專利名稱：：介導除蟲菌素b2:b1比例的除蟲鏈霉菌基因的制作方法1．發(fā)明領域本發(fā)明涉及除蟲菌素的組合物及除蟲菌素的生產方法，主要應用于動物健康領域。更具體地，本發(fā)明涉及包含有編碼aveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，該多核苷酸分子可被用于調整除蟲鏈霉菌培養(yǎng)物發(fā)酵所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，本發(fā)明還涉及篩選該多核苷酸分子的組合物及方法。本發(fā)明進一步涉及到載體，轉化的宿主細胞，除蟲鏈霉菌的新型突變株(其中aveC基因已經被突變以調整所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例)。2．發(fā)明背景2．1．除蟲菌素鏈霉菌可產生各種各樣的次級代謝產物，其中包括除蟲菌素，其含有一系列八種相關的能產生有效的抗蠕蟲和殺昆蟲活性的十六員的大環(huán)內脂類化合物，這八種截然不同但又密切相關的化合物主要指A1a,A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2a及B2b?！癮”系列化合物指的是天然除蟲菌素，其在C25位的取代基為(S)-仲丁基，“b”系列化合物指的是C25位的取代基為異丙基的那些化合物。代號“A”及“B”指的是C5位取代基分別為甲氧基和羥基的除蟲菌素；數(shù)字“1”指的是在C22位及C23位為雙鍵的除蟲菌素。而數(shù)字“2”為C22位有一個氫原子及在C23位有一個羥基的除蟲菌素；在這些相關的除蟲菌素中，B1型的除蟲菌素被公認為具有最強的抗寄生蟲和殺害蟲活性，因而也是最具商業(yè)前景的除蟲菌素。除蟲菌素及其通過除蟲鏈霉菌菌株需氧發(fā)酵的生產方法在美國專利4,310,519及4,429,042中都已有描述。天然除蟲菌素的生物合成被認為可以通過異丁酸及S-(+)-2-甲基丁酸的輔酶A硫代脂類似物內源性起始。經過隨機誘變進行菌株改進并聯(lián)合使用外源提供的脂肪酸可以有效生產除蟲菌素類似物。支鏈二氧酸脫氫酶缺陷的除蟲鏈霉菌的突變體(bkd缺陷突變體)只有在補充有脂肪酸發(fā)酵時才能產生除蟲菌素。篩選和分離支鏈脫氫酶活性缺陷的突變體(如除蟲鏈霉菌，ATCC53567)在歐洲專利(EP)276103中已有描述。在有外源提供的脂肪酸存在下發(fā)酵這些突變體的結果為對應于所使用的脂肪酸僅產生四種除蟲菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸補充除蟲鏈霉菌(ATCC53567)發(fā)酵，結果產生天然除蟲菌素A1a,A2a,B1a及B2a；用異丁酸補充發(fā)酵，結果產生天然除蟲菌素A1b,A2b,B1b及B2b；而用環(huán)戊烷羧酸補充發(fā)酵，結果產生四種新型的環(huán)戊基除蟲菌素A1,A2,B1及B2。如果用其它脂肪酸補充發(fā)酵可以產生新的除蟲菌素。通過篩選800多種潛在的前體，已經鑒定出60多種其它新的除蟲菌素(例見Dutton等，1991，抗生素雜志，44357-365；和Banks等，1994,Roy.Soc.Chem.14716-26)。此外，5-O-甲基轉移酶活性缺陷的除蟲鏈霉菌突變體實際上只能產生B類除蟲菌素，因而，同時缺少支鏈二氧酸脫氫酶及5-O-甲基轉移酶活性的除蟲鏈霉菌的突變體對應于補充發(fā)酵所用的脂肪酸僅生產出B類除蟲菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸補充該雙重突變體發(fā)酵，結果僅產生天然除蟲菌素B1a及B2a，而用異丁酸或環(huán)戊烷羧酸補充發(fā)酵則可以分別產生天然除蟲菌素B1b及B2b或新型環(huán)戊基B1及B2除蟲菌素。而用環(huán)己烷羧酸補充該雙重突變體菌是產生商業(yè)上重要的新型除蟲菌素環(huán)己基除蟲菌素B1(doramectin)的首選方法。該雙重突變體如除蟲鏈霉菌(ATCC53692)的分離及特性描述在歐洲專利申請EP276103中。2．2．參與除蟲菌素生物合成的基因在很多情況下，涉及次生代謝產物生產的基因及編碼一特定抗菌素的基因在染色體上的位置常常是簇集在一起的，例如，鏈霉菌聚酮化合物合成酶基因簇(PKS)(見Hopwood和Sherman,1990，遺傳學年評，2437-66)。這樣，通過生物合成途徑進行基因克隆的一個策略是分離抗藥性基因及然后檢測染色體上相鄰區(qū)域中其它與特定抗生素生物合成相關的基因。另外一種克隆重要代謝產物生物合成之相關基因的策略是突變體互補。例如，來自能產生特定代謝產物之生物的DNA文庫部分被導入不產生該代謝產物的突變體和篩選產生該代謝產物的轉化株。另外，利用來自于其它鏈霉菌的探針進行文庫雜交已被用于鑒別及克隆生物合成途徑中的基因。涉及除蟲菌素生物合成的基因(ave基因)，就象其它鏈霉菌次生代謝產物(例如，PKS)生物合成所需基因一樣，同樣簇集于染色體上。使用載體已成功克隆了許多ave基因以補充除蟲菌素生物合成受阻的除蟲鏈霉菌突變體。這些基因的克隆在美國專利5,252,474中已有描述。此外，Ikeda等，1995，抗生素雜志48532-534，描述了涉及C22,C23脫水步驟的染色體區(qū)域(aveC)定位在除蟲鏈霉菌4.82KbBamHⅠ酶切片斷上，并描述了產生單一組份B2a生產者的aveC基因突變。既然雙氫除蟲菌素，一潛在抗蠕蟲化合物，能由除蟲菌素B2a化學合成，該除蟲菌素B2a的單一組分生產者被認為在商業(yè)上生產雙氫除蟲菌素是比較有用的?？梢允钩x菌素生產的復雜度最小化的aveC基因突變，例如，降低除蟲菌素B2∶B1比率的突變的鑒定可以簡化商業(yè)上重要的除蟲菌素的生產及純化。3．發(fā)明簡述本發(fā)明提供了分離的多核苷酸分子，其含有除蟲鏈霉菌完整的aveCORF基因或其實質性部分，該分離的多核苷酸分子缺少位于除蟲鏈霉菌染色體上aveCORF所處位置下游的下一個完整的ORF。本發(fā)明分離的多核苷酸分子優(yōu)選包括同質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌aveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或者同圖1(SEQIDNO1)aveCORF或其實質性部分相同的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供了多核苷酸分子，其具有的核苷酸序列與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌aveC基因產物編碼序列同源或者同圖1(SEQIDNO1)中存在的aveCORF的核苷酸序列或其實質性部分同源。本發(fā)明進一步提供了多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列編碼的多肽的氨基酸序列與質粒pSE186(ATCC209604)的aveC基因產物編碼序列編碼的氨基酸序列同源或者同圖1(SEQIDNO2)的氨基酸序列或其實質性部分同源。本發(fā)明進一步提供了分離的多核苷酸分子，其含有一編碼AveC同系物基因產物的核苷酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，分離的多核苷酸分子含有編碼吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物的核苷酸序列，其中的同系物基因產物含有如SEQIDNO4的氨基酸序列或其實質性部分。在優(yōu)選的實施方案中，編碼吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物的本發(fā)明分離的多核苷酸分子含有SEQIDNO3的核苷酸序列或其實質性部分。本發(fā)明進一步提供了多核苷酸分子，其含有與SEQIDNO3所示的吸水鏈霉菌核苷酸序列同源的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列編碼的多肽與具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物同源。本發(fā)明還提供了寡核苷酸，其與具有圖1(SEQIDNO1)或SEQIDNO3所示核苷酸序列的多核苷酸分子雜交，或與具有圖1(SEQIDNO1)或SEQIDNO3所示核苷酸序列的互補核苷酸序列的多核苷酸分子雜交。本發(fā)明進一步提供了重組克隆載體及表達載體，它們可用于克隆或表達本發(fā)明的多核苷酸，包括含有除蟲鏈霉菌的aveCORF或者aveC同系物的ORF的多核苷酸分子。在一非限制性的實施方案中，本發(fā)明所提供的質粒pSE186(ATCC209604)含有除蟲鏈霉菌aveC基因完整的ORF。本發(fā)明進一步提供了轉化宿主細胞，其含有本發(fā)明的多核苷酸分子或重組載體及由此得到的新的菌株或細胞系。本發(fā)明進一步提供了基本上純化或分離的重組表達的AveC基因產物或AveC同系物基因產物或其實質性部分及其同系物。本發(fā)明進一步提供了產生重組AveC基因產物的方法，所述方法包括在有利于生產重組AveC基因產物或AveC同系物基因產物的條件下，培養(yǎng)用重組表達載體轉化的宿主細胞，并從細胞培養(yǎng)物中回收AveC基因產物或AveC同系物基因產物，其中所述重組表達載體所含有的多核苷酸分子的核苷酸序列可以編碼AveC基因產物或AveC同系物基因產物，該多核苷酸分子與控制多核苷酸分子在宿主細胞中表達的一個或多個調控元件可操作相連。本發(fā)明進一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列同質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列相同，或同如圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌aveCORF的核苷酸序列相同，但是其進一步包含一個或多個突變以使其中野生型的aveC等位基因已經失活且其表達的多核苷酸分子含有突變的核苷酸序列的除蟲鏈霉菌菌株(ATCC53692)的細胞相對于僅表達野生型的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株(ATCC53692)細胞而言，產生不同比例或量的除蟲菌素。根據(jù)本發(fā)明，可使用這種多核苷酸分子生產除蟲鏈霉菌新菌株，其與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株相比較，除蟲菌素的產量有可測的改變。在優(yōu)選的實施方案中，這種多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株相比以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，這種多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株相比可以生產增加水平的除蟲菌素)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，這種多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其中aveC基因已經失活)。本發(fā)明提供了鑒別能夠改變所產生的除蟲菌素的比例和/或量的除蟲鏈霉菌aveCORF突變的方法。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了鑒別能夠改變所產生的除蟲菌素2類∶1類比例的aveCORF突變的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子被導入該細胞并在其中被表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈霉菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQ1DNO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例與步驟(b)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，如果二者不同的話，則鑒定出能夠改變除蟲菌素2類∶1類比例的aveCORF突變存在，在優(yōu)選的實施方案中，除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定能夠改變所產生的除蟲菌素量的aveCORF突變或者包含有aveCORF的基因構建體突變的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列或含有編碼AveC基因產物的核苷酸序列的基因構建體的多核苷酸分子被導入該細胞并在其中表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈霉菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素的量，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQ1DNO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量與步驟(b)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，如果二者不同的話，則鑒定出能夠改變除蟲菌素量的aveCORF突變或基因構建體突變存在。在優(yōu)選的實施方案中，除蟲菌素的量因突變而增加。本發(fā)明進一步提供了重組載體，該載體可用于制備具有改變的除蟲菌素產量的除蟲鏈霉菌新菌株。例如，本發(fā)明提供了這樣一種載體，其可用于將任一個包含有本發(fā)明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除蟲鏈霉菌染色體上的aveC基因位點，或者插入，或者以同源重組的方式取代aveCORF或其部分。然而，根據(jù)本發(fā)明，當插入到除蟲鏈霉菌染色體上除aveC基因以外的位點時或者在除蟲鏈霉菌細胞中以附加體的形式出現(xiàn)時，包含有本發(fā)明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子在調控除蟲菌素生物合成方面也起到一定作用。因此，本發(fā)明也提供了這樣一種載體，其含有的多核苷酸分子含有本發(fā)明的突變核苷酸序列，可使用該載體將多核苷酸分子插入到除蟲鏈霉菌染色體上除aveC基因以外的位點處，或者該載體可以附加體的形式出現(xiàn)。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所提供的基因取代載體可被用于將突變的aveC等位基因插入到除蟲鏈霉菌染色體上以產生新型的細胞株，其可以較僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素。本發(fā)明進一步提供了一種制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株包含有能夠表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的比例和/或量發(fā)生改變。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株包含有能夠表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例發(fā)生改變，所述方法包括用攜有突變的aveC等位基因的載體轉化除蟲鏈霉菌菌株細胞，該突變的aveC等位基因編碼的基因產物使得表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例發(fā)生改變，選擇轉化細胞，該轉化細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞有所改變。在優(yōu)選實施方案中，在新菌株細胞中，所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例有所減少。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株包括能產生改變量的除蟲菌素的細胞，所述方法包括用攜有突變aveC等位基因或者含有該aveC等位基因的基因構建體的載體轉化除蟲鏈霉菌菌株細胞，其表達的結果使表達突變aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈霉菌菌株細胞所生產的除蟲菌素量較僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變，挑選已轉化的細胞，該轉化細胞產生的除蟲菌素量較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞產生的除蟲菌素量有所改變。在優(yōu)選實施方案中，在新菌株細胞中，所產生的除蟲菌素的量有所增加。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，這些除蟲鏈霉菌細胞中含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用使得aveC等位基因失活的載體轉化表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞，并且挑選其中aveC等位基因已經失活的轉化細胞。本發(fā)明進一步提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有的細胞已被任一含有本發(fā)明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子或載體轉化。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有的細胞表達了突變的aveC等位基因而不是野生型的aveC等位基因，或者同時表達突變的aveC等位基因和野生型的aveC等位基因，其中該新菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例相對于僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所改變。在更優(yōu)選的實施方案中，新菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例相對于僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所降低。這種新菌株可用于大規(guī)模生產有商業(yè)應用價值的除蟲菌素例如doramectin。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有的細胞可以表達突變的aveC等位基因或者含有aveC等位基因的基因構建體，而不是野生型的aveC等位基因，或者同時表達這兩者，其結果是相對于僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量而言，含有該突變的aveC等位基因的細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。在優(yōu)選的實施方案中，新細胞產生的除蟲菌素的量有所增加。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有的細胞中aveC基因已失活。這種菌株不僅對它們產生的與野生型菌株所產生的不同譜的除蟲菌素有用，對于本文所述的測定靶向或隨機誘變的aveC基因是否影響除蟲菌素產量的互補篩選試驗也是非常有用的。本發(fā)明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)除蟲鏈霉菌菌株細胞，并從培養(yǎng)物中回收除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因，與不表達突變aveC等位基因而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，該突變等位基因編碼的基因產物改變了表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例。在優(yōu)選的實施方案中，表達突變的細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例有所減少。該方法提供了商業(yè)上有價值的除蟲菌素例如doramectin的高效率的生產方法。本發(fā)明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)除蟲鏈霉菌菌株細胞，并從培養(yǎng)物中回收除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因構建體，與不表達突變aveC等位基因或基因構建體而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，表達突變的aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。在優(yōu)選的實施方案中，表達突變或基因構建體的細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的量有所減少。本發(fā)明進一步提供了由表達本發(fā)明的突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的新的組合物，其中與僅表達野生型的aveC等位基因而不表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌的相同菌株細胞所產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例相比，其以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素。這種新型的除蟲菌素組合物可以存在于發(fā)酵培養(yǎng)液中或者從培養(yǎng)液中獲得，并且可以部分或基本上純化。4.圖1．含有除蟲鏈霉菌aveCORF的DNA序列(SEQIDNO1)及其推定的氨基酸序列(SEQIDNO2)。圖2．含有除蟲鏈霉菌aveC基因完整的ORF的質粒載體pSE186(ATCC209604)。圖3．含有插入除蟲鏈霉菌aveCORF中的Sacc.Erythraea之ermE基因的基因取代載體pSE180(ATCC209605)。圖4．用五種重疊的粘粒(即pSE65,pSE66,pSE67,pSE68,PSE69)克隆識別的，來自于除蟲鏈霉菌的除蟲菌素聚酮化合物合成酶基因簇的BamHⅠ限制性酶切圖譜。通時指出了pSE118及pSE119的關系。圖5．除蟲鏈霉菌菌株的發(fā)酵產物的HPLC分析。通過與環(huán)己基B1的標準量比較進行峰定量。環(huán)己基B2的保留時間是7.4-7.7分鐘，環(huán)己基B1的保留時間是11.9-12.3分鐘。FIG.5A.除蟲鏈霉菌菌株SE180-11，其具有失活的aveCORF；FIG.5B.用pSE186(ATCC209604)轉化的除蟲鏈霉菌菌株SE180-11；FIG.5C.用pSE187轉化的除蟲鏈霉菌菌株SE180-11；FIG.5D.用pSE188轉化的除蟲鏈霉菌菌株SE180-11。圖6．由除蟲鏈霉菌aveCORF編碼的推定氨基酸序列(SEQIDNO2)，灰產色鏈霉菌的aveC同系物的部分ORF(SEQIDNO5)，及來自于吸水鏈霉菌的aveC同系物ORF(SEQIDNO4)的比較。以粗體表示的纈氨酸殘基是該蛋白質推定的起始位點。以大寫字母表示的保守殘基顯示出全部三種序列中的同源性，以小寫字母表示的保守殘基顯示出3種序列中的2種的同源性。這些氨基酸序列有近50％的序列同一性。圖7．含有來自于吸水鏈霉菌aveC同系物基因(其插入在除蟲鏈霉菌的aveCORF的BsaAⅠ/KpnⅠ位點)的564bp的BsaAⅠ/KpnⅠ片段的雜合質粒構建體。5．發(fā)明詳述本發(fā)明涉及鑒定及表征具有編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，構建可用于篩選突變的AveC基因產物對生產除蟲菌素的影響的除蟲鏈霉菌新菌株，并且發(fā)現(xiàn)某些突變的AveC基因產物可以降低除蟲鏈霉菌產生的除蟲菌素B2∶B1的比例。作為例子，本發(fā)明將在下文中描述具有與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或者具有圖1(SEQIDNO1)的ORF的核苷酸序列的多核苷酸分子，及具有由此得來的突變核苷酸序列的多核苷酸分子。然而，本發(fā)明闡明的原理可被類似地應用于其它的多核苷酸分子，包括來自于其它鏈霉菌例如吸水鏈霉菌及灰產色鏈霉菌等的aveC同系物基因。5．1．編碼除蟲鏈霉菌aveC基因產物的多核苷酸分子本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸分子，其包含有除蟲鏈霉菌完整的aveCORF或其實質性部分，該分離的多核苷酸分子缺少處于除蟲鏈霉菌染色體中aveCORF所處位置下游的下一個完整的ORF。本發(fā)明分離的多核苷酸分子優(yōu)選包括的核苷酸序列與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物的編碼序列相同，或者與圖1(SEQIDNO1)的ORF的核苷酸序列或其實質性部分相同。本文所用的含有編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產物的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子的“實質性部分”指的是分離的多核苷酸分子，其至少包括圖1(SEQIDNO1)所示的完整的aveCORF序列的約70％，并且編碼功能等同的AveC基因產物。這里，“功能等同”的AveC基因產物被定義為基因產物，當其在其中天然aveC等位基因失活的除蟲鏈霉菌菌株ATCC53692中表達時，結果產生的除蟲菌素與僅表達除蟲鏈霉菌菌株ATCC53692天然的野生型功能性aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株ATCC53692產生的除蟲菌素具有基本上相同的比例及量。除了aveCORF的核苷酸序列外，本發(fā)明分離的多核苷酸分子可以進一步包括天然側翼于除蟲鏈霉菌原位aveC基因的核苷酸序列，例如圖1(SEQIDNO1)所示的側翼核苷酸序列。本文所用的術語“多核苷酸分子”，“多核苷酸序列”，“編碼序列”，“開放閱讀框”及＂ORF都意指出DNA分子和RNA分子，其可以是單鏈或者雙鏈，其可以被轉錄或者翻譯(DNA)，或者被翻譯(RNA)成AveC基因產物，或者，如下所述，被翻譯為AveC同系物基因產物，或被翻譯成多肽(當置于適當調控元件的控制之下時，在適當宿主細胞表達系統(tǒng)中其與AveC基因產物或者AveC同系物基因產物同源)。編碼序列包括但不限于原核序列，cDNA序列，基因組DNA序列，及化學合成的DNA和RNA序列。如圖1(SEQIDNO1)所示的核苷酸序列在bp位置42,174,177及180包含四個不同的GTG密碼子。如下面第9部分所示，可構建aveCORF(圖1SEQIDNO1)5＇區(qū)域的多個缺失以幫助確定這些密碼子中的哪些能在aveCORF中用作蛋白質表達的起始位點。bp42位置處第一個GTG位點的缺失并不能消除AveC的活性。此外，再缺失bp位置174,177及180的所有GTG密碼子才能消除AveC的活性，這表明該區(qū)域對于蛋白質表達是必須的。本發(fā)明因此包括了不同長度的aveCORF及其相應的多肽，所述aveCORF可以在如圖1(SEQIDNO1)所示的bp174,177或者180bp的任一GTG位點啟動翻譯。本發(fā)明進一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列同質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列同源，或與圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌aveCORF核苷酸序列或其實質性部分同源。術語“同源”當用于指與除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列同源的多核苷酸分子時，意味著該多核苷酸分子具有的核苷酸序列(a)編碼與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列相同的AveC基因產物，或編碼與圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌的aveCORF核苷酸序列所編碼的相同的AveC基因產物，但其根據(jù)遺傳密碼的簡并性對核苷酸序列作了一個或多個沉默改變；或者(b)在中度嚴緊的條件下，與下述多核苷酸分子的互補序列雜交，該多核苷酸分子含有的核苷酸序列編碼由質粒pSE186(ATCC209604)AveC基因產物編碼序列所編碼的氨基酸序列，或者編碼圖1(SEQIDNO2)所示的氨基酸序列，并編碼如上文所定義的功能等同的AveC基因產物。所述中度嚴緊的條件也即在65℃下，0.5MNaHPO4,7％十二烷基硫酸鈉(SDS),1mMEDTA中與結合于濾膜上的DNA雜交，及在42℃下，在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(例見Ausubel等(編)，1989，分子生物學最新方法，Vol.1,GreenPublishingAssociates公司，和JohnWiley&Sons公司，紐約，p.2.10.3)。在優(yōu)選的實施方案中，同源的多核苷酸分子在高度嚴緊的條件下與質粒pSE186(ATCC209604)中編碼AveC基因產物的核苷酸序列的互補序列雜交，或者與圖1(SEQIDNO1)所示的核苷酸序列或其實質性部分的互補序列雜交，并編碼如上文所定義的功能等同的AveC基因產物。高度嚴緊的條件指的是在65℃,0.5MNaHPO4,7％十二烷基硫酸鈉(SDS),1mMEDTA中與結合于濾膜上的DNA雜交，及在68℃下，在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等，1989，見上文)。如下文實施例所述，AveC基因產物及其潛在的功能等同物的活性可以通過用HPLC分析發(fā)酵產物的方式來測定。不管是天然的還是人工合成的，多核苷酸分子(其含有的核苷酸序列編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產物的功能等同物)包括天然存在于除蟲鏈霉菌其它菌株的AveC基因，存在于鏈霉菌其它種的aveC同系物基因及突變的aveC等位基因。本發(fā)明進一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列所編碼的多肽含有的氨基酸序列與質粒pSE186(ATCC209604)的AveC基因產物編碼序列編碼的氨基酸序列，或與圖1(SEQIDNO2)所示的氨基酸序列或其實質性部分有同源性。本文所用的圖1(SEQIDNO2)的氨基酸序列的“實質性部分”指的是該多肽至少包括約70％的如圖1(SEQIDNO2)所示的氨基酸序列，并且組成了如上所定義的功能等同的AveC基因產物。本文用于指與來自于除蟲鏈霉菌的AveC基因產物的氨基酸序列有同源性的氨基酸序列的術語“同源性”指的是質粒pSE186(ATCC209604)的AveC基因產物編碼序列編碼的多肽，或含有如圖1(SEQIDNO2)所示的氨基酸序列(但其中一個或多個氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基保守取代，該保守取代的結果產生了如上所述的功能等同的基因產物)的多肽。保守的氨基酸取代是本領域眾所周知的。進行這樣的取代的規(guī)則描述于Dayhof,M.D.,1978,Nat.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.,Vol.5,Sup.3等。更具體地，保守的氨基酸取代一般發(fā)生在與酸性，極性，其側鏈大小相關的氨基酸家族中?；蚓幋a的氨基酸一般分為四組(1)酸性=天冬氨酸，谷氨酸；(2)堿性=賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性=丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸；及(4)不帶電的極性=甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸也可以被通稱為芳香的氨基酸。在任何特定組中的一個或多個取代，例如，用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，或者用谷氨酸取代天冬氨酸，或者用絲氨酸取代蘇氨酸，或用結構相關的氨基酸殘基取代任一個其它氨基酸殘基。例如，具有相似的酸性，極性，側鏈大小或其某些結合的相似性的氨基酸殘基進行取代對于整個多肽的功能沒有顯著的影響。本發(fā)明進一步提供了分離的多核苷酸分子，其包括的核苷酸序列編碼aveC同系物基因產物。本文所用的“AveC同系物基因產物”被定義為一基因產物，其與含有由質粒pSE186(ATCC209604)的AveC基因產物編碼序列編碼的氨基酸序列的除蟲鏈霉菌AveC基因產物至少具有50％的氨基酸序列同一性，或者與圖1(SEQIDNO2)所示的氨基酸序列至少具有50％的氨基酸序列同一性。在一個非限制性的實施方案中，AveC同系物基因產物來自于吸水鏈霉菌(歐洲專利申請0298423已有描述；保藏號為FERMBP-1901)，其包含有SEQIDNO4的氨基酸序列或其實質性部分。SEQIDNO4的氨基酸序列的“實質性部分”指的是至少含有70％的SEQIDNO4氨基酸序列的多肽，其構成功能等同的AveC同系物基因產物?！肮δ艿韧摹盇veC同系物基因產物被定義成基因產物，當在吸水鏈霉菌菌株FERMBP-1901中表達時(其中天然的AveC同系物等位基因已經失活)，導致所產生的米爾倍霉素的比例和量基本上同于僅表達吸水鏈霉菌菌株FERMBP-1901天然的野生型功能性aveC同系物等位基因的吸水鏈霉菌菌株FERMBP-1901所產生的比例和量。在一個非限制性實施方案中，本發(fā)明分離的多核苷酸分子(其編碼吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物)含有SEQIDNO3的核苷酸序列或其實質性部分。在這點上，含有SEQIDNO3之核苷酸序列的分離的多核苷酸分子的“實質性部分”指的是該分離的多核苷酸分子至少包括70％的如SEQIDNO3所示的核苷酸序列，并且編碼如上所定義的功能相當?shù)腁veC同系物基因產物。本發(fā)明進一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列同SEQIDNO3所示的吸水鏈霉菌核苷酸序列同源。術語“同源”當用于指含有與SEQIDNO3的吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物編碼序列同源的核苷酸序列的多核苷酸分子時，意味著該多核苷酸分子具有的核苷酸序列(a)編碼與SEQIDNO3的核苷酸序列或其實質性部分相同的基因產物，但其根據(jù)遺傳密碼的簡并性對核苷酸序列作了一個或多個沉默變化；或者(b)在中度嚴緊的條件下，與具有編碼SEQIDNO4之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補序列雜交并編碼上述功能等同的AveC同系物基因產物，所述中度嚴緊的條件也即在65℃下，0.5MNaHPO4,7％十二烷基硫酸鈉(SDS),1mMEDTA中與結合于濾膜上的DNA雜交，及在42℃下，0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(例見Ausubel等，文獻同上)。在優(yōu)選的實施方案中，同源的多核苷酸分子在高度嚴緊的條件下與SEQIDNO3中編碼AveC同系物基因產物的核苷酸序列或其實質性部分的互補序列雜交，并編碼上述功能等同的AveC同系物基因產物，所述高度嚴緊條件指的是在65℃,0.5MNaHPO4,7％十二烷基硫酸鈉(SDS),1mMEDTA中與結合于濾膜上的DNA雜交，及在68℃下，0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等，1989，見上文)。本發(fā)明進一步提供了一多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列所編碼的多肽與吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物具有同源性。本文用于指與來自于吸水鏈霉菌的SEQIDNO4的AveC同系物基因產物具有同源性的多肽的術語“同源性”指的是含有如SEQIDNO4所示氨基酸序列(但其中一個或多個氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基保守取代，該保守取代的結果在于產生了如上所述的功能等同的同系物基因產物)的多肽。本發(fā)明進一步提供了寡核苷酸分子，其與具有如圖1(SEQIDNO1)或者SEQIDNO3之核苷酸序列的多核苷酸分子雜交，或者與具有如圖1(SEQIDNO1)或者SEQIDNO3之核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列的多核苷酸分子雜交。該寡核苷酸的長度至少約為10個核苷酸，且優(yōu)選約為15-30個核苷酸，其在高度嚴緊的條件下與前述之一種多核苷酸分子雜交，即在37℃左右，6×SSC/0.5％焦磷酸鈉中洗滌14個堿基左右的寡核苷酸，在48℃左右洗滌17個堿基左右的寡核苷酸，在55℃左右洗滌20個堿基左右的寡核苷酸，及在60℃左右洗滌23個堿基左右的寡核苷酸。在一個優(yōu)選實施方案中，該寡核苷酸與前述多核苷酸分子之一的部分互補。這些寡核苷酸分子可用于不同目的，包括編碼，或用作基因調控所用的反義核酸分子，或用作擴增編碼aveC或aveC同系物的多核苷酸分子的引物。此外，可以結合已知技術，使用本文公開的多核苷酸分子或寡核苷酸在鏈霉菌的其它種或菌株中鑒定其它aveC同系物基因。例如，含有圖1(SEQIDNO1)的除蟲鏈霉菌核苷酸序列的一部分或者SEQIDNO3的吸水鏈霉菌核苷酸序列的一部分的寡核苷酸分子可被可測地標記及用于篩選由來源于相關生物體的DNA所構建的基因組文庫)。雜交條件嚴緊性的選擇是基于所涉及生物體的相互關系，在這個例子中，指的是除蟲鏈霉菌或者吸水鏈霉菌與其它相關生物體的關系。對不同嚴緊條件的要求是本領域技術人員眾所周知的，這樣的條件將根據(jù)衍生得到文庫及標記序列的特定生物體的不同而進行可預測的改變。優(yōu)選所述寡核苷酸的長度至少約為15個核苷酸，其包括，如下述實施例描述的那些?？梢岳眠@些或其它的寡核苷酸通過應用聚合酶鏈反應(PCR)等標準技術進行同系物基因擴增，但也可使用本領域已知的其它擴增技術，如連接酶鏈反應。可以檢測被鑒定為包含有aveC同系物核苷酸序列的克隆編碼功能AveC同系物基因產物的能力。為此，可對該克隆進行序列分析以鑒別適當?shù)拈喿x框以及起始和終止信號。或者或另外，可將克隆的DNA序列插入合適的表達載體，即含有轉錄及翻譯插入的蛋白質編碼序列所必需的元件的載體。可按下述使用多種宿主/載體系統(tǒng)中的任一種，包括但不局限于如質粒，噬菌體，或粘粒表達載體等的細菌系統(tǒng)?？梢匀缦旅娴?部分所述，通過使用如HPLC分析發(fā)酵產物來分析用含有潛在aveC同系物編碼序列的載體轉化的適當宿主細胞的AveC型活性。本文所述的多核苷酸分子的生產和操作是本領域技術人員易于做到的，其可以依下述的重組技術進行操作，例如，Maniatis等，1989，分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，現(xiàn)代分子生物學教程，GreenePublishingAssociates&WileyInterscience，紐約；Sambrook等，1989，分子克隆實驗指南，(第二版)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Innis等(編)，1995,PCR策略，AcademicPress公司，SanDiego；和Erlich(編)，1992,PCR技術，牛津大學出版社，紐約(列入本文作為參考)。編碼AveC基因產物或AveC同系物基因產物的多核苷酸克隆可以通過本領域已知的任何方法進行鑒別，包括但不限于下面第7部分所列舉的方法。通過使用如Benton和Dayis,1977，科學196180中所述的篩選噬菌體文庫的方法和Grunstein及Hogness,1975,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,723961-3965所述的篩選質粒文庫的方法，可以從基因組DNA文庫中篩選aveC及aveC同系物編碼序列。存在于質粒pSE186(ATCC209604)，或質粒pSE119中，且具有已知包含有aveCORF之核苷酸序列的多核苷酸分子(在下面第7部分進行描述)可以用作這些篩選實驗的探針?；蛘?，可以合成對應由純化的AveC同系物基因產物的部分或全部氨基酸序列推出的核苷酸序列的寡核苷酸探針。5．2．重組系統(tǒng)5．2．1．克隆與表達載體本發(fā)明進一步提供了重組克隆載體與表達載體，其可用于克隆及表達本發(fā)明的，包括有除蟲鏈霉菌aveCORF或任一aveC同系物ORF的多核苷酸分子。在一非限制性實施方案中，本發(fā)明提供了質粒pSE186(ATCC209604)，其包含有除蟲鏈霉菌aveC基因完整的ORF。除非特別說明，所有下面有關除蟲鏈霉菌aveCORF或包含有除蟲鏈霉菌aveCORF或其部分的多核苷酸分子，或除蟲鏈霉菌AveC基因產物的描述，同時也指的是AveC同系物和AveC同系物基因產物。已研制出多種不同的具體用于鏈霉菌的載體，包括噬菌體，高拷貝數(shù)質粒，低拷貝數(shù)質粒，及大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒等，其中任一個都可以用來實踐本發(fā)明。也從鏈霉菌中克隆了大量藥物抗性基因，其中某些基因被摻入載體作為選擇性標記。在其它文獻如Hutchinson,1980，應用生物化學與生物技術，16169～190中已經列舉了在鏈霉菌中使用這些載體的例子。優(yōu)選構建出的本發(fā)明的重組載體，尤其是表達載體使得本發(fā)明多核苷酸分子的編碼序列與轉錄或翻譯編碼序列所必需的一個或多個調控元件可操作相連以生產多肽。本文所用術語“調控元件”包括但不限于這樣的核苷酸序列，其編碼可誘導的及不可誘導的啟動子，增強子，操作子，及本領域已知的用于驅動和/或調控多核苷酸編碼序列的表達的其它元件。同時，如本文所用，該編碼序列與一個或多個調控元件“可操作相連”，其中這些調控元件有效地調節(jié)并允許轉錄編碼序列或翻譯其mRNA，或者既轉錄也翻譯?？杀患庸こ砂斜景l(fā)明的多核苷酸分子的典型的質粒載體包括pCR-Blunt,pCR2.1(Invitrogen),pGEM3Zf(Promega)，及其穿梭載體pWHM3(Vara等，1989，細菌學雜志，1715872-5881)等。構建包含有特殊編碼序列(其與合適的調控元件可操作相連)的重組載體的方法是本領域眾所周知的，可使用這些方法實踐本發(fā)明。這些方法包括體外重組技術，合成技術，體內基因重組。例見Maniatis等，1989，文獻同上；Ausubel等，1989，文獻同上；Sambrook等，1989，文獻同上；Innis等，1995，文獻同上；及Erlich,1992，文獻同上中描述的技術。這些載體的調控元件的強度和特異性可以不同。根據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，可使用多種適當?shù)霓D錄及翻譯元件中的任一種。對于細菌來說，轉錄調控區(qū)或啟動子的非限制性例子包括有；β-gal啟動子，T7啟動子，TAC啟動子，λ左及右啟動子，trp及l(fā)ac啟動子，trp-lac融合啟動子，對于鏈霉菌來說則較特殊，啟動子為ermE,melC，及tipA等。在下面第11部分所述的具體的實施方案中，一個包含有aveCORF的表達載體得以產生，所述ORF被克隆在與紅色糖多孢菌的強組成型ermE啟動子相鄰的位置。將該載體轉化到除蟲鏈霉菌中，隨后用HPLC分析發(fā)酵產物顯示所產生的除蟲菌素的滴度相對于僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株的產量有所增加。融合蛋白表達載體可被用于表達AveC基因產物-融合蛋白。純化的融合蛋白可被用于提高抗AveC基因產物的抗血清，用于研究AveC基因產物的生化特性，用不同的生化活性加工AveC融合蛋白，或有助于鑒定及純化表達的AveC基因產物?？赡艿娜诤系鞍妆磉_載體包括但不局限于這樣的載體，其整合有編碼β-半乳糖苷酶及trpE融合子，麥芽糖結合蛋白融合子，谷胱甘肽-S-轉移酶融合子及多組氨酸融合子(運載區(qū)域)的序列。在一個可替代的實施方案中，AveC基因產物或其部分可與AveC同系物基因產物或其部分融合，該AveC同系物基因產物來源于鏈霉菌的其它種或菌株，例如吸水鏈霉菌或灰產色鏈霉菌。在下面第12部分及圖-7所述的特定實施方案中，構建了嵌合質粒，其含有吸水鏈霉菌aveC同系物ORF的564bp的區(qū)域，其替代了除蟲鏈霉菌aveCORF的同源564bp的區(qū)域。將該雜合載體轉化至除蟲鏈霉菌細胞中，并且檢測其對所產生的除蟲菌素2類∶1類之比例的影響。AveC融合蛋白可被設計成包含有對純化有用的區(qū)域。例如，可以使用直鏈淀粉樹脂純化AveC-麥芽糖結合蛋白融合子；可以使用谷胱甘肽瓊脂糖珠純化AveC-谷胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白；可以使用二價鎳樹脂純化AveC-多組氨酸融合子?；蛘撸馆d體蛋白或多肽的抗體可被用于融合蛋白的親和層析純化。例如，可將與調控元件可操作相連的編碼單克隆抗體靶表位的核苷酸序列插入表達載體的適當位置處，以使表達的表位與AveC多肽融合。例如，可通過標準技術將編碼FLAGTM表位標記(IntemationalBiotechnologiesInc.)(其為親水性標記肽)的核苷酸序列插入表達載體中對應于AveC多肽羧基末端的位點?？梢岳蒙藤彽目笷LAGTM抗體檢測及親和純化表達的AveC多肽FLAGTM表位融合產物。編碼AveC融合蛋白的表達載體同樣也可以被設計成包含有編碼特殊的蛋白酶裂解位點的多接頭序列，以使表達的AveC多肽經用特定的蛋白酶處理可以從載體區(qū)域或融合配對物中釋放。例如，該融合蛋白載體可以包括編碼凝血酶或Xa因子酶切位點等的DNA序列。利用已知的方法將aveCORF上游和框內的信號序列插入表達載體中以介導表達的基因產物的運輸和分泌。信號序列的非限制性例子包括得自α因子，免疫球蛋白，外膜蛋白，青霉素酶和T細胞受體等的信號序列。為了幫助選擇用本發(fā)明的克隆或表達載體轉化或轉染的宿主細胞，該載體也可被設計為進一步包括報道基因產物或其它可選擇標記的編碼序列。優(yōu)選所述編碼序列與上述調控元件編碼序列可操作相連。對本發(fā)明有用的報道基因是本領域眾所周知的，其包括那些編碼綠熒光蛋白，熒光素酶，xylE及酪氨酸酶等的報道基因。編碼可選擇標記的核苷酸序列是本領域眾所周知的，其包括那些編碼賦予抗生素抗性，抗代謝物抗性，或提供營養(yǎng)缺陷型需求之基因產物的序列。這些序列包括例如編碼紅霉素，硫鏈絲菌肽或卡那霉素等抗性的核苷酸序列。5．2．2宿主細胞的轉化本發(fā)明進一步提供轉化的宿主細胞，其含有本發(fā)明的多核苷酸分子或重組載體，或由該宿主細胞衍生的新菌株或細胞系。可用于本發(fā)明實施中的宿主細胞優(yōu)選為鏈霉菌細胞，但其它的原核細胞或真核細胞同樣也可被使用。該轉化的宿主細胞一般包括但不局限于微生物，例如用重組噬菌體DNA，質粒DNA，或粘粒DNA載體轉化的細菌，或用重組載體等轉化的酵母。本發(fā)明的多核苷酸分子欲在鏈霉菌細胞中發(fā)揮作用，其也可以因克隆及表達目的轉化至其它細菌或真核細胞中。例如一般使用大腸桿菌菌株，如DH5α菌株，可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockville,MD,USA(保藏號31343)，或可商購(Stratagene)。優(yōu)選的真核宿主細胞包括酵母細胞，但哺乳動物細胞或昆蟲細胞也可被有效使用。本發(fā)明的重組表達載體最好被轉化或轉染至基本上均一培養(yǎng)的一個或多個宿主細胞中。一般根據(jù)已知技術，例如，通過原生質體轉化，磷酸鈣沉淀，氯化鈣處理，微量注射，電穿孔，通過與重組病毒接觸進行轉染，脂質體介導的轉染，DEAE-葡聚糖轉染，轉導，接合，或微粒轟擊將表達載體導入宿主細胞中。可以通過標準方法選擇轉化子，例如，選擇表達與上述重組載體相關的選擇性標記，如抗生素抗性的細胞。一旦將表達載體導入宿主細胞，可以通過檢測預期基因產物的標準技術證實aveC編碼序列已整合并維持在宿主染色體上或以游離體的形式存在，所述技術如Southern雜交分析，限制性酶切分析，PCR分析，包括逆轉錄酶PCR(rt-PCR)或者免疫測定法。含有和/或表達重組aveC編碼序列的宿主細胞可以通過至少四種公知的一般方法中的任一種來證實，所述方法包括(ⅰ)DNA-DNA,DNA-RNA，或者RNA-反義RNA雜交；(ⅱ)檢測標記基因功能的存在；(ⅲ)通過測定宿主細胞中aveC特異性mRNA轉錄物的表達來評估轉錄水平，及(ⅳ)通過免疫測定法或AveC生物活性的存在(例如，特定比例和量的除蟲菌素的產生表示除蟲鏈霉菌宿主細胞中存在AveC活性)檢測成熟多肽產物的存在。5．2．3．重組AveC基因產物的表達及鑒定一旦aveC編碼序列被穩(wěn)定導入合適的宿主細胞，該轉化的宿主細胞被無性增殖，可以在有助于AveC基因產物最大量生產的條件下培養(yǎng)所得細胞。所述條件一般包括將細胞培養(yǎng)至高密度。當表達載體含有可誘導的啟動子時，在需要誘導表達時可使用合適的誘導條件例如，溫度變化，營養(yǎng)耗盡，添加義務誘導物(例如，碳水化合物的類似物，例如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))，過量的代謝副產物的積累等。當表達的AveC基因產物保留在宿主細胞內部時，收集細胞并裂解，在本領域已知的提取條件下，例如，在4℃或有蛋白酶抑制劑的存在，或二者共存的條件下，從裂解物中分離及純化產物以使蛋白質的降解最小化。當表達的AveC基因產物從宿主細胞中分泌時，只需收集耗盡的營養(yǎng)培養(yǎng)基并從中分離產物。利用標準方法，可從細胞裂解物或培養(yǎng)基(適當時)中分離或基本上純化表達的AveC基因產物，所述方法包括但不局限于下列方法的任何組合硫酸銨沉淀，大小分級分離，離子交換層析，HPLC，密度離心及親和層析。當表達的AveC基因產物表現(xiàn)出生物活性時，可使用適當?shù)臋z測方法監(jiān)測純化方法的每一步中制品純度的提高。不管表達的AveC基因產物是否表現(xiàn)出生物活性，都可以依據(jù)其大小，與抗體或特異于AveC的抗體的反應性，或者在融合標記的存在下檢測該基因產物。因此，本發(fā)明提供了重組表達的除蟲鏈霉菌AveC基因產物及其同系物，所述基因產物含有可以被質粒pSE186(ATCC209604)的AveC基因產物編碼序列所編碼的氨基酸序列，或圖1(SEQIDNO2)所示的氨基酸序列或其實質性部分。本發(fā)明進一步提供了重組表達的吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物及其同系物，所述基因產物含有如SEQIDNO4所示的氨基酸序列或其實質性部分。本發(fā)明進一步提供了生產AveC基因產物的方法，所述方法包括在有助于產生重組AveC基因產物的條件下，培養(yǎng)用重組表達載體轉化的宿主細胞，并從細胞培養(yǎng)物中回收AveC基因產物，其中所述載體含有具有編碼AveC基因產物之核苷酸序列的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子與一個或多個控制多核苷酸分子在宿主細胞中的表達的調控元件可操作相連。重組表達的除蟲鏈霉菌AveC基因產物可用于不同的目的，其中包括篩選可以改變AveC基因產物功能的化合物，及因此調制除蟲菌素的生物合成以及產生針對AveC基因產物的抗體。一旦獲得純度足夠高的AveC基因產物，通過下列標準方法就可以鑒定基因產物，所述方法如SDS-PAGE，大小排阻層析，氨基酸序列分析，在除蟲菌素生物合成途徑中產生合適產物的生物活性等等。例如，可以使用標準的肽測序技術測定AveC基因產物的氨基酸序列?？梢杂糜H水性分析(例見Hopp和Woods,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA783824)，或者類似的軟件運算法則鑒定AveC基因產物的親水區(qū)及疏水區(qū)，籍此進一步鑒定AveC基因產物?？蛇M行結構分析以鑒定AveC基因產物中具有特殊二級結構的區(qū)域，例如可使用如X-射線結晶學的生物物理法(Engstrom,1974,Biochem.Exp.Biol.117-13)，計算機模型制作法(Fletterick及Zoller(編)，1986，分子生物學最新通訊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)和核磁共振(NMR)作圖及研究AveC基因產物及其底物之間相互作用的位點。通過研究所取得的信息可被用于選擇aveCORF的新突變位點，以幫助開發(fā)具有更合適的除蟲菌素生產特性的除蟲鏈霉菌新菌株。5．3．AveC突變體的構建及應用本發(fā)明進一步提供了多核苷酸分子，其或者具有與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或具有如圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌aveCORF的核苷酸序列，但其進一步包含有一個或多個突變，以致于除蟲鏈霉菌菌株ATCC53692(其中野生型aveC等位基因已經失活并表達含有突變的核苷酸序列的多核苷酸分子)較僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株ATCC53692的細胞產生了不同比例及量的除蟲菌素。按照本發(fā)明，所述多核苷酸分子可被用于生產除蟲鏈霉菌新菌株，所述新菌株與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株比較，除蟲菌素的生產發(fā)生可測的改變。在優(yōu)選的實施方案中，所述多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其與僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株相比，以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其與僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株相比可以產生增加水平的除蟲菌素)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其中aveC基因已經失活)。AveC編碼序列的突變包括將氨基酸缺失，添加或取代導入AveC基因產物，或導致AveC基因產物截短或其任何組合并產生所需結果的任何突變。例如，本發(fā)明提供了多核苷酸分子，其包含質粒pSE186(ATCC209604)的AveC基因產物編碼序列或如圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌aveCORF核苷酸序列，但其進一步包含有一個或多個突變，其編碼用不同的氨基酸殘基在AveC基因產物的選定位點對氨基酸殘基進行的取代。在下文例舉的幾個非限制性的實施方案中，該取代發(fā)生在氨基酸殘基第55,138,139，或230位，或其中幾個位點。通過多種已知方法的任一種可以進行aveC編碼序列的突變，包括使用易錯聚合酶鏈式反應，或通過盒式誘變。例如，可以使用寡核苷酸介導的誘變以一種確定的方式例如在aveCORF序列的特定區(qū)域導入一個或多個限制性位點或終止密碼子來改變aveCORF序列。正如美國專利5,605,793所述，也可使用包括隨機片斷化，重復誘變循環(huán)及核苷酸改組的方法產生較大的具有編碼aveC突變的核苷酸序列的多核苷酸文庫。靶向突變是有用的，對于改變AveC基因產物的一個或多個保守的氨基酸殘基尤其有用。例如，如圖6所示，通過將AveC基因產物與來自除蟲鏈霉菌(SEQIDNO2)、灰產色鏈霉菌(SEQIDNO5)及吸水鏈霉菌(SEQIDNO4)的AveC同系物基因產物推定的氨基酸殘基序列相比較，顯示了這些種之間顯著保守的氨基酸殘基位點。導致一個或多個所述保守的氨基酸殘基改變的靶向誘變對于產生可以顯示所需的除蟲菌素產量改變的新突變株是非常有效的。隨機誘變也是有用的，可以通過將除蟲鏈霉菌細胞暴露于紫外線或X-射線照射，或者暴露于如N-甲基-N＇-亞硝基胍，甲烷磺酸乙酯，亞硝酸或者氮芥子類的化學誘變劑進行誘變。有關誘變技術的綜述可參見Ausubel,1989，文獻同上。一旦產生突變的多核苷酸分子，可進行篩選以測定其是否可調制除蟲鏈霉菌中的除蟲菌素生物合成。在優(yōu)選的實施方案中，通過互補除蟲鏈霉菌菌株(其中aveC基因已經失活從而給出aveC-背景)檢測具有突變的核苷酸序列的多核苷酸分子。在非限制性方法中，突變的多核苷酸分子被剪接成與一個或多個調控元件可操作相連的表達質粒，其中質粒優(yōu)選包括一個或多個藥物抗性基因以選擇轉化細胞。使用已知技術將該載體轉化至aveC-宿主細胞，選擇轉化細胞并在允許或者誘導除蟲菌素產生的條件下在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。然后通過HPLC分析發(fā)酵產物以測定突變的多核苷酸分子互補宿主細胞的能力。在下面8.3部分要舉例說明攜有能降低除蟲菌素B2∶B1比例的突變的多核苷酸分子的幾個載體，其包括pSE188,pSE199及pSE231。本發(fā)明提供了鑒定除蟲鏈霉菌aveCORF突變(其可以改變所產生的除蟲菌素的比例和/或產量)的方法。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定除蟲鏈霉菌aveCORF突變(其可以改變所產生的除蟲菌素的B2∶B1比例)的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子被導入該細胞并在其中被表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈霉菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQIDNO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例與步驟(b)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，如果二者不同的話，則鑒定出有能夠改變除蟲菌素2類∶1類比例的aveCORF突變存在。在優(yōu)選的實施方案中，除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，該方法用于鑒定aveCORF或者包含有aveCORF的基因構建體中能夠改變所產生的除蟲菌素量的突變，所述方法包括(a)測定除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列或含有編碼AveC基因產物的核苷酸序列的基因構建體的多核苷酸分子被導入該細胞并在其中表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈霉菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素的量，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQIDNO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量與步驟(b)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，如果二者不同的話，則鑒定出有能夠改變除蟲菌素量的aveCORF突變或基因構建體突變存在。在優(yōu)選的實施方案中，除蟲菌素的量因突變而增加。上述的任一用于鑒定突變的方法可以通過使用發(fā)酵培養(yǎng)基進行，優(yōu)選在該培養(yǎng)基中添加環(huán)己烷羧酸，但其它合適的脂肪酸前體，例如，如表1所列的脂肪酸前體中的任一種也可以被使用。一旦鑒定出按所需方向調制除蟲菌素生產的突變的多核苷酸分子，也可以確定核苷酸序列上發(fā)生突變的位置。例如，可以通過PCR分離含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子并使用已知方法對其進行DNA序列分析。通過比較突變的及野生型的aveC等位基因的DNA序列，可以確定負責改變除蟲菌素生產的突變。在本發(fā)明具體的、但非限制性的實施方案中，含有第55(S55F),138(S138T),139(A139T)或230(G230D)位殘基單個氨基酸取代或者第138(S138T)及139(A139T)位殘基雙重取代的除蟲鏈霉菌AveC基因產物的AveC基因產物功能發(fā)生改變，使得所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例發(fā)生改變(參見下文第8部分)。因此，本發(fā)明包括多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列所編碼的突變的除蟲鏈霉菌AveC基因產物包含第55,138,139或230位氨基酸殘基或其任意組合處發(fā)生的一個或多個氨基酸取代。本發(fā)明進一步提供了制備新的除蟲鏈霉菌菌株的組合物，該菌株的細胞含有突變的aveC等位基因而導致除蟲菌素生產的變化。例如，本發(fā)明提供了重組載體，可使用該載體將任何含有本發(fā)明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除蟲鏈霉菌染色體上的aveC基因位點，以通過同源重組插入或取代aveCORF或其部分。然而，按照本發(fā)明，此處提供的含有本發(fā)明突變的核苷酸序列的多核苷酸分子也可以在插入到除蟲鏈霉菌染色體上除aveC基因外的位點，或在除蟲鏈霉菌細胞中保持游離狀態(tài)時，同樣起到調制除蟲菌素生物合成的作用。因此，本發(fā)明還提供了具有含有本發(fā)明突變的核苷酸序列的多核苷酸分子的載體，可使用這些載體將多核苷酸分子插入到除蟲鏈霉菌染色體上除aveC基因位點以外的位置，或保持游離狀態(tài)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了基因取代載體，其可以用于將突變的aveC等位基因插入除蟲鏈霉菌菌株中，籍此產生新的除蟲鏈霉菌菌株，所述菌株的細胞與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，產生的除蟲菌素2類∶1類比例有所改變。在優(yōu)選的實施方案中，該細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例減少。可使用本文提供的表達載體如pSE188,pSE199，及pSE231(這些表達載體在下面第8.3部分將舉例說明)中存在的突變的多核苷酸分子構建所述基因取代載體。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了載體，可使用該載體將突變的aveC等位基因插入除蟲鏈霉菌菌株細胞中以產生新細胞株，所述新細胞與僅表達野生型的AveC等位基因的相同菌株細胞相比，產生的除蟲菌素的量有所改變。在優(yōu)選的實施方案中，所述新細胞產生的除蟲菌素的量增加。在具體的、非限制性實施方案中，該載體進一步包含本領域已知的強啟動子，例如，來自Saccharopolysporaerythraea的強組成型ermE啟動子，其位于aveCORF上游并與aveCORF可操作相連。所述載體可以是如下面實施例11所描述的質粒pSE189，或可通過使用質粒pSE189的突變的aveC等位基因進行構建。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了基因取代載體，該載體可用于滅活野生型除蟲鏈霉菌菌株中的aveC基因。在非限制性的實施方案中，可以通過使用質粒pSE180(ATCC209605)中存在的突變的多核苷酸分子構建所述基因取代載體，其在下面第8.1部分舉例說明(圖3)。本發(fā)明進一步提供了包含有多核苷酸分子的基因取代載體，所述多核苷酸分子包含天然側翼于除蟲鏈霉菌染色體上原位aveC基因的核苷酸序列或由該序列組成，例如，包括那些如圖1(SEQIDNO1)所示的側翼核苷酸序列，可使用所述載體缺失除蟲鏈霉菌aveCORF。本發(fā)明進一步提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述新菌株含有表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株的細胞比較，所產生的除蟲菌素的比例和/或量發(fā)生改變。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述新菌株含有表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株的細胞比較，所產生的除蟲菌素2類∶1類比例發(fā)生改變，所述方法包括用攜有突變的aveC等位基因的載體轉化除蟲鏈霉菌菌株細胞，該突變的aveC等位基因編碼的基因產物使得與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株的細胞比較，表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例有所改變；選擇所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞有所改變的轉化細胞。在優(yōu)選實施方案中，除蟲菌素2類∶1類的比例有所減少。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株含有生產改變量的除蟲菌素的細胞，所述方法包括用攜有突變aveC等位基因的載體或者含有該aveC等位基因的基因構建體轉化除蟲鏈霉菌菌株細胞，所述突變的aveC等位基因的表達使得表達突變aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素的量較僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變；選擇所產生的除蟲菌素的量較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞有所改變的轉化細胞。在優(yōu)選實施方案中，轉化細胞中所產生的除蟲菌素的量有所增加。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株的細胞含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用失活的aveC等位基因的載體轉化表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞；選擇其中aveC等位基因已失活的轉化細胞。在優(yōu)選的、非限制性的實施方案中，除蟲鏈霉菌菌株細胞被基因取代載體轉化，該載體所攜帶的aveC等位基因已經因突變或用異源基因序列取代AveC等位基因的一部分而失活，其中選擇天然aveC等位基因已經被失活的aveC等位基因所取代的轉化細胞。如下所述，AveC等位基因的失活可以通過用HPLC分析發(fā)酵產物來測定。在如下面第8.1部分所述的具體的、非限制性的實施方案中，通過在aveCORF中插入來自紅色糖多孢菌的ermE基因而使aveC等位基因失活。本發(fā)明進一步提供了除蟲鏈霉菌的新菌株，其含有用本發(fā)明的任一多核苷酸分子或載體轉化的細胞。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有表達突變的aveC等位基因以取代野生型的aveC等位基因或含有同時表達這兩種等位基因的細胞，其中新菌株細胞以相對于僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所改變的2類∶1類的比例生產除蟲菌素。在優(yōu)選的實施方案中，新細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例降低。該新菌株對于商用除蟲菌素如doramectin的大規(guī)模生產是非常有用的。本文描述的篩選試驗的根本目的是鑒定突變的aveC等位基因，其在除蟲鏈霉菌細胞中的表達改變了，特別是降低了所產生除蟲菌素的2類∶1類的比例。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的表達可降低所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例的突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌新菌株細胞所產生的除蟲菌素的B2∶B1的比例減小的范圍是1.6∶1～0∶1以下；在更優(yōu)選的實施方案中，比例約為1∶1～0∶1；在最優(yōu)選的實施方案中，比例約為0.84∶1～0∶1。在下面描述的具體實施方案中，本發(fā)明的新細胞所產生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例小于1.6∶1。在下面描述的另一個不同的具體實施方案中，本發(fā)明的新細胞所產生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例大約是0.94∶1。在下面描述的另一個不同的具體實施方案中，本發(fā)明的新細胞所產生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例大約是0.88∶1。在下面描述的另一個不同的具體實施方案中，本發(fā)明的新細胞所產生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例大約是0.84∶1。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有表達突變的aveC等位基因，或含有aveC等位基因的基因構建體以取代野生型aveC等位基因或含有同時表達突變的和野生型aveC等位基因的細胞，其中新菌株細胞以相對于僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所改變的量生產除蟲菌素。在優(yōu)選的實施方案中，新菌株產生的除蟲菌素的量增加。在非限制性的實施方案中，基因構建體進一步包括強啟動子，例如，來自紅色糖多孢菌的強組成型ermE啟動子，其位于aveCORF上游并與aveCORF可操作相連。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有其中aveC基因已經失活的細胞。所述菌株可用于產生與野生型菌株相比有不同譜的除蟲菌素，在本文所述的互補篩選試驗中還可測定aveC基因靶向或隨機誘變是否影響除蟲菌素的生產。在下文所述的具體實施方案中，除蟲鏈霉菌宿主細胞經基因改造后含有失活的aveC基因。例如，下面實施例中所述的菌株SE180-11就是使用基因取代質粒pSE180(ATCC209605)(圖3)產生的，通過在aveC基因編碼區(qū)插入ermE抗性基因而使除蟲鏈霉菌aveC基因失活。本發(fā)明進一步提供了重組表達的，突變的除蟲鏈霉菌AveC基因產物及其制備方法，所述基因產物由本發(fā)明上述多核苷酸分子的任一種編碼。本發(fā)明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)除蟲鏈霉菌菌株細胞，并從培養(yǎng)物中回收所述除蟲菌素，所述細胞表達編碼基因產物的突變的aveC等位基因，與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，所述突變的等位基因改變了表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例。在優(yōu)選的實施方案中，表達突變的aveC等位基因的細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例有所減少。該方法提供了商業(yè)上有價值的除蟲菌素例如doramectin的高效率的生產方法。本發(fā)明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)除蟲鏈霉菌菌株細胞，并從培養(yǎng)物中回收所述除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因構建體，與不表達突變aveC等位基因或基因構建體而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，表達突變的aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。在優(yōu)選的實施方案中，在培養(yǎng)物中表達突變aveC等位基因或基因構建體的細胞產生的除蟲菌素的量有所增加。本發(fā)明進一步提供了由表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株產生的除蟲菌素的新的組合物，其中，突變的aveC等位基因所編碼的基因產物使表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株的細胞相比有所降低，其中，與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株的細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例相比，新組合物中的除蟲菌素以降低的2類∶1類比例產生。這種新型的除蟲菌素組合物可以存在于耗盡的發(fā)酵培養(yǎng)液中或者從中回收，并且可以通過已知的生化純化技術如硫酸銨沉淀，透析，大小分級分離，離子交換層析，HPLC等從培養(yǎng)液中部分純化或基本純化。5．4．除蟲菌素的用途除蟲菌素是一種非常有效的抗寄生蟲藥劑，特別是作為驅蟲劑、外寄生物殺死藥、殺蟲劑及殺螨劑。按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物均可用于這些用途。例如，按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物可用于治療人類的各種疾病或癥狀，尤其是本領域已知的由寄生蟲感染造成的那些疾病。參見IkedaandOmura,1997,Chem.Rev.97(7)2591-2609。更為具體的是，按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物對于由內寄生蟲所導致的各種疾病或癥狀能產生有效的治療作用，所述內寄生蟲例如寄生性線蟲類可以感染人體，家畜，豬，綿羊，家禽，馬或者牛。更具體的是，按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物對于抵抗感染人體的線蟲以及感染各種動物的線蟲均有效。這樣的線蟲包括腸胃寄生蟲如鉤蟲，線蟲，蛔蟲，類圓線蟲，旋毛蟲，毛細線蟲，鞭蟲，蟯蟲，惡絲蟲病及在血管、其它組織或器官中發(fā)現(xiàn)的寄生蟲如絲蟲性蠕蟲及類園屬及旋毛蟲的腸道提取物。按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物也可用于治療外寄生物感染，包括例如由螺、螨、虱子、跳蚤、綠頭蒼蠅、咬人的昆蟲、或者騷擾馬、牛的移棲雙翅目幼蟲等引起的哺乳類或鳥類等的節(jié)肢感染。按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物也可用作家用殺蟲劑，如殺滅蟑螂、衣蛾、地毯甲蟲、及家蠅等，以及對儲存谷物和農作物有害的昆蟲，包括革螨、蚜蟲、毛蟲、和鱗翅類幼蟲如蝗蟲等。用按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物能夠治療的動物包括綿羊、牛、馬、鹿、山羊、豬、鳥類包括家禽、狗和貓。按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物可以配制成適合于特定用途的劑型，這與被治療的宿主動物的特定種類、所涉及的寄生蟲及昆蟲有關。對于作為一種驅蟲劑使用的話，按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物可以以膠囊、丸劑、片劑、液體獸用頓服劑的形式口服，或者傾注，注射或植入的形式進行給藥。這種制劑可以以傳統(tǒng)的方式按標準的獸醫(yī)學實踐進行制備。這樣，膠囊、丸劑或片劑可以通過將活性成分與適當精制的稀釋劑或載體混合，另外含有崩解劑和/或粘合劑如淀粉、乳糖、滑石、硬脂酸鎂等。獸用頓服劑的配制是將活性成分分散在分散劑或潤濕劑等的水溶液中。注射劑可配制成消毒液，其中可含其它物質如足夠的鹽和/或葡萄糖使該溶液與血液等滲。這些制劑中有關活性成分的用量依照患者、被治療的宿主動物的種類、感染的嚴重性及類型、寄主的體重等的不同而變化。一般來講，對于口服給藥的制劑，活性組分的劑量可以從0.001到10mg/kg患者或動物的體重，在1天到5天內以單一劑量或分劑量服用均可。然而，在有些情況下，內科醫(yī)生或獸醫(yī)可依照臨床癥狀給予較高或較低的劑量。或者，按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物也可以與動物飼料一起給藥，對于這種目的，動物飼料中也可混和有濃縮的食物添加劑或預混劑。對于作為一種殺蟲劑及處理農業(yè)害蟲來說，按照本發(fā)明的方法所產生的除蟲菌素化合物也可以以噴霧，撒粉，乳劑及類似方式按農業(yè)上標準的方法進行使用。6．實施例除蟲鏈霉菌的發(fā)酵及除蟲菌素B2∶B1的分析同時缺少支鏈2-氧酸-脫氫酶及5-O-轉甲基酶活性物質的菌株如果在發(fā)酵介質中不補充脂肪酸的話，其將不產生除蟲菌素。該實施例證明了在這樣的突變株中，在有不同脂肪酸存在下引發(fā)生物合成時，可獲得B2∶B1的比例范圍很寬的除蟲菌素。6．1．材料及方法除蟲鏈霉菌ATCC53692儲存在-70℃的全肉湯種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的組成為淀粉(Nadex,LaingNational)-20g；藥介質(Trader＇sProtein,Memphis,TN)-15g；ArdaminepH(YeastProductsInc.)-5g；碳酸鈣-1g。用自來水調整最終的體積為1升，pH調整至7.2，在121℃下高壓滅菌25分鐘。取2ml上述準備的解凍的懸浮液接種到一個含有50ml同樣培養(yǎng)基的燒瓶中。在28℃在180rpm的旋轉振蕩器上將其培養(yǎng)48小時后，用2ml肉湯接種到一個含有50ml生產培養(yǎng)基的燒瓶中，該培養(yǎng)基含有淀粉-80g碳酸鈣-7g；Pharmamedia-5g；磷酸氫二鉀-1g；硫酸鎂-1g；谷氨酸-0.6g；七水合硫酸亞鐵-0.01g；硫酸鋅-0.001g；硫酸亞鎂-0.001g。用自來水調整最終的體積為1升，pH調整至7.2，在121℃下高壓滅菌25分鐘。不同的羧酸酶底物(參見表1)在甲醇中溶解并添加到發(fā)酵的肉湯基中接種24小時后最終濃度為0.2g/l。發(fā)酵的肉湯培養(yǎng)基在28℃培養(yǎng)14天，然后將其離心(2,500rpm，2分鐘)，去除上清液。用丙酮(15ml)，然后用二氯甲烷(30ml)萃取菌絲沉淀，分離有機相，過濾，然后蒸發(fā)干燥。殘余物用1ml甲醇吸收，并用配有240nm的掃描二極管組檢測器的Hewlett-Packard1090A液相色譜進行HPLC分析，所用柱子是BeckmanUltrasphereC-18,5μm,4.6mm×25cm的柱子，保持在40℃。將上述甲醇溶液25μm注入柱子中。在0.85/毫升分鐘下，用甲醇-水線性梯度從80∶20到95∶5進行洗脫超過40分鐘。環(huán)己基B1的兩種標準濃度用于校準檢測器的反應，測量對應于除蟲菌素B2及B1的曲線的面積。6．2．結果所觀察到的除蟲菌素B2和B1的HPLC保留時間，及2∶1比例如表1所示。表1表1所列數(shù)據(jù)證明了產生的除蟲菌素的B2∶B1的比例有一個很寬的范圍，表明了2類化合物與1類化合物脫水轉化的結果有很大的差異，這取決于所提供的脂肪酸側鏈啟動單元的性質。這表明B2∶B1比例的改變(由aveC蛋白的改變所產生)對于特定的底物具有特異性。因此，用特定的底物獲得的展示B2∶B1比例變化的突變子的篩選也需要在該底物的存在下進行。下面這些例子描述了使用環(huán)己烷羧酸作為篩選底物。然而，該底物僅用于舉例說明本發(fā)明潛在的實用性，而不是有意要限制本發(fā)明。7．實施例aveC基因的分離本實施例描述了編碼AveC基因產品的除蟲鏈霉菌染色體一個區(qū)域的分離及鑒定，正如下所描述的，aveC基因被鑒定為能夠改變所產生的除蟲菌素環(huán)己基B2與B1的比例(B2∶B1)。7．1．材料與方法7．1．1．用于DNA分離的鏈霉菌的生長下面的方法用于培養(yǎng)鏈霉菌。除蟲鏈霉菌ATCC31272株單菌落(單菌落分離物#2)在1/2濃度的YPD-6中分離，YPD-6包含有DifcoYeastExtract-5g；DifcoBacto-胨-5g；葡萄糖-2.5g；MOPS-5g；DifcoBacto瓊脂-15g.，最終的體積用dH2O調整至1升，pH調整至7.0，培養(yǎng)基在121℃下高壓滅菌25分鐘。上述培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體用于接種到10mlTSB培養(yǎng)基(DifcoTrypticSoyBroth-30g，在1升dH2O中，在121℃下高壓滅菌25分鐘)，在一個25mm×150mm試管中以300rpm振蕩，在28℃下培養(yǎng)48-72小時。7．1．2．從鏈霉菌中分離染色體DNA將上述生長的等分菌絲體(0.25ml或0.5ml)放置于一個1.5ml的微量離心試管并將該細胞在12,000×g離心60秒而濃縮。去除上清液，使細胞懸浮于0.25mlTSE緩中液中(20ml1.5M蔗糖，2.5ml1MTris-HCl,pH8.0,2.5ml1MEDTA,pH8.0，和75mldH2O)，其含有2mg/ml溶菌酶。樣品在37℃下振蕩培養(yǎng)20分鐘，運載至一個AutoGen540TM自動的核酸分離裝置(IntegratedSeparationSystems,Natick,MA)，基因組DNA用Cycle159(儀器軟件)按照操作手冊進行分離?；蛘?，將5ml的菌絲體置于一個17mm×100mm的試管中，通過在3,000rpm下離心5分鐘進行細胞濃縮，去除上清液。細胞重新懸浮在1mlTSE緩沖液中，通過在3,000rpm下離心5分鐘進行細胞濃縮，去除上清液。細胞重新懸浮在1ml含有2mg/ml溶菌酶的TSE緩沖液中，并在37℃振蕩孵育30-60分鐘。經過培養(yǎng)后，加入0.5ml10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，將細胞在37℃下孵育，直到裂解完成。裂解產物在60℃下孵育10分鐘，冷卻至室溫，分到兩個1.5mlEppendorf試管中，并用0.5ml苯酚/氯仿(50％苯酚，預先用0.5MTris平衡，pH8.0；50％氯仿)萃取1次。去除水相，用氯仿∶異戊醇(24∶1)萃取2到5次。通過加入1/10體積3M醋酸鈉，pH4.8沉降DNA，在冰中孵育混合物10分鐘，在15,000rpm,5℃將混合物離心10分鐘，將上清液移至一干凈的試管，并在其中加入1體積的異丙醇。然后將上清液與異丙醇一起在冰中孵育20分鐘，在15,000rpm,5℃將混合物離心20分鐘，將上清液移除，用70％乙醇洗滌DNA粒狀沉淀物1次。在粒狀沉淀物干燥后，將DNA再懸浮于TE緩沖液中(10mMTris,1mMEDTA,pH8.0)。7．1．3．從鏈霉菌中分離質粒DNA將一部分菌絲體(1.0ml)放置于一個1.5ml的微量離心試管，其在12,000xg下離心60秒濃縮細胞。去除上清液，細胞再懸浮于1.0ml10.3％蔗糖中，在12,000xg下離心濃縮60秒，去除上清液。然后將細胞重懸浮于0.25mlTSE緩沖液中，其含有2mg/ml溶菌酶，在37℃下振蕩孵育20分鐘，然后載至AutoGen540TM自動的核酸分離裝置中。按照操作手冊，使用Cycle106(儀器軟件)分離質粒DNA?；蛘?，將1.5ml的菌絲體放置于1.5ml微型離心試管中，在12,000xg下離心60秒濃縮細胞。去除上清液，細胞再懸浮于1.0ml10.3％蔗糖，在12,000xg下離心濃縮60秒，去除上清液。細胞重懸浮于0.5mlTSE緩中液中，其含有2mg/ml溶菌酶，在37℃孵育15-30分鐘。孵育后，加入0.25ml堿性SDS(0.3NNaOH,2％SDS)，在55℃下孵育15-30分鐘或直到溶液變清。將醋酸鈉(0.1ml,3M,pH4.8)加入到DNA溶液中，將其在冰中孵育10分鐘。DNA樣品在5℃下在14,000rpm離心10分鐘。將上清液移至一干凈的試管，并在其中加入0.2ml的苯酚/氯仿(50％苯酚∶50％氯仿)并輕輕混和。DNA溶液在5℃下以14,000rpm離心10分鐘，上清液移至一干凈的Eppendorf試管。加入異丙醇0.75ml，將溶液輕輕混和，然后在室溫下孵育20分鐘。將該DNA溶液在5℃下以14,000rpm離心15分鐘，移除上清液，用70％乙醇洗滌DNA沉淀顆粒，干燥，再在TE緩沖液中重懸浮。7．1．4．從大腸桿菌中分離質粒DNA將單一的轉化的大腸桿菌菌落在5mlLuria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中(Bacto-胨-10g,Bacto-yeastextract-5g，和NaCl-10g在1升dH2O中，pH7.0,在121℃下高壓滅菌25分鐘，并用100μg/ml氨卡青霉素補充)孵育。將培養(yǎng)物過夜培養(yǎng)，將1μm等分試樣置于1.5ml微型離心試管中，將培養(yǎng)樣品載至AutoGen540TM自動核酸分離器中，按照操作手冊，使用Cycle3(儀器軟件)分離質粒DNA。7．1．5．除蟲鏈霉菌原生質體的制備及轉化將除蟲鏈霉菌的單一菌落在1/2濃度的YPD-6中分離。菌絲體用于接種到25mm×150mm試管中的10mlTSB培養(yǎng)基中，并且在28℃下以300rpm振蕩培養(yǎng)48小時。用1ml菌絲體接種50mlYEME培養(yǎng)基。每升YEME培養(yǎng)基含有DifcoYeastExtract-3g；DifcoBacto-棟-5g；DifcoMaltExtract-3g；蔗糖-300g。經過在121℃下高壓滅菌25分鐘后，加入下列物質2.5MMgCl2·6H2O(分別在121℃下高壓滅菌25分鐘)-2ml；及甘氨酸(20％)(過濾滅菌)-25ml。將菌絲體在30℃下培育48-72小時，然后在50ml離心管(Falcon)中在3,000rpm下離心20分鐘收獲。去除上清液，菌絲體在P緩沖液中重懸浮，P緩沖液含有蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl26H2O-2.02g；H2O-600ml；K2PO4(0.5％)-10ml；痕量元素溶液-20ml；CaCl22H2O(3.68％)-100ml；及MES緩中液(1.0M,pH6.5)-10ml(*痕量元素溶液每升含有ZnCl2-40mg；FeCl3·6H2O-200mg；CuCl2·2H2O-10mg；MnCl2·4H2O-10mg；Na2B4O7·10H2O-10mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O-10mg)。pH調至6.5，最終體積調至1升，用0.45微米的篩子熱過濾培養(yǎng)基。菌絲體以3,000rpm離心20分鐘得到粒狀沉淀，去除上清液，將菌絲體在含有2mg/ml溶菌酶的20mlP緩沖液中重懸浮。菌絲體在35℃下振蕩孵育15分鐘，在顯微鏡下觀察以確定形成原生質體的范圍。當原生質體形成結束時，將其在8,000rpm下離心10分鐘。去除上清液，將原生質體在10mlP緩沖液中重懸浮。將原生質體在8,000rpm離心10分鐘，去除上清液，將其在2mlP緩沖液中重懸浮，大約有1×109個原生質體分布在2.0ml低溫小瓶(Nalgene)中。裝有1×109個原生質體的小瓶在8,000rpm下離心10分鐘，去除上清液，原生質體在0.1mlP緩沖液中重懸浮。將2～5μg轉化的DNA加入到原生質體中，接著加入0.5ml工作T緩沖液。T緩沖基含有PEG-1000(Sigma)-25g；蔗糖-2.5g；H2O-83ml.。用1N的NaOH將pH調節(jié)至8.8(過濾消毒后)，T緩沖基是過濾殺菌并在40℃下保存。工作T緩沖液(當天制作使用)是T緩沖基-8.3ml；K2PO4(4mM)-1.0ml；CaCl2.2H2O(5M)-0.2ml；及TES(1M,pH8)-0.5ml.。該工作T緩沖液的每一組分都是分別過濾殺菌的。在20秒鐘內將T緩沖液加入到原生質體，同時加入1.0mlP緩沖液，然后將原生質體在8,000rpm離心10分鐘。去除上清液后將原生質體在0.1mlP緩沖液中重懸浮。然后將原生質體在RM14培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl2.6H2O-10.12g；葡萄糖-10g；DifcoCasaminoAcids-0.1g；DifcoYeastExtract-5g；DifcoOatmeal瓊脂-3g；DifcoBacto瓊脂-22g；dH2O-800ml。溶液在121℃下高壓滅菌25分鐘。經過滅菌，加入下列消過毒的組分K2PO4(0.5％)-10ml；CaCl2·2H2O(5M)-5ml；L-脯氨酸(20％)-15ml；MES緩沖液(1.0M,pH6.5)-10ml；痕量元素(同上)-2ml；環(huán)己酰亞胺原液(25mg/ml)-40ml；及1NNaOH-2ml。將25mlRM14培養(yǎng)基等分在每個平板上，這些平板在使用前都要干燥24小時。原生質體在濕度95％，溫度30℃下孵育20-24小時。為了選擇硫鏈絲菌肽抗性轉化子，將含有125μg/ml硫鏈絲菌的1ml重復緩沖液均勻地平鋪在RM14再生板上，每100ml重復緩沖液含有蔗糖-10.3g；痕量元素溶液(與上相同)-0.2ml；及MES(1M,pH6.5)-1ml。原生質體在濕度95％，溫度30℃下孵育7-14天直到硫鏈絲菌肽抗性(ThiO’)菌落出現(xiàn)。7．1．6．鏈霉菌紫原生質體的轉化在某些情況下，鏈霉菌紫原生質體(S.lividans)TK64(由JohnInnes研究所，Norwich,U.K提供)被用于轉化。S.lividans生長、原生質化及轉化的方法和組分在Hopwood等人，1985，鏈霉菌的基因操作(GeneticManipulationofStreptomyces,ALaboratoryManual,JohnInnesFoundation,Norwich,U.K.中已有描述，并如其中所述地進行。質粒DNA從S.lividans轉化株中的分離如上述7．1．3中所描述。7．1．7．除蟲鏈霉菌株的發(fā)酵分析除蟲鏈霉菌的菌絲體在1/2濃度的YPD-6上培養(yǎng)4-7天后，接種到1×6英寸的試管中，其中含有8ml預制成的培養(yǎng)基及兩個5mm玻璃珠子，預制成的培養(yǎng)基含有可溶性淀粉(或者低沸點的淀粉或者KOSO,JapanComStarchCo.,Nagoya)-20g/L；Pharmamedia-15g/L；ArdaminepH-5g/L(ChamplainInd.,Clifton,NJ)；CaCO3-2g/L；2xbcfa(＂bcfa＂指的是支鏈脂肪酸)在培養(yǎng)基中含有一最終濃度為50ppm2-(+/-)-甲基丁酸，60ppm異丁酸，及20ppm異戊酸。將pH調至7.2，培養(yǎng)基在121℃下高壓滅菌25分鐘。試管以17°角在29℃下以215rpm振蕩培養(yǎng)3天。將用2-ml種子培養(yǎng)的等分試樣接種到一個300mlErlenmeyer燒瓶中，其中含有25ml生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有淀粉(或者低沸點的淀粉或者KOSO)-160g/L；Nutrisoy(ArcherDanielsMidland,Decatur,IL)10g/L；ArdaminepH-10g/L；K2HPO4-2g/L；MgSO4·4H2O-2g/L；FeSO4·7H2O-0.02g/L；MnCl2-0.002g/L；ZnSO4·7H2O-0.002g/L；CaCO3-14g/L2xbcfa(同上)；及環(huán)己烷羧酸(CHC)(在pH7.0下制成20％的溶液)-800ppm。pH調至6.9，培養(yǎng)基在121℃下高壓滅菌25分鐘。接種后，將燒瓶在29℃下以200rpm振蕩培養(yǎng)12天。經過培養(yǎng)，從燒瓶中抽取2ml的樣品，用8ml甲醇稀釋，混合，混合物在1,250xg下離心10分鐘沉淀碎片。用BeckmanUltrasphereODS柱子(25cm×4.6mmID)通過HPLC分析上清液，流速為0.75毫升/分鐘，并通過在240nm下的吸光度檢測。流動相為86/8.9/5.1甲醇/水/乙腈。7．1．8．除蟲鏈霉菌PKS基因的分離除蟲鏈霉菌(ATCC31272,SC-2)染色體DNA的粘粒文庫用由紅色多孢菌聚酮合成酶(PKS)基因片段制成的酮合成酶(KS)探針進行制備及雜交。有關粘粒文庫制備的詳細描述在下列文獻可以找到；Sambrook等人，1989，同上。有關鏈霉菌染色體DNA文庫制備的詳細描述在下列文獻可以找到；Hopwood等人，1985，同上。含有酮合成酶-雜交區(qū)域的粘粒菌落可以通過與一個2.7Kb的來自pEX26(由Dr.P.Leadlay,Cambridge,UK提供)的Ndel/Eco47Ⅲ片段雜交識別。使用Ndel及Eco47Ⅲ，大約有5ngpEX26被消化。反應混合物被載于0.8％SeaPlaqueGTG瓊脂糖凝膠(FMCBioProducts,Rockland,ME上。經過電泳后從凝膠中切除2.7KbNdel/Eco47Ⅲ片段，并使用FastProtocol的GELaseTM(EpicentreTechnologies)從凝膠中回收DNA。2.7Kb的Ndel/Eco47Ⅲ片段用[α-32P]dCTP(脫氧胞苷5＇-三磷酸鹽，四(三乙胺)鹽，[alpha-32P]-)(NEN-Dupont,Boston,MA)按照提供者的指導使用BRLNick翻譯系統(tǒng)(BRL生命技術公司，Gaithersburg,MD)進行標記。在0.05ml體積中進行典型的反應。加入5μl終止緩沖液后，按照廠商指導，將標記的DNA分子用G-25SephadexQuickSpinTMColumn(BoehringerMannheim)從尚未整合的核酸分子中分離。大約1,800粘粒菌落通過菌落雜交進行篩選。鑒定出10個與紅色多孢菌KS探針強力雜交的菌落。包含有粘粒DNA的大腸桿菌菌落在LB液體培養(yǎng)基中生長，按照操作說明用Cycle3(儀器軟件)在AutoGen540TM自動核酸分離器中從每一培養(yǎng)物中分離粘粒DNA。限制性核酸內切酶圖譜及DNA印跡雜交分析揭示了五種菌落中含有重疊的染色體區(qū)域。五種粘粒(也即pSE65,pSE66,pSE67,pSE68,pSE69)的除蟲鏈霉菌基因組BamH1酶切圖譜通過分析重疊的粘粒及雜交法進行構建(圖4)。7．1．9．調控除蟲菌素B2∶B1比例的DNA鑒定及aveCORF的鑒定下面的方法用于測試來自于pSE66粘?？寺〉膩喛寺∑握{控AveC突變株中除蟲菌素B2∶B1比例的能力。用Sac1及BamH1消化pSE66(5μg)。反應混合物載于0.8％SeaplaqueTMGTG瓊脂糖凝膠(FMCBioProducts),2.9KbSac1/BamH1片段切自電泳后的凝膠，并使用FastProtocol的GELaseTM(EpicentreTechnologies)從凝膠中回收DNA。大約有5μg的穿梭載體pWHM3(Vara等人，1989,J.Bacteriol.1715872-5881)被Sac1及BamHⅠ所消化。有0.5μg的2.9Kb插入子及0.5μg消化的pWHM3被一起混合，并按照廠商說明用1單位的連接酶(NewEnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MA)在15℃、總體積為20μl條件下孵育過夜。經過孵育，5μl的連接混合物在70℃下孵育10分鐘，冷卻至室溫，按照操作手冊用于轉化感受態(tài)的E.coliDH5α細胞(BRL)。質粒DNA從氨卡青霉素抗性轉化子中分離，通過限制性酶切分析可以證實2.9KbSac1/BamHⅠ插入子的存在。該質粒被命名為pSE119。如上7．1．5部分所描述的，除蟲鏈霉菌菌株1100-SC38(Pfizer內部菌株)的原生質體用pSE119進行制備和轉化。株1100-SC38是一個突變子，當用環(huán)己烷羧酸進行補充時，與除蟲菌素環(huán)己基-B1形式比較，其產生明顯多的除蟲菌素環(huán)己基-B2形式(B2∶B1的比例大約是30∶1)。用于轉化除蟲鏈霉菌原生質體的pSE119從E.coli株GM2163(得自Dr.B.J.Bachmann,Curator,E.coliGeneticStockCenter,YaleUniversity)、E.coli株DM1(BRL)、或者S.lividans株TK64中分離。分離菌株1100-SC38的硫鏈絲菌肽抗性轉化子并通過HPLC分析發(fā)酵產品來進行分析。含有pSE119的除蟲鏈霉菌株1100-SC38的轉化子產生比例改變的除蟲菌素環(huán)己基B2∶環(huán)己基-B1，該比例大約是3.7∶1(表2)。確定了pSE119能夠調控AveC突變子中的除蟲菌素B2∶B1的比例后，測出插入的DNA序列。按照操作手冊，使用質粒DNA分離試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)，大約有10μg的pSE119被分離，然后用ABI373A自動DNA測序儀(PerkinElmer,FosterCity,CA)進行測序。用遺傳學計算機組程序(GCG,Madison,WI)組合和編輯測序數(shù)據(jù)。DNA序列及aveCORF在圖1(SEQIDNO1)中已經列出。如下構建一種新的質粒，命名為pSE118。用SphⅠ及BamHⅠ消化大約5μg的pSE66。將反應混合物載在0.8％SeaPlaqueGTG瓊脂糖凝膠(FMCBioProducts)上，2.8Kb的SphⅠ/BamHⅠ片段經過電泳從凝膠中切除，使用FastProtocol的GELaseTM(EpicentreTechnologies)從凝膠中回收DNA。大約有5μg的穿梭載體pWHM3被SphⅠ及BamHⅠ所消化。有0.5μg的2.8Kb插入子及0.5μg消化的pWHM3被一起混合，并在15℃、總體積為20μl條件下按照廠商說明用1單位的連接酶(NewEnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MA)與其一起孵育過夜。經過孵育，5μl的連接混合物在70℃下孵育10分鐘，冷卻至室溫，按照操作手冊用于轉化受感態(tài)的E.coliDH5α細胞。質粒DNA從氨卡青霉素抗性轉化子中分離，通過限制性酶切分析可以證實2.8KbSphⅠ/BamHⅠ插入子的存在。該質粒被命名為pSE118。在pSE118及pSE119中的插入子DNA中大約有838個核苷酸重疊(表4)。除蟲鏈霉菌株1100-SC38的原生質體用pSE118進行如上轉化。分離菌株1100-SC38的硫鏈絲菌肽抗性轉化子并通過HPLC分析發(fā)酵產品來進行分析。含有pSE118的除蟲鏈霉菌株1100-SC38的轉化株相對于株1100-SC38在除蟲菌素環(huán)己基B2∶環(huán)己基-B1的比例上并未改變(表2)。7．1．10．來自除蟲鏈霉菌染色體DNA的aveC基因的PCR擴增一個含有aveCORF的～1.2Kb片段通過PCR擴增法從除蟲鏈霉菌染色體DNA中分離，其使用的引物按照從上所獲的aveC核苷酸序列進行設計。PCR引物由GenosysBiotechnologies,Inc.(Texas)提供。向右引物是5＇-TCACGAAACCGGACACAC-3(SEQIDNO6)；向左引物是5＇-CATGATCGCTGAACCGAG-3＇(SEQIDNO7)。在由生產商所提供的緩沖液中用DeepVentTM聚合酶(NewEngland-Biolabs)進行PCR反應，并存在300μMdNTP，10％甘油，200pmol每種引物，0.1μg模板及2.5單位酶，最終體積為100μl，使用Perkin-ElmerCetus熱交換器。第一個循環(huán)的熱分布圖為95℃5分鐘(變性步驟)，60℃2分鐘(退火步驟)，72℃下2分鐘(延伸步驟)。隨后的24循環(huán)有一個相似的熱譜圖，但變性步驟的時間縮短至45秒種以及退火時間縮短至1分鐘。PCR產品在1％瓊脂糖凝膠中電泳后，檢測到一個～1.2Kb的單DNA帶。從凝膠中純化該DNA，并按照操作手冊用25ng線性的鈍的PCR-鈍性載體(InVitrogen)在一個比例為1∶10摩爾的載體插入子進行連接。按照操作手冊將連接混合物用于轉化ShotTM感受態(tài)的E.coil細胞(Invitrogen)。質粒DNA從氨芐青霉素抗性轉化子中分離，該～1.2Kb插入子的存在可以通過限制性酶切分析證實。該質粒被命名為pSE179。來自pSE179的插入子DNA通過用BamHⅠ/XbaⅠ進行消化分離，用電泳法進行分離，從凝膠中純化，并用穿梭載體pWHM3進行連接(也已被BamHⅠ/XbaⅠ消化)，其在一個以比例為1∶5摩爾的載體與插入子存在的1μg總DNA濃度中進行。按照操作手冊連接混合物用于轉化感受態(tài)的E.coilDH5α細胞。質粒DNA從氨芐青霉素抗性轉化體中分離，該～1.2Kb插入子的存在可以通過限制性酶切分析證實。該質粒(被命名為pSE186(圖2，ATCC209604))被轉化至E.coilDM1中，并且質粒DNA從氨芐青霉素抗性轉化子中分離。7．2．結果鑒定出來自pSE119的2.9KbSacⅠ/BamHⅠ酶切片段，當其轉化至除蟲鏈霉菌株1100-SC38中時，顯著地改變了B2∶B1除蟲菌素的產量比。一般情況下，除蟲鏈霉菌株1100-SC38B2∶B1的比例約為30∶1，但當用含有2.9KbSacⅠ/BamHⅠ酶切片段的載體轉化時，除蟲菌素B2∶B1的比例減少至大約3.7∶1。對轉化體培養(yǎng)物進行后發(fā)酵分析證實了轉化DNA的存在。對2.9KbpSE119片段進行測序，并鑒定了約0.9Kb的ORF(圖1)(SEQIDNO1)，其包含一個PstⅠ/SphⅠ片段，以前在其它地方發(fā)生突變時其僅產生B2產物(Ikeda等人，1995，同上)。該ORF或者其相應誘導的多肽，與已知數(shù)據(jù)庫(GenEMBL，SWISS-PROT)相比，并不表明其與已知DNA或者蛋白序列有任何的同源性。表2表示用不同質粒進行轉化的除蟲鏈霉菌株1100-SC38的發(fā)酵分析表28．實施例除蟲鏈霉菌Avec突變株的構建本實施例描述了利用上述組分及方法構建幾種不同的除蟲鏈霉菌AveC突變株。將突變株引入至鏈霉菌基因中的技術可以參見Kieser及Hopwood,1991,Meth.Enzym.204430-458的一般描述。一個更加詳細的說明可以參見Anzai等人，1988,J.AntibiotXLI(2)226-233及Stutzman-Engwall等人,1992,J.Bacteriol.174(1)144-154。這些參考資料在此都被全文引用。8．1．除蟲鏈霉菌AveC基因的失活含有失活的AveC基因的AveC突變株可以通過如下所述的幾種方法進行構建。在第一種方法中，一個在pSE119(如上第7.1.9所描述的質粒)aveC基因內部的640bp的SphⅠ/PstⅠ片段被來自于Sacc.erythraea的ermE基因所取代(對于紅霉素抗性來說)。用Bg/Ⅱ及EcoRⅠ通過限制性酶切消化，從pIJ4026(來自JohnInnesInstitute,Norwich,U.K.；還參見Bibb等人，1985,Gene41357-368)中分離ermE基因，然后進行電泳，并從凝膠中純化。該約1.7Kb片段連接到pGEM7Zf(Promega)，其用BamHⅠ及EcoRⅠ進行消化，并依照操作手冊，將連接混合物轉化到感受態(tài)的E.coliDH5α細胞中。將質粒DNA從氨芐青霉素抗性轉化子中分離，該約1.7Kb插入子的存在可以通過限制性酶切分析證實。該質粒被命名為pSE27。pSE118(如上第7.1.9部分描述)用SphⅠ及BamHⅠ進行消化，將消化物進行電泳，并將該約2.8KbSphⅠ/BamHⅠ插入子從凝膠中純化。pSE119用PstⅠ及EcoRⅠ進行消化，然后進行電泳，并將該約1.5KbPstⅠ/EcoRⅠ插入子從凝膠中純化。將穿梭載體pWHM3用BamHⅠ及EcoRⅠ進行消化。pSE27用PstⅠ及SphⅠ進行消化。然后進行電泳，并將該約1.7Kb的PstⅠ/SphⅠ插入子從凝膠中純化。所有這四個片段(即約2.8Kb，約1.5Kb，約7.2Kb，約1.7Kb)以四種形式連接在一起。依照操作手冊，將連接混合物轉化到感受態(tài)的E.coliDH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化子中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析證實校正插入子的存在。該質粒被命名為pSE180(圖3；ATCC209605)。pSE180被轉化入S.lividansTK64細胞，通過抗硫鏈絲菌肽及紅霉素抗生素鑒定已轉化的菌落。從S.Lividans中分離pSE180，并且用于轉化除蟲鏈霉菌的原生質體。鑒定四種硫鏈絲菌肽抗性除蟲鏈霉菌轉化體，并制備原生質體并將其在非選擇性條件的RM14培養(yǎng)基中進行鋪板。原生質體再生后，篩選有紅霉素抗性及無硫鏈絲菌肽抗性的單菌落，表明了失活aveC基因的染色體整合及自由復制子的缺失。鑒定ErmrThios轉化體，并將其命名為SE180-11菌株。將整個染色體DNA從SE180-11株中進行分離，并用限制性酶BamHⅠ,HindⅢ,PstⅠ或者SphⅠ進行消化，并在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，然后轉移至尼龍膜上，并與ermE探針進行雜交。這些分析顯示，ermE抗性基因的染色體整合及伴隨的640bpPstⅠ/SphⅠ片段的缺失是由一個雙重交換的過程發(fā)生的。SE180-11株發(fā)酵產品的HPLC分析顯示一般的除蟲菌素不再產生(圖5A)。在使aveC基因失活的第二種方法中1.7KbermE基因從除蟲鏈霉菌SE180-11株的染色體上除去，在aveC基因中留下一個640bpPstⅠ/SpHⅠ缺失。如下構建基因取代質粒用XbaⅠ部分消化pSE180，將約11.4Kb片段從凝膠中純化。該約11.4Kb帶缺少1.7KbermE抗性基因。然后該DNA連接并轉化進E.coliDH5α細胞。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，校正插入子的存在可以通過限制性酶切分析證實。該質粒(被命名為pSE184)被轉化進E.coliDM1中，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA。該質粒用于轉化除蟲鏈霉菌SE180-11株的原生質體。從SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體中制備原生質體，并在RM14上作為單菌落進行鋪板。原生質體再生后，篩選出無紅霉素抗性及硫鏈絲菌肽抗性的單菌落，表明了失活aveC基因的染色體整合及含有ermE基因的自由復制子的缺失。鑒定出ErmrThios并命名為SE184-1-13。對SE184-1-13的發(fā)酵分析顯示一般的除蟲菌素不再產生，SE184-1-13具有與SE180-11相同的發(fā)酵特征。在第三種使aveC基因失活的方法中，使用PCR方法在核苷酸位置471的C后加入兩個G將一個移碼引進染色體aveC基因上，因此產生一個BspE1位點。加工的EspE1位置的存在對于檢測基因替代過程是有用的。設計PCR引物以在aveC基因中引進移碼突變，該引物由GenosysBiotechnologies公司所提供。向右引物為5＇-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3＇(SEQIDNO8)向左引物為5＇-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3＇(SEQIDNO9)。進行PCR的條件如上第7.1.10部分所描述。用Sph1消化666bp的PCR產品，分別給出兩個278bp及388bp的片段。從凝膠中純化388bp片段?；蛱娲馁|粒如下構建用EcoRⅠ及BamHⅠ消化穿梭載體pWHM3。用BamHⅠ及SphⅠ消化pSE119，然后進行電泳，從凝膠中分離約840bp的片段。用EcoRⅠ及XmmⅠ消化pSE119，然后進行電泳分離，并從凝膠中純化約1.7Kb的片段。四種片段(也即～7.2Kb，～840bp,～1.7Kb及388bp)以四種不同方式連接在一起。連接混合物被轉化進感受態(tài)的E.coliDH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析及DNA序列分析證實校正插入子的存在。該質粒(命名為pSE185)轉化進入E.coliDM1細胞，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA。該質粒用于轉化除蟲鏈霉菌株1100-SC38的原生質體。分離菌株1100-SC38的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，并通過HPLC分析發(fā)酵產品來分析。當pSE185轉化入除蟲鏈霉菌株1100-SC38中時，并未明顯改變除蟲菌素B2∶B1的比例(表2)。pSE185用于轉化除蟲鏈霉菌原生質體以在染色體aveC基因中產生一個移碼突變。從硫鏈絲菌肽抗性轉化株制備原生質體，并在RM14培養(yǎng)基上作為單菌落鋪板。原生質體再生后，篩選無硫鏈絲菌肽抗性的單菌落。通過PCR分離和篩選來自硫鏈絲菌肽敏感的菌落的染色體DNA的整合至染色體中的移碼突變的存在。該PCR引物是以aveC核苷酸序列為基礎設計的，由GenosysBiotechnologies(Texas)公司提供。向右的PCR引物為5＇-GCAAGGATACGGGGACTAC-3＇(SEQIDNO10)，向左的PCR引物為5＇-GAACCGACCGCCTGATAC-3＇(SEQIDNO11)，進行PCR的條件如上第7.1.10部分所述。所獲得的PCR產品為543bp，當用BspE1進行消化時，可以檢測到三個片段368bp,96bp，及79bp，表明了失活aveC基因的染色體整合及自由復制子的缺失。在aveC基因上含有移碼突變的除蟲鏈霉菌突變株發(fā)酵分析表明一般的除蟲菌素不再產生，這些突變株具有與株SE180-11及SE184-1-13相同的HPLC發(fā)酵特征。Thios轉化株被鑒定并命名為SE185-5a.此外，aveC基因上產生突變，使核苷酸位置520由G變?yōu)锳，其結果是在位置116上編碼色氨酸(W)的密碼子改變?yōu)橐粋€終止密碼子。有這種突變的除蟲鏈霉菌株不產生一般的除蟲菌素并具有與株SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a相同的發(fā)酵特征。此外，在aveC基因產生的突變改變了兩個位置(ⅰ)核苷酸位置970由G變?yōu)锳，使氨基酸位置256從甘氨酸(G)變?yōu)樘於彼?D)，及(ⅱ)核苷酸位置996由T變?yōu)镃，使氨基酸位置275從酪氨酸(Y)變?yōu)榻M氨酸(H)。具有這些突變(G256D/Y275H)的除蟲鏈霉菌株并不產生一般的除蟲菌素并具有與株SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a相同的發(fā)酵特征。除蟲鏈霉菌aveC失活突變株SE180-11、SE184-1-13、SE185-5a，及此處所提的其它株，提供了篩選工具用于評估aveC基因其它突變的影響。含有aveC基因的野生型拷貝的pSE186轉化入E.coilDM1細胞中，使質粒DNA從氨芐青霉素抗性轉化株中分離。該pSE186DNA用于轉化除蟲鏈霉菌的SE180-11株。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，測定紅霉素抗性的存在，通過HPLC分析發(fā)酵產品來分析ThiorErmr轉化體。反位的功能性aveC基因的存在就能將正常的除蟲菌素產量恢復到SE180-11株(圖5B)。8．2改變B2∶B1比例的AveC基因的突變分析如上所述，含有失活的aveC基因的除蟲鏈霉菌菌株SE180-11通過用一含有功能性aveC基因的質粒(pSE186)轉化而補充。SE180-11株也可用作宿主菌株來鑒定aveC基因的其它突變，如下所述。從菌株1100-SC38中分離染色體DNA，并用作aveC基因進行PCR擴增的模板。通過PCR擴增分離1.2KbORF，擴增所使用的引物是以aveC核苷酸序列為基礎而設計的。向右的引物為SEQIDNO6，向左的引物為SEQIDNO7(參見上述第7.1.10部分所述)。PCR及亞克隆條件如第7.1.10部分所述。1.2KbORF的DNA序列分析顯示了在核苷酸位置337由C變?yōu)門的aveC基因突變，在位置55處的氨基酸由絲氨酸(S)變?yōu)楸交彼?F)。含有S55F突變的aveC基因亞克隆入pWHM3以產生一個質粒，其被命名為pSE187，并用于轉化除蟲鏈霉菌菌株SE180-11的原生質體。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，以確定紅霉素抗性的存在，通過HPLC分析發(fā)酵產品來分析ThiorErmr轉化體。編碼氨基酸殘基55(S55F)上發(fā)生改變的aveC基因的存在，能夠將正常的除蟲菌素產量恢復到SE180-11株(圖5C)；然而，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B2的比例大約是26∶1，與用pSE186進行轉化的SE180-11株相比，其B2∶B1的比例大約是1.6∶1(表3)，顯示了單一的突變(S55F)調控了相對于環(huán)己基B1的環(huán)己基B2的產量。鑒定出在aveC基因中的另一個突變，使核苷酸位置862由G變?yōu)锳，位置230處的氨基酸由甘氨酸(G)變?yōu)樘於彼?D)。含有該突變(G230D)的除蟲鏈霉菌株產生的除蟲菌素B2∶B1的比例大約是30∶1。8．3．減少B2∶B1比例的突變可以如下構建減少環(huán)己基-B2對環(huán)己基-B1比例的幾種突變。鑒定出aveC基因的突變，使核苷酸位置588由G變?yōu)锳，位置139處的氨基酸由丙氨酸(A)變?yōu)樘K氨酸(T)。含有A139T突變的aveC基因被亞克隆入pWHM3中以產生一個質粒，其命名為pSE188，其被用于轉化除蟲鏈霉菌SE180-11株的原生質體。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，測定紅霉素抗性株的存在，通過HPLC分析發(fā)酵產品來分析ThiorErmr轉化體。編碼氨基酸殘基139(A139T)變化的突變的aveC基因的存在能夠將除蟲菌素產量恢復至SE180-11株(表5D)；然而，B2∶B1的比例約是0.94∶1，這表明該突變減少了環(huán)己基B2相對于環(huán)己基B1的產量。該結果并不是預期的，因為公布的結果以及上述突變的結果僅僅證明了aveC基因的失活或者增加除蟲菌素B2形式相對于B1形式的產量(見表3)。因為A139T突變以更加適宜的B1方向改變了B2∶B1的比例，因此構建編碼氨基酸位置138的蘇氨酸而非絲氨酸的突變。這樣，用EcoRⅠ消化pSE186并克隆入已經被EcoRⅠ消化的pGEM3Zf(Promega)中。該被命名為psE186a的質粒用ApaⅠ及KpnⅠ進行消化，在瓊脂糖凝膠中分離DNA片段，從凝膠中純化兩個片段～3.8Kb及～0.4Kb。來自pSE186的～1.2Kb插入的DNA片段被用作一個PCR模板以誘發(fā)在核苷酸位置585上發(fā)生單一堿基的改變。將PCR引物設計成在核苷酸位置585能引進一個突變，該引物是由GenosysBiotechnologies公司(Texas)提供。向右的PCR引物為5＇-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3＇(SEQIDNO12)；向左的PCR引物為5＇-GGAACCGACCGCCTGATACA-3＇(SEQIDNO13)。使用先進的GC基因組PCR試劑盒(ClonetechLaboratories，PaloAlto，CA)在由廠商提供的緩沖液中在存在200μMdNTPs,200pmol每種引物，50ng模板DNA,1.0MGC-Melt及1單位的KlenTaq多聚酶混合物下，最終體積為50μl，進行PCR反應。第一循環(huán)的熱學曲線為94℃1分鐘，接下來25個循環(huán)都是以94℃30秒鐘及68℃2分鐘進行，及一個循環(huán)68℃3分鐘。將295bp的PCR產品用ApaⅠ及KpnⅠ進行消化以釋放一個254bp的片段，其通過電泳進行分辨并從凝膠中純化。所有三種片段(～3.8Kb,～0.4Kb及254bp)用三種方式連接在一起。將連接混合物轉化入完整的E.coilDH5α細胞中。質粒DNA從氨芐青霉素抗性轉化株中分離，校正插入子的存在可以通過限制性酶切分析確認。該質粒被命名為pSE198。pSE198用EcoRⅠ進行消化，克隆進入已經用EcoRⅠ消化的pWHM3中，并將其轉化進入E.coilDH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化株中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析及DNA序列分析確認校正插入子的存在。該質粒DNA轉化進入E.coilDM1，從氨芐青霉素抗性轉化株中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析確認校正插入子的存在。該質粒，被命名為pSE199，可以用于轉化除蟲鏈霉菌株SE180-11原生質體。分離菌株SE180-11的硫鏈絲菌肽抗性轉化株，確定紅霉素抗性的存在，通過用HPLC法分析發(fā)酵產品而分析ThiorErmr轉化株。編碼在氨基酸殘基138(S138T)位發(fā)生改變的突變aveC基因的存在能夠將正常的除蟲菌素產量恢復至株SE180-11；然而，B2∶B1的比例為0.88∶1，表明了該突變減少了環(huán)己基-B2相對于環(huán)己基-B1的數(shù)量(見表-3)。該B2∶B1的比例甚至低于0.94∶1(這是用pSE188轉化菌株SE180-11而產生的A139T突變所觀察到的比例，如上所述)。構建另一個突變以同時在氨基酸位置138及139處引進一個蘇氨酸。來自于pSE186的約1.2Kb插入的DNA被用做PCR的模板。將PCR引物設計成能在核苷酸位置585及588處誘發(fā)突變，該引物由GenosysBiotechnologies公司(Texas)提供。向右的PCR引物為5’-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3＇(SEQIDNO14)；向左的PCR引物為5′-GGAACATCACGGCATTCACC-3＇(SEQIDNO15)。使用本部分上述的條件進行PCR反應。用Apa1及Kpn1消化449bp的PCR產物以釋放254bp的片段，其通過電泳進行分辨并從凝膠中純化。將pSE186a用ApaⅠ及KpnⅠ進行消化，在瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，及將3.8Kb與0.4Kb的兩個片段從凝膠中提純。所有這三個片段(～3.8Kb,～0.4Kb及254bp)以三種方式進行連接，連接混合物被轉化進入活性的E.coliDH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析確認校正插入子的存在。該質粒被命名為pSE230。用EcoRⅠ消化pSE230，克隆進已經被EcoRⅠ消化的pWHM3質粒中，并且轉化進入E.coliDH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析及DNA序列分析確認校正插入子的存在。該質粒DNA被轉化進入E.coliDM1細胞中，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析確認校正插入子的存在。該質粒，其被命名為pSE231，用于轉化除蟲鏈霉菌株SE180-11的原生質體。分離SE180-11的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，確定紅霉素抗性株的存在，然后通過發(fā)酵分析ThiorErmr。編碼S138T/A139T的雙重突變的aveC基因的存在能夠使正常的除蟲菌素產量恢復到SE180-11株；然而，B2∶B1的比例為0.84∶1，顯示了與用pSE188或者pSE199轉化SE180-11株所提供的減少量相比，該突變進一步減少了環(huán)己基-B2相對于環(huán)己基B1的產量(見表3)。表3<tablesid="table2"num="002"><table>除蟲鏈霉菌株(轉化質粒)轉化體測試號B2相對濃度B1相對濃度平均B2∶B1比例SE180-11(無)30000SE180-11(pWHM3)30000SE180-11(pSE186)262221401.59SE180-11(pSE187)122831126.3SE180-11(pSE188)241932060.94SE180-11(pSE199)181551710.88SE180-11(pSE231)62593090.84</table></tables>這些結果第一次證明了發(fā)生在aveC基因上特定的突變提高了商業(yè)上所需要的1類除蟲菌素相對于2類除蟲菌素的產量。9．實施例5＇端缺失突變子的構建如上面第5.1部分所解釋的那樣，如圖1(SEQIDNO1)所顯示的除蟲鏈霉菌核苷酸序列在為潛在的起始位點的四個bp位置42,174,177及180處有四個不同的GTG密碼子。本部分將要描述aveCORF(圖1；SEQIDNO1)5＇區(qū)多重缺失的構建，以幫助確定這些密碼子中哪個在aveCORF中用作蛋白表達的起始位點。在5’端有各種缺失的aveC基因片段可以通過PCR擴增從除蟲鏈霉菌染色體DNA中分離。PCR引物以aveCDNA序列為基礎進行設計，其由GenosysBiotechnologies公司提供。向右的引物為5＇-AACCCATCCGAGCCGCTC-3＇(SEQIDNO16)(D1F1)；5＇-TCGGCCTGCCAACGAAC-3’(SEQIDNO17)(D1F2)；5＇-CCAACGAACGTGTAGTAG-3＇(SEQIDNO18)(D1F3)；及5＇-TGCAGGCGTACGTGTGTTCAGC-3＇(SEQIDNO19)(D2F2)。向左的引物為5＇-CATGATCGCTGAACCGA-3＇(SEQIDNO20)；5＇-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3＇(SEQIDNO21)；及5＇-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3＇(SEQIDNO22)。PCR反應如上述第8．3部分進行。通過在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳來分離PCR產品，檢測到的單一DNA帶為1.0Kb或者1.1Kb。從凝膠中純化PCR產品，并依照操作手冊用25ng線性化的pCR2.1載體(Invitrogen)以1∶10摩爾載體-插入片段的比例進行連接。依照操作手冊將連接混合物用于轉化OneShotTM感受態(tài)的E.coli細胞(Invitrogen)。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，該插入片段的存在通過限制性酶切分析及DNA序列分析確認。這些質粒被命名為pSE190(用引物D1F1獲得)、pSE191(用引物D1F2獲得)、pSE192(用引物D1F3獲得)及pSE193(用引物D2F2獲得)。將插入的DNA分別用BamHⅠ/XbaⅠ進行消化，通過電泳進行分離，從凝膠中純化，并用在一個總DNA濃度為1μg以1∶5摩爾載體-插入片段比例時分別與已經用BamHⅠ/XbaⅠ消化的穿梭載體pWHM3連接。連接混合物被用于轉化活性的E.coliDH5α細胞。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，插入片段的存在可以通過限制性酶切分析進行確認。這些質粒被命名為pSE194(D1F1)、pSE195(D1F2)、pSE196(D1F3)及pSE197(D2F2)，被分別轉化進入E.Coli株DM1中，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析確認校正插入片段的存在。該DNA被用于轉化除蟲鏈霉菌株SE180-11的原生質體。分離菌株SE180-11的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，確定紅霉素抗性轉化體的存在，通過HPLC分析發(fā)酵產品來分析ThiorErmr轉化體以確定哪一個GTG位點為aveC表達所必需。結果指出在位置42處的GTG密碼子可以被消除，并不影響aveC的表達，因為pSE194、pSE195及pSE196每一個都缺乏位置42處的GTG位點，但在位置174、177及180處有三個GTG位點，當轉化進SE180-11時，每一個都能恢復正常的除蟲菌素產量。只有當SE180-11株用缺少所有這四種GTG位點的pSE197進行轉化時，其才不能恢復正常的除蟲菌素產量(表4)。表410．實施例克隆吸水鏈霉菌及產灰色鏈霉菌的aveC同系物本發(fā)明鑒定和克隆了鏈霉菌的其它產生除蟲菌素或比蜜霉素菌種的aveC同系物基因。例如，吸水鏈霉菌(FERMBP-1901)基因組DNA的粘粒文庫與上述除蟲鏈霉菌的1.2KbaveC探針雜交。鑒定出幾種有很強的雜交的粘粒菌落。將染色體DNA從這些粘粒中分離，并鑒定出4.9KbKpnⅠ片段與aveC探針雜交。測定該DNA的序列，鑒定出與除蟲鏈霉菌的aveCORF有很明顯的同源性的ORF(SEQIDNO3)。從吸水鏈霉菌aveC同系物ORF推導出來的氨基酸序列(SEQIDNO4)如圖6所示。此外，將產灰色鏈霉菌基因組DNA的粘粒文庫與來自上述的除蟲鏈霉菌的1.2KbaveC探針進行雜交。鑒定出幾種強烈雜交的粘?？寺 倪@些粘粒中分離染色體DNA，鑒定出一個與aveC探針雜交的5.4Kb的PstⅠ片段。對該DNA進行測序，并鑒定出與除蟲鏈霉菌的aveCORF有很明顯的同源性的aveC同系物的部分ORF。推導出來的部分氨基酸序列(SEQIDNO5)如圖6所示。來自吸水鏈霉菌和產灰色鏈霉菌的aveC同系物的DNA與氨基酸序列分析顯示這些區(qū)域彼此之間共有明顯的同源性(在氨基酸水平上約有50％的序列同一性)或者與除蟲鏈霉菌aveCORF及AveC基因產物也有明顯的同源性(圖6)。11．實施例在ermE啟動子后用aveC基因構建質粒pSE186的1.2KbaveCORF被亞克隆在pSE34中，其為一個穿梭載體pWHM3，具有300bpermE啟動子，該啟動子作為一個KpnI/BamHⅠ片段被插入在pWHM3的KpnⅠ/BamHⅠ位點(參見Ward等人，1986,Mol.Gen.Genet203468478)。用BamHⅠ及HindⅢ消化pSE186，通過電泳分辨消化物，將1.2Kb片段從瓊脂糖凝膠中分離并與已經用BamHⅠ及HindⅢ消化的pSE34進行連接。依照操作說明，該連接混合物被轉化進入感受態(tài)的E.coilDH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，通過限制性酶切分析確認1.2Kb插入片段的存在。該質粒(被命名為pSE189)被轉化進入E.coliDM1中，并從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA。用pSE189轉化除蟲鏈霉菌菌株1100-SC38的原生質體。分離菌株1100-SC38的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，并通過HPLC分析發(fā)酵產品來進行分析。含有pSE189的除蟲鏈霉菌株1100-SC38轉化體所產生的除蟲菌素的環(huán)己基-B2與環(huán)己基-B1的比例(大約是3∶1)相對于菌株1100-SC38所產生的上述物質的比例(大約是34∶1)已經改變，但與用pSE119進行轉化的菌株1100-SC38相比，總的除蟲菌素產量增加了約2.4倍(表5)。pSE189也可以轉化進入野生型除蟲鏈霉菌菌株的原生質體中。分離硫鏈絲菌肽抗性轉化株，并通過HPLC分析發(fā)酵產物來進行分析。用pSE189轉化的除蟲鏈霉菌野生型的除蟲菌素總產量與用pSE119轉化的野生型除蟲鏈霉菌株相比增加了2.2倍(表5)。表5<tablesid="table4"num="004"><table>除蟲鏈霉菌株(轉化質粒)轉化體測試號B2相對濃度B1相對濃度相對的除蟲菌素總產量平均B2∶B1比例1100-SC3861554.817633.91100-SC38(pSE119)923950.33574.71100-SC38(pSE189)165461668493.3野生型659421131.41野生型(pSE119)62481514811.64野生型(pSE189)554534510711.58</table></tables>12．實施例含有除蟲鏈霉菌aveCORF及吸水鏈霉菌aveC同系物序列的嵌合質粒如下所述，構建命名為pSE350的雜合質粒，其含有564bp部分的吸水鏈霉菌aveC同系物，取代除蟲鏈霉菌aveCORF的564bp的同系物部分(見圖7)。使用BsaAⅠ限制性位點和KpnⅠ限制性位點構建pSE350,BsaAⅠ限制性位點存在于兩個序列中(aveC225位)，KpnⅠ限制性位點存在于除蟲鏈霉菌aveC基因中(aveC810位)。用上述第7.1.10部分所述的PCR條件，通過PCR將kpnⅠ位點引入吸水鏈霉菌DNA中，其所用的向右引物為5’-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3’(SEQIDNO23)，向左引物為5’-GAACTGGTACCAGTGCCC-3’(SEQIDNO24)(由GenosysBiotechnologies公司提供)。將PCR產物用BsaAⅠ及KpnⅠ進行消化，通過在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳來分離這些片段，從凝膠中分離564bp的BsaAⅠ/KpnⅠ片段。將pSE179(如上述第7．1．10部分所述)用KpnⅠ及HindⅢ消化，通過在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳以分離這些片段，并將約4.5Kb的片段從凝膠中分離。用HindⅢ及BsaA1消化pSE179，通過在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳來分離這些片段，并從凝膠中分離一個約0.2Kb的BsaAⅠ/HindⅢ片段。該4.5Kb的HindⅢ/kpnⅠ片段、0.2KbBsaAⅠ/HindⅢ片段及來自于吸水鏈霉菌的564bp的BsaAⅠ/KpnⅠ片段以三種方式連接在一起，該連接混合物轉化進感受態(tài)的E.coliDH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，通過使用KpnⅠ及AvaⅠ限制性酶切分析確認該校正插入片段的存在。該質粒用HindⅢ及XbaⅠ進行消化以釋放1.2Kb插入片段，然后與pWHM3(其已經用HindⅢ及XbaⅠ消化)進行連接。將該連接混合物轉化進感受態(tài)的E.coliDH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，并用HindⅢ及AvaⅠ限制性酶切分析確認校正插入片段的存在。該質粒DNA轉化進入E.coliDM1中，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，通過限制性酶切分析及DNA序列分析確認校正插入片段的存在。該質粒被命名為pSE350，并用于轉化除蟲鏈霉菌株SE180-11的原生質體。將菌株SE180-11的硫鏈絲菌肽抗性轉化體分離，確定有紅霉素抗性存在，并通過HPLC分析發(fā)酵產物對ThiorErmr轉化體進行分析。結果顯示出含有除蟲鏈霉菌/吸水鏈霉菌雜合質粒的轉化體的平均B2∶B1比例約為109∶1(參見表6)。表6生物材料的保藏1998年1月29日，下列生物材料保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),12301ParklawnDrive,Roekville,MD,20852,USA，給出下列保藏號質粒保藏號質粒pSE180209605質粒pSE186209604以上所引用的全部的專利，專利申請，及公開文獻在此全面引作參考。本發(fā)明并不局限于本文所描述的具體實施方案的范圍，這些僅為本發(fā)明各個方面的個別舉例，功能上相當?shù)姆椒敖M合物都屬于本發(fā)明的范圍。實際上，除了上述說明及示例外，從上述說明和附圖，本發(fā)明的各種變化對于本領域技術人員來說都是很明顯的。這些變化都將落入所附權利要求書的保護范圍之內。序列表<110>輝瑞產品公司(非美國申請)<120>介導除蟲菌素B2∶B1比例的除蟲鏈霉菌基因<130>PC9916A<140><141><150>60/074,636<151>1998-02-13<160>24<170>PatentInVer.2.0-beta<210>1<211>1229<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<220><221>CDS<222>(174)..(1085)<400>1tcacgaaaccggacacaccacacacacgaaggtgagacagcgtgaacccatccgagccgc60tcggcctgcccaacgaacgtgtagtagacacccgaccgtccgatgccacgctctcacccg120aggccggcctgaacaggtcaggagcgctgccccgtgaactgctgtcgttgccggtg176val1gtggtgtgggccggggtcggcctgctgtttctggccctgcaggcgtac224ValValTrpAlaGlyValGlyLeuLeuPheLeuAlaLeuGlnAlaTyr51015gtgttcagccgctgggcggccgacggtggctaccggctgatcgagacg272ValPheSerArgTrpAlaAlaAspGlyGlyTyrArgLeuIleGluThr202530gcgggccagggtcagggcggcagcaaggatacggggactaccgatgtg320AlaGlyGlnGlyGlnGlyGlySerLysAspThrGlyThrThrAspVal354045gtctatcccgtgatttccgtcgtctgcatcaccgccgcggcggcgtgg368ValTyrProValIleSerValValCysIleThrAlaAlaAlaAlaTrp50556065ctcttccggaggtgccgtgtcgaacgacggctgctgttcgacgccctt416LeuPheArgArgCysArgValGluArgArgLeuLeuPheAspAlaLeu707580ctcttcctcgggctgctgttcgcgagctggcagagcccgctcatgaac464LeuPheLeuGlyLeuLeuPheAlaSerTrpGlnSerProLeuMetAsn859095tggttccattccgttctcgtctccaacgcgagtgtgtggggcgcggtg512TrpPheHisSerValLeuValSerAshAlaSerValTrpGlyAlaVal100105110ggttcctggggtccgtatgtgcccggctggcagggggcgggcccgggt560GlySerTrpGlyProTyrvalProGlyTrpGlnGlyAlaGlyProGly115120125gcggaggcggaaatgccgctggcgtcggcctccgtctgcatgtcggct608AlaGluAlaGluMetProLeuAlaSerAlaSerValCysMetSerAla130135140145ctgatcgtcaccgtgctgtgcagcaaggcactggggtggatcaaggcc656LeuIleValThrValLeuCysSerLysAlaLeuGlyTrpIleLysAla150155160cgccggccggcatggcggacctggcggctggtcctggccgtgttcttc704ArgArgProAlaTrpArgThrTrpArgLeuValLeuAlaValPhePhe165170175atcggcatcgtgctcggtctgtccgagccgctgccgtccgcctccggg752IleGlyIleValLeuGlyLeuSerGluProLeuProSerAlaSerGly180185190atcagcgtatgggccagagcgctgcccgaggtgaccttgtggagtggc800IleSerValTrpAlaArgAlaLeuProGluValThrLeuTrpSerGly195200205gagtggtaccagttccccgtgtatcaggcggtcggttccggcctggtc848GluTrpTyrGlnPheProValTyrGlnAlaValGlySerGlyLeuVal210215220225tgctgcatgctgggctcgctgcgcttcttccgcgacgaacgcgatgag896CysCysMetLeuGlySerLeuArgPhePheArgAspGluArgAspGlu230235240tcgtgggtggaacggggagcctggcggttgccgcaacgggcagcgaac944SerTrpValGluArgGlyAlaTrpArgLeuProGlnArgAlaALaAsh245250255tgggcgcgtttcctcgccgtggtcggtggggtgaatgccgtgatgttc992TrpAlaArgPheLeuAlaValValGlyGlyValAsnAlaValMetPhe260265270ctctacacctgtttccatatcctcctgtccctcgtcggtggacagccg1040LeuTyrThrCysPheHisIleLeuLeuSerLeuValGl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5TyrValPheAlaArgTrpThrAlaAspGlyGlyTyrHisLeuAlaAsp202530ValSerGlyProAspGlyArgGluProGlyHisArgArgIleIleAsp354045ValLeuLeuProAlaLeuSerMetAlaGlyValValGlyLeuAlaPhe505560TrpLeuValArgArgTrpArgAlaGluArgArgLeuSerPheAspAla65707580LeuLeuPheThrGlyValLeuPheAlaGlyTrpLeuSerProLeuMet859095AsnTrpPheHisProValLeuMetAlaAsnThrHisValTrpGlyAla100105110ValGlySerTrpGlyProTyrValProGlyTrpArgGlyLeuProPro115120125GlyLysGluAlaGluLeuProLeuValThrPheSerLeuGlySerThr130135140ValLeuLeuGlyValLeuGlyCysCysGlnValMetSerArgValArg145150155160GluArgTrpProGlyValArgProTrpGlnLeuValGlyLeuAlaPhe165170175LeuThrAlaValAlaPheAspLeuSerGluProPheIleSerPheAla180185190GlyValSerValTrpAlaArgAlaLeuProThrValThrLeuTrpArg195200205GlyAlaTrpTyrArgAlaArg210215<210>6<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>6tcacgaaaccggacacac18<210>7<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>7catgatcgctgaaccgag18<210>8<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>8ggttccggatgccgttctcg20<210>9<211>21<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>9aactccggtcgactccccttc21<210>10<211>19<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>10gcaaggatacggggactac19<210>11<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>11gaaccgaccgcctgatac18<210>12<211>43<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>12gggggcgggcccgggtgcggaggcggaaatgcccctggcgacg43<210>13<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>13ggaaccgaccgcctgataca20<210>14<211>46<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>14gggggcgggcccgggtgcggaggcggaaatgccgctggcgacgacc46<210>15<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>15ggaacatcacggcattcacc20<210>16<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>16aacccatccgagccgctc18<210>17<211>17<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>17tcggcctgccaacgaac17<210>18<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>18ccaacgaacgtgtagtag18<210>19<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>19tgcaggcgtacgtgttcagc20<210>20<211>17<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>20catgatcgctgaaccga17<210>21<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>21catgatcgctgaaccgagga20<210>22<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>22aggagtgtggtgcgtctgga20<210>23<211>19<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>23cttcaggtgtacgtgttcg19<210>24<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌<400>24gaactggtaccagtgccc18權利要求1．分離的多核苷酸分子，其包含除蟲鏈霉菌完整的aveCORF或其實質性部分，該分離的多核苷酸分子缺少位于除蟲鏈霉菌染色體中aveCORF原位下游的下一個完整的ORF。2．如權利要求1所述的分離的多核苷酸分子，其包括與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或者與圖1(SEQIDNO1)所示的aveCORF核苷酸序列或其實質性部分相同的核苷酸序列。3．如權利要求2所述的分離的多核苷酸分子，其進一步包括天然側翼于除蟲鏈霉菌中的原位AveC基因的核苷酸序列。4．分離的多核苷酸分子，其包括與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列，或者與圖1(SEQIDNO1)所示的aveCORF的核苷酸序列或其實質性部分具有同源性的核苷酸序列。5．分離的多核苷酸分子，其包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列與質粒pSE186(ATCC209604)的AveC基因產物編碼序列所編碼的氨基酸序列，或者與圖1(SEQIDNO2)所示的氨基酸序列或其實質性部分具有同源性。6．分離的多核苷酸分子，其包括SEQIDNO3的核苷酸序列或其實質性部分，或者與SEQIDNO3的核苷酸序列具有同源性的核苷酸序列。7．分離的多核苷酸分子，其包括編碼多肽的核苷酸序列，該多肽與SEQIDNO4的氨基酸序列具有同源性。8．寡核苷酸分子，其在高度嚴緊的條件下，與具有圖1(SEQIDNO1)或者SEQIDNO3的核苷酸序列的多核苷酸分子進行雜交，或者與具有與圖1(SEQIDNO1)或者SEQIDNO3的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸分子進行雜交。9．如權利要求8所述的寡核苷酸分子，其與圖1(SEQIDNO1)或者SEQIDNO3的核苷酸序列互補，或者與具有與表1(SEQIDNO1)或者SEQIDNO3的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸分子互補。10．重組載體，其包括多核苷酸分子，該多核苷酸分子含有選自下列的核苷酸序列(a)核苷酸序列，其與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列相同，或者與圖1(SEQIDNO1)的aveCORF的核苷酸序列或其實質性部分相同；(b)核苷酸序列，其與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列，或者與圖1(SEQIDNO1)的aveCORF的核苷酸序列或其實質性部分具有同源性；(c)核苷酸序列，其編碼的多肽具有的氨基酸序列與質粒pSE186(ATCC209604)的AveC基因產物編碼序列所編碼的氨基酸序列，或者與圖1(SEQIDNO2)的氨基酸序列或其實質性部分具有同源性。11．如權利要求10所述的重組載體，其進一步包括編碼一個或多個調控元件的核苷酸序列，該編碼調控元件的核苷酸序列與如權利要求10所述的核苷酸序列可操作相連。12．如權利要求11所述的重組載體，其進一步包括編碼選擇性標記的核苷酸序列。13．如權利要求12所述的重組載體，其為質粒PSE186(ATCC209604)。14．包括如權利要求12所述的重組載體的宿主細胞。15．如權利要求14所述的宿主細胞，其為除蟲鏈霉菌。16．重組載體，其包括含有核苷酸序列的多核苷酸分子，所述核苷酸序列選自下列序列SEQIDNO3的核苷酸序列或其實質性部分，與SEQIDNO3所示的核苷酸序列具有同源性的核苷酸序列，編碼與SEQIDNO4所示的氨基酸序列具有同源性的多肽的核苷酸序列。17．如權利要求16所述的重組載體，進一步包括編碼一個或多個調控元件的核苷酸序列，該編碼調控元件的核苷酸序列與如權利要求16所述的核苷酸序列可操作相連。18．如權利要求17所述的重組載體，進一步包括編碼選擇性標記的核苷酸序列。19．包括如權利要求18所述的重組載體的宿主細胞。20．如權利要求19所述的宿主細胞，其為吸水鏈霉菌。21．重組表達的除蟲鏈霉菌AveC基因產物或其同源性多肽，所述基因產物具有由質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，或者具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列或其實質性部分。22．重組表達的吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物或其同源多肽，所述基因產物具有SEQIDNO4所示氨基酸序列。23．用于生產重組AveC基因產物的方法，其包括在利于重組AveC基因產物生產的條件下培養(yǎng)用重組表達載體轉化的宿主細胞，并從細胞培養(yǎng)物中回收AveC基因產物，所述重組表達載體包括具有核苷酸序列的多核苷酸分子，所述核苷酸序列編碼由質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，或者編碼SEQIDNO2所示的氨基酸序列或其實質性部分，所述多核苷酸分子與一個或多個控制多核苷酸分子在宿主細胞中的表達的調控元件可操作相連。24．用于生產重組AveC同系物基因產物的方法，其包括在利于重組AveC同系物基因產物生產的條件下培養(yǎng)用重組表達載體轉化的宿主細胞，并從培養(yǎng)物中回收AveC同系物基因產物，所述重組表達載體包括具有核苷酸序列的多核苷酸分子，所述核苷酸序列編碼SEQIDNO4所示的氨基酸序列或其實質性部分，所述多核苷酸分子與一個或多個控制多核苷酸分子在宿主細胞中的表達的調控元件可操作相連。25．多核苷酸分子，其具有的核苷酸序列或者與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列相同，或者與如圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌的aveCORF的核苷酸序列相同；但是該核苷酸序列進一步包括一個或多個突變，從而使得其中野生型aveC等位基因已經失活并且表達含有突變的核苷酸序列的多核苷酸分子的除蟲鏈霉菌菌株ATCC53692的細胞產生的除蟲菌素的比例和量與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株ATCC53692的細胞所產生的比例和量有所不同。26．如權利要求25所述的多核苷酸分子，其調制除蟲菌素的生產，使得其中野生型aveC等位基因已經失活并且表達權利要求25所述的多核苷酸分子的除蟲鏈霉菌菌株ATCC53692的細胞與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株ATCC53692的細胞相比以降低的2類∶1類比例產生除蟲菌素。27．如權利要求26所述的多核苷酸分子，其中2類∶1類除蟲菌素為環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素。28．如權利要求27所述的多核苷酸分子，其中降低的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1比例小于1.6∶1。29．如權利要求28所述的多核苷酸分子，其中降低的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1比例約為0.94∶1。30．如權利要求29所述的多核苷酸分子，其中圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌AveCORF的突變編碼AveC基因產物的殘基139處由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸的氨基酸取代。31．如權利要求28所述的多核苷酸分子，其中降低的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1的比例大約為0.88∶1。32．如權利要求31所述的多核苷酸分子，其中圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌AveCORF的突變編碼AveC基因產物的殘基138處由絲氨酸變?yōu)樘K氨酸的氨基酸取代。33．如權利要求28所述的多核苷酸分子，其中降低的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1比例大約為0.84∶1。34．如權利要求33所述的多核苷酸分子，其中圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌AveCORF的突變編碼AveC基因產物的殘基138處由絲氨酸變?yōu)樘K氨酸的第一氨基酸取代，和AveC基因產物的殘基139處由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸的第二氨基酸取代。35．如權利要求25所述的多核苷酸分子，其中圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌AveCORF的突變編碼AveC基因產物的殘基55處由絲氨酸變?yōu)楸奖彼岬陌被崛〈?6．如權利要求25所述的多核苷酸分子，其中圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌AveCORF的突變編碼AveC基因產物的殘基230處由甘氨酸變?yōu)樘於彼岬陌被崛〈?7．含有強啟動子的多核苷酸分子，所述啟動子與圖1(SEQIDNO1)所示的除蟲鏈霉菌AveCORF可操作相連。38．如權利要求37所述的多核苷酸分子，其中所述強啟動子是來自紅色多孢菌的ermE啟動子。39．多核苷酸分子，其包含的編碼AveC基因產物的核苷酸序列已通過將異源核苷酸序列插入所述核苷酸序列中而失活。40．如權利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，該等位基因通過從圖1(SEQIDNO1)的AveCORF中缺失640bp的PstⅠ/SphⅠ片斷而失活。41．如權利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，該等位基因通過向該等位基因中導入移碼突變而失活。42．如權利要求41所述的多核苷酸分子，其中通過在圖1(SEQIDNO1)的aveCORF的471位核苷酸處的C核苷酸后增加兩個G核苷酸而導入移碼突變。43．如權利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，其中通過在編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產物的第116位氨基酸的核苷酸位置處導入終止密碼子而使該等位基因失活。44．如權利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，其中通過在AveC基因產物的氨基酸位置258處導入由甘氨酸變?yōu)樘於彼岬牡谝煌蛔?，并在AveC基因產物的氨基酸位置275處導入由酪氨酸變?yōu)榻M氨酸的第二突變而使aveC等位基因失活。45．基因取代載體，其包括的多核苷酸分子含有天然側翼于除蟲鏈霉菌染色體中的原位AveC基因的核苷酸序列。46．重組載體，其包括如權利要求25-44任一所述的多核苷酸分子。47．重組載體，其含有如權利要求39所述的多核苷酸分子，所述載體為pSE180(ATCC209605)。48．含有如權利要求46所述的重組載體的鏈霉菌宿主細胞。49．鑒別aveCORF中能夠改變所產生的除蟲菌素2類∶1類比例的突變的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子被導入該細胞并在其中被表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈霉菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQIDNO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例與步驟(b)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，如果二者不同的話，則可以證實有能夠改變除蟲菌素2類∶1類比例的aveCORF突變存在。50．如權利要求49所述的方法，其中除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。51．鑒定aveCORF或者包含有aveCORF的構建體中能夠改變所產生的除蟲菌素量的突變的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列或含有編碼AveC基因產物的核苷酸序列的基因構建體的多核苷酸分子被導入該細胞并在其中表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈霉菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素的量，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQ1DNO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量與步驟(b)的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，如果二者不同的話，則可以證實有能夠改變除蟲菌素量的aveCORF或基因構建體突變存在。52．如權利要求51所述的方法，其中所產生的除蟲菌素的量因突變而增加。53．制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株包含有能夠表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例發(fā)生改變，所述方法包括用攜有突變的aveC等位基因的載體轉化除蟲鏈霉菌菌株細胞，該突變的aveC等位基因編碼的基因產物使得表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例發(fā)生改變，選擇轉化細胞，該轉化細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞有所改變。54．如權利要求53所述的方法，其中除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。55．制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株包括能產生改變量的除蟲菌素的細胞，所述方法包括用含有突變aveC等位基因或者含有該aveC等位基因的基因構建體轉化除蟲鏈霉菌菌株細胞，其表達的結果使表達突變aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈霉菌菌株細胞所生產的除蟲菌素量較僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變，挑選已轉化的細胞，該轉化細胞產生的除蟲菌素量較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞產生的除蟲菌素量有所改變。56．如權利要求55所述的方法，其中所產生的除蟲菌素的量因突變而增加。57．制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株細胞含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用使該aveC等位基因失活的載體轉化除蟲鏈霉菌菌株細胞，并且選擇其中aveC等位基因已經失活的轉化細胞。58．如權利要求57所述的方法，其中載體是pSE180(ATCC209605)。59．除蟲鏈霉菌菌株，其含有表達突變的aveC等位基因的細胞，結果產生2類∶1類比例有所改變的除蟲鏈霉菌細胞，所述的2類∶1類比例的改變是相對于僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言的。60．如權利要求59所述的菌株，其中除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。61．如權利要求60所述的細胞株，其中細胞所產生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例小于1.6∶1。62．如權利要求61所述的菌株，其中細胞所產生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例大約是0.94∶1。63．如權利要求61所述的菌株，其中細胞所產生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例大約是0.88∶1。64．如權利要求61所述的菌株，其中細胞所產生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例大約是0.84∶1。65．除蟲鏈霉菌菌株，其含有表達突變的aveC等位基因或者基因構建體的細胞，結果產生量有所增加的除蟲菌素，所述的量增加是相對于僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言的。66．除蟲鏈霉菌菌株，其含有aveC基因已經失活的細胞。67．生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)除蟲鏈霉菌菌株細胞，并從培養(yǎng)物中回收除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因，與不表達突變aveC等位基因而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，該突變等位基因編碼的基因產物改變了表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例。68．如權利要求67所述的方法，其中除蟲菌素的2類∶1類的比例因突變而減少。69．生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)除蟲鏈霉菌菌株細胞，并從培養(yǎng)物中回收除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因構建體，與不表達突變aveC等位基因或基因構建體而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，表達突變的aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。70．如權利要求69所述的方法，其中所產生的除蟲菌素的量通過表達突變的aveC等位基因或基因構建體而增加。71．由除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素組合物，所述細胞表達編碼基因產物的突變的aveC等位基因，所述基因產物減少了表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類比例，所述除蟲菌素2類∶1類比例的減少是相對于不表達突變的aveC等位基因而僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言的，其中相對于不表達突變的aveC等位基因而僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類比例而言，以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素。全文摘要本發(fā)明涉及包含有編碼aveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子,該多核苷酸分子可被用于改變除蟲鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)物中所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例或量。本發(fā)明進一步涉及載體、宿主細胞和除蟲鏈霉菌的突變菌株,其中aveC基因已經被失活或突變以改變所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例或量。文檔編號C07K14/36GK1297485SQ99805027公開日2001年5月30日申請日期1999年1月25日優(yōu)先權日1998年2月13日發(fā)明者金·J·施圖茨曼-恩格沃爾,加藤芳弘,哈米什·A·I·麥克阿瑟申請人:輝瑞產品公司