專利名稱：一種多肽－人鈣結(jié)合s100蛋白21和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人鈣結(jié)合S100蛋白，以及編碼多肽的多核苷酸序列及其制備方法和應(yīng)用。
許多鈣結(jié)合蛋白屬于相同的進(jìn)化家族，擁有一個(gè)被稱為EF-hand的結(jié)構(gòu)域。這種類型的結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)12個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)，這個(gè)環(huán)通過一個(gè)12個(gè)氨基酸殘基的α螺旋區(qū)域向兩邊伸展，約成90度角。在EF-hand環(huán)中，鈣離子結(jié)合于一個(gè)五邊形的雙錐狀的構(gòu)象中。涉及結(jié)合的6個(gè)殘基在1，3，5，7，9和12位。12位上保守的Glu或Asp提供與Ca配位的兩個(gè)氧原子(雙配位基配體)。
細(xì)胞液中鈣離子濃度的變化引起了廣泛的細(xì)胞反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)的鈣結(jié)合蛋白是通過酶反應(yīng)或蛋白一蛋白相互作用調(diào)節(jié)來傳導(dǎo)鈣信號(hào)中的關(guān)鍵分子。它們中的一些在細(xì)胞周期中作用，或作用于細(xì)胞分化。被第二信號(hào)分子(如肌醇三磷酸)刺激后，它們短暫地從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到周圍的細(xì)胞質(zhì)中。相似的過程在核膜破裂和有絲分裂后期的染色單體分離中發(fā)生。
S100蛋白是一群小分子量(約10-12KD)的二聚的酸性鈣結(jié)合蛋白，在腦中很豐富。由于第一個(gè)分離的蛋白在100％硫酸銨中可溶而得名。這些蛋白最出眾的特征是EF-hand的存在。S100蛋白有2個(gè)鈣結(jié)合區(qū)域一個(gè)是基本的螺旋--環(huán)--螺旋區(qū)域，有低親和力，另一個(gè)是酸性的螺旋--環(huán)--螺旋EF-hand區(qū)域。EF-hand區(qū)域還包含了特異性鑒別S100家族的區(qū)域的一部分，它與鈣離子有高親和性。
至今，這些蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)任何特異的酶活性質(zhì)。在S100蛋白中，鈣的結(jié)合導(dǎo)致了構(gòu)象的改變，從而影響了二級(jí)作用蛋白。S100蛋白參與一個(gè)類型專一性的模式中的細(xì)胞內(nèi)鈣增加的信號(hào)傳導(dǎo)。
S100蛋白在中央和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中由膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。在成熟膠質(zhì)細(xì)胞中S100的積累與微管作用有關(guān)。S100推動(dòng)了神經(jīng)分化和生存，但如果過量表達(dá)，可能對(duì)細(xì)胞有害。選擇性的過量產(chǎn)生與老年癡呆癥的變化進(jìn)展有關(guān)，可能涉及有絲分裂蛋白激酶。
成人T細(xì)胞白血病(ATL)是由人T淋巴細(xì)胞病毒I型導(dǎo)致的成熟T細(xì)胞惡性腫瘤。T細(xì)胞受體αβ復(fù)合體(TCR.α..β+)表面表達(dá)減少是ATL患者特異的特征。S100蛋白在CD4+，TCR.α..β+ATL細(xì)胞中部表達(dá)，但在四個(gè)ATL患者中的CD4-，CD8-，TCR.α..β+白細(xì)胞中表達(dá)。這表明S100的增加與ATL的TCR.α..β+復(fù)合體表面表達(dá)減少有關(guān)。
S100血清水平的提高與分散的惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。這表明血清S100的量可作為轉(zhuǎn)移黑素瘤進(jìn)程的診斷標(biāo)志。另外，編碼人calgizzarin(一種S100類似蛋白)的mRNA以及那些編碼磷酯酶的mRNA在結(jié)腸直腸癌中增加，表明S100與這些癌的機(jī)制有關(guān)。
人S100蛋白和編碼其的核苷酸可用于診斷、預(yù)防和治療神經(jīng)，膜泡運(yùn)輸，免疫和瘤的病癥。
本發(fā)明的目的之一是提供一種分離的新的多肽--人鈣結(jié)合S100蛋白21及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的目的之二是提供編碼該多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的目的之三是提供含有編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸的重組載體。
本發(fā)明的目的之四是提供含有編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的目的之五是提供生產(chǎn)人鈣結(jié)合S100蛋白21的方法。
本發(fā)明的目的之六是提供針對(duì)本發(fā)明的多肽--人鈣結(jié)合S100蛋白21的抗體。
本發(fā)明的目的之七是提供了針對(duì)本發(fā)明多肽--人鈣結(jié)合S100蛋白21的模擬化合物、拮抗劑、激動(dòng)劑、抑制劑。
本發(fā)明的目的之八是提供診斷治療與人鈣結(jié)合S100蛋白21異常相關(guān)的疾病的方法。
本發(fā)明所說的人鈣結(jié)合S100蛋白21是人源的，它包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、類似物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
根據(jù)氨基酸序列同源比較發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的多肽具有S100基因家族的特征序列，特別是EF-hand的特征序列，可推斷出本發(fā)明的多肽屬于S100基因家族，因此，命名為人鈣結(jié)合S100蛋白21，具有S100基因家族相似的結(jié)構(gòu)和功能。
所說的“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。存在于活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，將其從天然狀態(tài)中與其他物質(zhì)分開，則為分離純化的。
所說的“分離的人鈣結(jié)合S100蛋白21”是指人鈣結(jié)合S100蛋白21基本上不含其它的蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化人鈣結(jié)合S100蛋白21?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。人鈣結(jié)合S100蛋白21多肽的純度能用氨基酸序列分析。
所說的新的多肽--人鈣結(jié)合S100蛋白21，其基本上是由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人鈣結(jié)合S100蛋白21的片段、衍生物和類似物。術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的人鈣結(jié)合S100蛋白21相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(Ⅰ)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(Ⅱ)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上的某個(gè)基團(tuán)被其它基團(tuán)取代包含取代基；或者(Ⅲ)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(Ⅳ)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進(jìn)成熟多肽而形成的多肽序列(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明所說的編碼這些多肽的多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中365-946位的序列；和(b)具有SEQ ID NO1中1-3507位的序列。
所說的分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發(fā)明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO1的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。它包含的多核苷酸序列全長為3507個(gè)堿基，其開放讀框(365-946)編碼了193氨基酸。根據(jù)氨基酸序列同源比較發(fā)現(xiàn)，此多肽與同源蛋白神經(jīng)鈣蛋白有99％的同源性，可推斷出該人鈣結(jié)合S100蛋白21具有同源蛋白神經(jīng)鈣蛋白相似的結(jié)構(gòu)和功能。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。所說的“簡(jiǎn)并的變異體”是指編碼具有SEQID NO2的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個(gè)序列之間具有至少50％，優(yōu)選具有70％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。所說的“核酸片段”的長度至少含10個(gè)核苷酸，較好是至少20-30個(gè)核苷酸，更好是至少50-60個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達(dá)文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的多核苷酸片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，etal.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。還可得到商業(yè)供應(yīng)的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶反應(yīng)技術(shù)時(shí)，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標(biāo)志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)測(cè)定人鈣結(jié)合S100蛋白21的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過免疫學(xué)技術(shù)或測(cè)定生物學(xué)活性，來檢測(cè)基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少10個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個(gè)核苷酸之內(nèi)，較佳的為1000個(gè)核苷酸之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當(dāng)然可以用作探針。DNA探針的標(biāo)記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測(cè)人鈣結(jié)合S100蛋白21基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的多核苷酸序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成，如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)測(cè)定。這類多核苷酸序列測(cè)定也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測(cè)序需反復(fù)進(jìn)行。有時(shí)需要測(cè)定多個(gè)克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含所說的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或直接用人鈣結(jié)合S100蛋白21編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞、被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
本發(fā)明中，編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸序列可插入到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達(dá)載體。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯調(diào)控元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.MolecularCloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.NewYork，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體的PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會(huì)使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體/轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)和選擇性標(biāo)記基因。
本發(fā)明中，編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細(xì)菌細(xì)胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的人鈣結(jié)合S100蛋白21(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
S100涉及神經(jīng)方面的病癥。這樣的病癥包括但不限于靜坐不能、老年癡呆癥、遺忘癥、肌萎縮硬化、兩極細(xì)胞紊亂、緊張癥、腦贅生物、癡呆、抑郁癥、唐氏綜合癥、遲發(fā)性隨意運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙、癲癇癥、亨廷頓舞蹈病、復(fù)合性硬化癥、神經(jīng)纖維瘤、帕金森氏癥、妄想癥、神經(jīng)分裂癥、圖雷特病等。一方面，與S100特異結(jié)合的抗體直接用作拮抗劑，或間接作為靶物質(zhì)、或參與運(yùn)輸藥物至表達(dá)S100的細(xì)胞或組織的機(jī)制。
S100涉及關(guān)于膜泡運(yùn)輸紊亂方面的病癥。這樣的病癥包括但不限于膀胱纖維變性，葡萄糖--半乳糖吸收障礙綜合癥，高膽固醇血癥，糖尿病，低血糖，格雷夫斯病，甲狀腺腫，庫欣癥和惡性貧血；腸胃的病癥包括潰瘍性結(jié)腸炎，胃和十二指腸潰瘍，其它與不正常膜泡運(yùn)輸有關(guān)的病癥，包括AIDS；過敏反應(yīng)包括哮喘和風(fēng)疹，自身免疫溶血貧血；擴(kuò)散性腎小球腎炎；腸炎，多重性硬化癥，風(fēng)濕，骨關(guān)節(jié)炎，重癥肌無力，硬皮病，切地阿克-東綜合癥；系統(tǒng)性紅斑狼瘡，毒性休克綜合癥，組織外傷，細(xì)菌、真菌、寄生蟲和原生動(dòng)物感染。一方面，特異性與S100結(jié)合的抗體可直接作為拮抗劑，間接作為靶物質(zhì)，參與攜帶藥物至表達(dá)S100的細(xì)胞或組織的運(yùn)輸機(jī)制。
S100涉及自身免疫紊亂引起的病癥。這樣的病癥包括但不僅限于AIDS，惡性貧血，成人呼吸困難綜合癥，過敏反應(yīng)，貧血，哮喘，動(dòng)脈周樣硬化，支氣管炎，膽囊炎，階段性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎，特異性皮膚炎，皮膚肌炎，糖尿病，肺氣腫，萎縮性胃炎，腎小球腎炎，痛風(fēng)，格雷夫斯病，嗜曙紅細(xì)胞過多，過敏性腸綜合癥，紅斑狼瘡，復(fù)合性硬化癥，重癥肌無力，心肌炎，骨關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松癥，胰腺炎，多肌炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，硬皮癥，斯耶格倫綜合癥和自身免疫甲狀腺炎，癌癥并發(fā)癥，血液透析和體外循環(huán)，細(xì)菌、真菌、寄生蟲和原生動(dòng)物感染和外傷。一方面，特異性與S100結(jié)合的抗體可直接作為拮抗劑，間接作為靶物質(zhì)，參與攜帶藥物至表達(dá)S100的細(xì)胞或組織的運(yùn)輸機(jī)制。
S100涉及腫瘤的發(fā)生機(jī)制。這些疾病包括但不僅限于腺癌，白血病，淋巴癌，黑素癌，骨髓癌，肉瘤，畸胎瘤，特別是子宮頸、腎上腺、膀胱、骨、骨髓、腦、胸、膽囊、神經(jīng)節(jié)、腸胃道、心、腎、肝、肺、肌肉、子房、胰腺、甲狀旁腺、陰莖、前列腺、唾液腺、皮膚、脾、睪丸、胸腺、甲狀腺和子宮的癌癥。一方面，特異性與S100結(jié)合的抗體可直接作為拮抗劑，間接作為靶物質(zhì)，參與攜帶藥物至表達(dá)S100的細(xì)胞或組織的運(yùn)輸機(jī)制。
本發(fā)明的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動(dòng)劑和抑制劑可直接用于疾病治療，例如，可治療惡性腫瘤、腎上腺缺乏癥、皮膚病、各類炎癥、HIV感染和免疫性疾病等。
本發(fā)明也提供了篩選化合物以鑒定提高(激動(dòng)劑)或阻遏(拮抗劑)人鈣結(jié)合S100蛋白21的藥劑的方法。激動(dòng)劑提高人鈣結(jié)合S100蛋白21刺激細(xì)胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細(xì)胞過度增殖有關(guān)的紊亂如各種癌癥。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動(dòng)物細(xì)胞或表達(dá)人鈣結(jié)合S100蛋白21的膜制劑與標(biāo)記的人鈣結(jié)合S100蛋白21一起培養(yǎng)。然后測(cè)定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
人鈣結(jié)合S100蛋白21的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。人鈣結(jié)合S100蛋白21的拮抗劑可以與人鈣結(jié)合S100蛋白21結(jié)合并消除其功能，或是抑制該多肽的產(chǎn)生，或是與該多肽的活性位點(diǎn)結(jié)合使該多肽不能發(fā)揮生物學(xué)功能。
在篩選作為拮抗劑的化合物時(shí)，可以將人鈣結(jié)合S100蛋白21加入生物分析測(cè)定中，通過測(cè)定化合物對(duì)人鈣結(jié)合S100蛋白21和其受體之間相互作用的影響來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。能與人鈣結(jié)合S100蛋白21結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時(shí)，一般應(yīng)對(duì)人鈣結(jié)合S100蛋白21分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明提供了用多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細(xì)胞作為抗原以生產(chǎn)抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還提供了針對(duì)人鈣結(jié)合S100蛋白21抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人鈣結(jié)合S100蛋白21直接注射免疫動(dòng)物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。制備人鈣結(jié)合S100蛋白21的單克隆抗體的技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison et alPNAS，1985，816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.PatNo.4946778)也可用于生產(chǎn)抗人鈣結(jié)合S100蛋白21的單鏈抗體。
抗人鈣結(jié)合S100蛋白21的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人鈣結(jié)合S100蛋白21。
與人鈣結(jié)合S100蛋白21結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
抗體還可用于設(shè)計(jì)針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人鈣結(jié)合S100蛋白21高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人鈣結(jié)合S100蛋白21陽性的細(xì)胞。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人鈣結(jié)合S100蛋白21相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人鈣結(jié)合S100蛋白21的產(chǎn)生或活性。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人鈣結(jié)合S100蛋白21水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人鈣結(jié)合S100蛋白21水平，可以用作解釋人鈣結(jié)合S100蛋白21在各種疾病中的重要性和用于診斷人鈣結(jié)合S100蛋白21起作用的疾病。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學(xué)或酶進(jìn)行特異性切割，并進(jìn)行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進(jìn)行質(zhì)譜分析。
編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于人鈣結(jié)合S100蛋白21的無表達(dá)或異常/無活性表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計(jì)用于表達(dá)變異的人鈣結(jié)合S100蛋白21，以抑制內(nèi)源性的人鈣結(jié)合S100蛋白21活性。例如，一種變異的人鈣結(jié)合S100蛋白21可以是縮短的、缺失了信號(hào)傳導(dǎo)功能域的人鈣結(jié)合S100蛋白21，雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏信號(hào)傳導(dǎo)活性。因此重組的基因治療載體可用于治療人鈣結(jié)合S100蛋白21表達(dá)或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸可包裝到脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
抑制{多肽名稱｝mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸可用于與人鈣結(jié)合S100蛋白21的相關(guān)疾病的診斷。編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸可用于檢測(cè)人鈣結(jié)合S100蛋白21的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下人鈣結(jié)合S100蛋白21的異常表達(dá)。如編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本進(jìn)行雜交以判斷人鈣結(jié)合S100蛋白21的表達(dá)狀況。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用人鈣結(jié)合S100蛋白21特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)人鈣結(jié)合S100蛋白21的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)人鈣結(jié)合S100蛋白21基因的突變也可用于診斷人鈣結(jié)合S100蛋白21相關(guān)的疾病。人鈣結(jié)合S100蛋白21突變的形式包括與正常野生型人鈣結(jié)合S100蛋白21 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列會(huì)特異性地針對(duì)某條人染色體具體位置并且可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點(diǎn)?，F(xiàn)在，只有很少的基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記物可用于標(biāo)記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，為了將這些序列與疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡(jiǎn)而言之，根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
體細(xì)胞雜合細(xì)胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實(shí)現(xiàn)亞定位。可用于染色體定位的其它類似策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流式分選的染色體預(yù)篩選和雜交預(yù)選，從而構(gòu)建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個(gè)步驟中精確地進(jìn)行染色體定位。此技術(shù)的綜述，參見Verma等，HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，NewYork(1988)。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
接著，需要測(cè)定患病和未患病個(gè)體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個(gè)體中觀察到某突變，而該突變?cè)谌魏握€(gè)體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個(gè)體，通常涉及首先尋找染色體中結(jié)構(gòu)的變化，如從染色體水平可見的或用基于cDNA序列的PCR可檢測(cè)的缺失或易位。根據(jù)目前的物理作圖和基因定位技術(shù)的分辨能力，被精確定位至與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA，可以是50至500個(gè)潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb對(duì)應(yīng)于一個(gè)基因)。
可以將本發(fā)明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動(dòng)劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機(jī)構(gòu)所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機(jī)構(gòu)許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。人鈣結(jié)合S100蛋白21以有效地治療和/或預(yù)防具體的適應(yīng)癥的量來給藥。施用于患者的人鈣結(jié)合S100蛋白21的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1是本發(fā)明人鈣結(jié)合S100蛋白21和同源蛋白神經(jīng)鈣蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人鈣結(jié)合S100蛋白21，下方序列是同源蛋白神經(jīng)鈣蛋白。相同氨基酸在兩個(gè)序列間用單字符氨基酸表示。由圖1可見，其相同性與相似形均為192/193(99％)。
圖2為分離的人鈣結(jié)合S100蛋白21的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。2lkDa為蛋白質(zhì)的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如Sambrook等人所著，[分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)]中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人鈣結(jié)合S100蛋白21的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNAIsolation Kit(Qiegene公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A) mRNA。2ugpoly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化DH5α，細(xì)菌形成cDNA文庫。用Dye terminate cyclereaction sequencing Kit(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動(dòng)測(cè)序儀(Perkin-Elmer公司)測(cè)定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測(cè)定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genebank)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)克隆0589的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對(duì)該克隆所含的插入cDNA片段進(jìn)行雙向測(cè)定。結(jié)果表明，0589克隆所含的全長cDNA為3507bp(如Seq ID NO1所示)，從第365bp至946bp有一個(gè)193bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個(gè)新的蛋白質(zhì)(如Seq ID NO2所示)。我們將此克隆命名為pBS-0589，編碼的蛋白質(zhì)命名為人鈣結(jié)合S100蛋白21。
實(shí)施例2cDNA克隆的同源檢索將本發(fā)明的人鈣結(jié)合S100蛋白21的序列及其編碼的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在Genbank、Swissport等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源檢索。與本發(fā)明的人鈣結(jié)合S100蛋白21同源性最高的基因是一種已知的同源蛋白神經(jīng)鈣蛋白，其編碼的蛋白在Genbank的準(zhǔn)入號(hào)為D10884。蛋白質(zhì)同源結(jié)果示于圖1，兩者高度同源，其相同性為99％；相似性為99％。
實(shí)施例3用RT-PCR方法克隆編碼人鈣結(jié)合S100蛋白21的基因用胎腦細(xì)胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Primer15’-ACGGCTGCGAGAAGACGAAGCTT-3’(SEQ ID NO3)Primer25’-AAGCCACTTTATTCCAGTCCCTT-3’(SEQ ID NO4)Primer1為位于SEQ ID NO1的5’端的第1bp開始的正向序列；Primer2為SEQ ID NO1的中的3’端反向序列。
擴(kuò)增反應(yīng)的條件在50μl的反應(yīng)體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應(yīng)25個(gè)周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR時(shí)同時(shí)設(shè)β-actin為陽性對(duì)照和模板空白為陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產(chǎn)品)。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與SEQID NO1所示的1-3507bp完全相同。
實(shí)施例4Northern印跡法分析人鈣結(jié)合S100蛋白21基因的表達(dá)用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對(duì)組織進(jìn)行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合后離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-SmM乙酸鈉-1mMEDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用α-32p dATP通過隨機(jī)引物法制備32P-標(biāo)記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴(kuò)增的人鈣結(jié)合S100蛋白21編碼區(qū)序列(365bp至946bp)。將32p-標(biāo)記的探針(約2×106cpm/ml)與轉(zhuǎn)移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進(jìn)行分析和定量。
實(shí)施例5重組人鈣結(jié)合S100蛋白21的體外表達(dá)、分離和純化根據(jù)SEQ ID NO1和圖1所示的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性擴(kuò)增引物，序列如下Primer35’-CCCCATATGATGGGGAAACAGAACAGCAAGCTG-3’(Seq ID No5)Primer45’-CCCGGATCCAATTCGATTGGTGGGCGCAGGGCT-3’(Seq ID No6)此兩段引物的5’端分別含有NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)相應(yīng)于表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28b(+)(Novagen公司產(chǎn)品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以含有全長目的基因的pBS-0589質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為總體積50μl中含pBS-0589質(zhì)粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃ 20s，60℃ 30s，68℃ 2min，共25個(gè)循環(huán)。用NdeⅠ和BamHⅠ分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28(+)進(jìn)行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細(xì)菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進(jìn)行測(cè)序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-0589)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產(chǎn)品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-0589)在37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個(gè)組氨酸(6His-Tag)結(jié)合的親和層析柱His.BindQuick Cartridge(Novagen公司產(chǎn)品)進(jìn)行層析，得到了純化的目的蛋白人鈣結(jié)合S100蛋白21。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在21kDa處得到一單一的條帶(圖2)。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進(jìn)行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個(gè)氨基酸與SEQ ID NO2所示的N-端15個(gè)氨基酸殘基完全相同。
實(shí)施例6抗人鈣結(jié)合S100蛋白21抗體的產(chǎn)生用多肽合成儀(PE公司產(chǎn)品)合成下述人鈣結(jié)合S100蛋白21特異性的多肽NH2-Met-Gly-Lys-Gln-Asn-Ser-Lys-Leu-Arg-Pro-Glu-Val-Met-Gln-Asp-COOH(SEQ ID NO7)。將該多肽分別與血藍(lán)蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復(fù)合，方法參見Avrameas，et al.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血藍(lán)蛋白多肽復(fù)合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍(lán)蛋白多肽復(fù)合物加不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml牛血清白蛋白多肽復(fù)合物包被的滴定板做ELISA測(cè)定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與人鈣結(jié)合S100蛋白21結(jié)合。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱人鈣結(jié)合S100蛋白21及其編碼序列(ⅲ)序列數(shù)目7(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度3507bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11 ACGGCTGCGAGAAGACGAAGCTTAGGGACGGCTGCGAGAAGACGAAGCTTAGGGACGGCT61 GCGAGAAGACGAAGCTTAGGGACGGCTGCGAGAAGACGAAGCTTAGGGACGGCTGCGAGA121 AGACGAAGCTTAGGGACGGCTGCGAGAAGACGAAGCTTAGGGACGGCTGCGAGAAGACGA181 AGCTTAGGGACGGCTGCGAGAAGACGAAGCTTAGGGGACAGACGCTGGGAGCGGCCGAGG241 CGAGTGATTTCTTCTGACTTGAGCCTGCAGTGTGCTGTGAGAGATCTACCACTAGATTAT301 CTCAACTTTGGTCTCCTGGGACCACTCGTTGCTGACAGTCAGAAACTGAATTCTTGCCGC361 CAGGATGGGGAAACAGAACAGCAAGCTGCGCCCGGAGGTCATGCAGGACTTGCTGGAAAG421 CACAGACTTTACAGAGCATGAGATCCAGGAATGGTATAAAGGCTTCTTGAGAGACTGCCC481 CAGTGGACATTTGTCAATGGAAGAGTTTAAGAAAATATATGGGAACTTTTTCCCTTATGG541 GGATGCTTCCAAATTTGCAGAGCATGTCTTCCGCACCTTCGATGCAAATGGAGATGGGAC601 AATAGACTTTAGAGAATTCATCATCGCCTTGAGTGTAACTTCGAGGGGGAAGCTGGAGCA661 GAAGCTGAAATGGGCCTTCAGCATGTACGACCTGGACGGAAATGGCTATATCAGCAAGGC721 AGAGATGCTAGAGATCGTGCAGGCAATCTATAAGATGGCTTCCTCTGTAATGAAAATGCC781 TGAAGATGAGTCAACCCCAGAGAAAAGAACAGAAAAGATCTTCCGCCAGATGGACACCAA841 TAGAGACGGAAAACTCTCCCTGGAAGAGTTCATCCGAGGAGCCAAAAGCGACCCGTCCAT901 TGTGCGCCTCCTGCAGTGCGACCCGAGCAGTGCCGGCCAGTTCTGAGCCCTGCGCCCACC961 AATCGAATTGTAGAGCTGCTTGTGTTCCCTTTTGATTCTTCTTTTTAACAATTTTTTTTT1021 TTTGCCAAACAATATCAATGGTGATGCCGTCCCCTGTGCGGTCTGATGCGCCTTCCTCCG1081 TGACGCCTTCAGCTTCTTTTGTCGTGGATGCTTCGTGGGAATGCCCAGAGCCCCAGTGTG1141 CTTGTGGAGAGCATGGACAGACTTCGTGGTGTTCATTGTTTGATGATTTTTAATCGTTAC1201 TATTATTTTTTTTTATTCTAATGTCTCTGTTCTAAAACGTAAGACTCGGGGGTTGGGGCA1261 AAAGAAGGGAAACCCATCCAGTCCTGTGATTCTATTGCAAGCTTCAAGGGGCTTTTGTTT1321 GAAAGACAAAACTCCCCACCTGAATCTGTTGTCACACGTGCCGTAGGGGTGATGGATGGC1381 ACCGGATGCTGGATTCCCCAAGAACAAGTTACCCTCTGGGGTGAGGCTATTCCAGCGAGC1441 TGGGACATTTCCCCATGGGGGCCCACTCCCCTCTCTTCCCCAGCAGGCTGTAGTTTCTAA1501 GCTGTGAACATTTCAAGATAAATTAACAGAGGAGAGGAAAAAGATGGCTCAGCTATTTTT1561 TCACAGGTTTACACTAGTTGAGCTAATATGCGTGTCTTTGGAAATTAAACACAAATGGTA1621 ACATATTCCAAAACCAGACCCATCTTGTTGCCTATTGTGATAAAATAAAAAGACGGCTGT1681 ATATAACATATTGGGTAATGCAGACCAAATTAAGTGTTTTGCCTTGTTTAAATGAAATGC1741 ATGTTTAGTGAGCACTAATACAATCTTATTCCAGAAGACTGTTTTTAGTAGCTTATTGTG1801 AAGTAAGACAACTATAATGAATGTCTGTCTTGTTTGGAAGTCATATCTGTCTTTGCACAA1861 ATGTACCAATCGACAAGTATATTTTATATATTCCATAAAAATACAAAGTAACCCTGACTA1921 GGGCCCAACTTTAATTTTGAATGCATTTCCAGAGTGGCCATGCCTAGAGGGCAGATGCAG1981 AGCAGGTGGTAGTGGGACAGGACAATTGGAGCACAGGAATGTTAACATGTATGACAGGGG2041 ACCAGTAGGGTGGTTTCCCTCTCAGGCCCAGCAGCCCATTGACAGCATTAGACTGGCGGC2101 ATGGTGCTTTTCTGAGCAGATCAATACTCTGCAGACTCGAAAAAACATCACATACATTCT2161 TGGAACTTCCCAGTGGTTTAATCTATGTGCATGGTTAGGGAGCCAGGTCTGGAATATTCA2221 GTTTCCCTGCCCCTGTTAAAGAATCAGAGGTTGGGCAGTCATCAAATTCATCATAAAGAC2281 ATGGGCAAGTGTGTCTGTGGTTTCCAAGGCCCCCCTATGGAGAATCCAAAAGTATTTTCC2341 ATTGCCGTGCTCTTTGAATGCAGACTTCTATTTCCAGAAGTGACAGCACAAGTCTGAGTT2401 GCTGTTTGGTCTGGTGACCTCAGACACACTAATTTGAATTGAAAGCTAAGAGTAAAAATT2461 TGCTGGTTACAGGCGAGTCATACTCTTGCAAGTAGTTAGCAAAGGGAGGCCCAAATTCTC2521 AAGGTTGTTGATGGGGAACTTGCCACTAAGAGAAGGCAGAGAGGTCCCTAGTGGGTATAT2581 TTGCTGCCAAGCCACTTGCCAAAGAAGAGGAACCACAGAAAGAGAGACATCATGACCAGG2641 AGAAAAATGTGACTAGACATGCTAACCTCCAGGTTTTTATATATGACTTGAGTCTGCTGT2701 AATTGGCAGCAGAAATCCAAATTTGTATGGTAGACCAAAAAGAACCAAATCCATAGGGTG2761 AAATTTTGAGACCTAGACTCTGTAAAAATAATCCTAGTCTTCCTCCAGGGGTCAGTTCCT2821 CACAGTGGTTCTGTACCAAAACTTGCCAAATTCCTCCATGGCCAAGTGTTAAAATCTGTG2881 TTTGGAAAATAGCGAATTAACCTAAGACACAGAAGGCAGACTGGGTGAGGAGACCTAGCA2941 TGCCCTATTGGCAGTGCTCAGGAGCTGCATCCCACTTTTCCCTGCTCTGAATCGAAGTCC3001 TAGTTCCTTCCTTTGATTCTCCTTTGGTAGGTGGAATCAGTTAATGTTTTGAGAAACCTG3061 CCTGGGCTCTGCCCTTAGTCATGACATCTCGCTGAGCCAGACCCACTCTGTTCCTTGGAA3121 CCTAGAGCTGGAGTGAGGAGTAGAGGTCTCCGGCTATTCCAGAAAGAAAAGTGAGCCACA3181 TGCAGGCTGATGAATGCCGACACTTCCAGAATGTATAGAAATAGTCCCTGTCCTGGCCTG3241 CCACTGACCCTGTCTGTATTTTCTCGGAGGTTGTTTTTCTCCTTCTCCTTCCCAGGAAGG3301 TCTTTGTATGTCGAATCCAGTGCACTCAAGTTTGGCCAAGGGACTCCACAGCACCCAGAA3361 GACTGCATGCCTCAAGGTTTATGTCACTCCTCTGCTGGGCTGTTCATTGTCATTGCTGTG3421 TTCAGGGACCTTTGGAAATAAAACCTGTTCTGTCCCAAATAAAACCAGCCTGTGATGTTC3481 AAGGGACTGGAATAAAGTGGCTTACGA(3)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度193個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21 Met Gly Lys Gln Asn Ser Lys Leu Arg Pro Glu Val Met Gln Asp16 Leu Leu Glu Ser Thr Asp Phe Thr Glu His Glu Ile Gln Glu Trp31 Tyr Lys Gly Phe Leu Arg Asp Cys Pro Ser Gly His Leu Ser Met46 Glu Glu Phe Lys Lys Ile Tyr Gly Asn Phe Phe Pro Tyr Gly Asp61 Ala Ser Lys Phe Ala Glu His Val Phe Arg Thr Phe Asp Ala Asn76 Gly Asp Gly Thr Ile Asp Phe Arg Glu Phe Ile Ile Ala Leu Ser91 Val Thr Ser Arg Gly Lys Leu Glu Gln Lys Leu Lys Trp Ala Phe106 Ser Met Tyr Asp Leu Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Lys Ala Glu121 Met Leu Glu Ile Val Gln Ala Ile Tyr Lys Met Ala Ser Ser Val136 Met Lys Met Pro Glu Asp Glu Ser Thr Pro Glu Lys Arg Thr Glu151 Lys Ile Phe Arg Gln Met Asp Thr Asn Arg Asp Gly Lys Leu Ser166 Leu Glu Glu Phe Ile Arg Gly Ala Lys Ser Asp Pro Ser Ile Val181 Arg Leu Leu Gln Cys Asp Pro Ser Ser Ala Gly Gln Phe(4)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3ACGGCTGCGAGAAGACGAAGCTT 23(5)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4AAGCCACTTTATTCCAGTCCCTT 23(6)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5CCCCATATGATGGGGAAACAGAACAGCAAGCTG33(7)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6CCCGGATCCAATTCGATTGGTGGGCGCAGGGCT 33(8)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7Met-Gly-Lys-Gln-Asn-Ser-Lys-Leu-Arg-Pro-Glu-Val-Met-Gln-Asp 1權(quán)利要求
1．一種分離的多肽-人鈣結(jié)合S100蛋白21，其特征在于它包含有SEQID NO2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2．如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
3．如權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
4．一種分離的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a)編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；或(c)與(a)或(b)有至少99％相同性的多核苷酸。
5．如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6．如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有SEQ ID NO1中365-946位的序列或SEQ ID NO1中1-3507位的序列。
7．一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特征在于它是由權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體構(gòu)建而成的重組載體。
8．一種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細(xì)胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細(xì)胞(a)用權(quán)利要求7所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；或(b)用權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
9．一種具有人鈣結(jié)合S100蛋白21活性的多肽的制備方法，其特征在于所述方法包括(a)在表達(dá)人鈣結(jié)合S100蛋白21條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的工程化宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人鈣結(jié)合S100蛋白21活性的多肽。
10．一種能與多肽結(jié)合的抗體，其特征在于所述抗體是能與人鈣結(jié)合S100蛋白21特異性結(jié)合的抗體。
11．一類模擬或調(diào)節(jié)多肽活性或表達(dá)的化合物，其特征在于它們是模擬、促進(jìn)、拮抗或抑制人鈣結(jié)合S100蛋白21的活性的化合物。
12．如權(quán)利要求11所述的化合物，其特征在于它是SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列或其片段的反義序列。
13．一種權(quán)利要求11所述化合物的應(yīng)用，其特征在于所述化合物用于調(diào)節(jié)人鈣結(jié)合S100蛋白21在體內(nèi)、體外活性的方法。
14．一種檢測(cè)與權(quán)利要求1-3中的任一權(quán)利要求所述多肽相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，其特征在于其包括檢測(cè)所述多肽的表達(dá)量，或者檢測(cè)所述多肽的活性，或者檢測(cè)多核苷酸中引起所述多肽表達(dá)量或活性異常的核苷酸變異。
15．如權(quán)利要求1-3中的任一權(quán)利要求所述多肽的應(yīng)用，其特征在于它應(yīng)用于篩選人鈣結(jié)合S100蛋白21的模擬物、激動(dòng)劑，拮抗劑或抑制劑；或者用于肽指紋圖譜鑒定。
16．如權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述的核酸分子的應(yīng)用，其特征在于它作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
17．如權(quán)利要求1-6及11中的任一權(quán)利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的應(yīng)用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或其模擬物、激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑以安全有效劑量與藥學(xué)上可接受的載體組成作為診斷或治療與人鈣結(jié)合S100蛋白21異常相關(guān)的疾病的藥物組合物。
18．權(quán)利要求1-6及11中的任一權(quán)利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的應(yīng)用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或化合物制備用于治療如惡性腫瘤、血液病、HIV感染和免疫性疾病和各類炎癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的多肽——人鈣結(jié)合S100蛋白21,編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開了此多肽用于治療多種疾病的方法,如惡性腫瘤,血液病,HIV感染和免疫性疾病和各類炎癥等。本發(fā)明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開了編碼這種新的人鈣結(jié)合S100蛋白21的多核苷酸的用途。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1297922SQ9912413
公開日2001年6月6日 申請(qǐng)日期1999年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月26日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請(qǐng)人:上海博道基因技術(shù)有限公司