亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

新型g蛋白偶聯(lián)受體的制作方法

文檔序號(hào):3550930閱讀:340來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):新型g蛋白偶聯(lián)受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物受體以及可以由這類(lèi)受體制得的多種用途的普通領(lǐng)域。更具體而言,本發(fā)明涉及編碼新型G蛋白偶聯(lián)受體的核酸以及受體本身。
背景和現(xiàn)有技術(shù)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)構(gòu)成了一個(gè)具有共同的結(jié)構(gòu)排列的蛋白家族,其特征為細(xì)胞外N末端、可能構(gòu)成跨膜結(jié)構(gòu)域的七個(gè)疏水α螺旋以及細(xì)胞內(nèi)C末端結(jié)構(gòu)域。GPCRs和許多種配體結(jié)合,其通過(guò)激活轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)(Caron,等人,Rec.Prog.Horm.Res.48∶277-290(1993);Freedman等人,Rec.Prog.Horm.Res.51∶319-353(1996))。
目前為止已經(jīng)克隆了超過(guò)300種GPCRs,一般認(rèn)為存在大約超過(guò)1000種這樣的受體。從機(jī)制上說(shuō),所有臨床相關(guān)的藥物中大約有50-60%都通過(guò)調(diào)節(jié)各種GPCRs的功能而發(fā)揮作用(Cudermann,等人,J.Mol.Med.73∶51-63(1995))。特別受關(guān)注的是位于背根神經(jīng)節(jié)中的受體。這個(gè)區(qū)域的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到參與疼痛的傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)以及感覺(jué)的主要或傳入感覺(jué)神經(jīng)元的密集支配。因此,來(lái)自這個(gè)區(qū)域的受體可被用于鑒定麻醉和鎮(zhèn)痛的新藥劑的測(cè)定中。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)了一種新型G蛋白偶聯(lián)受體,該受體在結(jié)構(gòu)上與先前報(bào)道的受體截然不同并且優(yōu)先在背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)。從大鼠中已經(jīng)分離和測(cè)序了1種背根受體(DRR),從人中分離和測(cè)序了6種。大鼠的受體命名為rDRR-1,其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。人的受體命名為hDRR-1(SEQ ID NO3);
hDRR-2(SEQ ID NO5);hDRR-3(SEQ ID NO7);hDRR-4(SEQ ID NO9);hDRR-5(SEQ ID NO11);和hDRR-6(SEQ ID NO13)。
除非特別說(shuō)明,如本文所用的術(shù)語(yǔ)“DRR”是指來(lái)自人和大鼠兩者的所有受體。
本發(fā)明的第一方面涉及除了以天然狀態(tài)存在的以外的蛋白,上述蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO1,3,5,7,9,11或13中所示的大鼠或人DRR組成的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“在功能上由…組成”是指包括其序列已經(jīng)進(jìn)行了添加、缺失或取代而基本上沒(méi)有改變受體的功能特征的任何受體蛋白。因此,本發(fā)明包含具有與序列表中所顯示完全相同的氨基酸序列的蛋白,以及基本上沒(méi)有差別的蛋白,這正如它們保留了DRR受體的基本的、定性的結(jié)合特征所證實(shí)的。本發(fā)明進(jìn)而包含基本上由DRR氨基酸序列組成的基本上純的蛋白,和DRR特異性結(jié)合的抗體(即對(duì)DRR的親和性比對(duì)其它任何以天然狀態(tài)存在的非DRR蛋白的親和性大至少100倍),以及通過(guò)一種方法制備的抗體,該方法包括將這種蛋白的藥物上可接受的制劑注射到能產(chǎn)生所述抗體的動(dòng)物中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,通過(guò)將受體的藥物可接受的制劑注射到小鼠中、然后將小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合,從而生產(chǎn)出人或大鼠DRR的單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及一種基本上純的多核苷酸,該多核苷酸編碼包括在功能上由大鼠DRR序列(如SEQ ID NO1所示)或人DRR序列(如SEQ IDNO3,5,7,9,11或13所示)組成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的這一方面包含編碼基本上由序列表中所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表達(dá)載體和用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。還包括通過(guò)這種方式制備的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的重組的大鼠和人DRR蛋白。
優(yōu)選地,編碼大鼠DRR的多核苷酸具有SEQ ID NO2中所示的核苷酸序列,而編碼人DRR的多核苷酸具有SEQ ID NO3,5,7,9,11或13中所示的核苷酸序列。含有這些特定多核苷酸的用于表達(dá)DRR的載體和宿主細(xì)胞也是優(yōu)選的。
另一方面,本發(fā)明涉及一種方法,該方法用于測(cè)定待測(cè)化合物和大鼠或人DRR結(jié)合的能力。該方法通過(guò)將DRR來(lái)源和已知結(jié)合受體的配體以及和待測(cè)化合物培養(yǎng)而進(jìn)行。上述DRR來(lái)源應(yīng)該基本上不含其它類(lèi)型的G蛋白偶聯(lián)受體,即存在的85%以上的所述受體都應(yīng)該是相應(yīng)于DRR的。完成培養(yǎng)后,通過(guò)結(jié)合配體已被置換的程度來(lái)確定測(cè)試化合物和DRR結(jié)合的能力。大鼠DRR應(yīng)優(yōu)選地相應(yīng)于SEQ ID NO1中所示的rDRR-1。人的受體應(yīng)優(yōu)選地為hDRR-1(SEQ ID NO3)、hDRR-2(SEQID NO5)、hDRR-3(SEQ ID NO7)、hDRR-4(SEQ ID NO9)、hDRR-5(SEQID NO11)或hDRR-6(SEQ ID NO13)。可以將表達(dá)重組DRR的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于所述的測(cè)定中,或從所述的細(xì)胞制備出膜并加以使用。盡管不是必需的,該測(cè)定可伴隨檢測(cè)對(duì)第二信使途徑(如腺苷酸環(huán)化酶途徑)的激活作用。這將有助于確定一種和DRR結(jié)合的化合物是否起到了激動(dòng)劑或拮抗劑的作用。
本文公開(kāi)的一種用于確定待測(cè)化合物是否是任何一種DRR的激動(dòng)劑的替代方法為采用細(xì)胞信號(hào)測(cè)定,例如測(cè)量細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶活性或細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的測(cè)定。將待測(cè)化合物和表達(dá)DRR,但基本上不含其它G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞培養(yǎng),所述細(xì)胞通常為用編碼DRR的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。當(dāng)與未接觸待測(cè)化合物的對(duì)照轉(zhuǎn)染子相比時(shí),作為激動(dòng)通過(guò)在從細(xì)胞信號(hào)測(cè)定獲得的結(jié)果中導(dǎo)致了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著變化來(lái)鑒定作為激動(dòng)劑的待測(cè)化合物。例如,接觸待測(cè)化合物的細(xì)胞可能表現(xiàn)為腺苷酸環(huán)化酶活性或細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的顯著增高。
本發(fā)明還包含一種方法,該方法用于檢測(cè)一種待測(cè)化合物是否是DRR的拮抗劑,這依賴于當(dāng)G蛋白偶聯(lián)受體大量表達(dá)時(shí)出現(xiàn)的所述受體已知的激活作用。該方法要求編碼該受體的DNA被摻入到表達(dá)載體中,從而使得它和啟動(dòng)子可操作地連接,然后將該載體用于轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗?。為了產(chǎn)生足夠的受體以產(chǎn)生組成型的受體激活(即在沒(méi)有天然配體存在的情況下激活),能大量產(chǎn)生蛋白的表達(dá)系統(tǒng)是優(yōu)選的,例如,DRR DNA可被可操作地連接到一個(gè)CMV啟動(dòng)子上并在COS或HEK293細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)染后選出具有激活受體的細(xì)胞,上述細(xì)胞的選擇根據(jù)的是其在細(xì)胞信號(hào)測(cè)定中表現(xiàn)出的活性比對(duì)照細(xì)胞有所增強(qiáng),對(duì)照細(xì)胞或者未被轉(zhuǎn)染或者已轉(zhuǎn)染了不能表達(dá)功能性DRR的載體。通常,細(xì)胞被選出是因?yàn)樗鼈兊募?xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶活性或細(xì)胞內(nèi)鈣濃度表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增高。將選出的細(xì)胞和待測(cè)化合物接觸并重復(fù)進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)測(cè)定以確定這是否造成了與未接觸該待測(cè)化合物的對(duì)照細(xì)胞相比活性降低。例如,和對(duì)照細(xì)胞相比,腺苷酸環(huán)化酶活性或鈣濃度的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低將意味著該測(cè)試化合物是DRR的拮抗劑。本文公開(kāi)的任何DRR都可用于這些測(cè)定。
通過(guò)將含DRR組基本上不含其它G蛋白偶聯(lián)受體的來(lái)源(例如一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)和血管緊張素Ⅱ或Ⅲ在存在或不存在待測(cè)化合物的情況下培養(yǎng),并測(cè)量對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的調(diào)節(jié)來(lái)進(jìn)行和DRR相互作用的化合物的測(cè)定。由于待測(cè)化合物導(dǎo)致的血管緊張素刺激的鈣置換的明顯增強(qiáng)或降低意味著和DRR發(fā)生的相互作用。可用于這些測(cè)定的受體包括大鼠DRR-1和人DRR-1,DRR-2,DRR-3,DRR-4,DRR-5和DRR-6。
另一方面,本發(fā)明涉及一種方法,該方法用于測(cè)定待測(cè)化合物改變大鼠或人DRR表達(dá)的能力。該方法是通過(guò)在待測(cè)化合物存在的情況下培養(yǎng)表達(dá)DRR、但基本上不含其它G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞而進(jìn)行的。然后收集細(xì)胞,并和對(duì)照細(xì)胞的表達(dá)比較DRR的表達(dá),上述對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)條件除了不含待測(cè)化合物外基本上是相同的。大鼠受體優(yōu)選為rDRR-1,人受體可以是DRR-1,DRR-2,DRR-3,DRR-4,DRR-5或DRR-6。
一種優(yōu)選的待測(cè)化合物為長(zhǎng)度至少為15個(gè)核苷酸的寡核苷酸,該寡核苷酸包含和用于檢測(cè)的DRR的序列互補(bǔ)的序列。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.rDRR-1的核苷酸序列編碼rDRR-1的克隆3B-32是采用啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)者步行試劑盒從大鼠基因組文庫(kù)中分離出來(lái)的(參見(jiàn)克隆技術(shù)方法.Clontech)。
將克隆的基因保藏在國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)Deutsche Sammlung VonMikroorganismen Und Zellkulturen GmbH中,地址Mascheroder Weg1 B.D-3300 Braunschweig,德國(guó)。保藏時(shí)間為1997年11月27日,提供的入冊(cè)登記號(hào)為DSM 11877。
圖2.推定的DRR-1的氨基酸序列克隆3B-32編碼337個(gè)氨基酸的蛋白。該氨基酸序列從核苷酸序列中的第一個(gè)ATG開(kāi)始。
圖3.克隆3B-32(rDRR-1)的推定的氨基酸序列和它的5個(gè)同源性最接近的序列的序列對(duì)比。加有方框和陰影的殘基為和rDRR-1序列相同的殘基。
圖4.人DRR同系物的氨基酸的序列對(duì)比對(duì)比了rDRR-1的所有6種人的同系物(hDRR-1;hDRR-2;hDRR-3;hDRR-4;hDRR-5和hDRR-6)的氨基酸序列。和克隆36(HUMAN36.PR)不同的氨基酸殘基用方框表示。這些序列間的同一性程度在77%到接近100%之間。
定義以下的說(shuō)明中使用了許多關(guān)于重組DNA技術(shù)的術(shù)語(yǔ)。為了提供清楚和一致地理解說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū),包括賦予這些術(shù)語(yǔ)的范圍,我們提供了以下的定義。
克隆載體能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒或噬茵體DNA或其它DNA的序列,其特征在于具有一個(gè)或少量的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。外源DNA片段可以在這些位點(diǎn)處被剪接到載體上,從而使該片段復(fù)制和克隆。上述載體可含有一個(gè)適用于鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記。例如,標(biāo)記可提供四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。
表達(dá)載體一種類(lèi)似于克隆載體的載體,但轉(zhuǎn)化到宿主后它能誘導(dǎo)已克隆到其中的DNA的表達(dá)??寺〉腄NA通常被置于某些調(diào)節(jié)序列(如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)的控制之下(即可操作地連接到調(diào)節(jié)序列上)。
基本上純的正如本文所使用的那樣,“基本上純的”意指合乎需要的產(chǎn)品基本上不含有污染的細(xì)胞成分。一種“基本上純的”蛋白或核酸通常包括樣品的至少85%,更大的百分比是優(yōu)選的。污染物可能包括蛋白、糖或脂類(lèi)。一種測(cè)定蛋白或核酸純度的方法是通過(guò)在一種基質(zhì)上(如聚丙烯酰胺或瓊脂糖上)電泳制劑。通過(guò)染色后出現(xiàn)的單一條帶來(lái)驗(yàn)證純度。其它評(píng)價(jià)純度的方法包括層析和分析離心。
宿主任何作為可復(fù)制的表達(dá)載體或克隆載體的受體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞都是該載體的“宿主”。這一術(shù)語(yǔ)包括已被改造在其染色體上或其基因組中摻入了合乎需要的基因的原核或真核細(xì)胞。可作為宿主的細(xì)胞的例子以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化的技術(shù)在本領(lǐng)域中是廣為人知的(參見(jiàn),例如Sambrook等人?!斗肿涌寺?shí)驗(yàn)指南》第2版,冷泉港(1989))。
啟動(dòng)子通常發(fā)現(xiàn)位于基因5’區(qū)并靠近起始密碼子的DNA序列。在啟動(dòng)子處開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的,那么轉(zhuǎn)錄的速度可由于誘導(dǎo)劑而增加。
互補(bǔ)的核苷酸序列本文所用的互補(bǔ)的核苷酸序列是指可通過(guò)正常的堿基配對(duì)產(chǎn)生的序列。例如核苷酸序列5-AGAC-3的互補(bǔ)序列為5-GTCT-3。
表達(dá)表達(dá)是從DNA產(chǎn)生多肽的過(guò)程。該過(guò)程涉及將基因轉(zhuǎn)錄成mRNA并將該mRNA翻譯成多肽。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及DRR受體蛋白,編碼該受體的遺傳序列,用于檢測(cè)化合物和DRR受體結(jié)合的方法以及用于檢測(cè)化合物改變DRR表達(dá)的能力的方法。上述受體及其核酸是由它們的結(jié)構(gòu)定義的(如圖1,2和4;以及SEQ ID No1-14所示)。
可以理解本發(fā)明不僅包括和圖中以及序列表中所示的那些相同的序列,還包括基本上相同的序列以及其它方面基本相同并導(dǎo)致受體保留了DRR的基本結(jié)合特性的序列。例如,眾所周知的是如定點(diǎn)誘變這樣的技術(shù)可以用于在蛋白的結(jié)構(gòu)中引入變化。通過(guò)這種或一些類(lèi)似的方法引入的DRR蛋白的變化包括在本發(fā)明之內(nèi),如果得到的受體保留了未改變的DRR基本的定性的結(jié)合特性的話。因此,本發(fā)明涉及一些蛋白,上述蛋白包含在功能上由SEQ ID NO1(大鼠)和SEQ ID NO3,5,7,9,11和14(人)的序列組成的氨基酸序列。
I.編碼DRR的核酸序列編碼DRR的DNA序列絕對(duì)地或至少高度優(yōu)先地在背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá),這些神經(jīng)節(jié)可用作分離編碼該受體的核酸的來(lái)源。此外,表達(dá)大鼠或人DRR的細(xì)胞和細(xì)胞系也可用作核酸的來(lái)源。這些或者可以是未轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)的細(xì)胞,或者可以是具體地改造以表達(dá)重組DRR的細(xì)胞系。
在所有的情況下都是從背根神經(jīng)節(jié)中分離poly A+mRNA的、并將其反轉(zhuǎn)錄和克隆。然后可以采用源自所附序列表中SEQ ID NO2,4,6,8,10,12或14中所示序列的探針來(lái)篩選這樣形成的cDNA文庫(kù),探針的來(lái)源根據(jù)所要分離的具體DRR而定。探針在長(zhǎng)度上通常應(yīng)當(dāng)至少具有14個(gè)堿基,并且應(yīng)源自DRR序列上保守性很差的一部分(參見(jiàn)圖3和圖4)。也可利用含有一個(gè)DRR基因的基因組文庫(kù)或所述基因的一部分進(jìn)行篩選,所述的基因或部分在其它DRR基因的分離中用作探針。例如,可以標(biāo)記全長(zhǎng)的rDRR-1并用于篩選人的基因組文庫(kù)以分離hDRR-1,hDRR-2等等(參見(jiàn)實(shí)施例部分)。
另一方面,通過(guò)利用位于基因任何一端的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可以將基因組DNA文庫(kù)用來(lái)分離DRR基因(對(duì)步驟的描述參見(jiàn)實(shí)施例部分)。例如,可用以下引物擴(kuò)增人的基因組DNA5’-GCAAGCTTTCTGAGCATGGATCCAACCGTC,和5’-CCCTCAGATCTCCAATTTGCTTCCCGACAG。
這可用于擴(kuò)增所有的六種在本文中鑒定為hDRR-1,hDRR-2,hDRR-3,hDRR-4,hDRR-5和hDRR-6的人DRR基因。然后這些基因可被克隆到適當(dāng)?shù)妮d體(如pGEM-T(Promega))中,以進(jìn)行DNA序列的分析。
Ⅱ抗大鼠和人DRR的抗體本發(fā)明還涉及特異性地結(jié)合大鼠或人的DRR的抗體以及用于生產(chǎn)所述抗體的方法。把“特異性地結(jié)合DRR的”抗體定義為那些對(duì)DRR的親和性比對(duì)任何其它蛋白的親和性大至少一百倍的抗體。用于生產(chǎn)所述抗體的方法可能包括將DRR蛋白自身注射到一種適當(dāng)?shù)膭?dòng)物中,或優(yōu)選地注射相應(yīng)于DRR的不同區(qū)域制得的短肽。上述肽的長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)至少為5個(gè)氨基酸,并且應(yīng)該選自被認(rèn)為是對(duì)靶向的特定DRR蛋白特有的區(qū)域。因此,在選擇產(chǎn)生抗體的肽時(shí),通常應(yīng)避開(kāi)高度保守的跨膜區(qū)域。制備和檢測(cè)抗體的方法對(duì)于本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員是眾所周知的,這可以由如下的標(biāo)準(zhǔn)參考著作來(lái)證實(shí)(Harlow等人.《抗體實(shí)驗(yàn)指南》.冷泉港實(shí)驗(yàn)室,N.Y.(1988);Klein.《免疫學(xué)自身與非自身辨別的科學(xué)》(1982);Kennett,等人,《單克隆抗體與雜交痛生物學(xué)分析的新方面》(1980);以及Campbel.“單克隆抗體技術(shù)”在《生物化學(xué)與分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》中,(1984))。
本文所用的“抗體”意指包括完整的分子以及保留了結(jié)合抗原的能力的片段(如Fab和F(ab)2片段)。這些片段通常是通過(guò)用如木瓜蛋白酶(生產(chǎn)Fab片段)或胃蛋白酶(生產(chǎn)F(ab)2片段)這樣的酶蛋白水解切割完整的抗體來(lái)生產(chǎn)的。術(shù)語(yǔ)“抗體”還指單克隆抗體和多克隆抗體兩種。多克隆抗體源自用抗原免疫接種的動(dòng)物的血清。單克隆抗體可采用雜交瘤技術(shù)制備(Kohler,等人,《自然》256495(1975);Hammerling,等人,在《單克隆抗體與T-細(xì)胞雜交痛》中Elsevier M.Y.第563-681頁(yè)(1981))??偟膩?lái)說(shuō),這種技術(shù)涉及或者用完整的DRR或者用源自DRR的片段免疫接種動(dòng)物、通常為小鼠。提取出免疫接種的動(dòng)物的脾細(xì)胞并和適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞(如SP20細(xì)胞)融合。融合后,將得到的雜交瘤細(xì)胞選擇性地維持在HAT培養(yǎng)基中,然后通過(guò)有限稀釋進(jìn)行克隆(Wands等人.《胃腸學(xué)》80∶225-232(1981))。然后測(cè)定通過(guò)這樣的選擇得到的細(xì)胞以鑒定分泌能結(jié)合DRR的抗體的克隆。
采用多種免疫測(cè)定的任意一種,可以將本發(fā)明的抗體或抗體片段用于檢測(cè)DRR蛋白的存在。例如,上述抗體可被用于放射免疫測(cè)定或免疫定量測(cè)定(immunometric assay),也稱(chēng)為“雙位點(diǎn)”或“夾心法”檢測(cè)(參見(jiàn)Chard,T.,“放射免疫測(cè)定與有關(guān)技術(shù)的介紹,”在《生物化學(xué)與分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》中,North HollandPublishing Co.,N.Y.(1978))。在典型的免疫定量檢測(cè)中,將一定量的未標(biāo)記的抗體和固體載體結(jié)合,該載體在待測(cè)的流體(例如血液、淋巴液、細(xì)胞提取物等等)中是不溶的。在抗原和固定化的抗體首先結(jié)合后,加入一定量可檢測(cè)的標(biāo)記的二抗(可以和第一種抗體一樣,也可以不一樣)以檢測(cè)和/或定量結(jié)合的抗原(參見(jiàn)例如《放射免疫測(cè)定法》,Kirkham等人編輯,第199-206頁(yè),E&S.Livingstone,Edinburgh(1970)。這些類(lèi)型測(cè)定的多種變化在本領(lǐng)域中是已知的,并可用于檢測(cè)DRR。
大鼠或人DRR的抗體也可用于純化完整的受體或受體片段(通常參見(jiàn)Dean等人,《親和層析實(shí)踐途徑》,IRL出版社(1986))。通??贵w被固定化在層析基質(zhì)如Sepharose 4B上。然后將基質(zhì)裝到層析柱中,使含所需DRR的制劑在促進(jìn)結(jié)合的條件下(如在低鹽的條件下)通過(guò)層析柱。然后洗滌層析柱,并用促進(jìn)與抗體解離的緩沖液(例如改變了pH值或鹽濃度的緩沖液)洗脫結(jié)合的DRR??梢詫⑾疵摰腄RR轉(zhuǎn)移到選中的緩沖液中(例如通過(guò)透析),并直接儲(chǔ)存或使用。
Ⅲ.受體結(jié)合的放射性配體測(cè)定DRR核酸和重組蛋白的一個(gè)主要用途就是設(shè)計(jì)用來(lái)鑒定能結(jié)合DRR受體的物質(zhì)的測(cè)定。這類(lèi)物質(zhì)可以是模擬受體結(jié)合的正常作用的激動(dòng)劑,也可以是抑制受體結(jié)合的正常作用的拮抗劑。尤其受關(guān)注的是鑒定和DRR結(jié)合并且調(diào)節(jié)細(xì)胞中腺苷酸環(huán)化酶活性的物質(zhì)。這些物質(zhì)具有作為鎮(zhèn)痛劑或麻醉劑的潛在的治療用途。在放射性配體結(jié)合測(cè)定中,將DRR來(lái)源和已知結(jié)合受體的配體以及待測(cè)的化合物一起培養(yǎng)以測(cè)定結(jié)合活性。優(yōu)選的DRR來(lái)源是經(jīng)過(guò)了轉(zhuǎn)化以重組表達(dá)受體的細(xì)胞,優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。選中的細(xì)胞應(yīng)不表達(dá)大量的任何其它可能結(jié)合配體并影響結(jié)果的G蛋白偶聯(lián)受體。這可很容易地通過(guò)在來(lái)源于與那些重組表達(dá)DRR相同的組織或細(xì)胞系,但未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中進(jìn)行結(jié)合的測(cè)定來(lái)確定。
測(cè)定可用完整的細(xì)胞或從所述細(xì)胞制得的膜進(jìn)行(參見(jiàn)例如Wang,等人,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》90∶10230-10234(1993))。將該膜和對(duì)DRR受體特異的配體以及待測(cè)化合物的制劑一起培養(yǎng)。結(jié)合完成后,例如通過(guò)過(guò)濾將受體和含配體以及待測(cè)化合物的溶液分開(kāi),并且測(cè)定已經(jīng)發(fā)生的結(jié)合的量。優(yōu)選地,使用的配體用放射性同位素、如125Ⅰ進(jìn)行可檢測(cè)的標(biāo)記。然而,如果需要的話也可使用熒光或化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記物替代。最為常用的熒光標(biāo)記化合物為異硫氰酸熒光素,羅丹明,藻紅蛋白,藻青蛋白,異藻青蛋白,鄰苯二醛和熒光胺。有用的化學(xué)發(fā)光化合物包括魯米諾,異魯米諾,theromatic acridiniumester,咪唑,吖啶銨鹽和草酸酯。任何這些試劑都可用于生產(chǎn)適用于上述測(cè)定的配體。
非特異性結(jié)合可通過(guò)在大量過(guò)剩的未標(biāo)記配體存在的情況下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)來(lái)確定。例如,標(biāo)記的配體可以和受體以及待測(cè)化合物在過(guò)量一千倍的未標(biāo)記配體存在的情況下一起培養(yǎng)。非特異性結(jié)合應(yīng)被從總結(jié)合中減去(即沒(méi)有未標(biāo)記配體時(shí)的結(jié)合),以得到每個(gè)測(cè)試樣品的特異性結(jié)合。必要時(shí),在測(cè)定中可包括其它步驟如洗滌,攪拌,振蕩,過(guò)濾等等。通常,在分離膜結(jié)合的配體和溶液中保留的配體之后以及在定量測(cè)量結(jié)合的配體(例如通過(guò)計(jì)數(shù)放射性同位素)之前包括了洗滌的步驟。比較存在待測(cè)化合物時(shí)獲得的特異性結(jié)合和僅存在標(biāo)記的配體時(shí)獲得的特異性結(jié)合,以確定待測(cè)化合物已經(jīng)置換了與受體的結(jié)合的程度。
在進(jìn)行結(jié)合測(cè)定時(shí),必須注意避免假象,假象可能使得看上去似乎待測(cè)化合物和DRR受體相互作用,而事實(shí)上結(jié)合是被某些其它機(jī)制抑制了。例如,待測(cè)化合物應(yīng)當(dāng)處于這樣一種緩沖液中,其自身基本上不抑制配體和DRR的結(jié)合,并且應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地在幾個(gè)不同的濃度下檢測(cè)。還應(yīng)測(cè)量待測(cè)化合物制劑的蛋白水解活性,并且在測(cè)定時(shí)包含抗蛋白酶是合乎需要的。最后,在足以對(duì)結(jié)果進(jìn)行斯卡查德分析的濃度范圍內(nèi)重新測(cè)量被鑒定為置換配體和DRR受體結(jié)合的化合物是非常合乎需要的。這種分析是本領(lǐng)域中眾所周知的并且可以用來(lái)測(cè)定待測(cè)化合物對(duì)受體的親和性(參見(jiàn)例如Ausubel.等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,11.2.1-11.2.19(1993);《生物化學(xué)與分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》Work等人編輯,N.Y.(1978)等)??捎糜?jì)算機(jī)程序輔助分析結(jié)果(參見(jiàn)例如Munson,P.,MethodsEnzymol.92∶543-577(1983);McPherson,G.A.,Kinetic,EBDALigand.Lowry-A Collection of Radioligand Binding AnalysisPrograms.Elsevier-Biosoft.英國(guó)(1985))。
可用多種不同的測(cè)定方法監(jiān)測(cè)通過(guò)配體的結(jié)合對(duì)受體的激活。例如,腺苷酸環(huán)化酶的測(cè)定可這樣進(jìn)行在微量滴定板的小孔中培養(yǎng)細(xì)胞,然后不同的孔在存在或不存在待測(cè)化合物的情況下培養(yǎng)。然后可以在乙醇中提取cAMP,將其凍干并用測(cè)定緩沖液重新懸浮。如此回收的cAMP的測(cè)定可以采用任何測(cè)定cAMP濃度的方法進(jìn)行,例如BiotrackcAMP酶免疫測(cè)定系統(tǒng)(Amersham)或環(huán)AMP(3H)測(cè)定系統(tǒng)(Amersham)。通常,腺苷酸環(huán)化酶測(cè)定和結(jié)合測(cè)定是分開(kāi)進(jìn)行的,但也可能在單一細(xì)胞制品中進(jìn)行結(jié)合測(cè)定和腺苷酸環(huán)化酶測(cè)定。其它可用于監(jiān)測(cè)受體活性的“細(xì)胞信號(hào)測(cè)定”在下文進(jìn)行了描述。
Ⅳ.用細(xì)胞信號(hào)測(cè)定鑒定DRR激動(dòng)劑和拮抗劑也可利用DRR通過(guò)細(xì)胞信號(hào)測(cè)定篩選候選藥物。為了鑒定DRR激動(dòng)劑,將編碼受體的DNA摻入到表達(dá)載體中,然后轉(zhuǎn)染到合適的宿主中。然后使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和一系列待測(cè)化合物接觸并監(jiān)測(cè)每個(gè)的效果??墒褂玫臏y(cè)定包括測(cè)量cAMP產(chǎn)生的測(cè)定(參見(jiàn)以上討論),測(cè)量對(duì)報(bào)道基因活性激活的測(cè)定,或測(cè)量對(duì)GTP-r-S結(jié)合的調(diào)節(jié)的測(cè)定。
也可用細(xì)胞信號(hào)測(cè)定鑒定DRR的拮抗劑。通過(guò)在異源系統(tǒng)中以非常高的濃度表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體,G蛋白偶聯(lián)受體即使在沒(méi)有其相關(guān)配體的情況下也能處于其激活狀態(tài)。例如,可用桿狀病毒感染昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞來(lái)超量表達(dá)受體,或?qū)RR基因與CMV啟動(dòng)子可操作地連接并在COS或HEK293細(xì)胞中表達(dá)。在這種組成型激活狀態(tài)中,在沒(méi)有配體的情況下通過(guò)測(cè)量待測(cè)化合物對(duì)組成型細(xì)胞信號(hào)活性抑制的能力可以鑒定受體的拮抗劑。針對(duì)這一內(nèi)容的適當(dāng)?shù)臏y(cè)定依然是cAMP測(cè)定,報(bào)道基因激活測(cè)定或測(cè)量GTP-r-S的結(jié)合的測(cè)定。
一種優(yōu)選的細(xì)胞信號(hào)測(cè)定是基于這種觀察穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了DRR的細(xì)胞在血管緊張素Ⅱ或Ⅲ存在的情況下培養(yǎng)后顯示出細(xì)胞內(nèi)鈣水平的改變(參見(jiàn)實(shí)施例5)。因此可以用類(lèi)似于以上討論的放射性受體測(cè)定的步驟,但用血管緊張素Ⅱ或Ⅲ替代標(biāo)記的配體并用測(cè)量鈣濃度來(lái)替代測(cè)量結(jié)合的放射性,來(lái)鑒定DRR的激動(dòng)劑或拮抗劑。比較在存在待測(cè)化合物以及血管緊張素Ⅱ或Ⅲ的情況下的鈣濃度以及單獨(dú)存在血管緊張素Ⅱ或Ⅲ的情況下的鈣濃度,以確定該待測(cè)化合物是否和DRR受體相互反應(yīng)。相應(yīng)于待測(cè)化合物的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加意味著待測(cè)化合物起到了激動(dòng)劑的作用,而細(xì)胞內(nèi)鈣濃度統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的下降則意味著它起到了拮抗劑的作用。
Ⅴ.測(cè)定對(duì)DRR表達(dá)的調(diào)節(jié)能力一種增強(qiáng)或減弱DRR的生物學(xué)作用的方法是改變受體在細(xì)胞中的表達(dá)水平。因此,對(duì)鑒定抑制或增強(qiáng)表達(dá)的化合物的測(cè)定是相當(dāng)受關(guān)注的。這些測(cè)定是這樣進(jìn)行的在待測(cè)化合物存在的情況下培養(yǎng)表達(dá)DRR的細(xì)胞,然后比較這些細(xì)胞中受體的表達(dá)以及在基本相同的條件下,但沒(méi)有待測(cè)化合物的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)。如在以上所討論的結(jié)合測(cè)定中一樣,所用的細(xì)胞基本上沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)的G蛋白偶聯(lián)受體是合乎需要的。一種定量受體表達(dá)的方法是將DRR序列和編碼肽或蛋白的很容易被定量的序列融合。例如,如實(shí)施例5所述,可以將DRR序列連接到編碼血凝素的序列上,并用于穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在和待測(cè)化合物一同培養(yǎng)后,血凝素/受體復(fù)合物可用抗血凝素抗體進(jìn)行免疫沉淀并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。替代地,可用標(biāo)記的配體進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的斯卡查德分析以確定受體的數(shù)目。結(jié)合測(cè)定可按照上文所討論的進(jìn)行,并且優(yōu)選使用已被改造用于重組表達(dá)DRR的細(xì)胞。
包含在DRR表達(dá)測(cè)定中的待測(cè)化合物的優(yōu)選基團(tuán)由互補(bǔ)于DRR核酸序列不同區(qū)段的寡核苷酸組成。這些寡核苷酸在長(zhǎng)度上應(yīng)當(dāng)至少有15個(gè)堿基并且應(yīng)當(dāng)源自受體核酸序列的非保守區(qū)。這些序列可以基于那些如SEQ ID NO2,4,6,8,10,12或14所示的序列。
被發(fā)現(xiàn)降低受體表達(dá)的寡核苷酸可被衍生或綴合以增強(qiáng)它們的效力。例如,可用核苷硫代磷酸替代它們天然的對(duì)等物(參見(jiàn)Cohen,J.,寡脫氧核苷酸,基因表達(dá)的反義抑制劑,CRC出版社(1989))。可將寡核苷酸運(yùn)送到病人的體內(nèi)以抑制DRR的表達(dá)。當(dāng)進(jìn)行該過(guò)程時(shí),以促進(jìn)其被細(xì)胞吸收的方式將寡核苷酸給藥是優(yōu)選的。例如可通過(guò)脂質(zhì)體或綴合到一種可被細(xì)胞攝取的肽上來(lái)運(yùn)送寡核苷酸。(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,897,355和4,394,448;也參見(jiàn)非美國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)WO8903849和EP 0263740)。其它增強(qiáng)寡核苷酸運(yùn)送效力的方法在本領(lǐng)域中是廣為人知的,也與本發(fā)明是相容的。
現(xiàn)在已經(jīng)描述了本發(fā)明,本發(fā)明通過(guò)參照以下的實(shí)施例將更容易理解,實(shí)施例是通過(guò)圖例說(shuō)明的方式提供的,實(shí)施例并非用來(lái)限制本實(shí)施例實(shí)施例1大鼠DRR-1的克隆cDNA片段的分離將簡(jiǎn)并的寡核苷酸合成出具有下列核苷酸序列的G蛋白偶聯(lián)受體的高度保守區(qū)域(跨膜結(jié)構(gòu)域2和7)5’GG CCG TCG ACT TCA TCG TC(A/T) (A/C)(T/C)C TI(G/T)CI(T/C) TIG C(A/C/G/T)G 3’(TM有義)SEQ ID NO15;和5’(A/G)(C/A/T)(A/T)(A/G)CA (A/G)TA IAT IAT IGG (A/G)TT3’(TM7反義)SEQ ID NO16從培養(yǎng)的大鼠胚胎背根神經(jīng)節(jié)(Sprague-Dawley)分離了PolyA+mRNA。用第一條鏈cDNA合成試劑盒(Pharmacia Biotech)逆轉(zhuǎn)錄了上述mRNA,然后利用Ampli-Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增條件如下94℃3分鐘,94℃、45℃和72℃各1分鐘循環(huán)40次。分離相應(yīng)于約650bps的cDNAPCR片段并亞克隆到pGEM-T-載體(Promega公司)中。重組克隆的核苷酸序列用T7-雙脫氧鏈終止測(cè)序試劑盒(Pharmacia Biotech)測(cè)定,基于Genbank/EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索發(fā)現(xiàn)其是獨(dú)特的。
全長(zhǎng)的大鼠DRR-1序列是利用650個(gè)堿基對(duì)的片段和“啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)者DNA步行試劑盒”(Clontech,cat#K1806-1)從大鼠基因組DNA得到的。該試劑盒含有5個(gè)未克隆的,與連接物連接的基因組DNA片段文庫(kù)。其方法包括兩個(gè)連續(xù)的PCR反應(yīng)。兩個(gè)反應(yīng)都是用同樣從Clontech獲得的“高級(jí)Tth聚合酶混合物”,按照銷(xiāo)售商建議的條件完成的。第一次PCR反應(yīng)用在試劑盒中提供的外部連接引物(AP1)以及源自DRR-1PCR片段之序列的外部基因特異性引物(GSP1)來(lái)實(shí)現(xiàn)。將第一次PCR混合物稀釋并用作第二次(嵌套)PCR反應(yīng)的模板,第二次PCR采用了嵌套連接引物(AP2)和嵌套基因特異引物(GSP2)。為了得到最初PCR片段序列上游的大鼠DRR-1基因序列,使用了下列寡核苷酸GSP1寡聚YF3B59-B’5’-CGCAGATGAGGTAGTACAGCATCAC SEQID NO17GSP寡聚 MML-R1,5’-CTGTGAGAGAGATGGTAACATACAG SEQ IDNO18從第一個(gè)文庫(kù)得到了1.9Kb的一個(gè)AP2-MMLR1片段,從第三個(gè)文庫(kù)得到了一個(gè)大約1.0Kb的片段。為了鑒定已知序列的下游序列使用了以下引物
GSP1寡聚YF3B59-F2’5’-GCATCCTTGACTGGTTCTTCTCAG SEQ IDNO19GSP2寡聚MML-F1,5’-GGGTGAGACTCATCATCATTTGTGG.SEQ IDNO20從第一個(gè)文庫(kù)得到了大約1Kb的一個(gè)MMLF1-AP2片段,從第三個(gè)文庫(kù)得到了一個(gè)大約600bp的片段。圖1顯顯了含有DRR-1完整預(yù)測(cè)的開(kāi)放讀框的1154個(gè)核苷酸的組合序列。該開(kāi)放讀框編碼具有預(yù)測(cè)分子量為38.7KD的含337個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖2)。該蛋白序列具有G蛋白偶聯(lián)受體的所有特征七個(gè)可能代表跨膜結(jié)構(gòu)域的疏水螺旋、N末端胞外域上可能的糖基化位點(diǎn)(第30位)和第285-289位上的保守的NPXXY序列。
實(shí)施例2人DRR受體基因的克隆用兩種方法鑒定和克隆了與大鼠DRR-1基因同源和/或有關(guān)的新型人DNA序列。首先篩選了入載體FixⅡ(Stratagene Cat.#946203)上的人基因組文庫(kù)。將大約106個(gè)人基因組克隆涂布并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上以用32P標(biāo)記的全長(zhǎng)大鼠DRR-1序列作為探針進(jìn)行雜交。雜交在42℃過(guò)夜進(jìn)行。濾膜在室溫、低嚴(yán)格條件下(1xSSC/0.1%SDS)洗滌以檢測(cè)相關(guān)的但不必相同的序列。
用購(gòu)自Boehringer-Mannheim的“擴(kuò)展PCR試劑盒”在允許精確擴(kuò)增非常大的DNA片段的條件下通過(guò)PCR擴(kuò)增了陽(yáng)性噬菌體中存在的人DNA插入片段。用各種限制酶消化這些長(zhǎng)的DNA片段并亞克隆到質(zhì)粒載體中。將和大鼠DRR-1基因探針雜交的這些克隆的部分并用ABI循環(huán)測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序。
第二種鑒定和DRR-1相關(guān)的新型人的序列的途徑涉及在總的人基因組DNA上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。根據(jù)以上描述的人基因組克隆合成了如下引物HML.H,5’-GCAAGCTTTCTGAGCATGGATCCAACCGTC,SEQ ID 21和
HML.Bg,5’-CCCTCAGATCTCCAATTTGCTTCCCGACAG,SEQ ID NO22擴(kuò)增得到含有人類(lèi)基因整個(gè)編碼序列的大約1Kb的片段。將這些得到的片段亞克隆到pGEM-T(Promega)載體中以進(jìn)行DNA測(cè)序分析。
利用以上的策略分離出6個(gè)人類(lèi)克隆克隆7, SEQ ID NO3和4;克隆18,SEQ ID NO5和6;克隆23,SEQ ID NO7和8;克隆24,SEQ ID NO9和10;克隆36,SEQ ID NO11和12;和克隆40,SEQ ID NO13和14;這些克隆中沒(méi)有一個(gè)含有內(nèi)含子,它們的序列對(duì)比可以參見(jiàn)圖3。
在氨基酸序列的水平上,大鼠DRR-1克隆和人類(lèi)克隆的同一性為47%-49%。
在核酸水平上,大鼠DRR-1克隆和人類(lèi)克隆的同一性為56%-58%。人類(lèi)克隆(7,18,23,24,36,40)內(nèi)部的序列同一性水平非常高,在氨基酸序列的水平上為77%-98%。所有的人類(lèi)序列都被用作在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中(Genbank,Swissprot,EST)檢索同源性的查詢。沒(méi)有檢測(cè)到相同的序列。最接近的匹配是蛋白的mas癌基因家族的成員。大鼠DRR-1和任何分離的人類(lèi)基因之間整個(gè)氨基酸序列的同源性在47%-50%之間。但某些片段表現(xiàn)出高得多的序列同源性,尤其是編碼推測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅶ(TM3和TM7)的區(qū)域和胞內(nèi)環(huán)(loop)2和3,其中大鼠序列及其人的同系物之間的同源性大約為80%。
實(shí)施例3原位雜交實(shí)驗(yàn)組織的制備通過(guò)斷頭法處死成年雄性Sprague-Dawley大鼠(~300gmCharles River.St-Constant,Quebec)。取出帶有背根神經(jīng)節(jié)的大腦和脊髓,在異戊烷中-40℃下速凍20s并在-80℃下保藏。冷凍的人的大腦、脊髓和背根神經(jīng)節(jié)是根據(jù)最嚴(yán)格的道德標(biāo)準(zhǔn)從位于Baltimore馬里蘭州大學(xué)的發(fā)育疾病的大腦與組織庫(kù)中得到的。將冷凍的組織在Microm HM500 M恒冷切片機(jī)(德國(guó))上制成14m的切片,并且融化固定到ProbeOn Plus載玻片(Fisher Scientific,Montreal,Quebec)上。原位雜交之前在-80℃下儲(chǔ)存切片。
合成核糖探針用SacⅡ或Not1限制酶將質(zhì)粒pGemT-3b32 GPCR進(jìn)行線性化處理。用T7或SP6 RNA聚合酶(Pharmacia Biotech)在〔35S〕UTP(~800Ci/mmol;Amersham,Qakville,Ontario)存在的條件下分別在體外轉(zhuǎn)錄了有義和反義的DRR核糖探針。用SacⅡ和Pst1限制酶將質(zhì)粒pGemT-克隆36GPCR進(jìn)行線性化處理。用T7或SP6RNA聚合酶(Pharmacia Biotech)在〔35S〕UTP存在的條件下分別在體外轉(zhuǎn)錄了有義和反義的克隆36的核糖探針。轉(zhuǎn)錄后用DNAse Ⅰ(Pharmacia)消化DNA模板。通過(guò)苯酚/氯仿/異戊醇提取來(lái)純化核糖探針,并在含醋酸銨和tRNA的70%乙醇中沉淀。標(biāo)記的核糖探針的質(zhì)量用聚丙烯酰胺-尿素凝膠電泳確認(rèn)。
原位雜交在溶于0.1M磷酸緩沖液(PH7.4)的4%的低聚甲醛(BDH,Poole,英國(guó))中將切片在室溫(RT)下預(yù)先固定10分鐘并用2x標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉緩沖液(SSC;0.15M NaCl.0.015M檸檬酸鈉,pH7.0)漂洗3次。然后將切片用0.1M三乙醇胺平衡,用溶于三乙醇胺的0.25%乙酐處理,用2xSSC漂洗并用系列濃度的乙醇(50%-100%)脫水。雜交在含75%甲酰胺(Sigma,St-Louis,Mo),600mM NaCl,10mMTris(pH7.5),1mMEDTA,1xDenhardt's溶液(Sigma),50g/ml變性鮭精DNA(Sigma),50g/ml酵母tRNA(Sigma),10%硫酸葡聚糖(Sigma),20mM二硫蘇糖醇和〔35S〕UTP-標(biāo)記的cRNA探針(10x106cpm/ml)的緩沖液中在潮濕的小室中于55℃下進(jìn)行18小時(shí)。雜交后切片用2XSSC在室溫下漂洗,用溶于RNase緩沖液(10mM Tris,500mM NaCl,1mM EDTA,pH7.5)的20g/ml RNase IA(Pharmacia)室溫處理45分鐘并洗滌,洗滌的最終嚴(yán)格性為0.1xSSC,65℃。然后使切片脫水并在顯影前用柯達(dá)Biomax MR膠片曝光21天和/或浸泡在用蒸餾水以1∶1稀釋的柯達(dá)NTB2乳膠中并在4℃下曝光4-6周,然后用醋酸甲酚紫(Sigma)進(jìn)行對(duì)比染色。
結(jié)果在所有檢驗(yàn)的區(qū)域中,大鼠DRR-1mRNA的軸索僅在背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)。高分辨率的乳膠放射自顯影表明銀顆粒僅在一些小的和中等大小的神經(jīng)元中聚集。DRR-1的這種獨(dú)特的和高度受限制的分布方式在大鼠胚胎中得以確認(rèn)。E17大鼠胚胎的箭頭型切片表明DRR-1mRNA局限于DRG。大鼠胚胎的所有其它結(jié)構(gòu)都沒(méi)有任何特異的雜交信號(hào),進(jìn)一步證實(shí)了DRR-1表達(dá)的高度選擇性。
人克隆36受體的表達(dá)出現(xiàn)在人胚胎背根神經(jīng)節(jié)中但不出現(xiàn)在脊髓中。目前為止還未在測(cè)量的任何成年人的CNS組織中檢測(cè)到克隆36的特異性雜交信號(hào)。這些包括脊髓、皮層、海馬、丘腦、黑質(zhì)和導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(數(shù)據(jù)未示出)??寺?6的mRNA在成體DRG中的存在還有待檢測(cè)。在其中將具有DRG切片的其它脊髓和35S-標(biāo)記的大鼠DRR-1反義探針或克隆36的有義探針雜交的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物中并未顯示出特異性的雜交信號(hào)。
實(shí)施例4Northern印跡將含有2g源自各種組織的polyA RNA的市售的大鼠和人的多種Northern印跡(Clontech)用于測(cè)定大鼠DRR-1信號(hào)及其人類(lèi)同系物的表達(dá)和分布。放射性標(biāo)記的探針制備如下利用Ready-to-Go DNA標(biāo)記試劑盒(Pharmacia Biotech)和〔32P〕CTP(3000Ci/mmol,Amersham)通過(guò)隨機(jī)引發(fā)標(biāo)記了源自大鼠DRR-1(參見(jiàn)實(shí)施例1)或人克隆36的25ng 650bp的3b-32PCR片段。印跡用Expresshyb(Clontech)在68℃預(yù)雜交1小時(shí),然后在同樣的條件下雜交(2x 106cpm/ml的探針)1小時(shí)。在2xSSC,0.05%SDS中室溫下洗滌印跡30min,然后在0.2xSSC,1%SDS中于50℃下洗滌3次60min,然后在-80℃用柯達(dá)Biomax膠片曝光6天。
大鼠DRR-1的表達(dá)和分布2星期曝光后所有研究的大鼠組織(心、大腦、脾臟、肺、骨骼肌、腎臟和睪丸)中DRR-1的表達(dá)都是陰性的,而大鼠的基因組Southern分析表明用同樣的cDNA片段探測(cè)到了1.1kb的條帶。
人克隆36的表達(dá)和分布用放射性標(biāo)記的克隆36的DNA片段探測(cè)了含有來(lái)自各種人組織的RNA的Northern印跡。兩星期曝光后所有研究的人組織(人胎兒的大腦、肺臟、肝臟和腎臟以及成人小腦、大腦皮層、骨髓、枕骨孔、額葉、顳葉、殼(putamen)、脊髓、扁桃體、尾狀核、胼胝體、海馬、全腦、底丘腦核和丘腦)中這種受體的表達(dá)都是陰性的。
實(shí)施例5應(yīng)答于血管緊張素Ⅰ-Ⅲ的鈣信號(hào)將人克隆24的編碼序列轉(zhuǎn)移到pcDNA3載體中并且進(jìn)行修飾以在該受體序列的C末端添加血凝素標(biāo)記。將命名為pcDNA3-HML-HA24的這一克??;通過(guò)改進(jìn)的CaCl2方法(Maniatis,《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989))轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中。將細(xì)胞在37℃,5%CO2下維持在培養(yǎng)基中并且每3天稀釋10倍。
將細(xì)胞接種到90mm組織培養(yǎng)皿(5×105個(gè)細(xì)胞/燒瓶)的補(bǔ)充了10%胎牛血清(FBS),100U/ml青霉素、100微克/ml鏈霉素和0.25微克/ml兩性霉素B(fungizone)的Dulbecco氏改進(jìn)必需培養(yǎng)基(DMEM,Gibco BRL)中。接種后一天,用每個(gè)培養(yǎng)皿30微克的質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲細(xì)胞進(jìn)行分析。首先用免疫沉淀和借助抗一血凝素抗體的Western印跡法檢測(cè)了該基因的表達(dá)。在瞬時(shí)以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中檢測(cè)到了大一種約43KD的蛋白,但在對(duì)照細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到。
在含800微克/mlG418的培養(yǎng)基中選擇大約21天后得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞。鈣信號(hào)的測(cè)量是通過(guò)這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系之一,即293/pcDNA3-HML-HA24進(jìn)行的。將細(xì)胞在24mm圓形玻璃蓋玻片上培養(yǎng)至鋪滿蓋玻片的50%-70%。在用1.8NBS緩沖液(135mM NaCl,5mMKCl,1.2mM MgCl2,1.8mMCaCl2,5mM葡萄糖和10mM HEPES,pH7.3)漂洗細(xì)胞后,在用1.8 NBS稀釋的0.5ml 3.5μM FURA-2AM(分子探針,F(xiàn)-1221)存在的情況下于室溫培養(yǎng)細(xì)胞一小時(shí)。然后細(xì)胞用1.8NBS漂洗3次并進(jìn)而在室溫下培養(yǎng)30分鐘。采用PTI(國(guó)際光子技術(shù)公司)D104光度計(jì)測(cè)量鈣的置換,該光度計(jì)裝備了PTI高速多波長(zhǎng)發(fā)光器,PTI SC 500光閘控制器,PTI LPS220 ARC光源和PTI FELIX軟件1.2版。利用光闌選擇和分離了含有2至8個(gè)細(xì)胞的小組。細(xì)胞用340nm和380nm的光照射并記錄由細(xì)胞發(fā)出的510nm的光。相繼加入血管緊張素Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ-實(shí)驗(yàn)之間的順序不同-,然后加入緩激肽作為陽(yáng)性對(duì)照。在用血管緊張素Ⅱ和血管緊張素Ⅲ刺激時(shí)得到了顯著的應(yīng)答。加入血管緊張素Ⅰ沒(méi)有產(chǎn)生應(yīng)答。
本文引用的參考文獻(xiàn)全部插入作為參考?,F(xiàn)在已經(jīng)完全地描述了本發(fā)明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在不影響本發(fā)明或其任何實(shí)施方案的精神或范圍的情況下,本發(fā)明可以在很寬的和同等的條件、參數(shù)等的范圍內(nèi)進(jìn)行。
序列表信息(1)總信息(ⅰ)申請(qǐng)人Astra Pharma Inc.加拿大(ⅲ)發(fā)明標(biāo)題新受體(ⅳ)序列數(shù)22(ⅴ)通訊地址A)通訊人A stra AB.Patent DepartmentC)街道S-151 85 SodertaljeD)城市SodertaljeE)州F)國(guó)家瑞典G)郵政編碼無(wú)(ⅵ)計(jì)算機(jī)可讀形式A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)B)計(jì)算機(jī)IBM PC或兼容機(jī)E)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOSF)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅶ)目前申請(qǐng)信息A)申請(qǐng)?zhí)朆)歸檔日期C)歸類(lèi)(ⅸ)遠(yuǎn)程通訊信息(A)電話46-8 553 26000(B)傳真46-8 553 28820SEQ ID NO1的信息序列特征A)長(zhǎng)度337氨基酸B)類(lèi)型氨基酸C)鏈特性不相關(guān)D)拓?fù)涮匦圆幌嚓P(guān)分子類(lèi)型蛋白是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO1Met Val Cys Val Leu Arg Asp Thr Thr Gly Arg Phe Val Ser Met Asp1 5 10 15Pro Thr Ile Ser Ser Leu Ser Thr Glu Ser Thr Thr Leu Asn Lys Thr20 25 30Gly His Pro Ser Cys Arg Pro Ile Leu Thr Leu Ser Phe Leu Val Pro35 40 45Ile Ile Thr Leu Leu Gly Leu Ala Gly Asn Thr Ile Val Leu Trp Leu50 55 60Leu Gly Phe Arg Met Arg Arg Lys Ala Ile Ser Val Tyr Val Leu Asn65 70 75 80Leu Ser Leu Ala Asp Ser Phe Phe Leu Cys Cys His Phe Ile Asp Ser85 90 95Leu Met Arg Ile Met Asn Phe Tyr Gly Ile Tyr Ala His Lys Leu Ser100 105 110Lys Glu Ile Leu Gly Asn Val Ala Phe Ile Pro Tyr Ile Ser Gly Leu115 120 125Ser Ile Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp130 135 140Pro Ile Trp Tyr His Cys His Arg Pro Arg Asn Met Ser Ala Ile Ile145 150 155 160Cys Val Leu Ile Trp Val Leu Ser Phe Leu Met Gly Ile Leu Asp Trp165 170 175Phe Phe Ser Gly Phe Leu Gly Glu Thr His His His Leu Trp Lys Asn180 185 190Val Asp Phe Ile Val Thr Ala Phe Leu Ile Phe Leu Phe Met Leu Leu195 200 205Phe Gly Ser Ser Leu Ala Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg210 215 220Arg Lys Pro Leu Ser Arg Leu Tyr Val Thr Ile Ser Leu Thr Val Met225 230 235 240Val Tyr Leu Ile Cys Gly Leu Pro Leu Gly Leu Tyr Leu Phe Leu Leu245 250 255Tyr TrP Phe Gly Ile His Leu His Tyr Pro Phe Cys His Ile Tyr Gln260 265 270Val Thr Val Leu Leu Ser Cys Val Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile275 280 285Tyr Phe Leu Val Gly Ser Phe Arg His Arg Lys Lys His Arg Ser Leu290 295 300Lys Met Val Leu Lys Arg Ala Leu Glu Glu Thr Pro Glu Glu Asp Glu305 310 315 320Tyr Thr Asp Ser His Val Gln Lys Pro Thr Glu Ile Ser Glu Arg Arg325 330 335CysSEQ ID NO2的信息序列特征長(zhǎng)度1011堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性雙鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型DNA(基因組)是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO2ATGGTTTGTG TTCTCAGGGA CACTACTGGA AGATTTGTGA GCATGGATCC AACCATCTCA60TCCCTCAGTA CAGAATCTAC AACACTGAAT AAAACTGGTC ATCCCAGTTG CAGGCCAATC 120CTCACCCTGT CCTTCCTGGT CCCCATCATC ACCCTGCTTG GATTGGCAGG AAACACCATT 180GTACTCTGGC TCTTGGGATT CCGCATGCGC AGGAAAGCCA TCTCAGTCTA CGTCCTCAAC 240CTGTCTCTGG CAGACTCCTT CTTCCTCTGC TGCCATTTTA TTGACTCTCT GATGCGGATC 300ATGAACTTCT ATGGCATCTA TGCCCATAAA TTAAGCAAAG AAATCTTAGG CAATGTAGCA 360TTCATTCCCT ATATCTCAGG CCTGAGCATC CTCAGTGCTA TCAGCACGGA GCGCTGCCTG 420TCTGTATTGT GGCCAATCTG GTACCACTGC CACCGCCCAA GAAACATGTC AGCTATTATA 480TGTGTTCTAA TCTGGGTTCT GTCCTTTCTC ATGGGCATCC TTGACTGGTT TTTCTCAGGA 540TTCCTGGGTG AGACTCACCA TCATTTGTGG AAAAATGTTG ACTTTATTGT AACTGCATTT 600CTGATTTTTT TATTTATGCT TCTCTTTGGG TCCAGTCTGG CGCTACTGGT GAGGATCCTC 660TGTGGTTCCA GACGGAAACC ACTGTCCAGG CTGTACGTTA CAATCTCTCT CACAGTGATG 720GTCTACCTCA TCTGCGGCCT GCCTCTCGGG CTTTACTTGT TCCTGCTATA TTGGTTTGGG 780ATCCATTTAC ATTATCCCTT TTGTCACATT TACCAAGTTA CTGTGCTCCT GTCCTGTGTG 840AACAGCTCTG CCAACCCCAT CATTTACTTC CTTGTAGGGT CCTTTAGGCA CCGTAAAAAG 900CATCGGTCCC TCAAAATGGT TCTTAAAAGG GCTCTGGAGG AGACTCCTGA GGAGGATGAA 960TATACAGACA GCCATGTTCA GAAACCCACT GAGATCTCAG AAAGGAGATG T 1011SEQ ID NO3的信息序列特征長(zhǎng)度322氨基酸類(lèi)型氨基酸鏈特性不相關(guān)拓?fù)涮匦圆幌嚓P(guān)分子類(lèi)型蛋白是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO3Met Asp Pro Thr Ile Pro Val Leu Gly Thr Lys Leu Thr Pro Ile Asn15 10 15Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Asn Gln Thr Leu Ser Phe Thr Gly20 25 30Leu Thr Cys Ile Ile Ser Leu Val Ala Leu Thr Gly Asn Ala Val Val35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr50 55 60Ile Leu Asn Leu Val Ala Ala Asn Phe Leu Phe Leu Ser Gly His Ile65 70 75 80Ile Phe Ser Pro Leu Pro Leu Ile Asn Ile Arg His Pro Ile Ser Lys85 90 95Ile Leu Ser Pro Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Ile Gly Leu Ser Met100 105 110Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Ile Leu Trp Pro Ile115 120 125Trp Tyr His Cys Arg Arg Pro Arg Tyr Leu Ser Ser Val Met Cys Val130 135 140Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Phe145 150 155 160Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asn Ser Val Trp Cys Glu Thr Ser165 170 175Asp Phe Ile Thr Ile Ala Trp Leu Val Phe Leu Cys Val Val Leu Cys180 185 190Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys195 200 205Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val210 215 220Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gln Trp Ala Leu Phe Ser225 230 235240Arg Ile His Leu Asp Trp Lys Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val245 250 255Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser ger Ala Asn Pro Ile Ile Tyr260 265 270Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys275 280 285Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Thr Pro Glu Val Asp Glu Gly290 295 300Gly Gly Trp Leu Pro Gln Glu Thr Leu Glu Leu Ser Gly Ser Lys Leu305 310 315 320Glu GlnSEQ ID NO4的信息序列特征長(zhǎng)度969堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性雙鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型DNA(基因組)是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO4ATGGATCCAA CCATCCCAGT CTTGGGTACA AAACTGACAC CAATCAACGG ACGTGAGGAG60ACTCCTTGCT ACAACCAAAC CCTGAGCTTC ACGGGGCTGA CGTGCATCAT TTCCCTTGTC 120GCGCTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCT 180GTCTCCATCT ACATCCTCAA CCTGGTCGCG GCCAACTTCC TCTTCCTTAG CGGCCACATT 240ATATTTTCGC CGTTACCCCT CATCAATATC CGCCATCCCA TCTCCAAAAT CCTCAGTCCT 300GTGATGACCT TTCCCTACTT TATAGGCCTA AGCATGCTGA GCGCCATCAG CACCGAGCGC 360TGCCTGTCCA TCCTGTGGCC CATCTGGTAC CACTGCCGCC GCCCCAGATA CCTGTCATCG 420GTCATGTGTG TCCTGCTCTG GGCCCTGTCC CTGCTGCGGA GTATCCTGGA GTGGATGTTC 480TGTGACTTCC TGTTTAGTGG TGCTAATTCT GTTTGGTGTG AAACGTCAGA TTTCATTACA 540ATCGCGTGGC TGGTTTTTTT ATGTGTGGTT CTCTGTGGGT CCAGCCTGGT CCTGCTGGTC 600AGGATTCTCT GTGGATCCCG GAAGATGCCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTCCTC 660ACAGTGCTGG TCTTCCTCCT CTGTGGCCTG CCCTTTGGCA TTCAGTGGGC CCTGTTTTCC 720AGGATCCACC TGGATTGGAA AGTCTTATTT TGTCATGTGC ATCTAGTTTC CATTTTCCTG 780TCCGCTCTTA ACAGCAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CTTTAGGCAG 840CGTCAAAATA GGCAAAACCT GAAGCTGGTT CTCCAAAGGG CTCTGCAGGA CACGCCTGAG 900GTGGATGAAG GTGGAGGGTG GCTTCCTCAG GAAACCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAAATTG 960GAGCAGTGA 969SEQ ID NO5的信息序列特征長(zhǎng)度322氨基酸類(lèi)型氨基酸鏈特性不相關(guān)拓?fù)涮匦圆幌嚓P(guān)分子類(lèi)型蛋白是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO5Met Asp Pro Thr Val Pro Val Leu Gly Thr Glu Leu Thr Pro Ile Asn15 10 15Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Lys Gln Thr Leu Ser Phe Thr Gly20 25 30Leu Thr Cys Ile Val Ser Leu Val Ala Leu Thr Gly Asn Ala Val Val35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr50 55 60Ile Leu Asn Leu Val Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly His Ile65 70 75 80Ile Cys Ser Pro Leu Arg Leu Ile Asn Ile Ser His Pro Ile Ser Lys85 90 95Ile Leu Ser Pro Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Ile Gly Leu Ser Met100 105 110Leu Asn Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Ile Leu Trp Pro Ile115 120 125Trp Tyr His Cys Arg Arg Pro Arg Tyr Leu Ser Ser Val Met Cys Val130 135 140Leu Leu Trp Ala Pro Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Phe145 150 155 160Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Val Arg Cys Glu Thr Ser165 170 175Asp Phe Ile Thr Ile Ala Trp Leu Val Phe Leu Arg Val Val Leu Cys180 185 190Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys195 200 205Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val210 215 220Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gln Trp Ala Leu Phe Ser225 230 235 240Arg Ile His Leu Asp Trp Lys Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val245 250 255Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr260 265 270Phe Phe Met Gly Ser Phe Arg Gln Leu Gln Asn Arg Lys Thr Leu Lys275 280 285Leu Val Leu Gln Arg Asp Leu Gln Asp Thr Pro Glu Val Asp Glu Gly290 295 300Gly Trp Trp Leu Pro Gln Glu Thr Leu Glu Leu Ser Gly Ser Lys Leu305 310 315 320Glu IleSEQ ID NO6的信息序列特征長(zhǎng)度969堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性雙鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型DNA(基因組)是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO6ATGGATCCAA CCGTCCCAGT CTTGGGTACA GAACTGACAC CAATCAACGG ACGTGAGGAG 60ACTCCTTGCT ACAAGCAGAC CCTGAGCTTC ACGGGGCTGA CGTGCATCGT TTCCCTTGTC 120GCGCTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCT 180GTCTCCATCT ACATCCTCAA CCTGGTCGCG GCCGACTTCC TCTTCCTTAG CGGCCACATT 240ATATGTTCGC CGTTACGCCT CATCAATATC AGCCATCCCA TCTCCAAAAT CCTCAGTCCT 300GTGATGACTT TTCCCTACTT TATAGGCCTA AGCATGCTGA ACGCCATCAG CACCGAGCGC 360TGCCTGTCCA TCCTGTGGCC CATCTGGTAC CACTGCCGCC GCCCCAGATA CCTGTCATCG 420GTCATGTGTG TCCTGCTCTG GGCCCCGTCC CTGCTGCGGA GTATCCTGGA GTGGATGTTC 480TGTGACTTCC TGTTTAGTGG TGCTGATTCT GTTCGGTGTG AAACGTCAGA TTTCATTACA 540ATCGCGTGGC TGGTTTTTTT ACGTGTGGTT CTCTGTGGGT CCAGCCTGGT CCTGCTGGTC 600AGGATTCTCT GTGGATCCCG GAAGATGCCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTCCTC 660ACAGTGCTGG TCTTCCTCCT CTGTGGCCTG CCCTTTGGCA TTCAGTGGGC CCTGTTTTCC 720AGGATCCACC TGGATTGGAA AGTCTTATTT TGTCATGTGC ATCTAGTTTC CATTTTCCTG 780TCCGCTCTTA ACAGCAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCATGGGCTC CTTTAGGCAG 840CTTCAAAACA GGAAGACCCT CAAGCTGGTT CTCCAGAGGG ATCTGCAGGA CACGCCTGAG 900GTGGATGAAG GTGGATGGTG GCTTCCTCAG GAAACCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAAATTG 960GAGATCTGA 969SEQ ID NO7的信息序列特征長(zhǎng)度322氨基酸類(lèi)型氨基酸鏈特性不相關(guān)拓?fù)涮匦圆幌嚓P(guān)分子類(lèi)型蛋白是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO7Met Asp Pro Thr Val Ser Thr Leu Asp Thr Glu Leu Thr Pro Ile Asn1 5 10 15Gly Thr Glu Glu Thr Leu Cys Tyr Lys Gln Thr Leu Ser Leu Thr Val20 25 30Leu Thr Cys Ile Val Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Phe Ser Ile Tyr50 55 60Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly Arg Leu65 70 75 80Ile Tyr Ser Leu Leu Ser Phe Ile Ser Ile Pro His Thr Ile Ser Lys85 90 95Ile Leu Tyr Pro Val Met Met Phe Ser Tyr Phe Ala Gly Leu Asn Phe100 105 110Leu Ser Ala Val Ser Thr Asp Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile115 120 125Trp Tyr Arg Cys His Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val130 135 140Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Leu145 150 155 160Cys Gly Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ala Trp Cys Gln Thr Ser165 170 175Asp Phe Ile Thr Val Ala Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys180 185 190Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Ile Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys195 200 205Ile Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val210 215 220Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gln Phe Phe Leu Phe Leu225 230 235 240Trp Ile His Val Asp Arg Glu Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val245 250 255Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr260 265 270Phe Phe Val Gly Ser Leu Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys275 280 285Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Thr Pro Glu Val Asp Glu Gly290 295 300Gly Gly Trp Leu Pro Gln Glu Thr Leu Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu305 310 315 320Glu GlnSEQ ID NO8的信息序列特征長(zhǎng)度969堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性雙鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型DNA(基因組)是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO8ATGGATCCAA CCGTCTCAAC CTTGGACACA GAACTGACAC CAATCAACGG AACTGAGGAG 60ACTCTTTGCT ACAAGCAGAC CTTGAGCCTC ACGGTGCTGA CGTGCATCGT TTCCCTTGTC 120GGGCTGACAG GAAACGCAGT TGTACTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCC 180TTCTCCATCT ACATCCTCAA CTTGGCCGCA GCAGACTTCC TCTTCCTCAG CGGCCGCCTT 240ATATATTCCC TGTTAAGCTT CATCAGTATC CCCCATACCA TCTCTAAAAT CCTCTATCCT 300GTGATGATGT TTTCCTACTT TGCAGGCCTG AACTTTCTGA GTGCCGTGAG CACCGATCGC 360TGCCTGTCCG TCCTGTGGCC CATCTGGTAC CGCTGCCACC GCCCCACACA CCTGTCAGCG 420GTGGTGTGTG TCCTGCTCTG GGCCCTGTCC CTGCTGCGGA GCATCCTGGA ATGGATGTTA 480TGTGGCTTCC TGTTCAGTGG TGCTGATTCT GCTTGGTGTC AAACATCAGA TTTCATCACA 540GTCGCGTGGC TGATTTTTTT ATGTGTGGTT CTCTGTGGGT CCAGCCTGGT CCTGCTGATC 600AGGATTCTCT GTGGATCCCG GAAGATACCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTGCTC 660ACAGTACTGG TCTTCCTCCT CTGTGGCCTG CCCTTTGGCA TTCAGTTTTT CCTATTTTTA 720TGGATCCACG TGGACAGGGA AGTCTTATTT TGTCATGTGC ATCTAGTTTC CATTTTCCTG 780TCCGCTCTTA ACAGCAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CCTTAGGCAG 840CGTCAAAATA GGCAGAACCT GAAGCTGGTT CTCCAGAGGG CTCTGCAGGA CACGCCTGAG 900GTGGATGAAG GTGGAGGGTG GCTTCCTCAG GAAACCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAGATTG 960GAGCAGTGA 969SEQ ID NO9的信息序列特征長(zhǎng)度322氨基酸類(lèi)型氨基酸鏈特性不相關(guān)拓?fù)涮匦圆幌嚓P(guān)分子類(lèi)型蛋白是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO9Met Asp Pro Thr Val Ser Thr Leu Asp Thr Glu Leu Thr Pro Ile Asn15 10 15Gly Thr Glu Glu Thr Leu Cys Tyr Lys Gln Thr Leu Ser Leu Thr Val20 25 30Leu Thr Cys Ile Val Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Phe Ser Ile Tyr50 55 60Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly Arg Leu65 70 75 80Ile Tyr Ser Leu Leu Ser Phe Ile Ser Ile Pro His Thr Ile Ser Lys85 90 95Ile Leu Tyr Pro Val Met Met Phe Ser Tyr Phe Ala Gly Leu Ser Phe100 105 110Leu Ser Ala Val Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile115 120 125Trp Tyr Arg Cys His Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val130 135 140Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Leu145 150 155 160Cys Gly Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ala Trp Cys Gln Thr Ser165 170 175Asp Phe Ile Thr Val Ala Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys180 185 190Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Ile Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys195 200 205Ile Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val210 215 220Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gln Phe Phe Leu Phe Leu225 230235 240Trp Ile His Val Asp Arg Glu Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val245 250 255Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr260 265 270Pne Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys275 280 285Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Ala Ser Glu Val Asp Glu Gly290 295 300Gly Gly Gln Leu Pro Gln Glu Thr Leu Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu305 310 315320Glu GlnSEQ ID NO10的信息序列特征長(zhǎng)度969堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性雙鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型DNA(基因組)是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO10ATGGATCCAA CGGTCTCAAC CTTGGACACA GAATTGACAC CAATCAACGG AACTGAGGAG 60ACTCTTTGCT ACAAGCAGAC CTTGAGCCTC ACGGTGCTGA CGTGCATCGT TTCCCTTGTC 120GGGCTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT CCCGCATGCG CAGGAACGCC 180TTCTCCATCT ACATCCTCAA CTTGGCCGCA GCAGACTTCC TCTTCCTCAG CGGCCGCCTT 240ATATATTCCC TGTTAAGCTT CATCAGTATC CCCCATACCA TCTCTAAAAT CCTCTATCCT 300GTGATGATGT TTTCCTACTT TGCAGGCCTG AGCTTTCTGA GTGCCGTGAG CACCGAGCGC 360TGCCTGTCCG TCCTGTGGCC CATCTGGTAC CGCTGCCACC GCCCCACACA CCTGTCAGCG 420GTGGTGTGTG TCCTGCTCTG GGCCCTGTCC CTGCTGCGGA GCATCCTGGA GTGGATGTTA 480TGTGGCTTCC TGTTCAGTGG TGCTGATTCT GCTTGGTGTC AAACATCAGA TTTCATCACA 540GTCCCGTGGC TGATTTTTTT ATGTGTGGTT CTCTGTGGGT CCAGCCTGGT CCTGCTGATC 600AGGATTCTCT GTGGATCCCG GAAGATACCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTGCTC 660ACAGTACTGG TCTTCCTCCT CTGTGGCCTG CCCTTTGGCA TTCAGTTTTT CCTATTTTTA 720TGGATCCACG TGGACAGGGA AGTCTTATTT TGTCATGTTC ATCTAGTTTC TATTTTCCTG 780TCCGCTCTTA ACAGCAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CTTTAGGCAG 840CGTCAAAATA GGCAGAACCT GAAGCTGGTT CTCCAGAGGG CTCTGCAGGA CGCGTCTGAG 900GTGGATGAAG GTGGAGGGCA GCTTCCTGAG GAAATCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAGATTG 960GAGCAGTGA 969SEQ ID NO11的信息序列特征長(zhǎng)度322氨基酸類(lèi)型氨基酸鏈特性不相關(guān)拓?fù)涮匦圆幌嚓P(guān)分子類(lèi)型蛋白是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO11Met Asp Pro Thr Val Pro Val Leu Gly Thr Lys Leu Thr Pro Ile Asn1 5 10 15Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Lys Gln Thr Leu Ser Phe Thr Val20 25 30Leu Thr Cys Ile Ile Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr50 55 60Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Phe Gln Ile65 70 75 80Ile Cys Arg Pro Leu Arg Leu Ile ASn Ile Ser His Leu Ile Arg Lys85 90 95Ile Leu Val Ser Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Thr Gly Leu Ser Met100 105 110Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile115 120 125Trp Tyr Arg Cys Arg Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val130 135 140Leu Leu Trp Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ser Met Leu Glu Trp Arg Phe145 150 155 160Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ser Trp Cys Glu Thr Ser165 170 175Asp Phe Ile Pro Val Ala Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys180 185 190Val Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys195 200 205Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val210 215 220Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Leu Gly Ala Leu Ile Tyr225 230 235 240Arg Met His Leu Asn Leu Glu Val Leu Tyr Cys His Val Tyr Leu Val245 250 255Cys Met Ser Leu Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr260 265 270Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys275 280 285Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Lys Pro Glu Val Asp Lys Gly290 295 300Glu Gly Gln Leu Pro Glu Glu Ser Leu Glu Leu Ser Gly Arg Arg Leu305 310 315 320Gly ProSEQ ID NO12的信息序列特征長(zhǎng)度969堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性雙鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型DNA(基因組)是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO12ATGGATCCAA CCGTCCCAGT CTTGGGTACA AAACTGACAC CAATCAACGG ACGTGAGGAG 60ACTCCTTGCT ACAAGCAGAC CCTGAGCTTC ACGGTGCTGA CGTGCATCAT TTCCCTTGTC 120GGACTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCT 180GTCTCCATCT ACATCCTCAA CCTGGCCGCA GCAGACTTCC TCTTCCTCAG CTTCCAAATT 240ATACGTTCGC CATTACGCCT CATCAATATC AGCCATCTCA TCCGCAAAAT CCTCGTTTCT 300GTGATGACCT TTCCCTACTT TACAGGCCTG AGTATGCTGA GCGCCATCAG CACCGAGCGC 360TGCCTGTCTG TTCTGTGGCC CATCTGGTAC CGCTGCCGCC GCCCCACACA CCTGTCAGCG 420GTCGTGTGTG TCCTGCTCTG GGGCCTGTCC CTGCTGTTTA GTATGCTGGA GTGGAGGTTC 480TGTGACTTCC TGTTTAGTGG TGCTGATTCT AGTTGGTGTG AAACGTCAGA TTTCATCCCA 540GTCGCGTGGC TGATTTTTTT ATGTGTGGTT CTCTGTGTTT CCAGCCTGGT CCTGCTGGTC 600AGGATCCTCT GTGGATCCCG GAAGATGCCG CTGACCAGGC TGTATGTGAC CATCCTGCTC 660ACAGTGCTGG TCTTCCTCCT CTGCGGCCTG CCCTTCGGCA TTCTGGGGGC CCTAATTTAC 720AGGATGCACC TGAATTTGGA AGTCTTATAT TGTCATGTTT ATCTGGTTTG CATGTCCCTG 780TCCTTTTTAA ACAGTAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CTTTAGGCAG 840CGTCAAAATA GGCAGAACCT GAAGCTGGTT CTCCAGAGGG CTCTGCAGGA CAAGCCTGAG 900GTGGATAAAG GTGAAGGGCA GCTTCCTGAG GAAAGCCTGG AGCTGTCGGG AAGGAGATTG 960GGGCCATGA 969SEQ ID NO13的信息序列特征長(zhǎng)度322氨基酸類(lèi)型氨基酸鏈特性不相關(guān)拓?fù)涮匦圆幌嚓P(guān)分子類(lèi)型蛋白是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO13Met Asp Pro Thr Val Pro Val Phe Gly Thr Lys Leu Thr Pro Ile Asn1 5 10 15Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Asn Gln Thr Leu Ser Phe Thr Val20 25 30Leu Thr Cys Ile Ile Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Tyr Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr50 55 60Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Phe Gln Ile65 70 75 80Ile Arg ser Pro Leu Arg Leu Ile Asn Ile Ser His Leu Ile Arg Lys85 90 95Ile Leu Val Ser Val Het Thr Phe Pro Tyr Phe Thr Gly Leu Ser Met100 105 110Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile115 120 125Trp Tyr Arg Cys Arg Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val130 135 140Leu Leu Trp Gly Leu Ser Leu Leu Phe Ser Met Leu Glu Trp Arg Phe145 150 155 160Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ser Trp Cys Glu Thr Ser165 170 175Asp Phe Ile Pro Val Val Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys180 185 190Val Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys195 200 205Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val210 215 220Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Leu Gly Ala Leu Ile Tyr225 230 235 240Arg Met His Leu Asn Leu Glu Val Leu Tyr Cys His Val Tyr Leu Val245 250 255Cys Met Ser Leu Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr260 265 270Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys275 280 285Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Lys Pro Glu Val Asp Lys Gly290 295 300Glu Gly Gln Leu Pro Glu Glu Ser Leu Glu Leu Ser Gly Ser Lys Leu305 310 315 320Gly ProSEQ ID NO14的信息序列特征長(zhǎng)度969堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性雙鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型DNA(基因組)是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO14ATGGATCCAA CCGTCCCAGT CTTCGGTACA AAACTGACAC CAATCAACGG ACGTGAGGAG 60ACTCCTTGCT ACAATCAGAC CCTGAGCTTC ACGGTGCTGA CGTGCATCAT TTCCCTTGTC 120GGACTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT ACCGCATGCG CAGGAACGCT 180GTCTCCATCT ACATCCTCAA CCTGGCCGCA GCAGACTTCC TCTTCCTCAG CTTCCAAATT 240ATACGTTCGC CATTACGCCT CATCAATATC AGCCATCTCA TCCGCAAAAT CCTCGTTTCT 300GTGATGACCT TTCCCTACTT TACAGGCCTG AGTATGCTGA GCGCCATCAG CACCGACCGC 360TGCCTGTCTG TTCTGTGGCC CATCTGGTAC CGCTGCCGCC GCCCCACACA CCTGTCAGCG 420GTCGTGTGTG TCCTGCTCTG GGGCCTGTCC CTGCTGTTTA GTATGCTGGA GTGGAGGTTC 480TGTGACTTCC TGTTTAGTGG TGCTGATTCT AGTTGGTGTG AAACGTCAGA TTTCATCCCA 540GTCGTGTGGC TGATTTTTTT ATGTGTGGTT CTCTGTGTTT CCAGCCTGGT CCTGCTGGTC 600AGGATCCTCT GTGGATCCCG GAAGATGCCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTGCTC 660ACAGTGCTGG TCTTCCTCCT CTGCGGCCTG CCCTTCGGCA TTCTGGGGGC CCTAATTTAC 720AGGATGCACC TGAATTTGGA AGTCTTATAT TGTCATGTTT ATCTGGTTTG CATGTCCCTG 780TCCTCTCTAA ACAGTAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CTTTAGGCAG 840CGTCAAAATA GGCAGAACCT GAAGCTGGTT CTCCAAAGGG CTCTGCAGGA CAAGCCTGAG 900GTGGATAAAG GTGAAGGGCA GCTTCCTGAG GAAAGCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAAATTG 960GGGCCATGA 969SEQ ID NO15的信息序列特征長(zhǎng)度35堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性單鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型其它核酸描述/desc=合成PCR引物是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO15GGCCGTCGAC TTCATCGTCW MYCTIKCIYT IGCNGSEQ ID NO16的信息序列特征長(zhǎng)度15堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性單鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型其它核酸描述/desc=合成PCR引物是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO16RHWRCARTAI ATIATSEQ ID NO17的信息序列特征長(zhǎng)度25堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性單鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型其它核酸描述/desc=合成PCR引物是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO17CGCAGATGAG GTAGTACAGC ATCACSEQ ID NO18的信息序列特征長(zhǎng)度25堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性單鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型其它核酸描述/desc=合成PCR引物是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO18CTGTGAGAGA GATGGTAACA TACAGSEQ ID NO19的信息序列特征長(zhǎng)度24堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性單鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型其它核酸描述/desc=合成PCR引物是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO19GCATCCTTGA CTGGTTCTTC TCAGSEQ ID NO20的信息序列特征長(zhǎng)度25堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性單鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型其它核酸描述/desc=合成PCR引物是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO19SEQ ID NO20的信息序列特征長(zhǎng)度25堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性單鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型其它核酸描述/desc=合成PCR引物是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO20GGGTGAGACT CATCATCATT TGTGGSEQ ID NO21的信息序列特征長(zhǎng)度30堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性單鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型其它核酸描述/desc=合成PCR引物是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO21GCAAGCTTTC TGAGCATGGA TCCAACCGTCSEQ ID NO22的信息序列特征長(zhǎng)度30堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈特性單鏈拓?fù)涮匦跃€性分子類(lèi)型其它核酸描述/desc=合成PCR引物是否假設(shè)否是否反義否序列描述SEQ ID NO22CCCTCAGATC TCCAATTTGC TTCCCGACAG
權(quán)利要求
1.一種包括在功能上由如SEQ ID NO1所示的大鼠背根受體1(DRR-1)組成的氨基酸序列的蛋白,以天然狀態(tài)存在的除外。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基本上純的蛋白,其中所說(shuō)的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO1的氨基酸序列組成.
3.一種基本上純的多核苷酸,該多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO1中所示的大鼠DRR-1組成的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白基本上由SEQ ID NO1的氨基酸序列組成.
5.權(quán)利要求4的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸具有SEQ ID NO2的核苷酸序列。
6.一種包括在功能上由如SEQ ID NO3所示的人背根受體1(DRR-1)組成的氨基酸序列的蛋白,以天然狀態(tài)存在的除外。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的基本上純的蛋白,其中所說(shuō)的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO3的氨基酸序列組成。
8.一種基本上純的多核苷酸,該多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO3中所示的人DRR-1組成的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求8的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白基本上由SEQ ID NO3的氨基酸序列組成。
10.權(quán)利要求9的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸具有SEQ IDNO4的核苷酸序列。
11.一種包括在功能上由如SEQ ID NO5所示的人背根受體2(DRR-2)組成的氨基酸序列的蛋白,以天然狀態(tài)存在的除外。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的基本上純的蛋白,其中所說(shuō)的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO5的氨基酸序列組成。
13.一種基本上純的多核苷酸,該多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO5中所示的人DRR-2組成的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求13的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白基本上由SEQ ID NO5的氨基酸序列組成。
15.權(quán)利要求14的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸具有SEQ IDNO6的核苷酸序列。
16.一種包括在功能上由如SEQ ID NO7所示的人背根受體3(DRR-3)組成的氨基酸序列的蛋白,以天然狀態(tài)存在的除外。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的基本上純的蛋白,其中所說(shuō)的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO7的氨基酸序列組成。
18.一種基本上純的多核苷酸,該多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO7中所示的人DRR-3組成的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求18的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白基本上由SEQ ID NO7的氨基酸序列組成。
20.權(quán)利要求19的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸具有SEQ IDNO8的核苷酸序列。
21.一種包括在功能上由如SEQ ID NO9所示的人背根受體4(DRR-4)組成的氨基酸序列的蛋白,以天然狀態(tài)存在的除外。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的基本上純的蛋白,其中所說(shuō)的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO9的氨基酸序列組成。
23.一種基本上純的多核苷酸,該多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO9中所示的人DRR-4組成的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求23的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白基本上由SEQ ID NO9的氨基酸序列組成。
25.權(quán)利要求24的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸具有SEQ IDNO10的核苷酸序列。
26.一種包括在功能上由如SEQ ID NO11所示的人背根受體5(DRR-5)組成的氨基酸序列的蛋白,以天然狀態(tài)存在的除外。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的基本上純的蛋白,其中所說(shuō)的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO11的氨基酸序列組成。
28.一種基本上純的多核苷酸,該多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO11中所示的人DRR-5組成的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求28的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白基本上由SEQ ID NO11的氨基酸序列組成。
30.權(quán)利要求29的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸具有SEQ IDNO12的核苷酸序列。
31.一種包括在功能上由如SEQ ID NO13所示的人背根受體6(DRR-6)組成的氨基酸序列的蛋白,以天然狀態(tài)存在的除外。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的基本上純的蛋白,其中所說(shuō)的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO13的氨基酸序列組成。
33.一種基本上純的多核苷酸,該多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO13中所示的人DRR-6組成的氨基酸序列。
34.權(quán)利要求33的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸編碼一種蛋白,該蛋白基本上由SEQ ID NO13的氨基酸序列組成。
35.權(quán)利要求34的多核苷酸,其中所說(shuō)的多核苷酸具有SEQ IDNO14的核苷酸序列。
36.一種通過(guò)以下方法制備的抗體,該方法包括將藥物可接受的制劑注射到能產(chǎn)生所說(shuō)抗體的動(dòng)物中的步驟,其中所述藥物可接受的制劑包括權(quán)利要求1,2,6,7,11,12,16,17,21,22,26,27,31或32之任一的蛋白。
37.一種特異性地結(jié)合權(quán)利要求1,2,6,7,11,12,16,17,21,22,26,27,31或32的蛋白之任一的抗體。
38.一種包括權(quán)利要求3或4之一的多核苷酸的用于表達(dá)大鼠DRR-1的載體。
39.用于表達(dá)的下之任一的載體(ⅰ)人DRR-1,該載體包括權(quán)利要求8或9的多核苷酸;(ⅱ)人DRR-2,該載體包括權(quán)利要求13或14的多核苷酸;(ⅲ)人DRR-3,該載體包括權(quán)利要求18或19的多核苷酸;(ⅳ)人DRR-4,該載體包括權(quán)利要求23或24的多核苷酸;(ⅴ)人DRR-5,該載體包括權(quán)利要求28或29的多核苷酸;(ⅵ)人DRR-6,該載體包括權(quán)利要求33或34的多核苷酸。
40.用權(quán)利要求38或39的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
41.由權(quán)利要求40的宿主細(xì)胞生產(chǎn)的重組的大鼠DRR-1、人DRR-1,人DRR-2,人DRR-3,人DRR-4,人DRR-5,人DRR-6。
42.一種用于測(cè)定待測(cè)化合物結(jié)合或激活G蛋白偶聯(lián)背根神經(jīng)節(jié)特異性受體(DRR)的能力的方法,該方法包括a)將含有DRR但基本上沒(méi)有其它G蛋白偶聯(lián)受體的來(lái)源和以下物質(zhì)一同培養(yǎng)(ⅰ)已知和DRR結(jié)合的配體;(ⅱ)所說(shuō)的待測(cè)化合物;以及b)確定所說(shuō)配體的結(jié)合被所說(shuō)待測(cè)化合物置換的程度。
全文摘要
本發(fā)明涉及主要發(fā)現(xiàn)于背根神經(jīng)節(jié)中的新型G蛋白偶聯(lián)受體。本發(fā)明包括受體蛋白以及編碼該蛋白的核酸。血管緊張素Ⅰ和Ⅲ影響了用編碼該受體的DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的鈣信號(hào)。此外,本發(fā)明涉及使用所述受體的方法和組合物。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1284966SQ9881376
公開(kāi)日2001年2月21日 申請(qǐng)日期1998年12月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月22日
發(fā)明者S·阿馬德, D·邦維爾, Y·福廷, P·萊姆波, D·奧多尼爾, S-H·沈 申請(qǐng)人:阿斯特拉制藥公司
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1