希體P28(MNYKKILITSALISLISSLPGVSFS，SEQ ID NO28)和OMP-1蛋白質(zhì)家族相類(lèi)似(Yu等人，1998；Ohashi等人，1998b)。發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽酶(SIS；Ser-X-Ser)(Oliver，1985)優(yōu)選的切割位點(diǎn)在ECa28-1的氨基酸21、22和23。還存在與恰菲埃里希體P28(SFS)預(yù)計(jì)切割位點(diǎn)相同的另一個(gè)推定的切割位點(diǎn)在氨基酸位置25(MNCKKILITTALISLMYSIPSISSFS，SEQ ID NO29)，這導(dǎo)致產(chǎn)生預(yù)計(jì)分子量為27.7-kDa的成熟ECa28-1。預(yù)計(jì)ECa28SA2上述報(bào)道的部分序列的信號(hào)切割位點(diǎn)在氨基酸30。但信號(hào)序列分析預(yù)測(cè)ECa28SA1含有一不能切割的信號(hào)序列。
小結(jié)已鑒定了分子量類(lèi)似的蛋白質(zhì)，并從多種立克次氏體(包括犬埃里希體、恰菲埃里希體和反芻類(lèi)考德里氏體)克隆到(Reddy等人，1998；Jongejan等人，1993；Ohashi等人，1998)。先前已描述了在含有6種同源性p28基因的恰菲埃里希體中的單個(gè)基因座和犬埃里希體中的兩個(gè)基因座(各含有若干同源性28-kDa蛋白質(zhì)基因)。
本發(fā)明示范了編碼犬埃里希體成熟28-kDa蛋白質(zhì)的基因的克隆、表達(dá)和特性，這些基因與恰菲埃里希體的omp-1多基因家族和反芻類(lèi)考德里氏體map-1基因同源。鑒定了兩種新型28-kDa蛋白質(zhì)基因，ECa28-1和ECa28SA3。另一種已部分測(cè)序過(guò)的(Reddy等人，1998)的犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因，ECa28SA2，本發(fā)明對(duì)其進(jìn)行了完整測(cè)序。本發(fā)明還公開(kāi)了含有5種犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因的犬埃里希體的單個(gè)基因座的鑒定和特性。
犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)與恰菲埃里希體OMP-1家族和反芻類(lèi)考德里氏體MAP-1蛋白質(zhì)同源。最大同源性的犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)(ECa28SA3、ECa28-1和ECa28-2)在該基因座中依次排列。這些蛋白質(zhì)的同源性范圍為67.5％到72.3％。這些28-kDa蛋白質(zhì)的差異為27.35％到38.6％。犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)ECa28SA1和ECa28SA2的同源性最小，同源性范圍為50.9％到59.4％，差異為53.3％到69.9％?；蛑g的差異主要在于四個(gè)超變區(qū)，并表明這些區(qū)域是表面外露的，且受免疫系統(tǒng)的選擇性壓力。已報(bào)道了7種犬埃里希體分離物中ECa28-1的保守性(McBride等人，1999)，表明犬埃里希體在北美可能是純系的。相反，還有關(guān)于恰菲埃里希體分離物中p28顯著多樣性的報(bào)道(Yu等人，1998)。
所有犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)看來(lái)是由30-kD蛋白質(zhì)翻譯后加工成為成熟的28-kD蛋白質(zhì)的。最近，在恰菲埃里希體P28中鑒定到一信號(hào)序列(Yu等人，1998)，N-端氨基酸測(cè)序證明該蛋白質(zhì)是經(jīng)翻譯后加工導(dǎo)致切去信號(hào)序列而產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)(Ohashi等人，1998)。還提出OMP-1F和OMP-1E的前導(dǎo)序列為前導(dǎo)信號(hào)肽(Ohashi等人，1998)。恰菲埃里希體OMP-1F、OMP-1E和P28上鑒定到的信號(hào)序列與犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列是同源的。實(shí)驗(yàn)研究沒(méi)有確定p28基因的啟動(dòng)子序列，但通過(guò)與大腸桿菌和其他埃里希體的RBS、-10和-35啟動(dòng)子區(qū)域的共有序列作比較，鑒定到假定的啟動(dòng)子區(qū)域(Yu等人，1997；McClure，1985)。這些啟動(dòng)子序列使各基因潛在地被轉(zhuǎn)錄和翻譯，表明這些基因可能在宿主中差異性表達(dá)。犬對(duì)感染的耐性可能與p28基因的易變性表達(dá)相關(guān)，這些多樣性表達(dá)導(dǎo)致體內(nèi)抗原性變化，從而使微生物逃脫免疫應(yīng)答。
發(fā)現(xiàn)犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因表現(xiàn)出與恰菲埃里希體omp-1基因家族和反芻類(lèi)考德里氏體map-1基因的核酸和氨基酸序列同源。上述研究鑒定到一種能與恢復(fù)期抗恰菲埃里希體的抗血清起反應(yīng)的犬埃里希體30-kDa蛋白質(zhì)，但認(rèn)為抗原性上不同(Rikihisa等人，1994)?；谌＠锵ｓw28-kDa蛋白質(zhì)四個(gè)可變區(qū)中氨基酸取代基比較的發(fā)現(xiàn)支持這種可能性。綜合這些發(fā)現(xiàn)還表明造成犬埃里希體和恰菲埃里希體P28之間抗原性差異的氨基酸位于這些可變區(qū)中，且易接觸免疫系統(tǒng)。有報(bào)道說(shuō)免疫反應(yīng)性肽位于反芻類(lèi)考德里氏體、恰菲埃里希體和犬埃里希體的28-kDa蛋白質(zhì)的可變區(qū)中(Reddy等人，1998)。對(duì)犬埃里希體和恰菲埃里希體P28的分析表明所有這些可變區(qū)都含有預(yù)計(jì)的外露氨基酸。對(duì)犬的研究證明犬埃里希體和恰菲埃里希體之間缺乏交叉保護(hù)(Dawson和Ewing，1992)。這一觀察可能與P28可變區(qū)中以及這些埃里希體品種的其他免疫性重要抗原中的抗原性差異相關(guān)。另一研究發(fā)現(xiàn)恰菲埃里希體感染的患者恢復(fù)期的人抗血清識(shí)別了恰菲埃里希體29/28-kDa蛋白質(zhì)，且與犬埃里希體的同源蛋白質(zhì)起反應(yīng)(Chen等人，1997)。犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)和恰菲埃里希體P28上的同源和交叉反應(yīng)表位看來(lái)能為免疫系統(tǒng)所識(shí)別。
犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)可能是重要的免疫保護(hù)性抗原。一些報(bào)道已證明犬埃里希體30-kDa抗原表現(xiàn)出強(qiáng)免疫反應(yīng)性(Rikihisa等人，1994；Rikihisa等人，1992)。人和犬恢復(fù)期抗血清中的抗體與恰菲埃里希體和犬埃里希體這種大小范圍的蛋白質(zhì)所起的反應(yīng)相一致，表明它們可能是重要的免疫保護(hù)性抗原(Rikihisa等人，1994；Chen等人，1994；Chen等人，1997)。另外，在對(duì)犬埃里希體免疫應(yīng)答的早期產(chǎn)生了對(duì)30、24和21-kDa蛋白質(zhì)的抗體(Rikihison等人1994，1992)，表明這些蛋白質(zhì)在疾病急性期的免疫應(yīng)答中尤其重要。最近，在恰菲埃里希體中鑒定到編碼28-kDa分子量外膜蛋白質(zhì)的一同源基因家族，且用重組恰菲埃里希體P28免疫接種的小鼠表現(xiàn)出產(chǎn)生了抗同源攻擊的免疫力(Ohashi等人，1998)。已證明在外膜中存在著恰菲埃里希體的P28，且免疫電鏡將P28定位于該微生物的表面，從而表明其可能起粘附素作用(Ohashi等人，1998)。本研究中鑒定的犬埃里希體的28-kDa蛋白質(zhì)可能處于相同的位置且可能起做著類(lèi)似的功能。
比較了犬埃里希體不同菌株的ECa28-1，表明該基因明顯完全保守。包括恰菲埃里希體的研究證明了ECa28-1差異的免疫學(xué)和分子證據(jù)。受恰菲埃里希體感染的患者對(duì)29/28-kDa蛋白質(zhì)具有可變的免疫反應(yīng)性，提示存在抗原性差異(Chen等人，1997)。最近已有的分子學(xué)證據(jù)支持恰菲埃里希體p28基因中的抗原性差異(Yu等人，1998)。5種恰菲埃里希體分離物的比較表明兩種分離物(Sapulpa和St.Vincent)100％相同，但另三種(Arkansas、Jax和91HE17)在氨基酸水平上的差異多達(dá)13.4％。ECa28-1的保守性表明美國(guó)發(fā)現(xiàn)的犬埃里希體菌株遺傳學(xué)上可能是相同的，所以犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)是一種用于美國(guó)犬埃里希病的有吸引力的候選疫苗。進(jìn)一步分析美國(guó)以外的犬埃里希體分離物可以提供犬埃里希體起源和進(jìn)化的信息。28-kDa蛋白質(zhì)的保守性使其成為一種用于犬埃里希病可靠血清學(xué)診斷的重要候選物。
在這點(diǎn)上多種同源基因的作用是未知的，但犬中犬埃里希體感染的持續(xù)相信可能與因同源性28-kDa蛋白質(zhì)基因的易變性表達(dá)所致的抗原性易變性相關(guān)，從而使犬埃里希體能夠逃避免疫監(jiān)護(hù)。邊緣無(wú)形體(A.marginale)的msp-3基因的變異部分引起了MSP-3蛋白質(zhì)的變異，導(dǎo)致持續(xù)性感染(Alleman等人，1997)。檢測(cè)急性和慢性感染的犬中埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因表達(dá)的研究，將更深入地了解28-kDa蛋白質(zhì)基因家族在感染持續(xù)性中的作用。
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本說(shuō)明書(shū)提到的任何專(zhuān)利或出版物表明了本發(fā)明涉及的領(lǐng)域中技術(shù)人員的水平。這些專(zhuān)利和出版物引入本文以供參考，程度相同，如同各獨(dú)立出版物單獨(dú)引入以供參考表明的那樣。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將不難理解，本發(fā)明適合于實(shí)施所述的目的和獲得所述的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及與之相關(guān)的那樣。本文描述的實(shí)施例、方法、程序、處理、分子和特定的化合物以?xún)?yōu)選例為代表，是示范性的，而不意味著限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)其中所作的改變和其它用途都將包括在權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
<110>Walker，David H.
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<223>ECa28-1的核酸序列<400>1attttattta ttaccaatct tatataatat attaaatttc tcttacaaaa 50atctctaatg ttttatacct aatatatata ttctggcttg tatctacttt 100gcacttccac tattgttaat ttattttcac tattttaggt gtaatatgaa 150ttgcaaaaaa attcttataa caactgcatt aatatcatta atgtactcta 200ttccaagcat atctttttct gatactatac aagatggtaa catgggtggt 250aacttctata ttagtggaaa gtatgtacca agtgtctcac attttggtag 300cttctcagct aaagaagaaa gcaaatcaac tgttggagtt tttggattaa 350aacatgattg ggatggaagt ccaatactta agaataaaca cgctgacttt 400actgttccaa actattcgtt cagatacgag aacaatccat ttctagggtt 450tgcaggagct atcggttact caatgggtgg cccaagaata gaattcgaaa 500tatcttatga agcattcgac gtaaaaagtc ctaatatcaa ttatcaaaat 550gacgcgcaca ggtactgcgc tctatctcat cacacatcgg cagccatgga 600agctgataaa tttgtcttct taaaaaacga agggttaatt gacatatcac 650ttgcaataaa tgcatgttat gatataataa atgacaaagt acctgtttct 700ccttatatat gcgcaggtat tggtactgat ttgatttcta tgtttgaagc 750tacaagtcct aaaatttcct accaaggaaa actgggcatt agttactcta 800ttaatccgga aacctctgtt ttcatcggtg ggcatttcca caggatcata 850ggtaatgagt ttagagatat tcctgcaata gtacctagta actcaactac 900aataagtgga ccacaatttg caacagtaac actaaatgtg tgtcactttg 950gtttagaact tggaggaaga tttaacttct aattttattg ttgccacata 1000ttaaaaatga tctaaacttg tttttawtat tgctacatac aaaaaaagaa 1050aaatagtggc aaaagaatgt agcaataaga gggggggggg ggaccaaatt 1100tatcttctat gcttcccaag ttttttcycg ctatttatga cttaaacaac 1150agaaggtaat atcctcacgg aaaacttatc ttcaaatatt ttatttatta 1200ccaatcttat ataatatatt aaatttctct tacaaaaatc actagtattt 1250tataccaaaa tatatattct gacttgcttt tcttctgcac ttctactatt 1300tttaatttat ttgtcactat taggttataa taawatgaat tgcmaaagat 1350
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<223>ECa28-1蛋白質(zhì)的氨基酸序列<400>2Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Met Tyr Ser Ile Pro Ser Ile Ser Phe Ser Asp Thr Ile Gln Asp20 25 30Gly Asn Met Gly Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Val Pro35 40 45Ser Val Ser His Phe Gly Ser Phe Ser Ala Lys Glu Glu Ser Lys50 55 60Ser Thr Val Gly Val Phe Gly Leu Lys His Asp Trp Asp Gly Ser65 70 75Pro Ile Leu Lys Asn Lys His Ala Asp Phe Thr Val Pro Asn Tyr80 85 90Ser Phe Arg Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Ile Glu Phe Glu Ile Ser110 115 120Tyr Glu Ala Phe Asp Val Lys Ser Pro Asn Ile Asn Tyr Gln Asn125 130 135Asp Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Ser His His Thr Ser Ala Ala140 145 150Met Glu Ala Asp Lys Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu Gly Leu Ile155 160 165Asp Ile Ser Leu Ala Ile Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Ile Asn Asp170 175 180Lys Val Pro Val Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Ile Gly Thr Asp185 190 195Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ile Ser Tyr Gln200 205 210Gly Lys Leu Gly Ile Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Thr Ser Val215 220 225Phe Ile Gly Gly His Phe His Arg Ile Ile Gly Asn Glu Phe Arg230 235 240Asp Ile Pro Ala Ile Val Pro Ser Asn Ser Thr Thr Ile Ser Gly
245 250 255Pro Gln Phe Ala Thr Val Thr Leu Asn Val Cys His Phe Gly Leu260 265 270Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe275<210>3<211>849<212>DNA<213>犬埃里希體<220>
<221>成熟肽<223>ECa28SA2的核酸序列<400>3atgaattgta aaaaagtttt cacaataagt gcattgatat catccatata 50cttcctacct aatgtctcat actctaaccc agtatatggt aacagtatgt 100atggtaattt ttacatatca ggaaagtaca tgccaagtgt tcctcatttt 150ggaatttttt cagctgaaga agagaaaaaa aagacaactg tagtatatgg 200cttaaaagaa aactgggcag gagatgcaat atctagtcaa agtccagatg 250ataattttac cattcgaaat tactcattca agtatgcaag caacaagttt 300ttagggtttg cagtagctat tggttactcg ataggcagtc caagaataga 350agttgagatg tcttatgaag catttgatgt gaaaaatcca ggtgataatt 400acaaaaacgg tgcttacagg tattgtgctt tatctcatca agatgatgcg 450gatgatgaca tgactagtgc aactgacaaa tttgtatatt taattaatga 500aggattactt aacatatcat ttatgacaaa catatgttat gaaacagcaa 550gcaaaaatat acctctctct ccttacatat gtgcaggtat tggtactgat 600ttaattcaca tgtttgaaac tacacatcct aaaatttctt atcaaggaaa 650gctagggttg gcctacttcg taagtgcaga gtcttcggtt tcttttggta 700tatattttca taaaattata aataataagt ttaaaaatgt tccagccatg 750gtacctatta actcagacga gatagtagga ccacagtttg caacagtaac 800attaaatgta tgctactttg gattagaact tggatgtagg ttcaacttc 849<210>4<211>283<212>PRT<213>犬埃里希體<220>
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<221>成熟肽<223>ECa28SA3的核酸序列<400>5atgaattgca aaaaaattct tataacaact gcattaatgt cattaatgta 50ctatgctcca agcatatctt tttctgatac tatacaagac gataacactg 100gtagcttcta catcagtgga aaatatgtac caagtgtttc acattttggt 150gttttctcag ctaaagaaga aagaaactca actgttggag tttttggatt 200aaaacatgat tggaatggag gtacaatatc taactcttct ccagaaaata 250tattcacagt tcaaaattat tcgtttaaat acgaaaacaa cccattctta 300gggtttgcag gagctattgg ttattcaatg ggtggcccaa gaatagaact 350tgaagttctg tacgagacat tcgatgtgaa aaatcagaac aataattata 400
agaacggcgc acacagatac tgtgctttat ctcatcatag ttcagcaaca 450agcatgtcct ccgcaagtaa caaatttgtt ttcttaaaaa atgaagggtt 500aattgactta tcatttatga taaatgcatg ctatgacata ataattgaag 550gaatgccttt ttcaccttat atttgtgcag gtgttggtac tgatgttgtt 600tccatgtttg aagctataaa tcctaaaatt tcttaccaag gaaaactagg 650attaggttat agtataagtt cagaagcctc tgtttttatc ggtggacact 700ttcacagagt cataggtaat gaatttagag acatccctgc tatggttcct 750agtggatcaa atcttccaga aaaccaattt gcaatagtaa cactaaatgt 800gtgtcacttt ggcatagaac ttggaggaag atttaacttc840<210>6<211>280<212>PRT<213>犬埃里希體<220>
<223>ECa28SA3蛋白質(zhì)的氨基酸序列<400>6Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ala Leu Met Ser Leu5 10 15Met Tyr Tyr Ala Pro Ser Ile Ser Phe Ser Asp Thr Ile Gln Asp20 25 30Asp Asn Thr Gly Ser Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Val Pro Ser35 40 45Val Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Arg Asn Ser50 55 60Thr Val Gly Val Phe Gly Leu Lys His Asp Trp Asn Gly Gly Thr65 70 75Ile Ser Asn Ser Ser Pro Glu Asn Ile Phe Thr Val Gln Asn Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Val Leu110 115 120Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Asn Asn Asn Tyr Lys Asn125 130 135Gly Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Ser His His Ser Ser Ala Thr140 145 150Ser Met Ser Ser Ala Ser Asn Lys Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu155 160 165Gly Leu Ile Asp Leu Ser Phe Met Ile Asn Ala Cys Tyr Asp Ile170 175 180Ile Ile Glu Gly Met Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val185 190 195Gly Thr Asp Val Val Ser Met Phe Glu Ala Ile Asn Pro Lys Ile200 205 210Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Glu215 220 225
Ala Ser Val Phe Ile Gly Gly His Phe His Arg Val Ile Gly Asn230 235 240Glu Phe Arg Asp Ile Pro Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Asn Leu245 250 255Pro Glu Asn Gln Phe Ala Ile Val Thr Leu Asn Val Cys His Phe260 265 270Gly Ile Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe275 280<210>7<211>133<212>PRT<213>犬埃里希體<220>
<223>ECa28SA2蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列<400>7Met Asn Cys Lys Lys Val Phe Thr Ile Ser Ala Leu Ile Ser Ser5 10 15Ile Tyr Phe Leu Pro Asn Val Ser Tyr Ser Asn Pro Val Tyr Gly20 25 30Asn Ser Met Tyr Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro35 40 45Ser Val Pro His Phe Gly Ile Phe Ser Ala Glu Glu Glu Lys Lys50 55 60Lys Thr Thr Val Val Tyr Gly Leu Lys Glu Asn Trp Ala Gly Asp65 70 75Ala Ile Ser Ser Gln Ser Pro Asp Asp Asn Phe Thr Ile Arg Asn80 85 90Tyr Ser Phe Lys Tyr Ala Ser Asn Lys Phe Leu Gly Phe Ala Val95 100 105Ala Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Ser Pro Arg Ile Glu Val Glu Met110 115 120Ser Tyr Glu Ala Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn125 130<210>8<211>287<212>PRT<213>犬埃里希體<220>
<223>ECa28SA1蛋白質(zhì)的氨基酸序列<400>8Met Lys Tyr Lys Lys Thr Phe Thr Val Thr Ala Leu Val Leu Leu5 10 15Thr Ser Phe Thr His Phe Ile Pro Phe Tyr Ser Pro Ala Arg Ala20 25 30Ser Thr Ile His Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro Thr
35 40 45Ala Ser His Phe Gly Ile Phe Ser Ala Lys Glu Glu Gln Ser Phe50 55 60Thr Lys Val Leu Val Gly Leu Asp Gln Arg Leu Ser His Asn Ile65 70 75Ile Asn Asn Asn Asp Thr Ala Lys Ser Leu Lys Val Gln Asn Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Lys Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Asn Ser Arg Ile Glu Leu Glu Val Ser110 115 120His Glu Ile Phe Asp Thr Lys Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Leu Asn125 130 135Asp Ser His Lys Tyr Cys Ala Leu Ser His Gly Ser His Ile Cys140 145 150Ser Asp Gly Asn Ser Gly Asp Trp Tyr Thr Ala Lys Thr Asp Lys155 160 165Phe Val Leu Leu Lys Asn Glu Gly Leu Leu Asp Val Ser Phe Met170 175 180Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Thr Thr Glu Lys Met Pro Phe Ser185 190 195Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Ile Gly Thr Asp Leu Ile Ser Met Phe200 205 210Glu Thr Thr Gln Asn Lys Ile Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu215 220 225Asn Tyr Thr Ile Asn Ser Arg Val Ser Val Phe Ala Gly Gly His230 235 240Phe His Lys Val Ile Gly Asn Glu Phe Lys Gly Ile Pro Thr Leu245 250 255Leu Pro Asp Gly Ser Asn Ile Lys Val Gln Gln Ser Ala Thr Val260 265 270Thr Leu Asp Val Cys His Phe Gly Leu Glu Ile Gly Ser Arg Phe275 280 285Phe Phe<210>9<211>281<212>PRT<213>恰菲埃里希體<220>
<223>恰菲埃里希體P28的氨基酸序列<400>9Met Asn Tyr Lys Lys Val Phe Ile Thr Ser Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Ile Ser Ser Leu Pro Gly Val Ser Phe Ser Asp Pro Ala Gly Ser20 25 30
Gly Ile Asn Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro Ser35 40 45Ala Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Arg Asn Thr50 55 60Thr Val Gly Val Phe Gly Leu Lys Gln Asn Trp Asp Gly Ser Ala65 70 75Ile Ser Asn Ser Ser Pro Asn Asp Val Phe Thr Val Ser Asn Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Met Asp Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Val Ser110 115 120Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asn125 130 135Glu Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Ser His Asn Ser Ala Ala Asp140 145 150Met Ser Ser Ala Ser Asn Asn Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu Gly155 160 165Leu Leu Asp Ile Ser Phe Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Val Val170 175 180Gly Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Ile Gly185 190 195Thr Asp Leu Val Ser Met Phe Glu Ala Thr Asn Pro Lys Ile Ser200 205 2I0Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Glu Ala215 220 225Ser Val Phe Ile Gly Gly His Phe His Lys Val Ile Gly Asn Glu230 235 240Phe Arg Asp Ile Pro Thr Ile Ile Pro Thr Gly Ser Thr Leu Ala245 250 255Gly Lys Gly Asn Tyr Pro Ala Ile Val Ile Leu Asp Val Cys His260 265 270Phe Gly Ile Glu Leu Gly Gly Arg Phe Ala Phe275 280<210>10<211>283<212>PRT<213>恰菲埃里希體<220>
<223>恰菲埃里希體OMP-1B的氨基酸序列<400>10Met Asn Tyr Lys Lys Ile Phe Val Ser Ser Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Met Ser Ile Leu Pro Tyr Gln Ser Phe Ala Asp Pro Val Thr Ser20 25 30Asn Asp Thr Gly Ile Asn Asp Ser Arg Glu Gly Phe Tyr Ile Ser
35 40 45Val Lys Tyr Asn Pro Ser Ile Ser His Phe Arg Lys Phe Ser Ala50 55 60Glu Glu Ala Pro Ile Asn Gly Asn Thr Ser Ile Thr Lys Lys Val65 70 75Phe Gly Leu Lys Lys Asp Gly Asp Ile Ala Gln Ser Ala Asn Phe80 85 90Asn Arg Thr Asp Pro Ala Leu Glu Phe Gln Asn Asn Leu Ile Ser95 100 105Gly Phe Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Met Asp Gly Pro Arg Ile110 115 120Glu Leu Glu Ala Ala Tyr Gln Lys Phe Asp Ala Lys Asn Pro Asp125 130 135Asn Asn Asp Thr Asn Ser Gly Asp Tyr Tyr Lys Tyr Phe Gly Leu140 145 150Ser Arg Glu Asp Ala Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Val Val Leu Lys155 160 165Asn Glu Gly Ile Thr Phe Met Ser Leu Met Val Asn Thr Cys Tyr170 175 180Asp Ile Thr Ala Glu Gly Val Pro Phe Ile Pro Tyr Ala Cys Ala185 190 195Gly Val Gly Ala Asp Leu Ile Asn Val Phe Lys Asp Phe Asn Leu200 205 210Lys Phe Ser Tyr Gln Gly Lys Ile Gly Ile Ser Tyr Pro Ile Thr215 220 225Pro Glu Val Ser Ala Phe Ile Gly Gly Tyr Tyr His Gly Val Ile230 235 240Gly Asn Asn Phe Asn Lys Ile Pro Val Ile Thr Pro Val Val Leu245 250 255Glu Gly Ala Pro Gln Thr Thr Ser Ala Leu Val Thr Ile Asp Thr260 265 270Gly Tyr Phe Gly Gly Glu Val Gly Val Arg Phe Thr Phe275 280<210>11<211>280<212>PRT<213>恰菲埃里希體<220>
<223>恰菲埃里希體OMP-1C的氨基酸序列<400>11Met Asn Cys Lys Lys Phe Phe Ile Thr Thr Ala Leu Ala Leu Pro5 10 15Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Leu Leu Ser Glu Pro Val Gln Asp20 25 30Asp Ser Val Ser Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro35 40 45
Ser Ala Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Asn50 55 60Pro Thr Val Ala Leu Tyr Gly Leu Lys Gln Asp Trp Asn Gly Val65 70 75Ser Ala Ser Ser His Ala Asp Ala Asp Phe Asn Asn Lys Gly Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Ile Glu Phe Glu Val Ser110 115 120Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Gly Asn Tyr Lys Asn125 130 135Asp Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Asp Arg Lys Ala Ser Ser Thr140 145 150Asn Ala Thr Ala Ser His Tyr Val Leu Leu Lys Asn Glu Gly Leu155 160 165Leu Asp Ile Ser Leu Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Val Val Ser170 175 180Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val Gly Thr185 190 195Asp Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Ile Asn Pro Lys Ile Ser Tyr200 205 210Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Ala Ser215 220 225Val Phe Val Gly Gly His Phe His Lys Val Ala Gly Asn Glu Phe230 235 240Arg Asp Ile Ser Thr Leu Lys Ala Phe Ala Thr Pro Ser Ser Ala245 250 255Ala Thr Pro Asp Leu Ala Thr Val Thr Leu Ser Val Cys His Phe260 265 270Gly Val Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe275 280<210>12<211>286<212>PRT<213>恰菲埃里希體<220>
<223>恰菲埃里希體OMP-1D的氨基酸序列<400>12Met Asn Cys Glu Lys Phe Phe Ile Thr Thr Ala Leu Thr Leu Leu5 10 15Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Ser Leu Ser Asp Pro Val Gln Asp20 25 30Asp Asn Ile Ser Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro35 40 45Ser Ala Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Arg Asn
50 55 60Thr Thr Val Gly Val Phe Gly Ile Glu Gln Asp Trp Asp Arg Cys65 70 75Val Ile Ser Arg Thr Thr Leu Ser Asp Ile Phe Thr Val Pro Asn80 85 90Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Leu Phe Ser Gly Phe Ala Gly95 100 105Ala Ile Gly Tyr Ser Met Asp Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Val110 115 120Ser Tyr Glu Ala Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys125 130 135Asn Glu Ala His Arg Tyr Tyr Ala Leu Ser His Leu Leu Gly Thr140 145 150Glu Thr Gln Ile Asp Gly Ala Gly Ser Ala Ser Val Phe Leu Ile155 160 165Asn Glu Gly Leu Leu Asp Lys Ser Phe Met Leu Asn Ala Cys Tyr170 175 180Asp Val Ile Ser Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala185 190 195Gly Ile Gly Ile Asp Leu Val Ser Met Phe Glu Ala Ile Asn Pro200 205 210Lys Ile Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Pro Ile Ser215 220 225Pro Glu Ala Ser Val Phe Ile Gly Gly His Phe His Lys Val Ile230 235 240Gly Asn Glu Phe Arg Asp Ile Pro Thr Met Ile Pro Ser Glu Ser245 250 255Ala Leu Ala Gly Lys Gly Asn Tyr Pro Ala Ile Val Thr Leu Asp260 265 270Val Phe Tyr Phe Gly Ile Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe Gln275 280 285Leu<210>13<211>278<212>PRT<213>恰菲埃里希體<220>
<223>恰菲埃里希體OMP-1E的氨基酸序列<400>13Met Asn Cys Lys Lys Phe Phe Ile Thr Thr Ala Leu Val Ser Leu5 10 15Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Ser Phe Ser Asp Pro Val Gln Gly20 25 30Asp Asn Ile Ser Gly Asn Phe Tyr Val Ser Gly Lys Tyr Met Pro35 40 45Ser Ala Ser His Phe Gly Met Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Asn
50 55 60Pro Thr Val Ala Leu Tyr Gly Leu Lys Gln Asp Trp Glu Gly Ile65 70 75Ser Ser Ser Ser His Asn Asp Asn His Phe Asn Asn Lys Gly Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Val Glu Phe Glu Val Ser110 115 120Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asn125 130 135Asp Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Gly Gln Gln Asp Asn Ser Gly140 145 150Ile Pro Lys Thr Ser Lys Tyr Val Leu Leu Lys Ser Glu Gly Leu155 160 165Leu Asp Ile Ser Phe Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Ile Asn170 175 180Glu Ser Ile Pro Leu Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val Gly Thr185 190 195Asp Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Thr Asn Pro Lys Ile Ser Tyr200 205 210Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Ala Ser215 220 225Val Phe Ile Gly Gly His Phe His Lys Val Ile Gly Asn Glu Phe230 235 240Arg Asp Ile Pro Thr Leu Lys Ala Phe Val Thr Ser Ser Ala Thr245 250 255Pro Asp Leu Ala Ile Val Thr Leu Ser Val Cys His Phe Gly Ile260 265 270Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe275<210>14<211>280<212>PRT<213>恰菲埃里希體<220>
<223>恰菲埃里希體OMP-1F的氨基酸序列<400>14Met Asn Cys Lys Lys Phe Phe Ile Thr Thr Thr Leu Val Ser Leu5 10 15Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Ser Phe Ser Asp Ala Val Gln Asn20 25 30Asp Asn Val Gly Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Val Pro35 40 45Ser Val Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Gln Glu Arg Asn50 55 60
Thr Thr Thr Gly Val Phe Gly Leu Lys Gln Asp Trp Asp Gly Ser65 70 75Thr Ile Ser Lys Asn Ser Pro Glu Asn Thr Phe Asn Val Pro Asn80 85 90Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly95 100 105Ala Val Gly Tyr Leu Met Asn Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Met110 115 120Ser Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys125 130 135Asn Asp Ala His Lys Tyr Tyr Ala Leu Thr His Asn Ser Gly Gly140 145 150Lys Leu Ser Asn Ala Gly Asp Lys Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu155 160 165Gly Leu Leu Asp Ile Ser Leu Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Val170 175 180Ile Ser Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val185 190 195Gly Thr Asp Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Ile Asn Pro Lys Ile200 205 210Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Glu215 220 225Ala Ser Val Phe Val Gly Gly His Phe His Lys Val Ile Gly Asn230 235 240Glu Phe Arg Asp Ile Pro Ala Met Ile Pro Ser Thr Ser Thr Leu245 250 255Thr Gly Asn His Phe Thr Ile Val Thr Leu Ser Val Cys His Phe260 265 270Gly Val Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe275 280<210>15<211>284<212>PRT<213>反芻類(lèi)考德里氏體<220>
<223>反芻類(lèi)考德里氏體MAP-1的氨基酸序列<400>15Met Asn Cys Lys Lys Ile Phe Ile Thr Ser Thr Leu Ile Ser Leu5 10 15Val Ser Phe Leu Pro Gly Val Ser Phe Ser Asp Val Ile Gln Glu20 25 30Glu Asn Asn Pro Val Gly Ser Val Tyr Ile Ser Ala Lys Tyr Met35 40 45Pro Thr Ala Ser His Phe Gly Lys Met Ser Ile Lys Glu Asp Ser50 55 60Arg Asp Thr Lys Ala Val Phe Gly Leu Lys Lys Asp Trp Asp Gly
65 70 75Val Lys Thr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Ser Ile Phe Thr Glu Lys80 85 90Asp Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala95 100 105Gly Ala Val Gly Tyr Ser Met Asn Gly Pro Arg Ile Glu Phe Glu110 115 120Val Ser Tyr Glu Thr Phe Asp Val Arg Asn Pro Gly Gly Asn Tyr125 130 135Lys Asn Asp Ala His Met Tyr Cys Ala Leu Asp Thr Ala Ser Ser140 145 150Ser Thr Ala Gly Ala Thr Thr Ser Val Met Val Lys Asn Glu Asn155 160 165Leu Thr Asp Ile Ser Leu Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Met170 175 180Leu Asp Gly Met Pro Val Ser Pro Tyr Val Cys Ala Gly Ile Gly185 190 195Thr Asp Leu Val Ser Val Ile Asn Ala Thr Asn Pro Lys Leu Ser200 205 210Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Ile Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Ala215 220 225Ser Ile Phe Ile Gly Gly His Phe His Arg Val Ile Gly Asn Glu230 235 240Phe Lys Asp Ile Ala Thr Ser Lys Val Phe Thr Ser Ser Gly Asn245 250 255Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Gly Phe Ala Ser Ala Ile Leu Asp260 265 270Val Cys His Phe Gly Ile Glu Ile Gly Gly Arg Phe Val Phe275 280<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<222>反芻類(lèi)考德里氏體MAP-1的核苷酸313-332，恰菲埃里希體P28的核苷酸307-326<223>用于PCR的正向引物793<400>16gcaggagctg ttggttactc 20<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<222>反芻類(lèi)考德里氏體MAP-1的核苷酸823-843，恰菲埃里希體P28的核苷酸814-834<223>用于PCR的反向引物1330<400>17ccttcctcca agttctatgc c21<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<223>引物46f，對(duì)ECa28SA2基因特異性<400>18atatacttcc tacctaatgt ctca 24<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<223>用于犬埃里希體中28-kDa蛋白質(zhì)基因測(cè)序的引物<400>19agtgcagagt cttcggtttc 20<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<223>用于犬埃里希體中28-kDa蛋白質(zhì)基因測(cè)序的引物<400>20gttacttgcg gaggacat18<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<222>ECa28-1的核苷酸687-710<223>用于PCR的引物394<400>21gcatttccac aggatcatag gtaa 24
<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<222>ECa28-1的核苷酸710-687<223>用于PCR的引物394C<400>22ttacctatga tcctgtggaa atgc 24<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<223>引物793C，其與Eca28-1的一區(qū)域退火，用于擴(kuò)增基因ECa28SA3和ECa28-1間的基因區(qū)<400>23gagtaaccaa cagctcctgc 20<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<222>
<223>引物EC28OM-F，互補(bǔ)于ECa28-1開(kāi)放讀框毗鄰的非編碼區(qū)域<400>24tctactttgc acttccacta ttgt 24<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<223>引物EC28OM-R，互補(bǔ)于ECa28-1開(kāi)放讀框毗鄰的非編碼區(qū)域<400>25attcttttgc cactattttt cttt 24<210>26<211>25<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>引物_結(jié)合<223>引物ECaSA3-2，相應(yīng)于ECa28SA3中的區(qū)域，用于擴(kuò)增基因ECa28SA3和ECa28-1之間的基因間區(qū)NC3<400>26ctaggattag gttatagtat aagtt25<210>27<211>23<212>PRT<213>犬埃里希體<220>
<221>肽<223>預(yù)計(jì)的ECa28-1和ECa28SA3 N-端信號(hào)肽<400>27Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ala Leu Met Ser Leu5 10 15Met Tyr Tyr Ala Pro Ser Ile Ser20<210>28<211>25<212>PRT<213>恰菲埃里希體<220>
<223>恰菲埃里希體P28 N-端信號(hào)肽的氨基酸序列<400>28Met Asn Tyr Lys Lys Ile Leu Ile Thr Ser Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Ile Ser Ser Leu Pro Gly Val Ser Phe Ser20 25<210>29<211>26<212>PRT<213>犬埃里希體<220>
<223>推定的ECa28-1切割位點(diǎn)的氨基酸序列<400>29Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Met Tyr Ser Ile Pro Ser Ile Ser Ser Phe Ser20 25<210>30<211>299
<212>DNA<213>犬埃里希體<220>
<223>基因間非編碼區(qū)域1的核酸序列(28NCl)<400>30taatacttct attgtacatg ttaaaaatag tactagtttg cttctgtggt 50ttataaacgc aagagagaaa tagttagtaa taaattagaa agttaaatat 100tagaaaagtc atatgttttt cattgtcatt gatactcaac taaaagtagt 150ataaatgtta cttattaata attttacgta gtatattaaa tttcccttac 200aaaagccact agtattttat actaaaagct atactttggc ttgtatttaa 250tttgtatttt tactactgtt aatttacttt cactgtttct ggtgtaaat 299<210>31<211>345<212>DNA<213>犬埃里希體<220>
<223>基因間非編碼區(qū)域2的核酸序列(28NC2)<400>31taatttcgtg gtacacatat cacgaagcta aaattgtttt tttatctctg 50ctgtatacaa gagaaaaaat agtagtgaaa attacctaac aatatgacag 100tacaagttta ccaagcttat tctcacaaaa cttcttgtgt cttttatctc 150tttacaatga aatgtacact tagcttcact actgtagagt gtgtttatca 200atgctttgtt tattaatact ctacataata tgttaaattt ttcttacaaa 250actcactagt aatttatact agaatatata ttctgacttg tatttgcttt 300atacttccac tattgttaat ttattttcac tattttaggt gtaat 345<210>32<211>345<212>DNA<213>犬埃里希體<220>
<223>基因間非編碼區(qū)域3的核酸序列(28NC3)<400>32tgattttatt gttgccacat attaaaaatg atctaaactt gtttttatta 50ttgctacata caaaaaaaag aaaaatagtg gcaaaagaat gtagcaataa 100gagggggggg ggggactaaa tttaccttct attcttctaa tattctttac 150tatattcaaa tagcacaact caatgcttcc aggaaaatat gtttctaata 200ttttatttat taccaatcct tatataatat attaaatttc tcttacaaaa 250atctctaatg ttttatactt aatatatata ttctggcttg tatttacttt 300gcacttccac tattgttaat ttattttcac tattttaggt gtaat 345<210>33<211>355<212>DNA<213>犬埃里希體<220>
<223>基因間非編碼區(qū)域4的核酸序列(28NC4)<400>33taattttatt gttgccacat attaaaaatg atctaaactt gtttttawta 50ttgctacata caaaaaaaga aaaatagtgg caaaagaatg tagcaataag 100aggggggggg gggaccaaat ttatcttcta tgcttcccaa gttttttcyc 150gctatttatg acttaaacaa cagaaggtaa tatcctcacg gaaaacttat 200cttcaaatat tttatttatt accaatctta tataatatat taaatttctc 250ttacaaaaat cactagtatt ttataccaaa atatatattc tgacttgctt 300ttcttctgca cttctactat ttttaattta tttgtcacta ttaggttata 350ataaw 35權(quán)利要求
1.編碼犬埃里希體30-千道爾頓蛋白質(zhì)的DNA序列，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)對(duì)抗犬埃里希體血清具有免疫反應(yīng)性。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)具有選自SEQID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)含有N-端信號(hào)序列。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA序列，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)是經(jīng)翻譯后修飾成為28-千道爾頓蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述的DNA具有選自SEQ IDNO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的序列。
6.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，在犬埃里希體的單個(gè)基因座中含有所述的DNA。
7.如權(quán)利要求6所述的DNA序列，其特征在于，所述的基因座是長(zhǎng)度為5.592kb的多基因基因座。
8.如權(quán)利要求7所述的DNA序列，其特征在于，所述的基因座編碼犬埃里希體的同源性28-千道爾頓蛋白質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的DNA序列，其特征在于，所述的犬埃里希體同源性28-千道爾頓蛋白質(zhì)選自ECa28SA1、ECa28SA2、ECa28SA3、ECa28-1和ECa28-2。
10.一種含有權(quán)利要求1所述的DNA序列的載體。
11.如權(quán)利要求10所述的載體，其特征在于，所述載體是一種表達(dá)載體，當(dāng)所述表達(dá)載體被引入細(xì)胞時(shí)，它能表達(dá)選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQID NO5序列編碼的肽或多肽。
12.一種重組蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)含有選自SEQ ID NO2、SEQID NO4和SEQ ID NO6的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求12所述的重組蛋白質(zhì)，其特征在于，所述的氨基酸序列是由含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5序列的核酸節(jié)段編碼的。
14.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的核酸節(jié)段。
15.一種產(chǎn)生權(quán)利要求12所述的重組蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟獲得含有一表達(dá)區(qū)的載體，該表達(dá)區(qū)含有編碼選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的氨基酸序列的序列，該序列與一啟動(dòng)子可操縱性連接；將所述的載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞；和在有效表達(dá)所述的表達(dá)區(qū)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
16.一種抗體，其特征在于，該抗體具有與選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的氨基酸序列的免疫反應(yīng)性。
17.一種抑制個(gè)體中犬埃里希體感染的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟鑒定懷疑接觸或感染了犬埃里希體的個(gè)體；和給予有效量的，含有犬埃里希體28-kDa抗原的組合物，以抑制犬埃里希體感染。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述28-kDa抗原是含有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的氨基酸序列的重組蛋白質(zhì)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述重組蛋白質(zhì)由含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的序列的基因所編碼。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述的重組蛋白質(zhì)分散在藥物學(xué)上可接受的載體中。
全文摘要
本發(fā)明涉及犬埃里希體的一個(gè)多態(tài)性多基因家族的同源性免疫反應(yīng)性28－kDa蛋白質(zhì)基因，ECa28－1和ECa28SA3的克隆、測(cè)序和表達(dá)。還提供了另一28－kDa蛋白質(zhì)基因ECaSA2的全序列。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼所有五種犬埃里希體同源性28－kDa蛋白質(zhì)基因的多基因基因座。重組犬埃里希體28－kDa蛋白質(zhì)能與受犬埃里希體感染的犬的恢復(fù)期抗血清起反應(yīng)。
文檔編號(hào)C07K16/12GK1535314SQ99813782
公開(kāi)日2004年10月6日 申請(qǐng)日期1999年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月30日
發(fā)明者D·H·沃克, 于學(xué)杰, J·W·麥克布里奇, D H 沃克, 麥克布里奇 申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)